Nematologia Una Guia de Campo y Lab Oratorio

Nematologa prctica: Una gua de campo y laboratorio
D.L. Coyne, J.M. Nicol y B. Claudius-Cole Traduccin de Soledad Verdejo-Lucas
PM
Integrated Pest Management
Esta gua ha sido realizada por el Instituto Internacional de Agricultura (IITA) y el Centro Internacional de Mejora del Maz y Trigo (CIMMYT) como parte de la estrategia del Programa Avanzado de Manejo Integrado de Plagas (SP-IPM) con objeto de mejorar la calidad y la utilizacin de la investigacin en manejo de plagas. IITA, CIMMYT y el SP-IPM estn financiados por un Grupo Consultor para Investigacin Agrcola Internacional (CGIAR; www.cgiar.org). La primera tirada de esta gua se realiz gracias a los fondos aportados por el Centro Tcnico ACP-EU para la Cooperacin Agrcola y Rural (CTA), mientras que esta tirada ha sido financiada en su totalidad por Syngenta. El SP-IPM es un programa global de socios cuya tarea es disear conjuntamente los esfuerzos en IPM de los centros internacionales de investigacin agrcola y sus socios y enfocar estos esfuerzos hacia las necesidades de los agricultores con pocos recursos en los pases en desarrollo. El programa se centra en aquellas reas donde la investigacin promete aportar soluciones a problemas apremiantes para el desarrollo agrcola sostenible pero donde el impacto ha sido hasta la fecha limitado debido a la fragmentacin de los esfuerzos entre diferentes organizaciones o en diferentes regiones del mundo, o bien, debido a la falta de conexin entre los investigadores y los agricultores. El SP-IPM espera conseguir un progreso rpido a travs de la disminucin de tales restricciones, romper las barreras para el intercambio de informacin, completar los vacios de investigacin donde existan y desarrollar modelos eficaces de cooperacin investigador-extensionista-agricultor para promocionar la adopcin de las tecnologas de IPM. SP-IPM c/o IITA, PMB 5320, Ibadan, Nigeria, o bien, SP-IPM c/o IITA, Carolyn House, 26 Dingwall Road, Croydon, CR9 3EE, UK www.spipm.cgiar.org IITA es una organizacin internacional de investigacin para el desarrollo con base en frica, establecida en 1967, y gobernada por un Consejo de Patronos. La visin del IITA es ser uno de los socios lderes en investigacin en frica para encontrar soluciones al hambre y la pobreza. La organizacin tiene ms de 100 cientficos internacionales en varias estaciones del IITA ubicados por toda frica. Esta red de cientficos est dedicada al desarrollo de tecnologas para reducir los riesgos de los productores y consumidores, incrementar la produccin local y generar riqueza. IITA, PMB 5320, Ibadan, Oyo State, Nigeria www.iita.org El cometido del CIMMYT es actuar como catalizador y lder en una red global de innovacin en el cultivo del maz y trigo, que sirva de sustento a la poblacin ms desfavorecida de los pases en desarrollo. CIMMYT crea, comparte, y utiliza el conocimiento y tecnologa para incrementar la seguridad alimentaria, mejorar la productividad y la rentabilidad de los sistemas productivos y sustentar los recursos naturales. CIMMYT, AP 6-641, 06600 Mexico DF, Mexico www.cimmyt.org SYNGENTA es lder mundial del agro-negocio y est comprometida con la agricultura sostenible a travs de la investigacin y tecnologa innovadora. La compaa es lder en la proteccin de los cultivos, y ocupa el tercer lugar en el mercado de las semillas comerciales de alto valor econmico. Syngenta tiene ms de 21.000 trabajadores distribuidos en ms de 90 pases. Seed Care es la seccin de negocio de Syngenta que investiga, desarrolla, manufactura y comercializa soluciones innovadoras para el tratamiento de las semillas. www.syngenta.com

D.L. Coyne, J.M. Nicol y B. Claudius-Cole Traduccin de Soledad Verdejo-Lucas
PM
Integrated Pest Management
Agradecimientos
Los autores agradecen el generoso aporte financiero del SP-IPM y CTA para la produccin de esta gua. El ncleo de donantes del SP-IPM que ha contribuido al desarrollo y produccin de esta gua est constituido por el Gobierno de Noruega, Suiza e Italia. Tambin agradecemos la generosa aportacin de CTA para la primera tirada de esta gua y a Syngenta por hacer posible esta reimpresin. El Dr. Braima James (Coordinador del SP-IPM) contribuy con su mpetu y continuo apoyo a la preparacin de la gua que esperamos satisfaga las demandas de nuestros socios y sea de utilidad para aumentar la concienciacin y la reduccin de los problemas nematolgicos. Agradecemos a Braima su continuo apoyo. Agradecemos muy particularmente los consejos y las numerosas contribuciones del Dr John Bridge durante la preparacin de esta gua. Gracias a Luma Al-Banna, John Bridge, Roger Cook, Don Dickson, Jon Eisenback, Georg Goergen, The Food and Environment Research Agency [Crown Copyright, UK], Dieter Heinicke, Sean Kelly, Sandra Mack, Mariette Marais, Alex McDonald, Hans Meerman, Edward Oyekanmi, Richard Plowright, Roger Rivoal, Richard Sikora, Paul Speijer, Hugh Wallwork, Esther van den Berg y Vivien Vanstone por las fotografas. Gracias tambin a R. Esser por la figura y a Graham Stirling por permitir la utilizacin de las figuras y material de referencia relacionado para los apndices. Se agradece la ayuda editorial de Duncan Scudamore y Elif Sahin. Un agradecimiento muy especial a Eleazar Romero del programa de Postgrado de Agronoma de la Universdidad Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA). Urbanizacin Terepaima, entre Redoma de Agua Viva y Urb. Chucho Briceo, Cabudare, Estado Lara, Venezuela, por revisar la traduccin al espaol de esta gua.
ISBN 978-131-338-2 2007 International Institute of Tropical Agriculture Todos los derechos reservados. La empresa editora anima al uso adecuado de este material citando adecuadamente la fuente del mismo. Se prohbe reproducir, copiar o transmitir este documento sin previo permiso por escrito de la editorial.
Reimpresin 2009.
Cita correcta: Coyne, D.L., Nicol, J.M. and Claudius-Cole, B. 2007. Practical plant nematology: a eld and laboratory guide. SP-IPM Secretariat, International Institute of Tropical Agriculture (IITA), Cotonou, Benin. Existe una versin en PDF de este documento que puede encontrarse en la web del CIMMYT, IITA y SP-IPM.
iii
Contenido
Prefacio Introduccin Biologa bsica de los nematodos parsitos de plantas
Apariencia y estructura Ciclo de vida Tipo de nematodos Endoparsitos migratorios Endoparsitos sedentarios Ectoparsitos
v 1 3
3 3 3 7 8 9
Sntomas de dao
Sntomas areos Sntomas causados por nematodos parsitos de la parte area Sntomas causados por nematodos parsitos de las races Sntomas bajo el suelo Races agalladas Races agalladas versus ndulos en las races Sistemas radicales reducidos Lesiones en races y tubrculos Podredumbre de races y tubrculos Grietas Quistes o races perladas Herramientas para el muestreo Nmero de muestras Diseo para el muestreo poca de muestreo Recogida de muestras de suelo Recogida de muestras de races Recogida de muestras de la parte area Cuidado y conservacin de las muestras Eleccin del mtodo de extraccin Preparacin de las muestras Etiquetado de las muestras Mtodo de la bandeja Mtodo de la maceracin de las races Mtodo del tamizado Mtodo de incubacin
11
11 11 11 14 14 18 19 19 21 23 24 25 25 26 26 27 28 28 28 31 32 32 34 40 42 48
Muestreo
25
Extraccin de nematodos
31
Nematologa prctica iv
Examen directo del tejido vegetal Manipulacin, fijacin y tincin de los nematodos
Manipulacin de los nematodos Pesca de nematodos Envo de los nematodos para su identificacin Servicios para la identificacin de nematodos Muerte de los nematodos Fijacin de los nematodos Muerte y fijacin en un solo proceso Conservacin de los nematodos sedentarios en la raz o tejido tuberoso Tincin Masas de huevos de Meloidogyne Recuento de los nematodos
51 53
53 53 55 57 57 58 59 59 60 60
Estimacin de la densidad de nematodos Anlisis del dao
61 63 65 67
61 63
Estimacin de sntomas de nematodos en la planta
Referencias y lecturas aconsejadas Apndice 1. Ejemplos de gneros de nematodos y especies patgenas de los cultivos de importancia mundial Apndice 2. Identificacin bsica de los nematodos Apndice 3. Hojas de registro para medir el dao causado por los nematodos
72 75
75 77 78 79 81 82
ndice de agallas producidas por Meloidogyne spp. en mandioca ndice de agallas producidas por Meloidogyne en zanahoria ndice de agallas producidas por Meloidogyne en lechuga ndice de lesiones en races de banano Diagrama para la estimacin de agallas Diagrama para estimar el dao causado por los nematodos de los quistes en trigo
Prefcio
Esta gua es una referencia sencilla y fcil de seguir para evaluar los problemas causados por los nematodos parsitos de plantas. La gua proporciona instrucciones claras e ilustra con fotografas los procedimientos para la toma y procesamiento de muestras para la evaluacin de los nematodos y tambin como acceder a ms informacin para su diagnstico e identificacin. El manual est dirigido a tcnicos, agricultores, agentes de extensin, y otras personas con inters en la produccin y proteccin de los cultivos, particularmente en aquellos lugares del mundo donde el acceso a ayuda experta y equipamientos es limitado. La gua se ha realizado en respuesta a la frecuente demanda de los especialistas que perciban la necesisdad de disponer de una gua que ayudase a diagnosticar problemas causados por nematodos. Es de esperar que la gua simplifique algunos aspectos de la nematologa y ayude a disminuir el misterio que rodea este problema que afecta a la produccin agrcola. Se dice, a veces, que los nematodos se perciben como un problema para la produccin agrcola slo cuando hay un nematlogo presente y que si no hubiera nematlogos no habra problemas de nematodos. Paradjicamente, los sntomas inespecficos causados por los nematodos se atribuyen habitualmente a otras causas que parecen ms probables u obvias. La realidad es que varios factores limitantes a menudo se combinan dando lugar a la disminucin de la produccin agrcola y es preciso cuantificar los principales factores limitantes de la produccin, entre los cuales se incluyen los nematodos. Teniendo en cuenta la amenaza de los nematodos en relacin a otras plagas y enfermedades, es un reto que ser de enorme beneficio la cuantificacin de los problemas nematolgicos a travs de la mejora de los procedimientos de campo y laboratorio. Los nematodos parsitos de plantas se encuentran siempre presentes y estn asociados con el crecimiento de la planta y la produccin del cultivo. Constituyen una limitacin significativa para la agricultura de subsistencia y pueden ser difciles de controlar. La determinacin de la importancia de ciertas especies de nematodos, comunidades de nematodos y la de los nematodos en combinacin con otros problemas no es una tarea simple en el mejor de los casos, pero ello es ms difcil de conseguir en climas tropicales que en climas templados. Especies de nematodos que antes eran desconocidas como causantes de dao a los cultivos se estn descubriendo continuamente debido a los cambios que experimenta la agricultura para adaptarse a las necesidades cambiantes y a la introduccin de nuevos cultivos. La introduccin o mejora de las tcnicas nematolgicas y el diagnstico puede llevar a la identificacin de los nematodos como la causa de un problema que ha existido durante muchos aos, pero que debido a la falta de experiencia del personal local, no se haba diagnosticado adecuadamente. Todava queda mucho por aprender sobre los nematodos y el dao que estos causan a los cultivos. Por ejemplo, an faltan datos fiables sobre la relacin entre el nmero de nematodos y las prdidas de produccin para muchos de los cultivos y tipos de nematodos. En muchos de los pases menos desarrollados, la mayora de la informacin bsica no existe. Por tanto, es importante realizar avances, aunque sean pequeos, en su conocimiento y desarrollo para su utilizacin posterior a travs de publicaciones de redes y sociedades relevantes o revistas nacionales e internacionales.
Nematologa prctica vi
Es de esperar que esta gua contribuya a mejorar el manejo de enfermedades y plagas, particularmente en aquellos lugares donde la experiencia en nematologa es escasa, tal es el caso de los pases menos desarrollados del mundo. Un paso inicial para el manejo de nematodos es el establecimiento de la presencia de los mismos a travs de la recoleccin de muestras y su relacin con los sntomas, y con ayuda experta, la identificacin con exactitud de las especies implicadas. El objetivo de esta gua es proporcionar ayuda para este paso inicial.
Danny Coyne IITA Nematlogo, Uganda. Julie Nicol CIMMYT Int. Nematlogo, Turkey. Biodun Claudius-Cole Nematlogo, Department of Crop Protection and Environmental Biology, University of Ibadan, Nigeria.
Introduccin
Los nematodos son un grupo diverso de animales con apariencia de gusano. Se encuentran virtualmente en todos los ambientes, tanto como parsitos como organismos de vida libre. Generalmente, son de tamao diminuto pero algunas especies pueden alcanzar varios metros de longitud. Esta gua se centra especficamente en los nematodos que parasitan las plantas (fitoparsitos), los cuales son muy pequeos, microscpicos, pueden causar dao significativo a los cultivos y se encuentran ampliamente distribuidos (Apndice 1). Dado que es difcil o imposible observar a simple vista los nematodos en el campo, y a que los sntomas que producen son a menudo inespecficos, el dao que ocasionan frecuentemente se atribuye a otras causas ms evidentes. Los agricultores y los tcnicos a menudo subestiman su efecto. Una apreciacin general es que los nematodos parsitos de plantas reducen la produccin agrcola en aproximadamente un 11% globalmente (Agrios, 2005), reduciendo la produccin en millones de toneladas anualmente. El nivel de dao que causan los nematodos depende de una amplia gama de factores tales como su densidad poblacional, la virulencia de las especies o aislados, y la resistencia (habilidad de la planta de reducir la poblacin del nematodo) o tolerancia (habilidad de la planta de rendir una cosecha a pesar del ataque del nematodo) de la planta husped. Otros factores que tambin contribuyen, aunque en menor medida, son el clima, disponibilidad de agua, condiciones edficas, fertilidad del suelo, y la presencia de otras enfermedades y plagas. Sin embargo, aunque tengamos conocimiento de la relacin nematodo-cultivo y los factores que la influencian, todava queda mucho por aprender. Por ejemplo, en la mayora de los caso se desconoce los umbrales del nematodo que causan dao en diversos cultivos en varias partes del mundo y la amenaza que estos representan para los mismos. Una vez comprobado que los nematodos son los principales responsables del dao observado en un cultivo, se puede decidir cuales sern las opciones de control. Estas dependern de los nematodos implicados, del cultivo, del sistema productivo y de las condiciones locales. Si se ha identificado la especie del nematodo, entonces se puede considerar la realizacin de intervenciones especficas, como por ejemplo la utilizacin de cultivos o variedades resistentes. Si no se ha realizado la identificacin, lo ms apropiado entonces es utilizar otras opciones ms generales o combinacin de acciones, como la rotacin de cultivos, tratamientos qumicos, control biolgico y prcticas sanitarias. El objetivo de esta gua es ayudar al lector en cuanto a: Percepcin de la biologa bsica de los nematodos Reconocimiento de los diferentes grupos y hbitos alimenticios de los nematodos. Identificacin de sntomas de dao Recoleccin de muestras de nematodos Procesamiento de muestras Enviar nematodos y muestras para su identificacin precisa.
Nematologa prctica 2
Cuando se observa zonas con crecimiento menor o pobre / disminucin de la produccin del cultivo Paso 1: Mirar y evaluar sntomas de dao causado por nematodos
Paso 2: Recoger muestras de suelo y de tejidos vegetales
Paso 3: Extraer los nematodos de las muestras
Paso 4: Identificar los nematodos
Paso 5: Determinar las densidades poblacionales de los nematodos
Paso 6: Anlisis del dao causado por el nematodo
Paso 7: Toma de decisin para su manejo
Figura 1. Estadios para la evaluacin y manejo de los nematodos. La Figura 1 muestra los pasos a seguir en la evaluacin y manejo de los nematodos. Esta gua proporciona informacin sobre como llevar a cabo los pasos 1 a 3. Tambin se puede intentar el paso 4 pero probablemente se necesite la ayuda de un nematlogo experto, y ciertamente esta ayuda ser necesaria para los pasos finales. Las secciones sobre Referencias bibliogrficas y Lecturas recomendadas (pgina 65) incluyen publicaciones de utilidad que van ms all de los aspectos nematolgicos recogidos en esta gua.
Biologa general de los nematodos fitoparsitos

Apariencia y estructura
Los nematodos fitoparsitos son vermiformes (forma de gusano) semejantes a hilos con un tamao que oscila entre 0,25 mm a >1,0 mm de longitud, si bien algunos alcanzan hasta 4,0 mm. Aunque el cuerpo de los nematodos suele estrecharse hacia la cabeza y cola, en la mayora de los casos existe una gran variedad de formas y tamaos (Fig. 2). Las hembras de algunas especies pierden su forma de verme conforme maduran, se ensanchan y adoptan forma de pera, limn, rin o esfrica cuando alcanzan el estadio adulto. Como todos los animales, los nematodos tienen sistema circulatorio, respiratorio y digestivo (Fig. 3). Los nematodos fitoparsitos se diferencian de otros nematodos que se alimentan de bacterias y hongos en que tienen una estructura especializada para su alimentacin llamada estilete con forma de lanza (Fig. 3). El nematodo utiliza el estilete para inyectar enzimas dentro de las clulas y tejidos vegetales y extraer su contenido de un modo similar a como lo hacen los pulgones que se alimentan de plantas.
Ciclo de vida
El ciclo de vida de los nematodos se divide tpicamente en seis estadios: el huevo, cuatro estadios juveniles y el adulto (Fig. 4). La duracin de cada uno de estos estadios del ciclo de vida difiere para cada especie y tambin depende de otros factores como la temperatura, la humedad y la planta husped. En condiciones favorables en los trpicos, muchas especies tienen un ciclo de vida corto y completan varias generaciones en una estacin del ao. Esto puede llevar a un incremento rpido de la poblacin a partir de un solo individuo (si se auto-fertilizan) o de dos individuos del nematodo. Los nematodos pueden sobrevivir condiciones desfavorables como una estacin seca o un invierno fro. La supervivencia de las diferentes especies vara segn el estadio del ciclo de vida en que se encuentren; por ejemplo, las especies de Heterodera sobreviven mejor en el estadio de huevos encapsulados dentro de los quistes. Las especies de Ditylenchus lo hacen mejor como cuarto estadio juvenil y las especies de Anguina, como segundo estadio juvenil.
Tipos de nematodos
Los nematodos fitoparsitos se pueden separar en dos grupos: parsitos areos- aquellos que se alimentan de las partea areas de las plantas- y los parsitos de races y tubrculos- aquellos que se alimentan de las partes subterrneas. Tambin se pueden agrupar por su hbito y movilidad en tres grupos principales: Endoparsitos migratorios nematodos mviles que se alimentan dentro del tejido radical. Endoparsitos sedentarios nematodos que, una vez alcanzado el sitio de alimentacin dentro de la planta, cesan de ser mviles y se alimentan desde un sitio fijo. Ectoparsitos nematodos que se alimentan de la planta desde el exterior sin invadir la misma.
Pratylenchus (forma de gusano/ vermiforme) [JB]
Helicotylenchus (forma de gusano vermiforme/espiral) [GG]
Discocriconemella (ligeramente hinchado)
Nacobbus (hinchado/fusiforme) [JB]
Achlysiella (hinchado/fusiforme) [JB]
Tylenchulus (forma de pera) [JB]
Rotylenchulus (forma de rin/ reniforme) [JB]
Heterodera (forma de limn)
Meloidogyne (forma esfrica/de calabaza) [JB]
Scutellonema (forma de gusano vermiforme/forma de C) [GG]
Criconematido (acostillado/ surcado)
Hirschmanniella (vermiforme/ largo) [JB]
Tylenchulus aspecto sobre la superficie de la raz (forma de pera) [EvB] Estructura externa de Ogma (costillas expandidas/flotantes) [EvB] Figura 2. Diversas formas de los nematodos tales como se observan al microscopio. (Fotografas de J. Bridge [JB], G. Goergen [GG] o E. van den Berg [EvB].)
Biologa bsica de los nematodos fitoparsitos 5 estilete esfago ovario vulva
ano
intestino
Estructura tpica de un nematodo fitoparsito (cortesa de R. Esser).
ovario vulva
hembra
macho
espcula del macho con bursa
Macho y hembra de Scutellonema. Figura 3. Diagrama de la estructura de un nematodo tal y como se observa al microscopio (parte superior). Ejemplo de un nematodo macho y una hembra (Scutellonema bradys) tal y como se observan al microscopio con indicacin de los rganos reproductivos del macho (espcula) y de la hembra (vulva y ovario) (parte inferior). Nota: No todas las especies de nematodos tienen machos. Algunas especies muestran una bursa protectora alrededor de la espcula pero esta no se encuentra en todas las especies. (Fotografa de H. Meerman.)
3er estadio juvenil 2 estadio juvenil (infectivo) 1er estadio juvenil (dentro del huevo) 4 estadio juvenil
Raz infectada de maz Huevo
Raz sana de maz Hembra adulta Macho adulto
Masa de huevos Masa de huevos y hembra adulta Figura 4. Ciclo de vida de los nematodos. Ciclo de Meloidognye en maz utilizado a modo de ejemplo segn se observa al microscopio. La fotos de los estadios no estn realizadas a la misma escala. El ciclo de vida de los nematodos migratorios sigue el mismo proceso, pero mantienen su forma de verme durante todo el ciclo y no producen masas de huevos. (Fotografas de E. Oyekanmi.)
Biologa bsica de los nematodos fitoparsitos 7
Endoparsitos migratorios (Fig. 5)

Todos los estadios del ciclo de vida de los nematodos endoparsitos son mviles excepto el huevo. Los nematodos perforan el tejido vegetal desplazndose de clula en clula, o pueden abandonarlo en busca de nuevos sitios de alimentacin. Mientras se alimentan normalmente depositan los huevos dentro del tejido cortical de la planta y tambin en el suelo que rodea la raz. Las clulas daadas liberan toxinas las cuales provocan la muerte de las clulas vecinas dando lugar a pequeas manchas o lesiones de tejido necrtico. Con frecuencia, los hongos que producen podredumbre de las races y las bacterias se encuentran asociados con las infestaciones de los nematodos migratorios y entran en los tejidos de la planta a travs de las zonas daadas por los nematodos.
Scutellonema bradys en yam.

Cilindro cortical
Cilindro central
Hirschmanniella en arroz [JB]. Figura 5. Hembras y huevos de nematodos migratorios endoparsitos teidos de rojo dentro del tejido radical. (Fotografa de J. Bridge [JB].)
Endoparsitos sendentarios (Fig. 6)

Los juveniles de segundo estadio de los nematodos endoparsitos sedentarios recin eclosionados de los huevos son los que normalmente invaden el tejido de la planta constituyen el estadio infectivo. Estos se mueven a travs de las partculas de suelo para localizar las races de la planta husped, y posteriormente, a travs del tejido radical para encontrar un sitio de alimentacin. En el sitio de alimentacin, se desarrolla la hembra y all permanece ubicada durante el resto de su ciclo de vida. Conforme la hembra se desarrolla, su cuerpo se hincha y adopta forma esfrica, de limn, rin, u ovoide. El nematodo se alimenta de un nmero reducido de clulas vegetales y este proceso est regulado por el nematodo mediante sustancias de crecimiento. Algunos grupos (p.e. los nematodos de los quistes y de las agallas) inducen en la planta husped la formacin de las llamadas clulas alimenticias gigantes. Los machos se mantienen vermiformes durante todo el ciclo de vida alimentndose en la superficie de la raz durante unos das, durante este tiempo pueden o no fecundar a las hembras antes de migrar al suelo donde mueren. Las hembras de los nematodos endoparsitos sedentarios generalmente producen una gran cantidad de huevos, que permanecen dentro de su cuerpo (p.e. nematodos de los quistes Heterodera spp.) o se acumulan en masas de huevos (p.e. nematodos de las agallas Meloidogyne spp.) las cuales permanecen unidas a sus cuerpos. Otros nematodos son sedentarios, pero solamente semiendoparsitos como el nematodo reniforme (Rotylenchulus spp.) y el de los ctricos (Tylenchulus semipenetrans), los cuales se encuentran embebidos parcialmente en el tejido radical.
Nematodo de los quistes (Heterodera spp.) rompiendo el tejido cortical de la raz de arroz.
Nematodos agalladores (Meloidogyne spp.) rompiendo y sobresaliendo de la raz de maz.
Nematodo agallador (Meloidogyne spp.) embebido en raz de calabaza con los huevos libres fuera de la raz [JB].
Adulto del nematodo de los quistes de los cereales (Heterodera lipjevi). Figura 6. Nematodos endoparsitos. (Fotografas de J. Bridge [JB].)
Nematodo reniforme (Rotylenchulus spp.) con la parte anterior introducida dentro del tejido radical (semi-endoparsito sedentario) [JB].
Nematodo agallador (Meloidogyne spp.) embebido en las races de batata [JB].
Biologa bsica de los nematodos fitoparsitos 9
Ectoparsitos (Fig. 7)
Los nematodos ectoparsitos se alimentan sobre la superficie de la planta externamente, generalmente lo hacen de los pelos radicales o de los tejidos corticales. Normalmente, se encuentran en grandes densidades poblacionales pero no siempre constituyen un problema. Sin embargo, pueden causar un dao grave cuando la planta est sufriendo otros estreses biticos o abiticos. (p.e. ataques fngicos o poca disponibilidad de agua). Ejemplos de nematodos ectoparsitos son los nematodos de anillo (Criconemoides spp.), los nematodos de espiral (Helicotylenchus spp.) y el nematodo areo que produce la punta blanca del arroz (Aphelenchoides besseyi). Es bien sabido que algunos ectoparsitos actan como vectores transmisores de virus de plantas, por ejemplo algunas especies de los nematodos daga (Xiphinema spp.), nematodos aguja (Longidorus spp.) y especies de nematodos que causan atrofia (Trichodorus y Paratrichodorus spp.).
Aulosphora alimentndose en una raz de arroz y detalle a mayor aumento del estilete penetrando el tejido radical.
Discocriconemella y detalle a mayor aumento de la regin de la cabeza [GG].
Tylenchorhynchus alimentndose en la punta de la raz [JB]. Figura 7. Nematodos ectoparsitos. (Fotografias de G. Goergen [GG] y J. Bridge [JB].)
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Sntomas de dao causados por nematodos

Uno de los mayores retos en la identificacin de los nematodos como los agentes causales de dao a los cultivos es el hecho de que la mayora de ellos no producen sntomas de diagnstico especfico y por tanto fciles de identificar. El dao causado por los nematodos es generalmente inespecfico y se confunde fcilmente con otros sntomas atribuibles a estrses de origen bitico o abitico. Por ejemplo, la clorosis puede deberse a una deficiencia en nitrgeno o puede ser debida a los nematodos; el crecimiento pobre puede deberse a la baja fertilidad del suelo, a estrs hdrico o puede deberse a los nematodos. Por tanto, se recomienda determinar la existencia de nematodos cuando el cultivo est sufriendo prdidas de produccin y mostrando alguno de los sntomas que se describen a continuacin. Informacin adicional sobre el cultivo, el historial del mismo, y las prcticas de manejo, junto con la informacin contenida en esta gua tambin puede indicar que los nematodos estn implicados en el problema observado. Los sntomas de dao causado por los nematodos pueden manifestarse tanto en la parte area como en la subterrnea.
Sntomas areos
Los sntomas en la parte area se clasifican en dos categoras: aquellos causados por nematodos parsitos de la parte area de las plantas que atacan al follaje y aquellos causados por nematodos parsitos de las races que atacan las races de las plantas.
Sntomas areos (Fig. 8)

Estos sntomas son generalmente especficos y estn asociados al nematodo que los ocasiona, y por tanto, pueden tener carcter de diagnstico. Estos incluyen: La formacin de agallas, o hinchamiento anormal de las semillas (p.e. Anguina) o de las hojas (p.e. Cynipanguina) Estras en las hojas, decoloracin de las hojas (especialmente en climas templados) (p.e. Aphelenchoides) Hinchamiento, crecimiento arrugado o desorganizado del tejido (p.e. Ditylenchus) Necrosis interna del tallo puesta de manifiesto por un anillo rojo (Bursaphelenchus cocophilus) Necrosis de las inflorescencias Clorosis/pardeado to de las hojas (agujas de los pinos) y muerte eventual de los rboles (Bursaphelenchus xylophilus).
Sntomas causados por nematodos parsitos de las races (Fig. 9)

Los nematodos parsitos de las races siempre causan crecimiento anormal de la parte area en mayor o menor grado, pero estos sntomas por si solos, generalmente, son insuficientes para diagnosticar un problema causado por nematodos de las races. La mayora de los sntomas reflejan o pueden confundirse con otros problemas como disminucin en la absorcin de agua o alteracin en la absorcin de nutrientes. Estos sntomas incluyen: Clorosis (amarilleo) o coloracin anormal del follaje Crecimiento deprimido en rodales, manchas o parches
Espigas de cebada y trigo deformadas debido al nematodo de las agallas de las semillas Anguina tritici [RS].
Hojas arrugadas o retorcidas de arroz causadas por Ditylenchus angustus [JB].
Enfermedad de la punta blanca del arroz causada Aphelenchoides besseyi [JB].
Sntomas del anillo rojo (Bursaphelenchus cocophilus) en el tronco de cocotero [JB].
Enfermedad de Ufra en arroz causada Decoloracin y rayado de la hoja (Musa) por Ditylenchus angustus [JB]. causado por Aphelenchoides sp. [PS].
Avena gravemente infectada por el nematodo del tallo causando crecimiento en rodales, pobre, clorosis (izquierda) e hinchamiento basal (derecha) asociado con la infeccin por Ditylenchus dipsaci [HW].
Agalla en semilla de trigo causada por Anguina tritici (semilla rota mostrando huevos y juveniles emergiendo desde su interior) [JB].
Figura 8. Sntomas areos causados por nematodos parsitos de la parte area de las plantas que atacan al follaje. (Fotografas de J. Bridge [JB], R. Sikora [RS], P. Speijer [PS] y H. Wallwork [HW].)
Sntomas de dao causado por nematodos 13
Clorosis y crecimiento deprimido en races de arroz (izquierda) causados por Heterodera sacchari.
Rodal de crecimiento pobre y clorosis de las hojas inferiores en trigo causado por Heterodera spp. [HW].
Retraso en la floracin/ maduracin y crecimiento deprimido en un rodal de papas solanun causado por el nematodo de los quistes de la papa [DH].
Follage fino y escaso en parcelas inundadas de arroz causado por Hirschmanniella spp.
Achaparrado/ reduccin de altura en musaceas (plantas de la izquierda) causada por Pratylenchus coffeae.
Distribucin en rodales y porte reducido en trigo atacado por el nematodo lesionador (Pratylenchus neglectus) [RR y RC].
Distribucin en rodales, crecimiento pobre y clorosis en maz debido al nematodo agallador (Meloidogyne spp.) [AM]. Muerte descendente de las ramas de ctricos causada por Radopholus similis. Caida de banano causada por Radopholus similis.
Figura 9. Sntomas en la parte area causados por nematodos parsitos de las races. (Fotografas de R. Cook [RC], D. Heinicke [DH], A. McDonald [AM], R. Rivoal [RR] y H. Wallwork [HW].)
Follaje fino o escaso Sntomas de estrs de agua como marchitez o abarquillado de las hojas Muerte descendente de las ramas de plantas leosas o perennes con poco o muy poco follaje nuevo Reduccin en el tamao de los frutos y semillas Bajo rendimiento del cultivo (poca cosecha). Otros sntomas que pueden sugerir infeccin de las races por nematodos son: Falta de respuesta normal al abonado Tendencia a reaccionar al estrs hdrico ms rpida que las plantas sanas y una recuperacin lenta al marchitamiento Poco o ningn desarrollo de nuevo follaje en el momento de la brotacin al inicio de la nueva estacin del ao Problemas de maleza graves (mayor densidad de maleza), debido a que las plantas infectadas por los nematodos tienen menos capacidad para competir con la maleza. Mayor incidencia de la enfermedad, debido a la supresin de la resistencia en las plantas infectadas por los nematodos.
Sntomas subterrneos
Estos se deben a los nematodos parsitos de las races, y pueden ser lo suficientemente especficos como para permitir el diagnstico del nematodo. Para observar los sntomas es necesario arrancar o desenterrar las races de las plantas. Los sntomas incluyen: Agallado Races escasas, ms cortas, engrosadas Lesiones en las races Necrosis en las races o tubrculos, podredumbre o muerte Agrietado de las races o tubrculos Quistes o raz perlada Races deformadas Alteracin de la arquitectura de la raz.
Agallas en las races

Las agallas en las races estn causadas principalmente por el nematodo agallador (Meloidogyne spp.), aunque otros nematodos como Nacobbus aberrans tambin puede cuasar agallado en las races (Fig. 10). Algunos nematodos, como Xiphinema spp., al alimentarse de las races pueden dar lugar a hinchamientos o agallas menos definidas que se localizan en las puntas de las races. Las agallas pueden variar considerablemente dependiendo de las especies de Meloidogyne, el cultivo y cultivar, y si estas tienen lugar en las races o en los tubrculos (Fig. 11). La apariencia tpica de las agallas es la siguiente: Hinchamientos pequeos de forma redondeada Abultamientos masivos de tejido indiferenciado que confluyen entre s. Puntas de la raz hinchadas Abultamientos irregulares a lo largo de la raz Puntas de raz curvadas en forma de gancho No se aprecia ningn hinchamiento de forma definida, solamente la superficie levantada en donde se encuentra el nematodo embebido.
Ndulos en races de mandioca causadas por Meloidogyne spp.
Meloidogyne graminicola en races de arroz causando atrofiamiento y agallas en races de las plntulas [RP] y puntas de races tpicamente curvadas [JB].
Agrupamiento masivo de tejido radical agallado en hrticolas causas por Meloidogyne spp.
Hinchazon de la punta de la raz en maz causada por Meloidogyne spp.
Agallado leoso y masivo en las races de un rbol causado por Meloidogyne spp.
Figura 10 contina a la vuelta de la pgina
Sistema radical de banano deformado con races hinchadas (izquierda) y seccin longitudinal de la raz de un banano con la superficie levantada y hembras de Meloidogyne spp. embebidas en la misma (resaltadas en la raz partida derecha).
Agallas en forma de cuentas de rosario en lechuga causadas por Meloidogyne spp.
Deformaciones y numerosas agallas y supresin del crecimiento de las races en maz causadas por Meloidogyne spp.
Races agalladas de papa causadas por Nacobbus aberrans [JB]. Figura 10. Races agalladas y otros sntomas causados por el nematodo agallador (Meloidogyne spp.) y Nacobbus sp. (Fotografas de J. Bridge [JB] y R. Plowright [RP].)
Una idea comnmente generalizada, pero errnea, es que los nematodos agalladores no atacan a las plantas de la familia de las Gramneas (pasto y cereales). En realidad, estas especies son fcilmente atacadas por estos nematodos pero el agallado es generalmente menos visible. Sin embargo, normalmente se pueden observar agallas pequeas (Fig. 10).
Agallas en tubrculos de yam (Dioscorea spp.).
Corte transversal de un tubrculo de yam mostrando la superficie elevada y dentada y las hembras del nematodo embebidas en el tejido.
Agallas en papa.
Agallas en remolacha.
Agallas en races de mandioca.
Agallas en zanahoria.
Figura 11. Agallas en organos de almacenamiento causados por el nematodo agallador (Meloidogyne spp.).
Agallas en las races versus ndulos (Fig. 12)

Las bacterias beneficiosas fijadoras de nitrgeno del gnero Rhizobium producen abultamientos en las races llamados ndulos y normalmente se observan en las races de las leguminosas. Los ndulos se distinguen de las agallas por su contenido y por la forma en que se encuentran unidos a las races. Los ndulos jvenes y activos tienen en su interior un lquido lechoso de color rosado a pardo, mientras que las agallas suelen ser de naturaleza slida y aspecto gelatinoso claro cremoso pero en ocasiones
Agallas producidas por el nematodo agallador en mandioca y lechuga (las dos fotos de la izquierda) comparadas con los ndulos producidos por organismos beneficiosos fijadores de nitrgeno (grupo de la derecha) en soja, frjol y cacahuete.
Races de col con sntomas similares a las agallas pero causados por Plasmodiophora brassicae. Figura 12. Agallas en las races causadas por nematodos comparadas con otros sntomas semejantes al agallado.
duro. Los ndulos estn unidos a la raz pero se pueden separar con facilidad de la misma; las agallas producidas por el nematodo agallador se originan desde el interior de la raz y resulta ms difcil separarlas de las races sin desgarrar el tejido cortical de la raz. Algunas enfermedades de las races como las races en forma de maza causada por el hongo Plasmodiophora brassicae pueden dar lugar a deformaciones en el sistema radical que recuerdan el dao causado por el nematodo agallador (Fig. 12).
Sistemas radicales reducidos

La actividad del nematodo puede causar un acortamiento de las races de forma tal que la masa radical queda reducida considerablemente o tiene un aspecto achaparrado (Fig. 13).
Races de arroz achaparradas y agalladas causadas por Meloidogyne graminicola [RP].
Sistema radical de olivo joven severamente atrofiado como resultado de la infeccin por nematodos lesionadores (Pratylenchus spp.).
Races de maz engrosadas causadas por Paratrichodorus minor [DD]. Figura 13. Acortamiento de races. (Fotografas de D. Dickson [DD] y R. Plowright [RP].)
Lesiones en las races y tubrculos

Las races y tubrculos pueden mostrar reas de tejido muerto (necrosis) como consecuencia de la actividad del nematodo (Fig. 14 y 15). Conforme el nematodo se alimenta y emigra dentro de las races, destruye clulas de la planta y tambin interrumpe las funciones celulares normales causando la muerte del tejido.
Sntomas del nematodo lesionador (Pratylenchus thornei) en races de trigo. Races de maz infectadas por nematodos lesionadores Pratylenchus (derecha) en comparacin con races no infectadas (izquierda). Races de banano mostrando extensas lesiones (necrosis) causadas por Radopholus similis.
Races de fresa con grandes lesiones causadas por el nematodo lesionador (Pratylenchus vulnus) [JB].
Figura 14. Sntomas de lesiones en races. (Fotografas de J. Bridge [JB].)
Lesiones internas y necrosis visibles bajo la superficie de yam (Dioscorea) debidas al nematodo del yam (Scutellonema bradys).
Lesiones en batata causadas por Scutellonema bradys.
Lesiones internas en batata debidas al nematodo agallador (Meloidogyne incognita) [JB].
Lesiones en batata causadas por Paratrichodorus (tubrculo del centro) [MM].
Dao causado por Ditylenchus destructor en papa [FERA].
Dao causado por Ditylenchus destructor en el tejido interno de papa [FERA].
Figura 15. Necrosis y lesiones en rganos de almacenamiento. (Fotografas de J. Bridge [JB], Food and Environment Research Agency [FERA] y M. Marais [MM].)
Podredumbre de la raz y de los tubrculos

Los nematodos por s mismos pueden causar la podredumbre de las races y tubrculos debido a la perforacin extensa del tejido vegetal dando lugar a necrosis substanciales y muerte del tejido y de la raz (Fig. 16 y 17). El nematodo barrenador del banano Radopholus similis, los nematodos lesionadores Pratylenchus spp., el nematodo del yam Scutellonema bradys, y Hirschmanniella miticausa en taro son ejemplos de ello. Frecuentemente, tambin se desarrollan infecciones bacterianas y fngicas que contribuyen a la podredumbre (Fig. 17).
Podredumbre, agrietado superficial (izquierda) y y supresin (derecha) de las races de banano causada por una combinacin de Radopholus similis, Helicotylenchus multicinctus y Meloidogyne spp.
Necrosis y reduccin de las races de batata debidas a Scutellonema bradys. Figura 16. Podredumbre de races causadas por infeccin de nematodos.
Necrosis subsuperficial en races tuberosas de mandioca infectadas por el nematodo agallador (Meloidogyne spp.), comparadas con races no infectadas a la izquierda.
Podredumbre de tubrculo de batata infectado por el nematodo agallador (Meloidogyne spp.) [JB].
Podredumbre interna en tubrculo de yam (Dioscorea) causada por una infeccin fngica que probablemente hayan entrado como resultado del dao causado por Scutellonema bradys en el tejido cortical.
Enfermedad del miti miti en taro/cocoyams causadas por Hirschmanniella miticausa [JB].
Podredumbre seca de yams (Dioscorea) causada por el nematodo del yam (Scutellonema bradys). Figura 17. Podredumbre de tubrculos causada por infeccin por nematodos. (Fotografas de J. Bridge [JB].)
Agrietado
Las races y tubrculos a veces desarrollan una superficie agrietada subsiguiente a la infeccin por el nematodo (Fig. 18). Este sntoma puede atribuirse a estrs de agua o nutricional durante el crecimiento. El agrietado se observa a menudo en tubrculos de batata causado por el nematodo reniforme (Rotylenchulus reniformis). Scutellonema bradys puede causar el mismo sntoma en yam (Dioscorea).
Escamas y agrietado (izquierda) de la superficie en tubrculos de yam (Dioscorea) causado por Scutellonema bradys.
Agrietado de la superficie de un tubrculo de papa causado por Scutellonema bradys. Agrietado de tubrculos de batata causados por Rotylenchulus spp. Figure 18. Sntomas de agrietado de tubrculos.
Quistes o raz perlada (Fig. 19)

Los nematodos de los quistes (p.e. Heterodera y Globodera spp.) se pueden observar en la superficie de las races de las plantas husped sin necesidad de aumento si se golpea la raz suavemente para eliminar el suelo adherido a las mismas, o bien, si el observador mira con atencin. Las hembras jvenes se ven como diminutas cuentas o bolitas blancas dando una apariencia perlada a la riz cuando hay muchas hembras. Conforme las hembras maduran, el quiste, que puede contener cientos de huevos, se endurece y se vuelve marrn o negro.
Quiste marrn oscuro y hembra blanca de Heterodera oryzicola embebida en el tejido radical de arroz [RP].
Hembras blancas
Hembras blancas del nematodo de los quistes de los cereales, Heterodera avenae, del tamao de la cabeza de un alfiler, causando ndulos en races de trigo (izquierda) antes de que las hembras maduren y formen el quiste marrn, mostrado a la derecha con los huevos fuera del mismo [HW].
Races de papa con hembras blancas de Globodera rostochiensis pegadas a lo largo de la superficie de la raz dndole la apariencia de cuentas blancas pegadas o aspecto perlado [JB]. Figura 19. Quistes o races perladas. (Fotografas de J. Bridge [JB], R. Plowright [RP] y H. Wallwork [HW].)
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Muestreo
Una vez se haya observado sntomas que indican una posible o probable infestacin con nematodos, el paso siguiente es tomar muestras de las plantas afectadas y del suelo alrededor de las races de las mismas. Posteriormente, stas se llevan a analizar al laboratorio para determinar que nematodos se encuentran presentes, y si es posible, determinar tambin sus densidades poblacionales. Las caractersticas del suelo que se relacionan a continuacin tienen implicaciones en la forma de realizar el muestreo y por tanto se deben tener en cuenta: La distribucin en agregados de los nematodos debido al sistema radical de la planta husped y el comportamiento estacional del nematodo. Tipo de cultivo e historial del mismo reas plantadas con diferentes variedades Humedad del suelo Compactacin del suelo Tipo de suelo Temperatura y cambios estacinales.
Herramientas para el muestreo

En la Fig. 20 se muestran una serie de herramientas tiles para el muestreo, entre ellas, pala, azada, pala de mano, destornillador, barreno, cuchillos (para cortar races), tijeras, bolsas de plstico de polietileno, etiquetas. El barreno debe tener una caa de 2030 cm de longitud y 2025 mm de dimetro, puede ser completamente cilndrico o semi-cilndrico. Los barrenos semi-cilndricos facilitan el sacar del barreno la muestra de suelo recogida. Tambin se necesita rotuladores para etiquetar las bolsas de las muestras, lpiz y cuaderno para anotar los datos.
Figura 20. Surtido de herramientas para tomar muestras de nematodos.
Nmero de muestras
Tomar un nmero suficiente de muestras para asegurarse de que son representativas de la situacin del campo. Cuanto mayor sea el nmero de sub-muestras /barrenos combinadas por cada muestra que se tome en un campo, mayor exactitud tendr la evaluacin. Sin embargo, es preciso alcanzar un equilibrio entre el tiempo necesario para tomar las muestras y los medios disponibles.
El procedimiento de muestreo y el nmero de muestras tomadas debe tener en cuenta la variacin o agregacin del nematodo. De un rea de 0,5 hectreas, tomar un mnimo de 10 sub-muestras y como mximo de 50. Combinar las sub-muestras para conseguir una muestra compuesta que represente el rea del campo muestreada. Al combinar las muestras de esta forma se facilita su conservacin ya que se mantiene la temperatura y humedad de las mismas.
Diseo del muestreo

Los nematodos raramente estn distribuidos de forma uniforme en el campo, y por tanto las muestras deben tomarse de varias zonas del campo. Recoger muestras por separado de zonas con crecimiento pobre y de zonas con crecimiento relativamente bueno donde estas diferencias sean obvias para poder compararlas. Seguir siempre el mismo procedimiento y modelo en la recogida de muestras durante los muestreos y experimentos para que las comparaciones entre campos, parcela, tratamientos, etc. tengan significado. El procedimiento de muestreo puedes ser al azar o sistemtico (Fig. 21). El muestreo al azar no se adecua a la distribucin natural del nematodo en manchas o parches y solo es representativo si el rea de muestreo es pequea. El muestreo sistemtico representa un modo ms estructurado de tomar muestras ya que considera la naturaleza del campo y la distribucin del nematodo.
Fig. 20. Examples of sampling patterns
A a
B b
C c
Figura 21. Patrones de muestreo para nematodos. (a) Muestreo al azar; (bd) muestreo sistemtico.
Epoca de muestreo
La poca o momento ptimo de muestreo vara dependiendo del cultivo ya que est relacionada con la fase de crecimiento del cultivo y el objetivo del muestreo (predictivo o diagnstico). El muestreo predictivo (que no es el objeto de esta gua) se realiza al principio de la estacin, antes de plantar o justo en el momento de plantar, o bien, al finalizar el cultivo precedente para determinar el nmero de nematodos (densidad poblacional). Muchas especies de nematodos incrementan sus densidades poblacionales hasta alcanzar niveles altos durante la campaa del cultivo y stas densidades poblacionales se reducen durante los periodos entre cultivos (estacin seca); esto es ms fcil de observar en plantas anuales que en perennes o en los cultivos arbreos. Por tanto, las muestras debern tomarse idealmente a mitad de la campaa y/o al finalizar la cosecha con fines de diagnstico. Los cultivos perennes se pueden muestrear durante el periodo de crecimiento activo de la planta o rbol, es decir, durante la estacin lluviosa/crecimiento para identificar el problema.
Muestreo 27
Recoleccin de muestras de suelo

Como regla general, evitar muestrear el suelo cuando est muy hmedo o muy seco. Sin embargo, cuando los cultivos crecen normalmente, por ejemplo, en terrenos inundados (p.e. arroz) o condiciones ridas (p.e. sisal), stos deben muestrearse en estas condiciones para que las muestras sean representativas de las condiciones habituales de cultivo. Dividir los campos mayores de 1 hectrea en parcelas de 1 hectrea (10 000 m2 ) y muestrear estas parcelas por separado. Tomar de 10 a 50 sub-muestras (barrenos) y combinarlas para hacer una muestra compuesta que pese 12 kg. Tomar la sub-muestra de suelo de la zona de las races con una pala, azada, barreno o herramienta similar que sea adecuada para el cultivo que se est muestreando. Colocarla la muestra compuesta con cuidado en una bolsa, etiquetarla y cerrar las bolsas con las muestras (Fig. 22).
Asegurarse de tomar muestras entre las hileras, en los surcos de siembra.
Una vez llenado el barreno, sacarlo con cuidado del suelo.
La muestra debe representar una seccin transversal del suelo desde la superficie (0 cm) hasta aproximadamente unos 2030 cm de profundidad.
En caso de no disponer de un barreno, las muestras tambin se pueden tomar con una pala u otra herramienta similar.
Colocar el barreno sobre un recipiente grande, plano y de material resistente, preferentemente plstico.
Sacar todo el contenido del barreno sobre el recipiente con la ayuda de un instrumento resistente y sin punta. Asegurarse de que se ha eliminado bien todo el suelo del barreno antes de tomar otra muestra.
Colocar las muestras en bolsas de plstico resistentes que puedan cerrarse. Etiquetar claramente con una etiqueta y escribir con lpiz (no utilizar bolgrafo porque se emborrona y hace ilegible la escritura).
O incluso ms fcil, etiquetar la bolsa por fuera con un rotulador impermeable al agua.
Figura 22. Recoleccin y embolsado de las muestras.
Recoleccin de muestras de races

Las races se pueden recolectar al mismo tiempo y de los mismos puntos que las muestras de suelo, y en general, se deben guardar en la misma bolsa que el suelo, ya que de esta forma, el suelo ayuda a conservar las races evitando su desecacin. Generalmente, aunque depende del cultivo, 25100 g de races por muestra compuesta son suficientes, pero se puede recolectar menor cantidad cuando las races son finas como en el caso del arroz, y mayor cantidad cuando las races son grandes y gruesas como en el caso del banano o cuando se trata de rboles. Cuando existen al mismo tiempo, races finas y gruesas, como en el banano, se aconseja recolectarlas por separado. Evitar tomar muestras de plantas muertas o aquellas que estn en avanzado estado de senescencia, ya que los nematodos habrn emigrado de estas plantas a otras fuentes de alimento. En el caso de cultivos con escaso porte, todo el sistema radical de una planta puede constituir una sub-muestra. Arrancar la planta del suelo con sus races con la ayuda de una pala o azada de forma que al levantar las races una porcin considerable del sistema radical permanezca intacto y teniendo cuidado de no romperlas, depositarlas en la tierra. Despus de sacudir el suelo de las races, tomar al azar sub-muestras de las races con un cuchillo o tijeras.
Recoleccin de muestras de tejido vegetal areo

Se deben recolectar hojas, tallos, semillas, u otras partes del vegetal que presenten sntomas y de donde se sospeche que existan nematodos. De nuevo, es importante seleccionar las muestras de un nmero de plantas afectadas, las cuales deben compararse con porciones de tejido vegetal no afectado de diferentes plantas.
Cuidado de las muestras

Recolectar las muestras en bolsas de plstico resistentes, y etiquetarlas de forma clara y sistemticamente. Las etiquetas de plstico marcadas con rotulador impermeable al agua o con un lpiz de grafito se puede colocar dentro de la mima bolsa de plstico (Fig. 22), o alternativamente, escribir directamente sobre la bolsa de plstico con un rotulador impermeable al agua el nmero de la muestra y su referencia. Las etiquetas de papel es mejor sujetarlas por fuera de la bolsa con un alambre o brida. Si se utilizan etiquetas de papel, escribir con lpiz y no con bolgrafo porque ste se borra cuando se humedece la etiqueta. Pero siempre tener presente que las etiquetas de papel se deterioran rpidamente con la humedad. Anotar siempre que sea posible: El cultivo y el cultivar o variedad La fecha de muestreo El nombre del agricultor La localidad (y coordenadas GPS si es posible) Un nmero de referencia (o parcela) si se trata de una parcela experimental El cultivo(s) precedente.
Muestreo 29
Los nematodos son muy sensibles y perecederos, y por tanto, es muy importante que se tomen las medidas adecuadas para mantener las muestras recolectadas en buenas condiciones. Las muestras NO deben dejarse nunca expuestas a la luz solar ni dentro de un vehculo cerrado estacionado al sol. Tampoco debe transcurrir mucho tiempo desde su recoleccin hasta su procesamiento. Las muestras, una vez recogidas, se deben colocar en una bolsa o arcn nevera (contenedor hecho con material aislante; Fig. 23), o empaquetarlas en cajas de cartn de paredes gruesas y colocarlas en zonas sombreadas donde las condiciones sean ms frescas. Cuando no es posible procesar las muestras inmediatamente, stas se pueden almacenar en un refrigerador (aproximadamente 10C) durante dos semanas como mximo. Sin embargo, hay que tener en cuenta que la supervivencia del nematodo decrece con el tiempo y que los nematodos procedentes de ambientes calurosos pueden sufrir dao al refrigerarlos.
Figura 23. Bolsa/arcn nevera para el almacenamiento de las muestras.
31
Extraccin de nematodos
El paso siguiente en el proceso es extraer los nematodos de las muestras. Las extracciones deben realizarse tan pronto como sea posible despus de haber recolectado las muestras dado que stas se deterioran con el paso del tiempo. Existen cuatro tcnicas bsicas de extraccin las cuales se describen en esta gua: Bandejas de extraccin Maceracin de las races y hojas Tamizado Incubacin. Otros tres mtodos - elutriador, el embudo de Fenwick y la centrifugacin flotacin requieren un equipamiento especial y no se describen en esta gua. Sin embargo, se puede obtener informacin sobre estos mtodos consultando las referencias bibliogrficas incluidas en la seccin de Referencias y Lecturas recomendadas (pgina 65). En algunos casos tambin es posible examinar directamente los nematodos en el tejido vegetal.
Seleccin del mtodo de extraccin

La seleccin del mtodo a utilizar depende de las condiciones y materiales disponibles, el tipo de muestra, y tambin de los tipos de nematodos presentes en la misma. Algunos mtodos de extraccin son ms tiles para un tipo especial de nematodos mientras que otros son ms generales. Esta gua describe en detalle los mtodos ms sencillos incluyendo el de las bandejas de extraccin que es til en la mayora de las condiciones y proporciona una evaluacin razonable de los nematodos en suelo, races, semillas o tejido vegetal y se puede replicar fcilmente. La Tabla 1 muestra el mtodo de extraccin ms adecuado para cada tipo de nematodo (sedentario/ migratorio) en muestras de suelo, races o foliares.
Tabla 1. Mtodo de extraccin de eleccin para diferentes tipos de nematodos y muestras. Muestra de suelo Nematodos sedentarios Bandeja de extraccin (p. 34) Tamizado (p. 42) Maceracin de races/hojas (p. 40) Incubacin (p. 48) X Nematodos migratorios X X X X X X Muestra de races o foliar Nematodos sedentarios Nematodos migratorios X
Si se conoce el nematodo diana como en el caso de parcelas experimentales entonces se podr identificar con exactitud el tipo de material que habr que muestrear y procesar en ese caso (suelo, raz, tubrculo, hoja, etc.). Pero si no se est seguro, entonces se realizarn extracciones de suelo y races para tener en cuenta tanto los nematodos sedentarios como los migradores.
Preparacin de las muestras

Las muestras de suelo hmedo (capacidad de campo) se deben mezclar muy bien antes de tomar submuestras para la extraccin de los nematodos. Romper los terrones o grumos de suelo y eliminar las piedras, races y restos vegetales. Pasar el suelo hmedo por un tamiz con malla gruesa con orificios entre 12 mm (Fig. 26, paso 1) que se colocar sobre un recipiente adecuado y mezclar muy bien. Tomar una sub-muestra de la mezcla con un vaso o recipiente de volumen conocido (Fig. 26, paso 2); normalmente se utiliza 100 ml de suelo. De cada muestra compuesta de suelo tomada en el campo se deben procesar dos sub-muestras de 100 ml y despus realizar la media de los resultados obtenidos. En el caso de suelo mojado, como el procedente de parcelas inundadas de arroz, es preciso tomar pequeas bolitas o grumos de varias partes de la muestra de campo o de la base de las races y medir la sub-muestra a procesar mediante el desplazamiento del agua para obtener muestras del mismo tamao (Fig. 29, pasos 1 y 2). Llenar un vaso hasta un volumen determinado marcado previamente (p.e. 200 ml) y aadir los grumos de suelo para aumentar el volumen hasta la cantidad requerida, por ejemplo, un aumento de volumen de 200 a 300 ml es equivalente a una medida de 100 ml de suelo. Posteriormente, utilizar el mtodo de tamizado para extraer los nematodos. Separar las races del suelo y eliminar cualquier suelo adherido a las mismas golpendolas suavemente o enjuagndolas con cuidado bajo el grifo o en un recipiente con agua. Eliminar el exceso de agua de las races colocndolas sobre papel absorbente, trocearlas con unas tijeras y extraer los nematodos de acuerdo con el mtodo de extraccin seleccionado.
Etiquetado
Es importante realizar un etiquetado de las muestras que sea claro, correcto y consistente (Fig. 24). Etiquetar los recipientes con un rotulador impermeable al agua o con lpiz graso, o bien, utilizar etiquetas que se puedan quitar y trasladar a lo largo de las diferentes etapas del proceso de extraccin. Asegurarse de que todas las muestras estn correctamente etiquetadas en todo momento.
Extraccin de nematodos 33
Etiquetar las muestras con una etiqueta de papel y escribir con lpiz.
Etiquetar la bolsa de la muestra con un rotulador negro impermeable al agua.
Etiquetar la bandeja de extraccin con una etiqueta de plstico y tambin etiquetar la bandeja con un rotulador permanete impermeable al agua o un lpiz graso.
Etiquetar el vaso con un rotulador permanete impermeable al agua o un lpiz graso.
Lpiz graso impermeable al agua.
Figura 24. Materiales para etiquetar y ejemplos de etiquetado.
Mtodo de las bandejas de extraccin

Este mtodo (y sus variantes) tambin es conocido como la tcnica de Baermann modificada, el mtodo del cuenco o el mtodo de la bandeja de Whitehead. Ventajas: No se necesita equipo especial Es fcil de adaptar a circunstancias bsicas utilizando el material disponible localmente Extrae una amplia variedad de nematodos mviles Es una tcnica simple. Desventajas: Los nematodos de gran tamao y aquellos que tienen movimiento lento no se extraen bien. Las extracciones a veces pueden estar bastante sucias (especialmente si el contenido en arcilla del suelo es alto) lo cual dificulta el recuento de los nematodos. La proporcin de nematodos que se extraen puede variar dependiendo de la temperatura ambiente dando lugar a posibles variaciones en los resultados entre las muestras extradas en diferentes momentos o pocas del ao. Se tarda 3 o 4 das en conseguir la mxima recuperacin de los nematodos.
Equipo
Una cesta (o cedazo domstico) hecho con malla gruesa (Fig. 25) Un plato/bandeja/cuenco, ligeramente ms grande que el cedazo Papel absorbente (papel de secar las manos, cocina, servilletas de papel) Vasos o recipientes para recoger la extraccin Frascos lavadores Rotulador impermeable al agua Cuchillos/tijeras Balanza para pesar Mesa de trabajo o poyata de laboratorio amplia.
La mayora de los utensilios necesarios se pueden comprar en el mercado o fabricar con materiales que se consiguen con facilidad (Fig. 25). Los embudos se pueden sujetar en una gradilla o un soporte con tubos de goma insertados en el vstago y cerrados en la base inferior con una pinza (Fig. 25, arriba). Para construir el tamiz se puede utilizar una malla anti-insectos sujeta a una seccin de tubera de plstico de unos 10 cm a 15 cm de dimetro aproximadamente (Fig. 25, centro). Es muy importante que la malla y la base del tamiz estn ligeramente elevadas (~2 mm) respecto a la base de la bandeja/ plato. Para ello, se puede utilizar por ejemplo, tres o cuatro patas pequeas hechas de la misma tubera que se pegarn con pegamento a la base del tamiz (Fig. 25, abajo). Este espacio es necesario para que los nematodos puedan pasar con facilidad al agua. En caso contrario, los nematodos no migrarn al agua.
Mtodo
Es muy importante asegurarse de que durante todo el proceso, todos los recipientes utilizados para cada muestra estn etiquetados de forma correcta y consistente durante todo el proceso ya que es muy fcil cometer equivocaciones. Las extracciones de suelo y races se deben etiquetar por separado.
Ejemplo del mtodo de extraccin del embudo con el tubo de goma sujeto con una pinza y etiquetado en la base. Los nematodos se concentrarn en el tubo de goma justo por encima de la pinza.
Ejemplo de diferentes tipos de tamices o cedazos y bandeja sencillos. El ejemplo de la bandeja naranja a la izquierda se ha hecho utilizando una seccin transversal de tubera de PVC y una malla anti-mosquito sujeta al fondo con pegamento para cosntruir el tamiz. Es muy importante que el tamiz no descanse directamente sobre el fondo de la bandeja sino que debe quedar un pequeo espacio que lo levante del fondo.
Tamiz hecho con tubera de PVC y malla con patas de plstico para levantarlo del fondo y asegurarse que el nematodo puede migrar facilmente al agua. Figura 25. Diferentes maneras de extraer nematodos de una muestra.
Para muestras de suelo: Separar las races de las muestras y colocarlas aparte en otro plato. Etiquetar. Utilizar un tamiz de malla gruesa para eliminar las piedras y residuos vegetales del suelo y deshacer los grumos o terrones de suelo (Fig. 26, paso 1). En un recipiente de plstico (palangana, cubo) mezclar muy bien la muestra de suelo. Tomar una medida de suelo (p.e. 100 ml) (Fig. 26, paso 2). Colocar papel absorbente (papel de secar las manos, servilletas de papel, etc.) sobre un tamiz/cedazo de plstico (colocado sobre un plato de plstico) y asegurarse de que toda la base del tamiz quede completamente cubierta por el papel (Fig. 26, paso 3). Etiquetar. Poner la medida de suelo sobre el papel colocado sobre el tamiz. Es importante que el suelo quede sobre el papel las salpicaduras de suelo da lugar a extracciones sucias difciles de contar (Fig. 26, paso 4). Aadir agua a las bandejas de extraccin (Fig. 26, paso 5) despacio y con cuidado (entre el borde de la malla y el lateral de la bandeja) y no al papel o suelo. Aadir un volumen determinado de agua a cada bandeja para humedecer el suelo o las races pero sin cubrirlo asegurndose de que hay suficiente agua como para que no se seque la muestra. Las muestras de suelo requieran mayor cantidad de agua que las de races. Posteriormente, aadir ms agua si fuera necesario. Dejar las bandejas de extraccin en reposo (preferentemente en la oscuridad) por un periodo de tiempo determinado (48 horas si es posible) (Fig. 26, paso 6) y reponer el agua de las bandejas si hay posibilidad de que se sequen. Los nematodos en el suelo o en el tejido vegetal se movern a travs del suelo o tejido vegetal y pasarn al agua colocada en la bandeja/placa y all se quedarn. Despus del periodo de extraccin, levantar el tamiz que contiene el suelo y dejar que el agua escurra sobre la bandeja de extraccin (Fig. 26, paso 7). Poner el tamiz aparte y tirar el tejido vegetal/suelo a la basura. Verter el agua de la bandeja/plato en un vaso previamente etiquetado con la ayuda de un frasco lavador para lavar la bandeja o plato. (Fig. 26, pasos 8 y 9). Dejar que las muestras sedimenten (Fig. 26, paso 10). Para contar los nematodos extrados, concentrar el volumen de la suspensin vertiendo el agua cuidadosamente o sifonar el exceso de agua (teniendo cuidado de no perder los nematodos depositados en el sedimento), o bien, pasar la extraccin por un tamiz con luz de malla muy pequea (p.e. 2030 m) (Fig. 26, paso 11). Lavar los nematodos retenidos en este tamiz y recogerlos en un vaso (o tubo) para su recuento o conservacin si se van a enviar fuera o contar ms tarde (Fig. 26, pasos 12 y 13).
2. Medir una submustra de suelo estandarizada en volumen, p.e. 100 ml. 1. Tamizar la muestra por un tamiz grueso para eliminar restos vegetales y grumos.
3. Cubrir el cedazo con papel absorbente y colocar sobre un plato o bandeja de plstico.
Figura 26 continua en la pgina siguiente
4. Colocar el suelo sobre el papel procurando que este quede depositado sobre el papel y no caiga ningn suelo sobre o fuera de los bordes.
5. Aadir con cuidado el agua a la bandeja y asegurandose que se vierte en el hueco entre la bandeja y el tamiz.
6. Dejar reposar las extracciones de las muestras durante 2 das, revisando peridicamnete el nivel de agua para asegurarse que las muestras permanecen hmedas y que no se secan debido a la evaporacin. Si ello sucediera, aadir ms agua a la bandeja hasta completar el nivel incial.
7. Levantar el tamiz de la bandeja con cuidado, dejar que escurra el agua y tirar el papel y el suelo a la basura.
8. Verter el agua que contiene los nematodos sobre un vaso previamente etiquetado.
9. Lavar muy bien la bandeja sobre el mismo vaso con la ayuda de un frasco lavador.
10. Dejar que sedimenten los nematodos en las muestras durante unas horas o toda la noche.
11. Reducir el volumen de la suspension mediante decantacin, o bien, pasndola a travs de un tamiz de luz de malla pequea (p.e. 28 m) y recoger la suspensin retenida en el tamiz en un vaso para determinar los nematodos.
12. La muestra se puede guardar en un tubo si no se va a observar inmediatamente.
13. Si la muestra se va a envar fuera para su evaluacin, los nematodos se pueden recolectar, una vez hayan sedimentado, del fondo del tubo con una pipeta y depositarlos en un tubo o vial ms pequeo para su almacenaje o envo.
Figura 26. Mtodo de las bandejas para extraer nematodos de muestras de suelo.
Para muestras de races: En ocasiones, las races se pueden separar en diferentes categoras, como por ejemplo trozos de races gruesas y duras y races alimenticias finas. Es til extraer por separado los nematodos de cada categora de races dado que la textura del tejido radical y el tipo de nematodos que las invade puede variar, al igual que las densidades del nematodo en una y otra categora. La eficiencia de la extraccin tambin puede variar puesto que los nematodos que salen de las races ms gruesas tardarn ms tiempo en hacerlo. Golpear suavemente las races/tubrculos para eliminar el suelo adherido a las mismas o enjuagarlas bajo el grifo de agua y despus eliminar el exceso de agua colocndolas sobre papel absorbente. Pelar con cuidado los tubrculos con un cuchillo o pelador de cocina quitando la piel o cscara superficial. Cortar las races (o las cscaras de los tubrculos) en trozos muy pequeos con la ayuda de un cuchillo o tijeras y colocarlas en un cuenco o plato previamente etiquetado (Fig. 27, paso 1). Mezclar muy bien todo el material cortado. Tomar y pesar una sub-muestra (p. e. 5 g) del material cortado en una balanza. (Fig. 27, paso 2). Colocar la sub-muestra de races pesada sobre un papel absorbente colocado sobre el tamiz situado sobre la bandeja previamente etiquetada (Fig. 27, paso 3). Continuar el procedimiento siguiendo los pasos indicados para la extraccin de nematodos del suelo detallado anteriormente (Fig. 26, pasos 513). Alternativamente, utilizar el mtodo de maceracin de las races para las races ms gruesas (Fig. 28, pginas 4041), y luego completar el procedimiento siguiendo los pasos descritos para las bandejas de extraccin (Fig. 26, pasos 513). Si los nematodos se van a enviar fuera para su identificacin o recuento, stos deben conservarse de acuerdo con el protocolo descrito en las pginas 5760.
1. Cortar las races o cscaras de los tubrculos y colocarlas en un plato o cuenco previamente etiquetado.
2. Pesar una sub-muestra de races.
3. Colocar la sub-muestra de races en tamices para su extraccin. A continuacin seguir los pasos 513 descritos en la Figura 26. Figura 27. Mtodo de las bandejas para extraer nematodos de muestras de races.
Mtodo de maceracin de las races

Conocido tambin como el mtodo de maceracin de las races seguido de incubacin y extraccin en bandeja. Ventaja: No se necesita equipo especial. Desventaja: El tiempo empleado en la maceracin es crtico debe ser el suficiente para permitir que el nematodo pueda salir fcilmente del tejido de la planta, pero a su vez, debe evitarse que el nematodo sufra dao por una maceracin excesiva.
Equipo
Vasos Tijeras/cuchillos Frasco lavador Rotulador impermeable al agua Balanza para pesar Batidora domestica
Mtodo
Cortar las races y las cscaras de los tubrculos (en su caso) en trozos pequeos (Fig. 28, pasos 1 y 2) y mezclarlos. Pesar una sub-muestra (Fig. 28, paso 3). Ponerla en la batidora y aadir agua en cantidad suficiente para cubrir justamente las cuchillas de la batidora. Macerar las sub-muestras de races y cscaras finas durante intervalos de 5 segundos, o bien, de 10 segundos para races ms duras, y esperar brevemente a que la suspensin repose entre las dos maceraciones (Fig. 28, paso 4). Verter la suspensin de races en agua en un vaso y enjuagar la batidora de los residuos adheridos a las paredes y recoger el lquido de lavado con la ayuda de un frasco lavador en el mismo vaso donde se ha recogido la suspensin de races. (Fig. 28, paso 5). Verter cuidadosamente la suspensin de races en agua sobre papel absorbente colocado sobre un tamiz y a continuacin seguir el mtodo de la bandeja de extraccin. (Fig. 26, paso 5 y siguientes). Opcionalmente, las races se pueden teir antes de la maceracin para mejorar la visibilidad de los nematodos despus de la extraccin (ver pgina 60).
1. Despus de lavar los tubrculos, perlarlos finamente con un cuchillo o pelador de verduras.
2. Cortar las cscaras o las races con unas tijeras o cuchillo.
3. Pesar una sub-muestra.
4. Macerar las raeces/ cscaras en una batidora.
5. Verter la suspensin macerada en un vaso previamente etiquetado y lavar el interior de la batidora sobre el vaso.
6. Verter la muestra cuidadosamente sobre el papel colocado sobre el tamiz de forma similar al mtodo de las bandejas. 513 descritos en la Figure 26.
A continuacin, seguir los pasos 513 descritos en la Figure 26.
Figura 28. Mtodo de la maceracin de las races.
Mtodo del tamizado

Ventajas: Buena extraccin de todo tipo de nematodos Bueno para los nematodos de gran tamao y aquellos de movimiento lento Idneo para extraer nematodos de suelo mojado til para extraer quistes del suelo. Desventajas: Los nematodos pueden posarse con las partculas de suelo si el suelo no est bien disperso Los nematodos se daan con facilidad Requiere un equipamiento ms especializado
Equipo
Para nematodos mviles en el suelo: Vasos y cubos Rotulador impermeable al agua Tamices de 20 cm de dimetro (Endecotts o Retsch) de 2 mm, 90 m (o 53 m) y 38 m de luz de malla Equipo de bandejas de extraccin Para recuperar quistes de nematodos sedentarios (p.e. Heterodera): Se utilizar el mismo equipo que para los nematodos mviles en el suelo, pero adems se necesita Tamices de 20 cm dimetro (Endecotts or Retsch) de 2 mm, 250 m, y 150 m de luz de malla Embudos Papel de filtro (o papel de secar las manos) Si se desconoce si hay nematodos sedentarios entonces se necesita utilizar todo el equipo.
Mtodo
Para nematodos mviles en el suelo: Llenar un cubo con 6 litros de agua aproximadamente. Marcar un nivel de agua trazando una lnea con un rotulador impermeable al agua dentro del cubo para que todas las muestras se procesen en el mismo volumen (Fig. 29, paso 3). Poner una sub-muestra de suelo oreado, tamizado y mezclado o de suelo mojado medido mediante el desplazamiento de agua en un vaso (Fig. 29, pasos 1 y 2) dentro del cubo (Fig. 29, paso 4). Mezclar muy bien el suelo y agua con la mano en el cubo (Fig. 29, paso 5). Dejar que las partculas ms grandes del suelo sedimenten durante 30 segundos (Fig. 29, paso 6). Verter lentamente partes de la parte superior del agua a travs de tamices superpuestos: utilizar un tamiz de 2mm de luz de malla para retener los restos vegetales y descartarlos, o slo los tamices de 90 m y 38 m para capturar los nematodos si no hay restos vegetales (Fig. 29, paso 7). Este paso necesita dos personas. Tener mucho cuidado de que el agua no rebose los bordes de los tamices superpuestos (ni tampoco entre los tamices) cuando se est vertiendo el cubo de agua sobre los tamices ya que se perderan los nematodos con el agua que se derrame. Verter lentamente y golpear suavemente el tamiz inferior si fuera necesario para facilitar que el agua fluya a travs de los tamices. Volver a llenar el cubo hasta la marca sealada (Fig. 29, paso 8) y repetir el proceso una o dos veces ms (Fig. 29, pasos 5 7). Lavar los residuos capturados en los tamices de 90 y 38 m, concentrarlos en la parte inferior del mismo y recogerlos en un vaso previamente etiquetado y asegurarse que los tamices quedan bien limpios lavndolos por la parte de atrs con suavidad (Fig. 29, pasos 911). Dejar reposar las extracciones en los vasos durante 23 horas para que los nematodos en suspensin sedimenten en el fondo del vaso. Si fuera necesario, decantar o eliminar el exceso de agua.
Extraccin de nematodos 43 Nivel de agua
1. Aadir agua a un vaso hasta un volumen conocido, p.e. 200 ml.
2. Medir el suelo aadiendo grumos de cada muestra compuesta hasta que el agua desplazada alcance el volumen superior marcado.
3. Medir un volumen determinado de agua utilizando una lnea previamente marcada en el interior del cubo.
4. Verter la sub-muestra de suelo previamente medida dentro del cubo con agua.
5. Mezclar muy bien.
6. Dejar sedimentar el suelo durante 30 segundos.
7. Verter lentamente partes del agua sobre dos tamices superpuestos (90 y 38 m de luz de malla) con el tamiz de 90 m en la parte superior.
8. Volver a llenar el cubo con agua y repertir los pasos 5, 6 y 7.
9. Concentrar los residuos extraidos lavando los tamices con cuidado con una manguera principlamente por la parte de atrs.
10. Asegurarse que los tamices estn bien lavados por detrs y que todos los residuos y nematodos capturados sobre la superficie del tamiz se encuentran concentrados en la parte inferior del mismo.
11. Lavar con cuidado los residuos recogidos en los tamices de 90 m y 38 m en un vaso previamente etiquetado.
Figura 29. Extraccin de nematodos del suelo mediante tamizado.
Se pueden continuar procesando las extracciones de acuerdeo con el mtodo de las bandejas de extraccin (Fig. 26, pasos 313, pgina 37). Para recuperar quistes de nematodos sedentarios: Secar al aire las muestras de suelo antes de proceder a la extraccin (Fig. 30, paso 1). Llenar un cubo con 6 litros de agua aproximdamente. Marcar un nivel de agua trazando una lnea con un rotulador impermeable al agua dentro del cubo (Fig. 30, paso 2). Aadir la sub-muestra de suelo medida al cubo (Fig. 30, paso 3). Mezclar muy bien el suelo y agua con la mano, y dejar que las partculas del suelo sedimenten durante 60 segundos. Los quistes flotarn en el agua (Fig. 30, pasos 4 y 5). Verter lentamente parte de la parte superior del agua a travs de tamices superpuestos: 2mm para retener los restos vegetales y descartarlos, los tamices de 250 m y 150 m se utilizarn para capturar los quistes (Fig. 30, paso 6). Lavar los residuos capturados en los tamices de 250 m y 150 m y recogerlos en un vaso previamente etiquetado (Fig. 30, pasos 7 y 8). Volver a llenar el cubo hasta la marca sealada (Fig. 29, paso 8) y repetir el proceso (pasos 48) al menos una vez, recogiendo todos los residuos capturados en los tamices en el mismo vaso. Repetir este proceso tantas veces como sea necesario hasta tener la seguridad de que se han recuperado todos los quistes que haba en la muestra depositada en el cubo. Preparar y etiquetar un filtro (papel de filtro, de secar las manos, filtro de leche) para colocarlo sobre un embudo (p. e. en forma de cono) sobre un soporte o vaso (Fig. 30, paso 10). Verter la extraccin sobre el filtro colocado en el embudo (Fig. 30, pasos 11 y 12). Dejar que el agua drene a travs del embudo. Quitar con cuidado el papel de filtro del embudo y colocarlo en una bandeja con algo de agua para que el filtro permanezca hmedo antes de su observacin directa al microscopio (Fig. 30, paso 13). Para observar los quistes, abrir con cuidado el filtro y extender el contenido del mismo sobre el papel de filtro y a continuacin observar a la lupa. Alternativamente: Dejar que el papel de filtro se seque en el embudo para posteriormente recogerlo y conservarlo hasta su observacin, pesca y recuento de los quistes (Fig. 30, paso 14).
Extraccin de nematodos 45 Nivel de agua
1. Secar el suelo al aire en un plato.
2. Llenar el cubo con agua hasta la lnea marcada.
3. Verter la sub-muestra de suelo previamente medida dentro del cubo con agua
4. Mezclar muy bien.
5. Dejar sedimentar el suelo durante 60 segundos.
6. Verter la mitad del agua lentamente sobre tres tamices superpuesto de 2 mm, 250 y 150 m.
7. Lavar los residuos capturados sobre los tamices de 250 y 150 m lavndo los tamices por detrs si fuera necesario. Figura 30 continua en la pgina siguiente
8. Lavar los residuos recogidos en los tamices de 250 y 150 m sobre un vaso previamente etiquetado con la ayuda de un frasco lavador.
9. Volver a llenar el cubo con agua y repertir los pasos 48.
10. Doblar un crculo de papel de filtro en cuatro partes y abrirlo en forma de cono, ponerlo sobre un embudo colocado sobre un vaso o plataforma para que no se caiga.
11. Verter la extraccin sobre el papel de filtro.
12. Dejar que el lquido drene a travs del papel de filtro.
ou
13. Colocar el papel de filtro con los quistes y residuos extraidos en un plato o cuenco con agua en el fondo para mantener la humedad si el recuento de los quistes se va a realizar inmediatamente.
14. Alternativamente, dejar que los extractos se sequen en el embudo si los quistes no se van a contar en ese momento.
Figura 30. Extraccin de nematodos de los quistes mediante el mtodo de tamizado.
Los quistes procedentes de las sub-muestras de suelo secadas al aire flotarn en la superficie del cubo, pero si las circunstancias no permiten el secado al aire, los quistes se pueden extraer directamente de las muestras del suelo. Muchos quistes flotarn, pero los quistes nuevos ms pesados quizs no lo hagan por lo que ser necesario agitar el agua y reducir el tiempo de sedimentacin antes de decantar la suspensin de agua a travs de los tamices. Los quistes tambin se pueden pescar del tamiz, o directamente de las muestras secas bajo la lupa con la ayuda de un pincel fino. La determinacin del nmero de quistes en el suelo es un dato til, pero tambin es preciso determinar el nmero de huevos contenidos en los quistes. Para ello habr que romper y/o aplastar los quistes para liberar los huevos contenidos en su interior (ver Referencias y Lecturas recomendadas).
Mtodo de incubacin
Este mtodo tambin se conoce como incubacin de las races en bolsas de plstico o frascos de cristal. Ventaja: No se necesita equipo especial. Desventajas: La eficiencia de la extraccin puede ser relativamente baja Los nematodos extrados a menudo se encuentran en malas condiciones por falta oxigeno.
Equipo
Bolsas de plstico, frascos de cristal, matraces, o vasos similares.
Mtodo
Cortar el tejido vegetal en fragmentos finos y mezclarlo bien (Fig. 31, paso 1). Pesar una sub-muestra /muestra. Ponerla en una bolsa de plstico previamente etiquetada y cerrarla o en un recipiente (que no sea de metal) con tapadera que contenga una pequea cantidad (1020 ml) de agua (Fig. 31, paso 2). Los nematodos eclosionarn de los huevos o migrarn desde el tejido radical al agua durante un periodo entre 2 a 7 das. Recoger el agua del recipiente peridicamente (p.e. diariamente), lo que contribuir a que el nematodo sobreviva, e ir reuniendo sucesivamente los volmenes de suspensin recogidos en un vaso previamente etiquetado utilizando siempre el mismo vaso para cada muestra (Fig. 31, paso 3). Reponer el agua cada vez que se decante, cerrar y dejar estar repitiendo el proceso durante el periodo de 27 das (Fig. 31, paso 4). Reducir o concentrar la suspensin/extraccin recogida de cada muestra y observar directamente al microscopio o guardar siguiendo los pasos 1113 de la Fig. 26.
1. Cortar las races y pesar una submuestra de las mismas.
2. Colocar la sub-muestra pesada de races en un frasco, matraz, o bolsa de plstico y dejar durante 27 das. Dejar la tapadera del contendor floja, no cerrrar por completo.
3. Agitar a diario el recipiente y verter con cuidado la suspensin en un vaso dejando el tejido vegetal en el recipiente.
4. Despus de verter la suspensin, volver a llenar el recipiente con agua.
5. Concentratar la suspensin y recoger los nematodos para determinaciones posteriores, por ejemplo utilizando un tamiz de luz de malla pequeo o dejar sedimentar la suspensin y decantar el exceso de agua. Despus seguir, los pasos 12 y 13 de la Fig 26.
Figura 31. Mtodo de extraccin por incubacin.
51
Examen directo del material vegetal

El tejido vegetal infectado se puede examinar bajo la lupa de diseccin, por ejemplo para comprobar si los nematodos estn presentes antes de enviar el material para su identificacin por expertos. Las hembras adultas sedentarias, que estn embebidas en las races (ver Figuras 10 y 11) se pueden diseccionar del tejido vegetal y utilizarlas para su identificacin. Cuando las muestras se envan fuera para la identificacin de las especies, tambin es necesario enviar el tejido radical (agallado) al taxnomo, conservado en una solucin de lactoglicerina. La observacin directa tambin resulta til para evaluar y observar el tejido foliar y los nematodos que infectan las semillas (ver Fig. 8), y para pescar individuos y ciertos nematodos con objeto de disponer de colecciones de preparaciones de nematodos, etc. Para la observacin directa del material vegetal: Lavar el tejido vegetal bajo una corriente de agua suave, o colocarlo en un cuenco con agua durante unos minutos para eliminar el suelo y la suciedad adherida pero con cuidado de no desplazar de su sitio los nematodos ectoparsitos que estn alimentndose o sujetos externamente a la raz. Cortar el tejido vegetal en trozos de ~2 cm con unas tijeras o un cuchillo. Colocar el tejido vegetal en una placa Petri con agua en su base (Fig. 32). Para la observacin inmediata diseccionar el tejido con la ayuda de agujas enmangadas y pinzas para liberar los nematodos del tejido vegetal. Esto es lo propio para los endoparsitos sedentarios (Fig. 32). Si los tejidos vegetales contienen nematodos migratorios es aconsejable dejarlos en una placa Petri durante toda la noche o incluso ms tiempo. Los nematodos migrarn del tejido vegetal al agua. Los nematodos se pueden pescar entonces bajo la lupa binocular para su identificacin o conservacin (y tincin) y /o envo para su posterior identificacin.
Diseccin del tejido vegetal.
Rotura de las cubiertas de las semillas para facilitar el libre movimiento de los nematodos.
Figura 32. Examen directo del material vegetal en agua.
53
Manipulacin, fijacin y tincin de los nematodos

Existen varias tcnicas de utilidad para la manipulacin e identificacin de los nematodos, las cuales se describen en esta seccin.
Manipulacin de los nematodos

Los nematodos son difciles de manipular debido a su tamao microscpico particularmente para principiantes. Casi siempre es necesario manipularlos en un medio lquido, generalmente, agua. La utilizacin de una lupa de diseccin en lugar de un microscopio ayuda en el proceso. Es preciso seleccionar los nematodos individualmente para establecer cultivos puros o para realizar preparaciones para su identificacin, y por tanto, es preciso pescarlos. Cuando se manipula nematodos procedentes de cultivos puros, se pueden transferir tandas de especimenes con una pipeta capilar de crital (ver Fig. 35). Incluso, se pueden manipular y transferir nematodos individualmente estrechando la punta de la pipeta capilar utilizando un mechero Bunsen.
Pesca de los nematodos

Para observar los nematodos de cerca, a menudo se necesita pescarlos individualmente de la suspensin extrada y montarlos sobre un porta-objetos (Fig. 33). Ello pude resultar difcil al principio pero con la prctica resulta ms fcil. Los nematodos son translcidos (se ve a travs de ellos) y pude resultar difcil verlos; la observacin con luz transmitida colocada debajo de la platina de una lupa binocular ayuda a verlos. (Fig. 34). Si los nematodos se pescan del tejido vegetal o de las races, la luz incidente colocada por encima de la platina tambin puede ser de ayuda.
Figura 33. Pescando nematodos utilizando una astilla de bamb en una lupa de diseccin.
Se pueden utilizar varios instrumentos para pescar nematodos, por ejemplo un alfiler fino de los utilizados para insectos, una astilla de bamb, una pestaa o cerda de pincel fino pegada al extremo de una aguja enmangada, un palillo de dientes afilado o la parte central de una pluma de pjaro (Fig. 35). Verter o utilizar una pipeta para colocar una parte de la suspensin de los nematodos (o tejido vegetal infectado) en una placa Petri, cmara de recuento o pocillo de cristal. El volumen de la suspensin aadido debe cubrir el fondo del recipiente superficialmente para facilitar la pesca de los nematodos. Colocarla bajo una lupa de diseccin utilizando el aumento ms bajo segn convenga al observador. Agitar suavemente la suspensin con un movimiento circular de la mueca para desplazar los nematodos hacia el centro de la placa. Localizar un nematodo y levantarlo con suavidad hasta la superficie del agua con la herramienta que se utilice para pescar. Ir ajustando el objetivo del microscopio para mantener el nematodo siempre enfocado mientras se le est pescando de la suspensin acuosa. Manteniendo el instrumento de pesca por debajo del nematodo levantarlo con suavidad para sacar el nematodo fuera del agua. El nematodo debe quedarse colgando de la punta del instrumento de pesca. Poner la punta del instrumento de pesca suavemente en una gota de agua sobre un porta-objeto, un pocillo de cristal o en otro recipiente que contenga algo de agua. Para observar el nematodo(s) sobre el porta-objeto en el microscopio, es til relajarlos, para ello, colocar el porta-objeto brevemente sobre una placa caliente (templada, no muy caliente). Poner bolitas de cristal o astillas de un cubre-objetos en los bordes de la gotita de agua y colocar un cubre-objeto sobre la misma para no aplastar al nematodo. Observar la preparacin al microscopio.
Lupa de diseccin con luz transmitida.
Microscopio con luz transmitida.
Figura 34. Tipos de microscopios utilizados para pescar o contar nematodos.
Manipulacin, fijacin y tincin de los nematodos 55
Figura 35. Una muestra de instrumentos para pescar nematodos: astilla de bamb; puntas de pipeta estiradas mediante calor, aguja de diseccin con una pestaa pegada a la punta.
Envio de los nematodos para su identificacin

Si despus del muestreo y extraccin, se puede identificar inmediatamente los nematodos a nivel de gnero y contarlos, ello proporcionar una indicacin rpida de cuales son los grupos de nematodos presentes y saber si se encuentran a niveles potenciales de dao o pueden asociarse con el dao observado en el cultivo. Sin embargo, si no se posee la experiencia para realizar esto, o si se necesita conocer la especie del nematodo, ser necesario enviar las muestras fuera para que sean identificadas por un nematologo especialista. Antes de enviar las suspensiones extradas, se necesita matar los nematodos presentes en las mismas (ver la seccin siguiente) y conservarlos, especialmente si se van a enviar fuera del pas. Los nematodos se pueden enviar vivos si previamente se ha llegado a un acuerdo con el laboratorio de destino o si se envan dentro del pas. A veces, tambin se puede enviar suelo o tejido vegetal, sin embargo, es fundamental respetar las normas de cuarentena de cada pas. Los nematodos se pueden recolectar en viales o tubos pequeos (Fig. 36) y empaquetarlos cuidadosamente en contenedores de material aislante para su transporte al laboratorio donde se realizar la identificacin. Los viales deben estar claramente etiquetados con un cdigo/nmero. Los cdigos se deben apuntar en folios por duplicado (uno debe acompaar a los especimenes y el otro debe guardarlo la persona que los enva) indicando todos los detalles de la muestra y este documento se debe guardar hasta que se reciban los resultados de la identificacin.
Diferentes tipos de recipientes tiles para guardar o enviar muestras.
Pequeos micortubos itles para enviar muestras para su identificacin.
Transferencia de nematodos a un microtubo para guardarlas o enviarlas.
Utilizacin de un pocillo de cristal para conservar los nematodos pipeteando unas gotas de formalina.
Figura 36. Almacenaje de muestras de nematodos para su transporte.
Servicios para la identificacin de nematodos

Existe un nmero de taxnomos ubicados en varios centros del mundo capaces de identificar con exactitud los nematodos. Sin embargo, muy pocos centros ofrecen un servicio de identificacin rutinaria de nematodos, especialmente a nivel especfico. Algunos de los centros que ofrecen este servicio son: Plant Disease and Diagnostic Services CABI Bioscience UK Bakeham Lane Egham Surrey TW20 9TY, UK Tel: +44 (0)1784 470111 Biosystematics ARC-PPRI P/Bag X134 Pretoria 0001, Republic of South Africa Tel: +27 (0)12 356 9830 Nematology Department of Plant Protection Faculty of Agriculture University of Jordan Amman 11942, Jordan Tel: +962 (0)6 535 50003004 Central Science Laboratory Sand Hutton York YO4 1LZ, UK Tel: +44 (0)1904 462000 Laboratrio de Nematologia (Meloidogyne spp., Bursaphelenchus xylophilus) IMAR-CMA Departamento de Zoologia Faculdade de Cincias e Tecnologia Universidade de Coimbra 3004-517 Coimbra, Portugal Tel: +351 239855760 Embrapa Recursos Genticos e Biotecnologia (Meloidogyne spp.) Parque Estao Biolgica - PqEB Av. W5 Norte Caixa Postal 02372 CEP 70770-900, Braslia - DF, Brasil Tel: +55 (61) 3403660/34484930 Laboratrio de Nematologia da ESALQ Setor de Zoologia Av. Pdua Dias, 11 Caixa Postal 9 13418-900 Piracicaba - SP, Brasil Tel: +55 (19) 34294338/34294269
Antes de enviar cualquier muestra para su identificacin, es esencial contactar con el centro de destino y convenir con ellos si tienen capacidad para manipular las muestras que se envan y acordar la mejor manera para su conservacin y transporte. Se puede contactar con la seccin de nematologa del CIMMYT e IITA que ofrecen consejos generales y entrenamiento. Tambin se puede buscar informacin a travs de las sociedades relacionadas con la nematologa listadas en la contracubierta de esta gua.
Muerte de los nematodos

Es importante matar los nematodos con rapidez dado que cada especie adopta una forma particular cuando se han matado rpidamente lo cual puede ayudar en la identificacin. El mejor procedimiento para matar los nematodos es el calor suave (5565C) que conserva el contenido del cuerpo del nematodo. Si se matan a temperaturas muy altas, el contenido del cuerpo se cuece y desnaturaliza lo que dificulta su identificacin. Los nematodos se pueden matar primero y despus fijarlos, o bien, se pueden matar y fijar en el mismo proceso.
Un mtodo simple y eficiente para matar nematodos es aadir un volumen de agua hirviendo igual al de la suspensin de nematodos. Si se va a enviar toda la extraccin, ser necesario reducir el volumen de la misma de forma que quede menos de la mitad de la extraccin en el frasco o vial donde se enve. Resulta ms fcil matar y fijar los nematodos en un tubo ms grande y luego trasvasarlos a tubos ms pequeos (Fig. 36), o bien recoger los nematodos del fondo del tubo con una pipeta y colocarlos en los tubos donde se va a enviar. Tambin se puede matar los nematodos colocando la suspensin concentrada en un volumen pequeo en un tubo y sosteniendo el tubo dentro de un vaso con agua caliente a punto de hervir durante 1-2 minutos, esto puede llevar mucho tiempo cuando hay un nmero grande de muestras. Tambin puede resultar engorroso ya que hay que tener cuidado que los tubos se mantengan en posicin vertical y no se vuelquen en el agua perdiendo as la muestra.
Fijacin de los nematodos

El mtodo ms simple para fijar y conservar las muestras es pipetear unas pocas gotas de formaldehdo (formalina) sobre los nematodos recientemente muertos por el calor. Dos o tres gotas para un frasco o vial de 7 ml es suficiente (Fig. 37); si el frasco es de mayor tamao, har falta aadir ms gotas. Este es un mtodo rpido y fcil para evitar que las muestras se deterioren durante la manipulacin y almacenamiento antes de su identificacin, sin embargo, este mtodo no proporciona especimenes de buena calidad para su conservacin a largo plazo y tambin puede dificultar la identificacin, especialmente si las muestras no se van a examinar inmediatamente. Tomar precauciones con el formaldehdo porque comporta riesgos para la salud.
Pipeteando formalina en una suspension de nematodos en un tubo de 7 ml para conservar la muestra.
Tincin de tejidos vegetales con fuscina cida en una solucin de lactoglicerina sobre una placa caliente.
Figura 37. Fijacin y tincin de los nematodos.
Muerte y fijacin en un solo proceso

Calentar el fijador casi hasta el punto de ebullicin en un tubo de ensayo o vaso de precipitados colocado en agua hirviendo. Verter el fijador caliente en un volumen igual al de la suspensin sobre la suspensin de los nematodos (p.e. 2 ml del fijador caliente en 2 ml de la suspensin = 4 ml). Alternativamente: Recoger los nematodos en una pequea gota de agua en un pocillo de cristal y aadir 23ml del fijador caliente con una pipeta.
Los fijadores ms adecuados son: TAF Trietanolamina 2 ml Formalina (40% formaldehdo) 7 ml Agua destilada 91 ml El fijador se conserva estable durante mucho tiempo y la apariencia de los nematodos se mantiene como si estuvieran vivos porque los especimenes no se desecan. FA 4:1 Formalina (40% formaldehdo) 10 ml Acido actico glacial (cido propinico) 1 ml Agua destilada 89 ml En FA 4:1 los nematodos mantienen su estructura aunque pueden decolorarse despus de algn tiempo. Formalina glicerina Formalina (40% formaldehdo) 10 ml Glicerina 1 ml Agua destilada 89 ml Este fijador tiene la ventaja de prevenir la desecacin de los nematodos incluso si los viales no estn hermticamente cerrados. Una vez ms, recordar que se deben tomar precauciones con los fijadores porque comportan riegos para la salud.
Conservacin de los nematodos sedentarios en races o tubrculos

La identificacin de los nematodos sedentarios requiere el examen de las hembras. Por tanto, los tejidos vegetales que contengan las hembras, como las races agalladas, se deben conservar y enviar para su examen. Para ello, ser suficiente colocar una sub-muestra pequea del tejido vegetal infectado dentro de un frasco o vial que contenga lactofenol o lactoglicerina. La tincin previa del tejido vegetal puede ayudar en la identificacin.
El lactofenol se puede comprar tal cual, o bien se puede preparar mezclando a partes iguales un volumen de glicerina, cido lctico y agua destilada (lactoglicerina) y disolviendo una cantidad pequea (1%) de fenol en la mezcla anterior (lactofenol). Dado que el fenol es muy txico, es mejor utilizar slo lactoglicerina aunque esta mezcla es menos eficaz para la conservacin de las muestras durante largos periodos de tiempo.
Tincin
La observacin de los nematodos dentro del tejido vegetal se hace ms fcil utilizando ciertos colorantes que tien el nematodo pero dejan el tejido vegetal prcticamente sin teir (p. e. ver Fig. 5). Las races gruesas o abultadas se deben cortar en fragmentos o secciones finas antes de teirlas para asegurar la transmisin de la luz despus de aclararlas. Teir con lactoglicerina + 0.1% azul de algodn, o bien, 0.050.1% fucsina cida, luego eliminar el exceso de colorante aclarando las races en un vaso con una solucin que contenga a partes iguales un volumen de glicerina y agua destilada + unas gotas de cido lctico. Los mejores resultados se obtienen cuando se dejan desteir las races durante varios das. Lavar el material vegetal con suavidad para eliminar partculas de suelo u otros residuos adheridos al mismo y eliminar el exceso de agua colocndolo sobre papel secante o absorbente. Cortar las races gruesas o ms grandes, o los tubrculos en fragmentos o rodajas de pequeo grosor. Ponerlas sobre un tejido de muselina o gasa, atar los extremos con un cordn o hilo de algodn, y etiquetar con claridad sujetando una etiqueta a cada bolsa de muselina. Calentar la solucin del colorante casi hasta el punto de ebullicin en un vaso sobre una placa caliente. Poner las bolsas de muselina dentro del colorante caliente y dejar durante unos 3 minutos dependiendo del grosor de las races. Utilizar un vaso alto y llenarlo con la solucin del colorante hasta la mitad aproximadamente ya que al introducir el tejido vegetal se producir espuma y as se evitar que se derrame (Fig. 37). Sacar las bolsas de muselina del vaso con el colorante y lavarlas con agua corriente bajo el grifo. Colocar las bolsas de muselina en la solucin aclarante y dejarlas durante toda la noche o ms tiempo. Examinar al microscopio. Colocar las races unas al lado de las otras sobre un porta-objetos y aplastarlas ligeramente con otro porta-objeto colocado sobre el anterior para facilitar la observacin de los nematodos teidos en el interior de las mismas. Los nematodos se teirn de azul con el azul de algodn y de rojo con la fucsina cida.
Masas de huevos de Meloidogyne

La Phloxina B tie la matriz gelatinosa que rodea los huevos de Meloidogyne lo cual aumenta la visibilidad de la masa de huevos y permite el recuento rpido de las hembras adultas/masas de huevos presentes. Los huevos conservan su viabilidad despus de la tincin. La solucin se prepara aadiendo 15 mg (una pizca muy pequea) a 1 litro de agua. Colocar las races previamente enjuagadas en una bandeja o plato (preferentemente blanco) que contenga la solucin de Phloxina B y dejar durante 1520 min. Contar las masas de huevos teidas (rojo).
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Estimacin de las densidades poblacionales de los nematodos

Despus de extraer los nematodos del suelo o del tejido vegetal, primero se debe proceder a su identificacin y luego a su cuantificacin. Ello permite la evaluacin de su asociacin o potencial de causar dao. Este manual no proporciona una gua para la identificacin de los nematodos fitoparsitos, para ello, recurrir a la seccin de Lecturas recomendadas en la pgina 65 (en el Apndice 2, se incluye una descripcin muy bsica de los nematodos fitoparsitos ms comunes). La estimacin de las densidades poblacionales slo se debe intentar si se han identificado los nematodos con certeza. Si no se posee la capacidad o habilidad suficiente para ello, las muestras deben enviarse a expertos (ver pgina 57).
Recuento de los nematodos

Los nematodos extrados se pueden observar y contar utilizando una lupa binocular o un microscopio (Fig. 34); el tener acceso a ambos es lo ideal. Es fundamental disponer de una buena iluminacin de calidad (luz transmitida situada debajo de la platina). Un aumento de 40 veces generalmente es adecuado (p.e. un objetivo de 4x combinado con un ocular de 10), pero tambin se puede utilizar un microscopio (p.e. utilizando un objetivo de 10) para cuando los nematodos estn en malas condiciones o son difciles de identificar. Las lupas de diseccin permiten mayor capacidad de maniobra y profundidad de foco, especialmente para muestras sucias. Los nematodos que no puedan identificarse en la cmara de recuento al aumento que se utiliza para contar, o a mayor aumento utilizando el microscopio, se deben pescar individualmente (Fig. 33) y montarlos sobre un porta-objetos para su identificacin al microscopio utilizando mayores aumentos. Existen varios modelos de cmaras de recuento, pero bsicamente lo que se necesita es una placa de plstico transparente que tenga una cuadrcula sobresaliente grabada en el fondo (Fig. 38). Esta se puede preparar fcilmente marcando lneas en la parte inferior de una placa Petri pequea. Una placa abierta de plstico rectangular de 5 ml de capacidad es til para todos los propsitos; tambin posibilita mover los nematodos o residuos en la placa, y pescarlos para su identificacin a mayor aumento (Fig. 33). Los laterales en forma inclinada ayudan a disminuir las distorsiones pticas causadas por los meniscos mientras que la cuadrcula sobresaliente ayuda a reducir el movimiento de los nematodos entre las lneas de la cuadrcula. Las muestras concentradas a 5 ml se pueden contar en su totalidad, pero si la densidad poblacional del nematodo es muy alta o la muestra est muy sucia, se contar una porcin (alcuota) de la misma diluyendo con agua tantas veces como sea necesario. Sin embargo, se debe tener cuidado y asegurarse de que se ha contado una porcin representativa del total de la muestra, lo cual se consigue mezclando concienzudamente la muestra antes de tomar la alcuota.
Extraer los nematodos de un peso conocido de material vegetal o volumen de suelo mediante uno de los mtodos descritos anteriormente. Concentrar la suspensin extrada en un determinado volumen conocido utilizando una probeta o vaso graduado (p.e. 10 ml). Agitar la suspensin inmediatamente antes de tomar una alcuota de la misma. Utilizar una pipeta con el extremo ancho para tomar las alcuotas para evitar que los residuos la obturen. Se puede cortar las puntas de las pipetas si estas son demasiado estrechas. Pipetear la alcuota con cuidado en la cmaro o placa de recuento evitando las salpicaduras. Si hubiera muy pocos nematodos en la muestra, contar todo el volumen de la suspensin. Si la densidad poblacional del nematodo es alta, contar los nematodos en una alcuota (p. e. en 1 o 2 ml). En ocasiones es necesario diluir la suspensin para facilitar el recuento, por ejemplo, doblando el volumen de la misma. Contar todos los nematodos en la cmara de recuento siguiendo sistemticamente el mismo recorrido con la ayuda de la cuadrcula marcada en el fondo de la placa. Algunas veces los nematodos flotan en la superficie de la suspensin, esperar a que sedimenten, o bien, aadir, una gotita muy pequea de jabn lquido para solucionarlo. Utilizar un contador (idealmente un contador mltiple; Fig. 38) para contar los diferentes gneros de nematodos presentes en la muestra, y si no se dispone de un contador, anotar en un papel los nematodos contados haciendo una raya o trazo. Despus del recuento, devolver la alcuota contada a la suspensin de donde se tom. Repetir el recuento utilizando 23 alcuotas por muestra y despus calcular la media de las alcuotas contadas antes de calcular el nmero total de nematodos por muestra. Contadores individuales y mltiples. Figura 38. Herramientas para el recuento de los nematodos. La media del nmero de nematodos contados en cada alcuota se debe multiplicar por el volumen total de la suspensin para calcular el nmero total nematodos presentes en el volumen de suelo o peso de material vegetal a partir del cual se realiz la extraccin (p.e. 100 ml de suelo o 5 g de races).
Tipos de placas de recuento.
Tipos de pipetas.
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Anlisis del dao

Estimacin de los sntomas de dao en la planta
El dao causado por el nematodo se puede evaluar al mismo tiempo que se recolectan las muestras en el campo. La cantidad de races daadas se estima visualmente (como un porcentaje) utilizando un ndice para su estimacin (Apndice 3). La estimacin del dao causado por el nematodo agallador es un dato particularmente til pero tambin pude estimarse para otros nematodos. Generalmente, existe una buena correlacin entre la estimacin del dao y las prdidas de produccin. La estimacin del dao proporciona una indicacin rpida de ese dao en el preciso momento en que se realiza la estimacin. En aquellos lugares donde no existe un equipamiento bsico de nematologa, esta estimacin puede ser el nico medio de evaluar el dao. La estimacin del dao tambin puede ser de ayuda en la identificacin de resistencia o tolerancia en ensayos de evaluacin de variedades. El nmero de plantas a evaluar puede ser desde una o dos hasta 25 o ms, dependiendo del cultivo y del rea que se est evaluando, y tambin depende de si agricultor quiere asumir un riesgo bajo o alto en el proceso de evaluacin. La estimacin la debe realizar una sola persona o un nmero reducido de personas para que el resultado de la estimacin sea consistente. Se recomienda la utilizacin de un ndice que refleje el criterio de estimacin para consultarlo regularmente y mantener as la consistencia de la estimacin. Cuando se evala el dao causado por el nematodo es necesario adoptar un criterio y tomar algunas decisiones, por ejemplo, las plantas con una infeccin grave causada por el nematodo agallador pueden tener poca cantidad de races con agallas para evaluar puesto que stas se han podrido y desaparecido. Por tanto, el agallado puede parecer mnimo, cuando en realidad, el dao debido al nematodo es grave. Tambin se debe tener en cuenta la variabilidad de la respuesta de los diferentes cultivos y variedades de un mismo cultivo a las especies del nematodo en custin, en particular en el caso del nematodo agallador. A su vez, diferentes especies del mismo nematodo pueden dar lugar a sntomas diferentes; por ejemplo, Meloidogyne hapla forma generalmente agallas pequeas en forma de bolitas o cuentas (como se muestra en lechuga en el Apndice 3), mientras que Meloidogyne incognita causa un agallado ms masivo y fusin del tejido radical (Apndice 3). Los ndices para la estimacin de dao que se muestran en el Apndice 3 sirven de ejemplo y proporcionan una base sobre la cual crear un ndice de estimacin de dao para otros cultivos teniendo en cuenta las circunstancias particulares del dao causado por cada nematodo. En su mayora, los ndices que se presentan en esta gua estiman el dao en una escala del 1 al 5 con objeto de alcanzar un equilibrio entre el tiempo que se requiere para la evaluacin y la precisin de la misma. Si se dispone de ms tiempo, los ndices basados en una escala del 1 al 10 proporcionan una estimacin del dao ms precisa.
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Referencias y lecturas recomendadas

Agrios, G.N. (2005). Plant Pathology, 5th edn. Academic Press, USA. 922 pp. Bridge, J. and Page, S.L.J. (1980). Estimation of root-knot Nematode infestation levels on roots using a rating chart. Tropical Pest Management 26: 296298. Brown, R.H. and Kerry, B.R. (1987). Principles and Practice of Nematode Control in Crops. Academic Press, Sydney. 447 pp. Evans, D., Trudgill, D.L. and Webster, J.M. (1993). Plant Parasitic Nematodos in Temperate Agriculture. CAB International, Wallingford. 648 pp. Luc, M., Sikora, R.A. and Bridge, J. (2005). Plant Parasitic Nematodes in Subtropical and Tropical Agriculture, 2nd edn. CAB International, Wallingford. 871 pp. Mai, W.F. and Mullin, P.G. (1996). Plant Parasitic Nematodes. A Pictorial Key to Genera, 5th edn. Comstock, London and Cornell University, Ithaca. 276 pp. Moens, M. and Perry, R. (2006). Plant Nematology. CAB International, Wallingford. 447 pp. Southey, J.F. (1986). Laboratory Methods for Work with Plant and Soil Nematodes. Ref. Book 402. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food. Commercial Colour Press, London. 202 pp. Speijer, P.R. and De Waele, D. (1997). Screening of Musa Germplasm for Resistance and Tolerance to Nematodes. INIBAP Technical Guidelines 1. International Network for the Improvement of Banana and Plantain, Montpellier. 47 pp. Stirling, G.R., Nicol, J. and Reay, F. (1999). Advisory Services for Nematode Pests Operational Guidelines. Rural Industries Research and Development Corporation. RIRDC Publication No. 99/41. 111 pp. Waller, J.M., Lenn, J.M. and Waller, S.J. (2002). Plant Pathologists Handbook, 3rd edn. CAB International, Wallingford. 516 pp. Wallwork, H. (2000). Cereal Root and Crown Diseases. Grains Research Development Corporation Publications, Canberra, Australia. 58 pp. Whitehead, A.G. (1997). Plant Nematode Control. CAB International, Wallingford. 400 pp. Zuckerman, B.M., Mai, W.F. and Krusberg, L.R. (eds) (1990). Plant Nematology Laboratory Manual. University of Massachusetts Agricultural Experiment Station, Massachusetts. 252 pp.
67
Apndice 1. Ejemplos de gneros y especies de nematodos de importancia mundial como patgenos de cultivos
Nematodos y sntomas de dao
Achlysiella Necrosis en las races Achlysiella williamsi Anguina Agallas en las semillas y hojas, distorsin de las hojas A. tritici (ear cockle nematode) Aphasmatylenchus Crecimiento pobre de las races, clorosis Aphasmatylenchus straturatus Aphelenchoides Necrosis y distorsin de las hojas y semillas, destruccin del micelio fngico A. arachidis A. besseyi A. fragariae A. ritzemabosi A. composticola Belonolaimus Necrosis de las races, clorosis, marchitez B. longicaudatus Bursaphelenchus Clorosis y muerte del rbol B. xylophilus
Principales cultivos afectados Distribucin
Caa de azucar Cereales y pasto Cereales climas templados, principalmente trigo
Australasia Clima templado: mundial Clima templado China, este de Europa, India, norte de frica, Asia occidental
Tubrculos
Clima tropical: Oeste de frica
Tubrculos Arroz Fresa Crisantemo Championes
Clima tropical: Oeste de frica Clima tropical: todas las reas del mundo donde se cultiva arroz Clima templado: Europa, Amrica del Norte, Japn Clima templado: Europa, Amrica del Norte y del Sur, sur de frica y Australia Todas las reas del mundo donde se cultiva champion
Maz dulce, hortcolas, tubrculos, ctricos, algodn
Subtropical: Sudeste USA
Pino
B. cocophilus Cocotero, palmera de aceite Necrosis (anillo rojo) del tallo, inflorescencia, caida del fruto
Clima templado: China, Korea, Japan, Amrica del Norte, Portugal,Taiwan, Amrica Central y del Sur, Caribe

Clima templado y tropical Tropical: USA, frica Occidental, Amrica Central y del Sur Subtropical: USA Subtropical: USA
Criconemella Clorosis, necrosis de las races y de las vainas, marchitez C. onoensis Arroz C. ornata C. xenoplax Ditylenchus Lesiones en tallos y hojas, distorsin de las hojas y follaje, podredumbre de bulbos y tubrculos D. africanus D. angustus D. dipsaci D. myceliophagus Helicotylenchus Necrosis de las races H. multicinctus Hemicriconemoides Destruccin de las races, clorosis, muerte descendente de las ramillas H. mangiferae Tubrculos Frutales
Tubrculos Arroz Habas, cebollas, narcisos y otras bulbceas, cereales Champion
Subtropical: Sur de frica Tropical: Bangladesh, India, Burma, Vietnam Europa, Amrica del Norte y Sur, este de Australia Clima templado: Todas las reas del mundo donde se cultiva champion
Clima templado y tropical: mundial Amplia distribucin en muchos cultivos pero dao poco conocido Bananos, musceas Tropical/subtropical: Todas las reas del mundo donde se cultiva banano
Frutales
Subtropical: Sur de Asia, Africa, Amrica Central y del Sur, Caribe
Heterodera (nematodo de los quistes) Quistes en las races, crecimiento pobre de las races, clorosis, marchitez Cereales (trigo, cebada, avena) H. avenae (quiste de los cereales) H. cajani (quiste de la lenteja) H. ciceri (quiste del garbanzo) H. lipjevi (quiste de los cereales) H. glycines (quiste de la soja) H. latipons (quiste de los cereales) H. mani H. oryzae (quiste del arroz) H. sacchari (quiste de la caa de azucar) H. schachtii (quiste de la remolacha azucarera) H. zeae (quiste del maz)
Global: Centro-oeste de Asia y norte de frica, norte de Europa, China, India, Australia, Pacifico Noroeste USA India Lenteja (Cajanus indicus) Mediterrneo Garbanzo, lenteja Centro y oeste de Asia, India, China, norte Cereales (trigo, cebada, avena) de Europa Subtropical: Amrica del Norte y del Sur, Soja, habas Japn, China Asia occidental Cereales (trigo, cebada, avena) Asia occidental Cereales (trigo, cebada, avena) Tropical: India, Bangladesh Arroz Tropical: frica occidental, India Caa de azucar, arroz Remolacha, acelga y otras brsicas Clima templado/subtropical: Europa, Norte Amrica, oeste y sur de frica, Australia Tropical: India Maz
Apndice 1. Ejemplos de gneros y especies de nematodos 69

Hirschmanniella (nematodos del arroz y nematodo mitimiti) Lesiones en las races, podredumbre del cormo (enfermedad mitimiti) H. gracilis H. imamuri H. oryzae H. spinicaudata Hoplolaimus (nematodos lanza) Necrosis de las races H. columbus H. seinhorsti Longidorus (nematodos aguja) Agallado de las puntas de las races. Transmisores de virus L. elongatus Meloidogyne (nematodos agalladores) Agallado de races y tubrculos, clorosis, marchitez M. acronea M. africana M. arenaria M. artiellia M. chitwoodi M. coffeicola M. exigua M. graminicola M. hapla M. incognita M. javanica M. oryzae M. mayaguensis M. naasi Nacobbus (falso nematodo agallador) Agallado de races N. aberrans
Arroz Arroz Arroz Arroz
Tropical Tropical Tropical: frica occidental, Amrica del Norte y del Sur, sur y sudoeste de Asia Tropical: frica, Amrica del Norte y del Sur
Algodn Algodn, hortcolas
Tropical: USA, Egypto Tropical: frica, sur de Asia, Amrica del Sur
Fresa, remolacha
Climas templados: Europa, Canada
Algodn, sorgo Caf Tubrculos Trigo, cebada y legumbres Papa, remolacha, cereales Caf Caf Arroz Pyrethrum, hortcolas, trbol Hortcolas, algodn, tabaco, gama de huspedes muy amplia Hortcolas, algodn, tabaco, gama de huspedes muy amplia Arroz Hortcolas, papaya, gama de huspedes muy amplia Trigo, cebada
Tropical: Sur de frica Tropical: frica Tropical: mundial Pases Mediterrneos: Italia, Francia, Grecia y Espaa, Asia occidental, Israel y Siberia occidental Climas templados: Norte Amrica, Mexico, sur de frica, Europa Tropical: Amrica del Sur Tropical: Amrica del Sur Tropical: Sur y sudeste de Asia Clima templado/subtropical: mundial Tropical: mundial Tropical: mundial Tropical: Sur de Asia Tropical: mundial Norte de Europa, Nueva Zealanda, Chile, USA, Iran y antigua Unin Sovitica
Hortcolas, papa, remolacha
Clima templado/subtropical: Amrica del Norte, Central y del Sur, Europa (invernaderos)

Paralongidorus (nematodos aguja) Agallado de las puntas de las races. Transmisores de virus P. australis Paratrichodorus Races acortadas (engrosadas) ennegrecidas. Transmisores de virus P. minor Pratylenchus (nematodos lesionadores) Necrosis de las races, cormos y tubrculos P. brachyurus P. coffeae P. goodeyi P. loosi P. neglectus P. penetrans P. thornei P. zeae Radopholus (nematodos barrenadores) Necrosis de las races, tubrculos, podredumbre, rotura de races, caida de la planta R. citri R. similis R. nativus Rotylenchulus (nematodo reniforme) Crecimiento pobre de las races, clorosis, achaparrado R. parvus R. reniformis R. variabilis Rotylenchus (nematodos espiral) Crecimiento escaso R. robustus
Arroz
Subtropical: Australia
Hortcolas
Clima templado/subtropical: Europa, USA
Tubrculos, pia, mandioca Bananas, yams, caf, ctricos, especias, gama de huspedes muy amplia Bananas T Papa, hortcolas, cereales (trigo, cebada, avena) Frutales y frutos secos, hortoclas, pequeos frutos, ornamentales Cereales (trigo, cebada, avena) Maz, arroz
Tropical: mundial Tropical: mundial Subtropical: Este y oeste de frica, Canarias Subtropical: Sur de Asia Australia, oeste de Asia, Norte de Africa, USA, Canada Climas templados: mundial Australia, Oeste de Asia, Norte de frica, Israel, Mexico, USA Tropical: Sur y sudeste de Asia, frica
Ctricos Tropical: Indonesia Bananas, ctricos, races y Tropical: mundial tubrculos, cocotero, t, pimienta negra, y otras especias Cereales y legumbres de grano Clima templado: Australia
Lenteja (Cajanus indica), batata Pia, hortcolas Batata
Tropical: frica Tropical: mundial Tropical: frica
Hortcolas, plantones de rboles
Clima templado: Europa, Norte Amrica, India
Apndice 1. Ejemplos de gneros y especies de nematodos 71

Scutellonema (nematodos espiral) Podredumbre seca de los tubrculos, crecimiento pobre de las races S. bradys (nematodo del yam) S. cavenessi Trichodorus Races acortadas (regordetas) ennegrecidas. Transmisores de virus T. primitivus T. viruliferus Trophotylenchulus Crecimiento reducido de las races T. obscurus Tylenchorhynchus Races reducidas

Principlamente en los trpicos y frica Yams, mandioca Tubrculos Tropical: Oeste de frica, Caribe Tropical: Oeste de frica
Remolacha, papa
Clima templado/subtropical: Europa, Norte Amrica
Caf Cereales, hortcolas
Tropical: frica Clima templado y tropical
Tylenchulus Crecimiento pobre de las races, declinacin lenta de los rboles T. semipenetrans (nematodo de los ctricos) Ctricos Xiphinema (nematodos daga) Agallado de las puntas de las races Transmisores de virus X. americanum X. diversicaudatum X. index
Subtropical/tropical: Todas las reas del mundo donde se cultiva ctricos
rboles, via, Rosas, via, pequeos frutos Via, rboles frutales, rosa
Clima templado/subtropical: mundial Clima templado: Europa, Norte Amrica, Australia, Nueva Zelanda Clima templado: Europa, Amrica del Sur, Mediterrneo, sur de frica, este de Australia
Adaptado de la Tabla 13.1 de J. Bridge y T.D. Williams, Plant parasitic nematodes, pp.140162, en Waller et al. (2002) (cortesa de CABI Publishing).
Apndice 2. Identificacin bsica de los nematodos

Este manual no proporciona una gua taxonmica de los nematodos fitoparsitos, para ello ver la seccin de Referencias y Lecturas recomendadas. Sin embargo, a continuacin se ofrece una descripcin bsica de los nematodos fitoparsitos ms comunes. La figura 39 muestra las diferencias visuales entre los nematodos fitoparsitos (regin ceflica) y los no fitoparsitos a modo de ayuda para su diferenciacin. Meloidogyne nematodo agallador La hembra adulta es esfrica o tiene forma de pera con un cuello alargado mientras que los machos tienen forma de gusano (vermiforme). Los juveniles y las hembras son endoparsitos que causan agallas. El estilete es delgado con ndulos basales. Los huevos se depositan en una matriz gelatinosa. Pratylenchus nematodo lesionador Nematodo vermiforme. Hembra con un solo ovario. Cabeza relativamente ancha y aplanada y cola redondeada. La regin de los labios es plana y el estilete robusto, de 1419 m de longitud con ndulos basales enormes. Causa lesiones en las races de las plantas. Todos los estadios son infectivos y son endoparsitos migratorios. Heterodera nematodo de los quistes La hembra adulta tiene forma de limn y forma quistes cuando alcanza la madurez. La hembra es semi-endoparsita solo con la porcin anterior del cuerpo dentro del tejido vegetal. Los huevos se encuentran retenidos en el quiste pero adems pueden poseer una masa de huevos. El estilete del juvenil es potente y con ndulos prominentes. Helicotylenchus nematodo espiral La regin labial es alta, cnica, redondeada. El nematodo se encuentra generalmente enrollado en una espiral amplia o en forma de C. Hembra con dos ovarios con la cola dorsalmente curvada. Son semi-endoparsitos o ectoparsitos y generalmente se encuentran en el suelo. Scutellonema falso nematodo espiral Bsicamente aplica la misma descripcin que para Helicotylenchus, excepto que: El estilete es ms corto y los ndulos basales son menos pronunciados. La forma relajada es recta o ligeramente en forma de C. Son principalmente ectoparsitos. Xiphinema y Longidorus nematodos lanza Nematodos muy largos El estilete es una estructura larga en forma de aguja sin ndulos basales pronunciados. La forma relajada es generalmente recta. Son ectoparsitos.
Apndice 2. Identificacin bsica de los nematodos 73
Nematodos fitoparsitos:
Paratrichodorus [JB]
Heterodera [JB]
Scutellonema [JB]
Hemicriconemoides [JB]
Hemicycliophora [JB]
Hoplolaimus [JB]
Tylenchorhynchus [JB]
Plectus [JB]
Cabeaza de J2 de Meloidogyne [SM]
Xiphinema [LA-B]
Filenchus [LA-B]
Cabeza de hembra de Meloidogyne [LA-B]
Xiphinema [SM]
Helicotylenchus [SM] Pratylenchus [SK]
Cabeza de hembra de Longidorus anterior [LA-B]
Figura 39 contina en el dorso
Nematodos no fitoparsitos:
Mononchus [JB]
Discolaimus [JB]
Figura 39. Comparacin de la region ceflica de varios nematodos fitoparsitos y no fitoparsitos. (Fotografas de J. Bridge [JB], S. Mack [SM], L. Al-Banna [LA-B] y S. Kelly [SK].)
75
Apndice 3. Indices para medir el dao causado por los nematodos

Estimacin del dao causado por el nematodo agallador (Meloidogyne spp.) en mandioca
Realizar una estimacin combinada de races y tubrculos cuando se evalan las plantas en su madurez en el momento de la cosecha o realizar solo una estimacin de las races de las plantas cuando se arrancan durante el periodo de crecimiento vegetativo. Races de Mandioca
1. No se observan agallas, races alimentcias intactas.
2. Se observa al menos una agalla.
3. Numerosas agallas, aproximadamente el 50% de las races afectadas.
4. Numerosas agallas, la mayora de las races afectafas.
5. Abundantes agallas en la mayora de las races, con necroisis y races alimenticias muy afectadas o ausentes.
Plantas de mandioca
1. No se observan agallas, races alimenticias y tubrculos sanos.
2. Al menos se observa una agalla en las races.
3. Agallas visibles en las races, pocas races alimentcias y tubrculos de menor tamao.
4. Numerosas agallas, races necroticas y tubrculos de menor tamao.
5. Abundantes agallas en la mayora de las races, races alimentcias casi ausentes y pocos tubrculos.
Apndice 3. Indices para medir el dao causado por nematodos 77
Estimacin del dao causado por el nematodo agallador en zanahoria
1. Sin agallado.
2. Agallado ligero.
3. Agallado moderado.
4. Agallado considerable.
5. Agallado grave.
Estimacin del dao causado por el nematodo agallador en lechuga
1. Sin agallas.
2. Agallado ligero.
3. Agallado moderado.
4. Agallas considerable.
5. Agallado grave.
Estimacin de lesiones en races de banano

Adaptado de Paul Speijer y Dirk De Waele (1997).
0%, limpio
5%
10%
25%
50%
75%
100%
Estimacin de lesiones en Musa

Ejemplo de cinco indices de necrosis (%) de la superficie del cortex de la raz en races de banano cortadas en secciones longitudinales mostrando necrosis causadas por nematodos endoparsitos lesionadores (cortesa de Paul Speijer y Dirk De Waele, 1997). 10 cm
% de necrosis en cada mitad de raz
0% 1% 2% 17% 12% 0% 5% 10% 15% 20%
% proporcin de cada mitad de raz (5 20% = 100%)
Seleccionar al azar cinco races funcionales por muestra (planta). Cada raz debe tener al menos 10cm de longitud. Cortar longitudinalmente cada raz por la mitad y descartar una de las mitades. Estimar el dao de la otra mitad de la raz de acuerdo con el porcentaje del cortex que muestra necrosis. Cada raz contribuye un 20% al total de la muestra de forma que sumadas se obtiene el 100% para las 5 races. As, si la mitad de la raz muestra necrosis, indexarla como 10%. Si la raz no muestra necrosis, indexarla como 0% (ver figura superior). Una vez realizado el indexaje de cada una de las 20 races, sumar los 5 ndices para obtener el porcentaje total de necrosis de la muestra.
Diagrama del ndice de agallas para el nematodo agallador

Cortesa de John Bridge y Sam Page (1980)
0 No se observan ndulos en las races.
1 Pocas agallas pequeas, dificiles de encontrar.
2 Solo agallas pequeas pero claramente visibles. Las races principales limpias.
3 Algunas agallas visibles y grandes.
4 Predomina las agallas grandes pero las races principales estan limpias.
5 50% de las races afectadas. Agallado de algunas de las races principales. Sistema radical reducido.
6 Agallado en las races principales.
7 La mayora de las races principales agalladas.
8 Todas las races principales agalladas incluyendo la central. Se observan pocas races lmpias.
9 Todas las races gravemente agalladas. Las plantas generalmente se estn muriendo.
10 Todas las races severamente agalladas. No hay sistema radical. Las plantas generalmente muertas.
Indice de dao causado por nematodos de los quistes en trigo

Adaptado de A.D. Rovira en Brown y Kerry (1987).
1 Sin dao, limpia.
2 Dao ligero.
3 Dao moderado.
4 Dao considerable.
5 Dao grave.
Redes y organizaciones de utilidad

Afro-Asian Society of Nematologists (http://www.ifns.org/membership/aasn.html) Australasian Association of Nematologists (http://nematologists.org.au) Brazilian Nematological Society (http://www.ciagri.usp.br/~sbn/sbn_i.htm) Cereal Nematode Network Chinese Society of Plant Nematologists (http://www.ifns.org/membership/cspn.html) Nematology Initiative in East and Southern Africa Egyptian Society of Agricultural Nematology (http://www.ifns.org/membership/esan.html) European Society of Nematologists (http://esn.boku.ac.a) International Federation of Nematology Societies (http://www.ifns.org/) Japanese Nematological Society (http://www.ifns.org/membership/jns.html) Nematological Society of India (http://www.ifns.org/membership/nsi.html) Nematological Society of Southern Africa (http://www.ifns.org/membership/nssa.html) Organization of Nematologists for Tropical America (http://www.ontaweb.org) Society for Invertebrate Pathology (http://www.sipweb.org/) Society of Nematologists (http://www.nematologists.org) West and Central African Nematology Network
Creditos: Fotos: Todas las fotografas han sido realizadas por los autores a menos que se d credito a otros autores. Ediccin, diseo, maquetacin y pruebas de imprenta: Green Ink Publishing Services Ltd, UK (www.greenink.co.uk) Impresin: Pragati Oset Pvt. Ltd, India (www.pragati.com)
Los nematodos fitoparasitos estan siempre presentes en los campos de cultivo, pero a menudo, los daos que causan se atribuyen a otras plagas y enfermedades u otros problemas del cultivo. En pases en desarrollo, en particular, donde los recursos y facilidades son escasos, es dificil identificar y cuantificar con precisin el problema nematolgico. El objetivo de esta gua es ayudar a superar esta limitacin proporcionando una referencia fcil de seguir para determinar los problemas causados por los nematodos fitoparsitos. La gua ofrece instruciones claras y con muchas ilustraciones sobre los procedimentos para recolectar y procesar muestras para evaluar los problemas de nematodos, asimismo ofrece informacin sobre como acceder a ayuda para su diagnstico e identificacin. El manual est dirigido a tcnicos, agricultores, agentes de extensin, y otras personas con inters en la produccin y proteccin de los cultivos, particularmente en aquellos lugares del mundo donde el acceso a ayuda experta e instalaciones avanzadas son limitadas. Es de esperar que esta gua simplifique algunos aspectos de la nematologa y ayude a disminuir el misterio que rodea este problema que afecta a la produccin agrcola.
ISBN 978-131-338-2
D.L. Coyne, J.M. Nicol y B. Claudius-Cole
D.L. Coyne, J.M. Nicol y B. Claudius-Cole

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Nematologa prctica: Una gua de campo y laboratorio

D.L. Coyne, J.M. Nicol y B. Claudius-Cole Traduccin de Soledad Verdejo-Lucas

Nematologa prctica: Una gua de campo y laboratorio

Estimacin de la densidad de nematodos Anlisis del dao

Estimacin de sntomas de nematodos en la planta

Paso 2: Recoger muestras de suelo y de tejidos vegetales

Paso 3: Extraer los nematodos de las muestras

Paso 4: Identificar los nematodos

Paso 5: Determinar las densidades poblacionales de los nematodos

Paso 6: Anlisis del dao causado por el nematodo

Paso 7: Toma de decisin para su manejo

Biologa general de los nematodos fitoparsitos

Pratylenchus (forma de gusano/ vermiforme) [JB]

Helicotylenchus (forma de gusano vermiforme/espiral) [GG]

Discocriconemella (ligeramente hinchado)

Nacobbus (hinchado/fusiforme) [JB]

Achlysiella (hinchado/fusiforme) [JB]

Tylenchulus (forma de pera) [JB]

Rotylenchulus (forma de rin/ reniforme) [JB]

Heterodera (forma de limn)

Meloidogyne (forma esfrica/de calabaza) [JB]

Scutellonema (forma de gusano vermiforme/forma de C) [GG]

Criconematido (acostillado/ surcado)

Hirschmanniella (vermiforme/ largo) [JB]

Biologa bsica de los nematodos fitoparsitos 5 estilete esfago ovario vulva

Estructura tpica de un nematodo fitoparsito (cortesa de R. Esser).

espcula del macho con bursa

Raz infectada de maz Huevo

Raz sana de maz Hembra adulta Macho adulto

Biologa bsica de los nematodos fitoparsitos 7

Endoparsitos migratorios (Fig. 5)

Scutellonema bradys en yam.

Endoparsitos sendentarios (Fig. 6)

Nematodos agalladores (Meloidogyne spp.) rompiendo y sobresaliendo de la raz de maz.

Nematodo agallador (Meloidogyne spp.) embebido en las races de batata [JB].

Biologa bsica de los nematodos fitoparsitos 9

Discocriconemella y detalle a mayor aumento de la regin de la cabeza [GG].

Sntomas de dao causados por nematodos

Sntomas areos (Fig. 8)

Sntomas causados por nematodos parsitos de las races (Fig. 9)

Hojas arrugadas o retorcidas de arroz causadas por Ditylenchus angustus [JB].

Enfermedad de la punta blanca del arroz causada Aphelenchoides besseyi [JB].

Sntomas del anillo rojo (Bursaphelenchus cocophilus) en el tronco de cocotero [JB].

Sntomas de dao causado por nematodos 13

Agallas en las races

Sntomas de dao causado por nematodos 15

Ndulos en races de mandioca causadas por Meloidogyne spp.

Hinchazon de la punta de la raz en maz causada por Meloidogyne spp.

Figura 10 contina a la vuelta de la pgina

Agallas en forma de cuentas de rosario en lechuga causadas por Meloidogyne spp.

Sntomas de dao causado por nematodos 17

Agallas en tubrculos de yam (Dioscorea spp.).

Agallas en races de mandioca.

Agallas en las races versus ndulos (Fig. 12)

Sntomas de dao causado por nematodos 19

Sistemas radicales reducidos

Races de arroz achaparradas y agalladas causadas por Meloidogyne graminicola [RP].

Lesiones en las races y tubrculos

Figura 14. Sntomas de lesiones en races. (Fotografas de J. Bridge [JB].)

Lesiones en batata causadas por Scutellonema bradys.