TECNICAS HISTOLOGICAS

TECNICAS HISTOLOGICAS

Se define Tcnica Histolgica

como el conjunto de operaciones
a que se somete un tejido, a fin
de posibilitar su estudio al
microscopio.

Las Tcnicas Histolgicas incluyen

los siguientes pasos:

Obtencin de la Muestra.
Fijacin de la Muestra.

Deshidratacin.

Inclusin en Parafina.
Obtencin de cortes.

Coloracin.
Montaje
 OBTENCION DE LA MUESTRA

El material a utilizar puede ser extrado

de los diversos animales de laboratorio, o
bien puede tratarse de material humano.

Fases en la obtencin de material

animal:

Muerte del animal.

-

Extraccin de los rganos.

-

Prefijado de la muestra
-

Reduccin a piezas.
-
Obtencin de muestra:

De tres fuentes puede provenir el

material humano:

Necropsias o Autopsias: Son las piezas

que se obtienen de un cadver.

Biopsias: Son trozos de tejido que se

obtienen de un sujeto con vida con el
objeto de estudiarlos al microscopio
y efectuar un diagnstico
histopatolgico.

- Piezas operadas: Los tejidos que han

sido extrados de las intervenciones
quirrgicas, generalmente tumores u
rganos inflamados, pero, slo
servirn para anatoma patolgica.
 FIJACION DE LA MUESTRA

Este proceso se refiere al tratamiento del tejido con

sustancias qumicas que tienen varias finalidades:

Conservar los tejidos de forma que muestren el

mayor parecido posible a su estado in vivo.

Aumentar la dureza del tejido para facilitar la

preparacin de finas pelculas de ste.

Destruir bacterias y grmenes que pudieran

encontrarse en ellos.

Interrumpir los procesos celulares dinmicos que

ocurren a la muerte de la clula.
La fijacin mantiene las
estructuras al estimular la
formacin de enlaces
cruzados entre las protenas.

Regla de Oro para la Fijacin

La mejor fijacin es cuando a

pasado el menor tiempo
entre la muerte del tejido y la
fijacin.

Tamao de la Muestra.

El tamao de la muestra debe

de ser de 1-1.5 cm. variando
el estudio para lo cual de va a
utilizar.
 FIJACION (CONTINUACION)

La mayor parte de los fijadores actan como oxidantes, favoreciendo as la coloracin

ulterior de los tejidos.

FIJADORES QUMICOS

Son los ms utilizados; pueden ser:

- fijadores simples, constituidos por una sola sustancia qumica, y

- fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su
constitucin.

FIJADORES SIMPLES:

a) Formol al 10%, es el ms usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que

no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar rganos
o tejidos para estudios histolgicos topogrficos.
b) Alcohol etlico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microqumica.
c) Alcohol metlico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre,
mdula sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin, etc.).
FIJADORES COMPUESTOS:

En su composicin intervienen un nmero variable de fijadores simples

racionalmente elegidos con el fin de completar la accin de cada uno de
ellos o atenuar sus defectos.
a) Lquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-actica.
b) Lquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-actica.
c) Lquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
d) Lquido de Bouin, mezcla picro-formos-actica.
e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohlico.

FIJADORES FSICOS:

1. Desecacin.
2. Calor seco.
3. Calor hmedo.
4. Fro.
5. Congelacin y desecacin.
Para Microscopia Electrnica se usan:

Glutaraldehdo al 2.5%, Paraformaldehdo,

Tetrxido de Osmio y Permanganato de
Potasio
Permiten conservar detalles estructurales
finos, ya que otros fijadores como el
formaldehido, son muy enrgicos en su accin
con las protenas.

Actan como colorantes electrodensos,

permitiendo observar al tejido con el haz de
electrones.
Una solucin de Glutaraldehdo al 2.5% en un
tampn a pH 7.4, evita la violenta
desnaturalizacin de las protenas guardando
detalles finos de la clula. Es el ms usado en
Microscopia Electrnica.
 DESHIDRATACION Y ACLARAMIENTO

DESHIDRATACIN
Despus que la muestra ha sido fijada se
elimina el fijador y se deshidrata.

Debido a que una gran parte del tejido est

constituida por agua, se aplica una serie
gradual de soluciones acuosas de menor a
mayor de agente deshidratante, por ejemplo,
Alcohol Etlico o Acetona.

Iniciando con alcohol al 50 %, luego con una

solucin de 60%, 70%, 80%, 90%, 96% y
alcanzando de manera paulatina el alcohol al
100 % para eliminar el agua.

Esto se hace por que si se colocara el tejido

en una solucin al 100% de alcohol
inmediatamente, el agua saldra muy rpido
del tejido y se deformara.
ACLARAMIENTO, DIAFANIZACIN

Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una

solucin de una sustancia que es miscible tanto
con el alcohol como con el medio de inclusin
a utilizar (en la mayora de los casos se utiliza
como medio de inclusin Parafina lquida).

La sustancia comnmente utilizada es el Xileno

o Xilol.

Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna

transparente o claro en el xileno, esto se debe
a que cambia su ndice de refraccin.

Tambin se pueden utilizar Tolueno, Benzol o

Cloroformo como medios de aclaramiento.

NOTA: El alcohol y el xileno disuelven los

lpidos de la clula y por lo cual al extraerse
tambin se extraen las grasas y los lpidos de la
clula.
 INCLUSION EN PARAFINA

A fin de que se puedan obtener cortes

suficientemente finos para ser observados al
microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y
envueltos por una sustancia de consistencia firme.
Las sustancias usadas para este fin son: gelatina y
parafina.

El objeto de la inclusin es:

Tener un objeto lo suficientemente duro para su

manejo y corte.

La inclusin se logra al infiltrar la parafina liquida o

cualquier medio de inclusin en estado lquido al
tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y
penetra en el tejido.

Por lo general se coloca la muestra de tejido en un

recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60 C,
colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a
6 horas manteniendo la temperatura a 60 C.
Debido al calor, el xilol o el benzol
se evaporan y los espacios
anteriormente ocupados por ellos
son ahora ocupados por la
parafina.

Despus se coloca la pieza y un

poco de parafina fundida en un
molde de papel o metal de forma
rectangular y se deja solidificar a
temperatura ambiente,
formndose un bloque slido de
parafina con el trozo de tejido
incluido, a este bloque se le
denomina Taco.
 OBTENCION DE CORTES
El taco ahora se puede cortar en secciones
lo suficientemente delgadas como para
permitir el paso de la luz.

La mayor parte de los preparados para

microscopia ptica tienen un grosor entre 3
a 10 micrmetros.

Para estos cortes se utiliza un aparato

llamado MICROTOMO.

Cuando deseamos estudiar grasas o lpidos

que se extraen en el proceso de
aclaramiento o enzimas que quedan
inactivadas por el calentamiento de la
inclusin, nos auxiliamos con la Tcnica de
Congelacin de Tejidos.

Un tejido congelado, es los suficientemente

duro para ser cortado. Se sumerge la
muestra de tejido en Nitrgeno lquido para
tener una congelacin rpida.
Luego se corta con un aparato especial denominado
MICROTOMO DE CONGELACIN, existe un
aparato ms elaborado y eficiente para los cortes de
congelacin llamado CRIOSTATO.

La ventaja de esta tcnica es que los cortes que se

obtienen son muy rpidos, se puede utilizar en el
diagnostico de material patolgico, tomado en
intervenciones quirrgicas y el resultado se obtiene
en el transcurso de una operacin.

Para Microscopia Electrnica se requieren cortes

ms delgados (denominados ultra finos) de
aproximadamente 25 a 100 nm. de espesor y de 0.5
mm. de lado medio. Para esto se utiliza un
MICROTOMO CON HOJA DE VIDRIO O
DIAMANTE. Una vez preparados, se montan sobre
rejillas de cobre con un dimetro de 3mm.
 COLORACION O TINCION DE LA MUESTRA

Las tinciones son combinaciones de colorantes cidos y

bsicos que permiten obtener suficiente contraste de
color en los cortes histolgicos comunes.

A continuacin presentaremos una lista de las tinciones

ms comunes:

Hematoxilina y Eosina: La hematoxilina al ser bsica tie

cidos de color morado (ncleos con DNA y RNA),
mientras que la eosina es un cido y tie bases de color
rosado (citoplasma).

PAS (cido Perydico de Schiff): Tie carbohidratos

(mucopolisacridos) de color rojo, por ejemplo las clulas
caliciformes en el intestino.

Tricrmico de Masson: Tie de color azul la colgena, de

rojo la queratina, y de morado los ncleos (muy utilizada
para los cortes de piel).

Nissl: Tie de color morado el retculo endoplsmico

rugoso y los corpsculos de Nissl en las neuronas.
 Pentacrmico de Movat: Tie de
amarillo la colgena, los msculos de
color rojo, de azul mucopolisacridos,
la elastina de color negro, y los
ncleos de morado.

Wright: utilizado en frotis

sanguneos, permite observar todas
las clulas sanguneas, coloreando los
eritrocitos de color rosado, con un
centro claro. Permite observar todas
las clulas sanguneas, coloreando los
eritrocitos de color rosado, con un
centro claro.

Reyes Mota: Tie la elastina de color

morado.

Adems de las tinciones comunes

tenemos a la inmunohistoqumica, la
cual se basa en la utilizacin de
anticuerpos especficos, los cuales
marcan o resaltan las estructuras que
se desean ver.
 EJEMPLOS DE COLORACIONES
Tricrmico
Tricrmico de de Van
Van
Coloracin
Coloracin Hematoxilina-
Hematoxilina- Gieson.
Gieson.
Eosina
Eosina Resultados:
Resultados:
Resultados:
Resultados: Clulas:
Clulas:
Ncleos
Ncleos yy material
material basfilo
basfilo -- Ncleos:
Ncleos: negro
negro -- azul
azul
en tonos de morado.
en tonos de morado. -- Citoplasma:
Citoplasma: amarillo
amarillo
Citoplasma
Citoplasma en
en tonos
tonos de
de
rosado
rosado Colgeno:
Colgeno: rojo
rojo intenso
intenso
Glndula
Glndula salival
salival Sublingual,
Sublingual, Piel
Piel humana,
humana, objetivo
objetivo
objetivo 40X
objetivo 40X 40X
40X

Impregnacin
Impregnacin Argntica
Argntica
Resultados:
Resultados:
Clula
Clula (neurona):
(neurona):
-Soma
-Soma yy prolongaciones
prolongaciones
(dendritas,
(dendritas, axn)
axn) de
de
color pardo oscuro
color pardo oscuro

Corteza
Corteza cerebral
cerebral de
de rata,
rata,
objetivo
objetivo 40X
40X
cido Peridico de Schiff (PAS)
Hematoxilina
Resultados:
- Ncleos: azul
-Clulas caliciformes y Chapa estriada en
fucsia

Intestino delgado, objetivo 40X

Corte de piel con tricrmico de Masson

 MONTAJE Y OBSERVACION EN EL MICROSCOPIO

Para observar adecuadamente los cortes teidos con

el microscopio ptico, se ha de proceder a cubrir las
preparaciones mediante un cubreobjetos.

Para ello se requiere la utilizacin de una sustancia

cementante o medio de montaje.

Si durante la tcnica de tincin se han empleado

colorantes hidrosolubles, deben utilizarse medios de
montaje no-acuosos, es decir hidrofbicos.

Si por el contrario, los colorantes utilizados son no-

inicos, es preceptivo utilizar un medio de montaje
hidrosoluble. Antes de su aplicacin, los cortes deben
hidratarse convenientemente.