Aseguramiento de calidad

CULTIVOS DE REFERENCIA
Norma ISO 17025

Bqca. QM Alicia I. Cuesta,

Consultora Internacional de la FAO
 Objetivos de la clase

1. Cultivos de referencia: definición y requisitos.

2. Preservación y mantenimiento de cultivos de referencia.
3. Proveedores de cepas de referencia.
4. Manejo y uso de cultivos de referencia
 Cultivos de referencia:

REQUISITO
Para acreditar o mantener la acreditación de un ensayo,
el laboratorio de microbiología debe contar con cultivos de
referencia.

El número y la elección del género y especie de las mismas

dependerá
de los ensayos que se efectúan
y las necesidades particulares de estos últimos.
 Cultivos de referencia:
REQUISITO

SON NECESARIOS PARA DEMOSTRAR

TRAZABILIDAD.

El laboratorio debe elaborar e implementar un

procedimiento documentado para
el uso y manejo de cultivos de referencia.
 ¿ Para qué son necesarios los
cultivos de referencia ?
Evaluación de la calidad de los medios
de cultivo.

Realizar controles de calidad interno

durante la ejecución de
los ensayos.

Realizar controles de calidad de

reactivos.

Pruebas confirmatorias.
Ejemplo prueba de CAMP

Validar métodos.
 Cultivos de referencia:

Definición:
Término colectivo que se refiere
a cepas de referencia, cepas de reserva y cepas de trabajo.

Requisitos:

Células microbianas capaces de crecer (VIABILIDAD).

Cepas de referencia: Las colecciones suministran las cepas
con instrucciones para su recuperación.

 Se debe tratar de un cultivo puro .(PUREZA).

Genéticamente estables.( ESTABILIDAD)

( mantenimiento de características genotípicas y fenotípicas)
 Cultivos de referencia:

En todos los casos la manipulación y modo de

conservación de las cepas debe ser tal de prevenir :

El deterioro de las cepas.

La contaminación cruzada.

 Mutaciones, deterioro o alteración de las características

típicas de las cepas.

Su crecimiento característico debe ser documentado sobre

cada medio sobre el que se utiliza como cepa control.
 Definición:
Material de referencia

Material o sustancia que posee valores de una o más

propiedades suficientemente homogéneas y bien
conocidas para permitir su uso en la calibración de
aparatos, la evaluación de un método de medición o la
atribución de valores a estos materiales.
( COGUANOR NGR/ISO/IEC 43-1)
 CEPAS DE REFERENCIA:

PARA DEMOSTRAR LA TRAZABLIDAD DEBEN

OBTENERSE DIRECTAMENTE DE:
UNA COLECCIÓN NACIONAL O INTERNACIONAL DE
CULTIVO DE REFERENCIA RECONOCIDO.
Son microorganismos definidos:
 Por lo menos a nivel de género y especie.
 catalogados.
 muy caracterizados.
 de origen conocido.
[ISO 11133-1:2000]

Se comercializan liofilizadas.
 CEPAS DE REFERENCIA:

Los organismos de acreditación deben

considerar válida
la fuente de dónde provino la cepa.
IMPORTANTE:
En la práctica para cumplir con el requisito
prevenir mutaciones, deterioro o alteración de
las características típicas de las cepas de
el número de repiques
a partir de la cepa de referencia
debe ser limitado
( en general es aceptado hasta 5 repiques a
partir de la cepa de referencia )
 Si una cepa se adquiere por cualquier vía
que no sea la propia colección,
NO se puede mencionar utilizando el número
que tienen en esa colección,
sino solamente como derivada
de la cepa de colección.
 Adquisición de
Cepas de referencia:

 1 era opción: Obtención directa a partir de una colección

nacional e internacional reconocida.

 2 da opción: Proveedores comerciales certificados por ISO

que 9001.
Comercializan repiques de cepas de referencia adquiridas en
una colección reconocida. Generalmente el 3er o 4 repique.
Deben mantener sus recipientes originales.
Requerimiento en la recepción (compra de insumo) : certificado de
origen donde conste el número de repique y el origen entre otros.
 Proveedores
de cepas de referencia:
Primera opción:
Algunos ejemplos
ATCC (American Type Culture Collection).
SVM (Foundation for the Advancement of Public and
Environmental Protection)
CECT (Colección española de cultivos tipos).
CNCM. (Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes) lNSTITUT PASTEUR

Segundo opción:
Algunos ejemplos
Proveedores acreditados por ISO 9001 que realizan repiques a
partir cepas adquiridas en la colección reconocida.
Oxoid Companie
Cepas de
colección
de
referencia
http://wwwatc.org
 Definición:
Material de referencia certificado.

Material o sustancia acompañado de un certificado,

que posee valores de una o más propiedades,
certificados por un procedimiento que establece su
trazabibilidad a una realización exacta de la unidad en la
cual se expresan los valores de dichas propiedades, para
el cual cada valor certificado está acompañado por su
incertidumbre, con un nivel de confianza establecido.
( COGUANOR NGR/ISO/IEC 43-1)
 Cepas de referencia certificadas:

Definición: Cepas de referencia certificadas es un Material

de referencia certificado biológico.
La colección certifica que ha suministrado una determinada
cepa, que es un cultivo puro, y que se ha caracterizado por
pruebas morfológicas, bioquímicas y moleculares
adecuadas.

Por ser un material biológico surgen dificultades de

certificación
 Reconstitución
de las cepas de referencia:
 Las Cepas de referencia ingresan al laboratorio de
microbiología se registran en planilla según
procedimiento.
 Las Cepas de referencia se almacenan entre 0-5 º C
hasta su uso.
 Las Cepas de referencia se reconstituyen y se siembran
utilizando el medio de cultivo, las condiciones de
incubación y el procedimiento indicado en las
instrucciones para cada tipo de microorganismo del
organismo proveedor de las cepas.
 En paralelo, a las Cepas de referencia, se les realiza un
control de calidad de pureza y viabilidad y se registra.
 Identificación de la
cepa.
Género y especie del
microorganismo
TIPO y Nº de colección.
REGISTRO DE Nº de lote.
CEPAS DE REFERENCIA: Fecha de recepción.
Control de calidad de la
cepa de referencia
Conforme (SI/NO).
Fecha de caducidad de
la cepa.
Personal responsable.
 Control de calidad de
pureza y viabilidad:
 Se realiza a diferentes niveles del proceso. CADA VEZ
QUE HAGO UN REPIQUE.

 Su finalidad es asegurarse que las cepas conservan su

viabilidad y sus caracteres bioquímicos.

Frecuencia de realización de este control: para las

cepas de reserva almacenadas el laboratorio la
establecerá en cada caso.

 En caso de no presentar las características establecidas

se ejecuta la Acciones correctivas establecida en el
procedimiento.
 Registro de Control de calidad
de pureza y viabilidad de las cepas:
Fecha del control.

Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo. TIPO

y Nº de colección.

Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo).

Pruebas a realizar (depende del microorganismo):

o Coloración de Gram
o Características de las colonias en medios selectivos
o Pruebas bioquímicas y serológicas.
CEPAS DE
RESERVA
 Cepas de reserva:
Definición: Cepas idénticas obtenidas mediante un único
subcultivo de una cepa de referencia.
[ISO 11133-1:2000].
Las cepas de reserva son una serie de alícuotas de cultivos
idénticos obtenidas en el laboratorio por subcultivo de la cepa de
referencia.

CREF

REPIQUE UNICO

Cres Cres Cres Cres Cres Cres

Las cepas de reserva las prepara y conserva el laboratorio.

Cepas de reserva:

Dentro del laboratorio (ver plano del laboratorio)

Debe haber un lugar destinado a
almacenar las cepas de reserva.

Debe estar claramente señalado

que se trata de cepas potencialmente peligrosas
y su manipulación restringida
a personal autorizado.
 MÉTODOS A)LIOFILIZACIÓN.
PARA
LA PRESERVACIÓN
Y MANTENIMIENTO B) CONGELACIÓN
Uso
DE A BAJAS de agentes
CEPAS DE RESERVA TEMPERATURAS.
Crioprotectores
obtenidas a partir
de cepas de referencia :
 MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

A) LIOFILIZACIÓN.

 Definición: es un proceso de desecación desde el estado

congelado.

Agentes Crioprotectores:
Leche descremada de calidad microbiológica
( esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.
Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol.

PRODUCTO: se puede conservar en refrigeración o a

temperatura ambiente por años.
 MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

B) CONGELACIÓN A BAJAS
TEMPERATURAS:
Agentes Crioprotectores:
Leche descremada de calidad microbiológica
( esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V.
Pueden adicionarse Aditivos como por ejemplo inositol.
Glicerol al 10%
Caldo BHI con glicerol 20%.

Proceso de congelación:
Equipamiento o insumos para lograr la congelación:
Congelador o cámara o uso de Nitrógeno líquido.
 MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

B) CONGELACIÓN A BAJAS
TEMPERATURAS:

Proceso de congelación:
Temperaturas de congelación:
Deseable a -70 o -80 º C o menores temperaturas.
A temperaturas más altas como -20 º C no es lo ideal pero tal
vez sea la única forma posible. Es preferible a -40º C.

Envases: Uso criovial o tubo estéril.

PRODUCTO: se puede conservar en a temperatura

congelación por años.
Inconveniente: problemas y pérdida de las cepas la falta de
suministro de energía, falta de insumos o avería del
equipamiento.
 LA PRESERVACIÓN Y MANTENIMIENTO
DE
CEPAS DE RESERVA

!! Es muy importante un buen método de conservación de

modo de mantener los microorganismos vivos, puros y la
cepa microbiana auténtica!!
Para lo cual se debe tener en cuenta los conocimientos
básicos de Microbiología.
Proveer condiciones adecuadas para cada tipo de
microorganismo.
Con cada subcultivo, hay Riesgo de cambio de la cepa.

Evito el crecimiento.
 FACTORES QUE AFECTAN
LA VIABILIDAD DE LA CEPA

La viabilidad de las cepas, sometidas a un

proceso de congelación
(para su almacenamiento),
está determinada por los siguientes factores:

a) Tipo de cepa. Ejemplo las bacterias Gram

positivas resisten mejor que las Gram negativas.

b) El cultivo debe estar en las mejores condiciones

posibles antes de ser expuesto a bajas
temperaturas.
 FACTORES QUE AFECTAN
LA VIABILIDAD DE LA CEPA
b) Condiciones necesarias antes de ser expuesto a bajas
temperaturas:
1. La EDAD DEL CULTIVO puede afectar la capacidad del
microorganismo de sobrevivir.
Cultivos demasiados jóvenes o demasiado viejos son menos
resistentes al shock térmico.
Ideal es fin etapa logarítmica principio fase estacionaria tiene
mayor probabilidad de recuperación.
( en bacterias en general es 24 horas de incubación a 37º C)

2. Las CONDICIONES DE DESARROLLO también juegan un

papel importante .
Ejemplo; Las levaduras que crecen aireadas y agitadas tienen
mayor resistencia a la temperatura que aquellas que
desarrollan en un medio sólido.
 MÉTODOS PARA LA PRESERVACIÓN Y
MANTENIMIENTO DE CEPAS DE RESERVA

Las instrucciones del fabricante de los

sistemas de preservación de cepas
disponibles comercialmente deben ser
rigurosamente respetados y observados.
 Ejemplo:
Supervivencia de los microorganismos
almacenados a –20º C en Mast Cryobank
Referencia: Mast Cryobank TM, ETICOR

Microorga

Enterobacter aer
Pseudomona aeru
 Procedimiento:
Cepas de reserva:
Paso 1: Información en cada
Paso 1: criovial:
Los tubos o crioviales •Identificación de la cepa
donde se almacenan las
cepas reserva , se rotulan • Tipo y Nº de colección
(previamente • Nº de repique.
a la inoculación) •Fecha de realización del C res.
•Fecha de vencimiento del
Paso 2: El desarrollo criovial.
microbiano obtenido, se • Nº de tubo o criovial.
inocula asépticamente en el
medio líquido sobrenadante
que contienen los crioviales.
 Identificación de la cepa.
Género y especie del
REGISTRO DE CEPAS microorganismo.
DE RESERVA TIPO y Nº de colección.
Nº de Lote Cepa referencia.
 Nº de criovial o vial.
Fecha de reconstitución de la
Cepa referencia.
Nº de repique.
Frasco en uso.
Fecha de baja criovial.
Ubicación de almacenamiento.
Observaciones
 Procedimiento:
Cepas de reserva:

Paso 3:
Congelar o liofilizar la Cres

Paso 4:
Manipulación de la Cres para obtener cepas de trabajo Ct
IMPORTANTE!! Para cepas congeladas de crioviales este
paso se debe realizar de manera de prevenir el
descongelamiento y la contaminación del criovial
(Cres), mediante el traslado en caja termostatizada del
mismo y repique en campana de flujo laminar.
 Procedimiento:
Cepas de reserva:

 En el caso de descongelamiento de las cepas de reserva no

deben volver a congelarse.

 El criovial vencido se elimina del cepario y se registra.

 Cuando se fracciona alícuotas en leche u otros agentes

crioprotectores, se usan, se descongelan y no se pueden
volver a congelar ni a usar.

 Las cepas liofilizadas una vez reconstituidas no se pueden

volver a usar.
 Cepas de trabajo:

Subcultivos de microorganismos obtenidos a partir

de las cepas de reserva para ser utilizados en los
ensayos que lo precisen.

Obtención de cepas de trabajo:

Los cultivos de trabajo se obtienen a partir de la Cepas de
reserva sobre un medio sólido o líquido no selectivo adecuado
utilizando un ansa estéril e incubando en condiciones
adecuadas.
 Las cepas de trabajo no deben ser subcultivadas.
 CEPA DE REFERENCIA

Reconstitución
(Sólo se acepta un único repique)
*

OBTENCIÓN DE LAS CEPAS DE RESERVA

Esquema
*
CONSERVACIÓN MEDIANTE DISTINTOS MÉTODOS
de cultivos
(Liofilización, nitrógeno líquido, ultracongelación rápida, etc.)
Se Se
subcultiva
subcultiva
de
Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento unauna
vez
solasola
vez.
referencia:
Descongelación / reconstitución
*
*Controles
CEPAS DE TRABAJO
(Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento) de pureza y
pruebas
bioquímicas
UTILIZACIÓN EN EL CONTROL DE CALIDAD DE
LOS MEDIOS, VALIDACIÓN DE MÉTODOS Y de la cepa.
CONTROLES INTERNOS DE CALIDAD
 PASOS a seguir para
el manejo de los cultivos de referencia:

PROVEEDOR DE CEPA

 Adquisición de cepa de referencia (C Ref):

- Requisitos de compra y Registro de la cepa adquirida.
LABORATORIO
 Subcultivo de C Ref:
- Control de pureza y viabilidad (REGISTRO).
 Preparación de la cepa de reserva (Cres)
- Control de pureza y viabilidad periódicos (REGISTRO).
- Registro de cada frasco de la nueva cepa de reserva
Incorporada al cepario.

LABORATORIO
 PASOS a seguir para
el manejo de los cultivos de referencia:

CONDICIONES CONTROLADAS DE
LABORATORIO ALMACENAMIENTO
DE LA CEPA DE RESERVA

Subcultivo la cepa de reserva (C t):

LABORATORIO -Control de pureza y viabilidad (REGISTRO).

USO PARA CONTROLES DE CALIDAD

 Síntesis final
El laboratorio de microbiología debe contar con cultivos de
referencia.
Los cultivos de referencia se utilizan en el laboratorio para:
Evaluar la calidad de los medios de cultivo, aseguramiento
de la calidad de los resultados de ensayo y validación de
métodos microbiológicos.
Es necesario contar e implementar un procedimiento para
el manejo de cultivos de referencia, asegurar la trazabilidad
y el origen de la cepa, así como conocer las características
de las cepas usadas en los ensayos de modo que
mantengan su viabilidad y sus caracteres bioquímicos.
NECESITAMOS UN DESCANSO!!!