Expo Espectrofotometria

Práctica 7- Determinación de la
concentración de DNA por

espectrofotometría
INTEGRANTES:
Rodrigo Getzael Vargas Carreón
Daniel Isaí Báez Tovar
Jesús Ricardo García Vidal
Sergio Humberto Castellanos Maya
Shelly Daniela Ventura Hernández
INTRODUCCIÓN
 La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las

investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite
comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una
cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la
misma sustancia.
 El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda
de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar a nuestros ojos aquellas
longitudes de onda no absorbida. La determinación precisa de la cantidad del
DNA puede hacerse por espectrofotometría o fluorometría.
¿Qué es la espectrofotometría?
 La espectrofotometría es un método analítico fundamentado en la evaluación de la

interacción entre las radiaciones electromagnéticas y las moléculas, medida a través
de la absorción o la transmisión de luz de la sustancia en cuestión.
 La principal aplicación de la espectrofotometría en el campo de la biología
molecular y la genética, es el análisis cuantitativo de ácidos nucleicos y proteínas.
 La espectrofotometría proporciona una estimación simple y precisa de la
concentración de DNA cuando este se encuentra relativamente puro, sin
contaminación significativa de proteínas o solventes orgánicos que absorben a
longitudes de onda similares.
 La fluorometría hace uso de marcas fluorescentes que se unen específicamente a los
ácidos nucleicos. El fluorometro emite luz sobre la muestra (excitación) y mide el
nivel de luz fluorescente que esta emite en forma perpendicular a la del haz de
excitación.
FENÓMENOS DE INTERACCIÓN ENTRE LUZ Y MATERIA
FENÓMENO DE ABSORCIÓN
La absorción es una de las propiedades básicas de la luz y esta se da
cuando una luz blanca cae sobre un cuerpo y este mismo va a absorber
de forma parcial o total el espectro, en este caso la luz, y va a reflejar o
transmitir algunas longitudes de ondas las cuales constituyen el color
Existen 3 tipos de absorción de la
luz
• FENÓMENO DE EMISIÓN
• Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental,
produciendo la emisión de energía radiante. En este caso, lo que se mide es la
energía emitida y, en este fenómeno se basa la “fotometría de llama” o la
“fluorescencia”
 Espectro de emisión. Es el elemento que emite la luz
• Espectro de absorción. es el elemento que recibe la luz y la absorbe

LEY DE LAMBERT Y BEER
Es una relación empírica que relaciona

la absorción de luz con las propiedades del
material atravesado.
Fue descubierta independientemente (y de
distintas maneras) por Pierre Bouguer en
1729, Johann Heinrich Lambert en 1760
y August Beer en 1852. En forma
independiente, Wilhel Beer y Johann
Lambert propusieron que la absorbancia
de una muestra a determinada longitud de
onda depende de la cantidad de especie
absorbente con la que se encuentra la luz
al pasar por la muestra.
ESPECTOFOTÓMETRO
El espectrofotómetro es un instrumento con el que

se apoya la espectrofotometría para medir la
cantidad de intensidad de luz absorbida después de
pasar a través de una solución muestra.
También es un instrumento usado en el análisis
químico que sirve para medir, en función de
la longitud de onda, la relación entre valores de una
misma magnitud fotométrica relativos a dos haces
de radiaciones y la concentración o reacciones
químicas que se miden en una muestra. También se
utiliza en laboratorios de química para
la cuantificación de sustancias y microorganismos.
PARTES DEL ESPECTOFOTÓMETRO
1) Fuente de luz: Proporciona energía radiante en forma

de luz visible o no visible
2) Rendija de entrada: Tiene como función reducir al
máximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa entre
en el sistema de selección de longitud de onda
3) Monocromadores :
Prismas y Redes de Difracción
4) Rendija de salida: Tiene como función impedir que la
luz difusa atraviese la cubeta de la muestra, que
provocaría alteraciones en la lectura
5) Cubeta: Recipiente donde se coloca la muestra para
la medición
6.-DETECTOR
 Fotocélulas o células fotovoltaicas:

Es una lámina de Cobre sobre la que se
extiende una capa de Selenio o de
Óxido de Cobre. A ésto se le conoce
como semiconductor. Sobre el
semiconductor hay una capa de metal
transparente que sirve de electrodo.
La luz incide sobre el Selenio y éste desprende electrones, que pasan a la placa de
Cobre originando una diferencia de potencial por existir carga negativa sobre el
Cobre y positiva sobre el Selenio. El conjunto se conecta a un amperímetro que
señala el paso de corriente.
Características:
 Son resistentes
 Económicas
 Sensibles desde el ultravioleta hasta los
1.000 nm. De longitud de onda
 No se requiere batería externa, ni vacío,
la corriente producida es directamente
proporcional a la energía que llega.
 Tienen “efecto fatiga
Fototubos multiplicadores
 Es un tubo que contiene un cátodo que emite electrones de forma proporcional a la energía
que incide sobre él. Tiene un ánodo que recoge los electrones y la corriente se multiplica
varias veces al chocar los electrones sobre sucesivos ánodos que van teniendo un voltaje
superior al precedente.
Características:
 La señal se amplifica en
cientos o miles de veces.
 El tiempo de respuesta es muy
rápido.
 No tienen “efecto fatiga” tan
altos como la anterior.
 Son muy sensibles.
7.- Medidor
 Son sistemas de lectura de la energía eléctrica que recoge el detector y que puede ser
lectura directa (se utiliza una célula fotovoltaica) o puede ser amplificadores de señal como
en el caso del fototubo multiplicador. Los actuales aparatos incorporan lectura digital y
cálculos automáticos de concentraciones con relación a las curvas de calibración.
METODOLOGÍA (MATERIALES NECESARIOS)
Espectrofotómetro Agua bidestilada esteril Cubeta de cuarzo Pipeta de bajo

para espectrofotómetro volumen
Muestra de DNA
Espectrofotómetro:
Puntos clave
La cuantificación del DNA, asi

como su pureza, va a ser
determinada por la
espectrofotometría
Puntos clave
 La concentración de ácidos
nucleicos suele determinarse
midiendo a 260 nm
 Las proteínas absorben a 280 nm
 Algunos compuesto contaminanten
como hidratos de carbono,
péptidos, fenoles, compuestos
aromáticos u otras sustancias
absorben a 230 nm
Procedimiento
1. Preparar el espectrofotómetro en la 2. Obtener la lectura de la solución blanco ,

longitud de onda a medir (260 nm) nos debe dar un regitro en 0
Procedimiento
3. Hacer una dilución: 4ul de muestra de DNA 4. Colocar la cubeta de cuarzo con la muestra en el
en 196µl de agua bidestilada. Mezclar con espectrofotómetro y medir la densidad óptica a una
pipetero suave y transferir a la cibeta de longitud de onda 260nm, 280nm y 230nm
cuarzo.
¿Qué hacer con los valores obtenidos?
Ejemplo:
Abs en longitud de onda… resultado

260nm 0.372
280nm 0.181
230nm 1.2
Conocer la concentración del DNA:

1 Unidad de absorbancia en 260nm = 50 µg/µl de DNA
Formula para conocer la concentración de DNA en la muesta:
Concentración= abs 260nm x 50 µg/µl

0.372 x 50 = 18.6 µg/µl
Ejemplo: Abs en longitud de onda… resultado
260nm 0.372
280nm 0.181
230nm 1.2
Pureza del DNA en la muestra:
Cocientes para
obtener
El nivel de pureza del
DNA en la muestra
Ejemplo: Abs en longitud de onda… resultado
260nm 0.372
280nm 0.181
230nm 1.2
Pureza del DNA en la muestra:

A260/a280= 0.372/0.181
A260/a280= 2.05 (Target: 2.0-2.3)
Cocientes para *Tenemos un DNA no contaminado por proteínas
obtener en la muestra
El nivel de pureza del
DNA en la muestra A260/a230= 0.372/1.2
A260/a230= 0.31 (Target: 1.8-2.0)
*Tenemos un DNA contaminado por compuestos
fenólicos en la muestra
Conclusión
Mediante la espectrofotometría se puede determinar la concentración y la pureza de una

muestra de ADN basándose en la capacidad de absorbancia de un compuesto presente en una
solución a una longitud de onda determinada.
El uso de los de métodos de extracción comerciales ha aumentado debido a que la matriz
permite capturar selectivamente al ADN haciendo posible obtener un extracto de alta pureza
con moléculas íntegras; al tiempo que se reduce el número de pasos en la extracción y se
disminuye la posibilidad de contaminación con ADN o ARN exógeno. Extractos con estas
características aumentan la sensibilidad y reproducibilidad de las técnicas moleculares, con lo
que se garantiza la obtención de resultados confiables.

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concentración de DNA por

 La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las

 La espectrofotometría es un método analítico fundamentado en la evaluación de la

• Espectro de absorción. es el elemento que recibe la luz y la absorbe

Es una relación empírica que relaciona

El espectrofotómetro es un instrumento con el que

1) Fuente de luz: Proporciona energía radiante en forma

 Fotocélulas o células fotovoltaicas:

Espectrofotómetro Agua bidestilada esteril Cubeta de cuarzo Pipeta de bajo

La cuantificación del DNA, asi

1. Preparar el espectrofotómetro en la 2. Obtener la lectura de la solución blanco ,

Abs en longitud de onda… resultado

Conocer la concentración del DNA:

Formula para conocer la concentración de DNA en la muesta:

Concentración= abs 260nm x 50 µg/µl

Pureza del DNA en la muestra:

Pureza del DNA en la muestra:

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