1

Estrategias Biotecnológicas e
Instrumentales aplicables en la
producción de Metabolitos Secundarios
en condiciones de cultivo in vitro

MARY ANDREA SANTAMARÍA TORRES

MAESTRÍA EN CI ENCIAS BIOLÓGICAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FI TOQUIMICA DE PRODUCTOS NATURALES Y VEGETALES

2018
 2

Contenido
Biotecnología

1
Introducción
Cultivos in vitro
Cultivo de callos
2
Células en suspensión Explante
Ventajas Composición y condiciones del medio
3 Elicitación
Estrategias
Aplicaciones
Proyecto de Inv.
Lui et al 2018 4
Delgado et al 2013 5
Conclusiones
 Introducción 3

Limitaciones en el Estudio de MS

Desconocimiento
Recolecciones Variabilidad Restricciones de los
Baja Indiscriminadas dependiente geopolíticas mecanismos que
concentración Poblaciones en de para la
controlan su
en la planta vía de condiciones obtención
ambientales del material. síntesis y
extinción.
acumulación.

Arias, M. et al. Rev. Fac. Nal. Agr. Medellín. 2009, 62, 4881-4895. 3
 4

Biotecnología
“…Vida al servicio de la vida…”

Conservación de especies vegetales Plantas resistentes a virus, bacterias e insectos

Plantas tolerantes a distintos tipos de
estrés abióticos
Cultivos resistentes a herbicidas
Biotec.
Mejoras en calidad de alimentos
Agrícola
Cultivo de tejidos para obtención
Aumentar la producción de MS y conservación de plantas
 Cultivo in vitro de Células y Tejidos 5

Vegetales
CULTIVO TIEMPO RENDIMIENTO

300
Planta 2,4 %
semanas

Coptis japonica Cultivo

2 semanas 13,4 %
(Ranunculaceae) celular

Berberina

Antibacteriana
anti-inflamatoria
antimalárica

Ikuta, A. et al. Coptis: In vitro regeneration of plantas ande the production of berberine. En: Biotechnology in
Agriculture and Forestry. Y. P. S. Bajaj (Ed.). 2012, 110-127 p.
 Cultivo in vitro de Células y Tejidos 6

Vegetales
Aumentar el rendimiento de los metabolitos e incluso obtener
metabolitos no expresados en la planta.

Las células de cualquier planta podrían fácilmente

multiplicarse para producir sus metabolitos específicos.

Evitar la sobreexplotación e incluso la extinción de algunas

especies.

Posibilidad de realizar el escalado mediante reactores.

Estudiar las rutas biosintéticas y ecología química.

Arias, M. et al. Rev. Fac. Nal. Agr. Medellín. 2009, 62,4881-4895.

Verporte, R. et al. Phytochem. Rev. 2002, 1, 13-25.
 Cultivo in vitro de Células y Tejidos 7

Vegetales

Siembra
Obtención del callo
Explante explantes en
medio MS

Thorpe T. History of Plant Cell Culture. En: Smith R. (ed). Plant Tissue Culture: Techniques and Experiments. Third
Edition. Academic Press. 2013, 122p.
 Cultivo in vitro de Células y Tejidos 8

Vegetales

Totipotencialidad
Callo Celular
Balance de reguladores del crecimiento vegetal
Desdiferenciación/Rediferenciacion

Diferenciación Desdiferenciación Rediferenciación

Thorpe T. History of Plant Cell Culture. En: Smith R. (ed). Plant Tissue Culture: Techniques and Experiments. Third
Edition. Academic Press. 2013, 122p.
 Cultivo in vitro de Células y Tejidos 9

Vegetales

Imagen adaptada de (Azizi et al.,

2015.Comptes Rendus Biologies 338(7),
pp.463-470)

Siembra
Obtención del callo
Explante explantes en
medio MS
Células en Suspensión Bioreactor
Gran Escala

Thorpe T. History of Plant Cell Culture. En: Smith R. (ed). Plant Tissue Culture: Techniques and Experiments. Third
Edition. Academic Press. 2013, 122p.
 Estrategias para aumentar la 10

producción de MS
 Tipo de órgano
Selección de la fuente de
Dexplante.  Edad ontogénica
 Tamaño y estado sanitario de la planta donante

 Cultivo-asepsia
Composición del medio y  Condiciones Controladas: °C, HR, Luz,
condiciones de cultivo Fotoperiodo
 Nutrientes

Adición de elicitores.

Wang, J., et al. 2017. Production of Active Compounds in Medicinal Plants: From Plant Tissue Culture to
Biosynthesis. Chinese Herbal Medicines, 9(2), pp.115-125.
 Estrategias para Aumentar la Producción de MS 12

¿Cómo actúan los elicitores?

Estímulo Ruta de Señalización

Metabolitos Secundarios

Expresión de genes
Wang, J. et al. Chinese Herbal Medicines. 2017, 9(2), 115-125.
 Aplicaciones 13

Efecto de las diferentes combinaciones de reguladores de crecimiento para

inducción de callos en varios explantes de especies Piper
 14
Aplicaciones
Estacionaria

Peso Seco (mg)

Log
Variaciones en
• Ciclo de crecimiento Lag
• pH
• Actividad específica PAL
Tiempo (días)
• Contenido total de Fenoles pH

Tiempo (días)

Delgado, G., Kato, M., Rojas, C. (2013). Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas. 12(2), 269-282.
 15
Aplicaciones
Efecto de los elicitores MeJA y SA a diferentes concentraciones y tiempo de
exposición en el incremento de la CADs
 16

Aplicaciones
Efecto de los elicitores MeJA y SA en células en suspensión de Gardenia
jasminoides

HPLC

Liu Z., Chen J., Yin Z., Shangguan X., Peng D., Lu T., Lin P. (2018).. Plant Cell
 17

Aplicaciones
Estudio comparativo de la producción
metabólica y actividad enzimática en cultivos
in vitro de células en suspensión de Piper
cumanense en condiciones de elicitación

Laboratorio Cultivo de
Tejidos Vegetales
 Aplicaciones 18

Piper cumanense

Ácido cumanénsico
40 mg Ácido cuménico – 200 mg
0,017% 0,067%

Parra, J. et al. Phytochem. Lett. 2011, 4, 280-282./Parra, J. et al. Phytochem. Lett. 2013, 6, 590-592.
 19
Aplicaciones
Metodología: Efecto de los elicitores ácido salicílico y quitina en células en
suspensión de Piper cumanense
Células
Sin Elicitor
Cultivo de Células en Suspensión Medio
Células
50 µM
Medio
Quitina
Efecto de Elicitores Células
100 µM
Medio
Células
50 µM
Medio
Ácido Salicílico
Células
100 µM
Medio
 Aplicaciones 20

Metodología: Efecto de los elicitores ácido salicílico y quitina en células en

suspensión de Piper cumanense
Callo friable
2g
15 días

Medio MS (M&S 1962)+ Vitamina

m-inositol (100mg/L) y tiamina- Cambio de medio Agitación rotatoria
HCl (1mg/L) + Sacarosa 3% 15 días
pH ajustado a 5,8.

15 días

Adición de Elicitores Alícuotas 10 mL +

Lectura 3, 6, 12 h Unión suspensiones
Medio nuevo 10 mL
Murashige T., Skoog F. Physiol Plant. 1962, 15 (3), 473–497.
 Aplicaciones 21

Efecto de los elicitores ácido salicílico y quitina en células en suspensión de

Piper cumanense
Células
Sin Elicitor
Cultivo de Células en Suspensión Medio
Células
50 µM
Medio
Quitina
Efecto de Elicitores Células
100 µM
Medio
Células
50 µM
Medio
Ácido Salicílico
Células
100 µM
Medio
 22

Extracción de MS de las células

Liofilización

Toma de muestra Extracción

Concentración
Análisis
cromatográfico

Toma de alicuota Extracción

Briceño Z. Aproximación Proteómica y Metabolómica de la Producción de Metabolitos Secundarios en Líneas Celulares

Elicitadas de Solanum Lycopersicum. Tesis de Doctorado. Universidad de Murcia, España. (2014).
 23
Validar un método por HPLC para cuantificar ácido cuménico y ácido
cumanénsico.
Analitos aislados U
Robustez
% De Rec.
Optimización de las condiciones cromatográficas Precisión
%Error
Selectividad
Preparación de la muestra Sensibilidad
LOD
Linealidad
LOQ
Curva de calibración

5 Niveles de Pendiente Repetibilidad BL Test de ±

Concentració de la curva de Reproducibilidad BLF Youde
n Calibración MR n-
Y=mx+b MF Steiner

Sahu et al. J Pharm Biomed Anal. 2018, 147, 590-611.

 24

Conclusiones
Los procedimientos de cultivo in vitro permiten aumentar el número de células,
tejidos y órganos proveniente de plantas en condiciones controladas de
laboratorios.
Al ser los cultivos in vitro sistemas altamente controlados, éstos pueden constituir
modelos adecuados para realizar investigaciones bioquímicas y fisiológicas que
ayuden a entender el metabolismo secundario y rutas biosintéticas en plantas.
Las condiciones óptimas para el establecimiento de cultivos in vitro dependen de
cada especie y requieren ser determinadas.
La elicitación es una estrategia potencial para aumentar la producción de
metabolito secundarios de plantas cultivadas in vitro.
El éxito del análisis cuantitativo de MS depende fuertemente de una preparación
de la muestra y un método instrumental bajo control.
 25

.:.Gracias.:.