FACULTAD DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL GUA DE PRCTICA DE LABORATORIO BIOTECNOLOGIA

CINTICA ENZIMTICA

Las fuentes ms importantes como materia prima para la obtencin de energa son los polisacridos, el almidn y el glucgeno. En los vegetales el almidn constituye el polisacrido de reserva ms abundante, sintetizndose en los cloroplastos de las clulas fotosintticas y en los amiloplastos de las clulas del parnquima de almacenamiento El almidn es un polisacrido compuesto por unidades de glucosa con dos componentes; uno, mayoritario, llamado amilasa, de estructura lineal (las unidades estn unidas, exclusivamente, por enlaces -1,4-glucosdicos), y otro, minoritario, amilopectina, de estructura ramificada (cada cierto nmero de eslabones lineales hay una ramificacin, que encabeza una glucosa unida mediante enlace -1,6-glucosdico a una de las glucosas de la estructura lineal). La prctica se aprovecha, para seguir la degradacin del almidn por amilasa salival, de que amilasa forma un complejo azul con iodo, cosa que no pueden hacer los productos de su degradacin. OBJETIVOS Extraer a partir de semillas de leguminosas enzimas de tipo amilceo analizar la actividad amiloltica, del extracto enzimtico obtenido, a travs del producto coloreado que se obtiene en la reaccin

Determinar el efecto de la temperatura, pH, de la concentracin de la enzima y la concentracin de sustrato en la reaccin enzimtica Comparar la cintica enzimtica de la amilasa extrada de vegetales con respecto a la amilasa animal o microbial.

MATERIALES Y REACTIVOS. Lugol: Se prepara disolviendo 1 g de iodo, 2 g de KI en 200 ml de agua destilada. Buffer de pH 5,0; 6,0, 7.0 y 8,0. (Fosfato de sodio) 6 Tubos de ensayo, 2 Vasos de precipitado 1 Cronmetro. 20 Semillas de leguminosa de 5 das de germinacin Mortero. Reactivos de Fehlling, Benedict. Gradillas Matraz aforador de 100 ml Pipetas de 1 y 5 ml. Planchas de calentamiento Glicerina Vidrios reloj Hidrxido de sodio K2HPO4 pH metros o papel indicador

PROCEDIMIENTO: Solucin de Enzima: Se prepara colectando 1 ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) diluida en 20 ml con agua destilada. Solucin de Almidn: Preparar 100 ml de una solucin de almidn al 1 %. Disuelva 1 gramos de almidn en 100 ml de agua destilada, Preprela la solucin disolviendo el almidn en agua a 50 o 60 C. INFLUENCIA DE [E] EN LA CINTICA Tubos Solucin de almidn al 1% (ml) Solucin de Enzima (ml) 1 10 0.5 2 10 10 3 10 1.5 4 10 2.0 5 10 2.5 6 10 0.0

Adicione en cada tubo la cantidad de enzima, de acuerdo con la tabla, al terminar con el ltimo tubo accione el cronmetro. Tome muestras cada minuto, extrayendo de cada 1 ml de solucin, agrguele unas gotas de lugol y anote el color para cada tiempo y en cada tubo ensayado.

Determine el tiempo que tarda en reaccionar la solucin enzima-almidn con el lugol. Realice un Control, tomando 1 ml de agua destilada y adicionndole unas gotas de lugol. observe la coloracin La mezcla de las dos gotas debe quedarse del color del Lugol. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla: Tubos Volumen de Enzima Velocidad Reaccin (1/t) Tiempo (min.)

Con estos datos construya un grfico de [E] en el eje de las ordenadas contra velocidad de reaccin (1/t) en el eje de abscisas. Repita la experiencia con los extractos enzimticos de semillas vegetales.

INFLUENCIA DE [S] EN LA CINTICA PROCEDIMIENTO: Tubos Solucin de almidn al 0.5%(ml) Agua destilada (ml) Solucin de Enzima (ml) 1 1.0 4.0 0.5 2 2.0 3.0 0.5 3 3.0 2.0 0.5 4 4.0 1.0 0.5 5 5.0 0.0 0.5

Incube los tubos a 40 grados Celsius durante 10 minutos A intervalos de 1 minuto determinar la presencia de almidn mediante la reaccin con Lugol. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla: Volumen de Sustrato (ml) Velocidad Reaccin Tiempo total de (1/t) reaccin (min.)

Tubos

Con los datos de la tabla construya un grfico de velocidad de reaccin (volumen / tiempo) en el eje ordenado contra volumen de sustrato en el eje de abscisas

INFLUENCIA DEL pH. EN LA CINTICA PROCEDIMIENTO: Tubos Solucin buffer (2 ml) Solucin de almidn al 0.5%(ml) Solucin de Enzima (ml) Volumen final (ml) 1 pH 5.0 2 2 6 2 pH 6.0 2 2 6 3 pH 7.0 2 2 6 4 pH 8.0 2 2 6

Incube a 40 grados Celsius por 10 minutos y ensaye la reaccin con el Lugol, tomando 1 ml cada minuto Con los datos obtenidos establezca las conclusiones sobre el rango de pH en el cual la enzima muestra su actividad ptima.

INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA EN LA CINTICA PROCEDIMIENTO: Tubos Solucin de almidn al 0.5%(ml) Solucin de Enzima (ml) Volumen final en cada tubo 1 5 1.0 6.0 2 5 1.0 6.0 3 5 1.0 6.0 4 5 1.0 6.0 5 5 1.0 6.0

Hierva durante 5 min. y reponga el volumen de agua perdida por evaporacin en el tubo. Incbelo a 40 grados Celsius y determine la presencia de almidn en l a diferentes intervalos de tiempo.

Incube un segundo tubo a 40 grados Celsius y un tercero a 50 grados Celsius, y ensaye en ellos la reaccin con Lugol a intervalos de 1 minuto. Anote el tiempo que se demora en desaparecer la coloracin azul.

Un cuarto tubo incbelo en un bao de hielo y ensaye tambin la reaccin con Lugol. El ltimo tubo djelo a temperatura ambiente del laboratorio y ensaye con el Lugol hasta la desaparicin de la reaccin positiva en intervalos de 1 minuto. Con los datos obtenidos en el ensayo complete la siguiente tabla,

Tubos 1 2 3 4 5

Velocidad Reaccin (Vol./tiem)

Tiempo Reaccin (min.)

Color observado

EXTRACCIN DE AMILASAS DE SEMILLAS PROCEDIMIENTO:

Prepare 30 ml de un macerado acuoso con 10 g de semillas de frijol germinadas teniendo en cuenta que el agua debe estar caliente (50 grados). Adicione 5 gotas de glicerina para extraer lo ms posible los enzimas.

Deje reposar de 15 - 20 minutos de 30 - 45 grados Celsius y filtre el extracto. Para reconocer la presencia de azcares reductores (maltosa y glucosa), realizar la reaccin con los reactivos de Fehling, Tollens o Benedict de una muestra de 1 - 2 ml del sistema de reaccin.

Realice los ensayos tanto con amilasa salival como con amilasa del extracto de semillas

INMOVILIZACION DE ENZIMAS

INTRODUCCION

Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada da ms numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biolgicos, presentan una gran actividad cataltica; muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad y regioespecificidad); son muy activos a temperatura ambiente y presin atmosfrica. A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se ha generalizado en los procesos qumicos industriales, debido a que la mayora de las enzimas no son estables en las condiciones de trabajo. Por otra parte al ser solubles en agua, la separacin de los sustratos y productos, es difcil, y por tanto, no se pueden reutilizar. Con la inmovilizacin de las enzimas se han podido superar estos ltimos inconvenientes, permitiendo que el proceso biotecnolgico sea econmicamente rentable.

OBJETIVOS Establecer la efectividad de enzimas inmovilizadas y sin inmovilizar Determinar el tiempo de residencia del sustrato en el sistema de la enzima inmovilizada Establecer tiempos de catlisis de la enzima en cada uno de los sistemas (inmovilizada y sin inmovilizacin)

ASPECTOS GENERALES SOBRE LA INMOVILIZACIN DE ENZIMAS

La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar: El aumento de la estabilidad de la enzima. La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso. La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control, adaptado a la aplicacin de la enzima inmovilizada. Los diferentes tipos de biorreactores enzimticos aparecen en la Figura 1. Estos con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas elevadas de enzima, la cual mantendr su actividad durante ms tiempo. Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtencin de productos con mayor pureza. Los principales inconvenientes del proceso de inmovilizacin son: La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado nativo. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de protenas inmovilizadas con un diferente nmero de uniones al soporte. Siempre suele haber una prdida de actividad de la enzima durante la movilizacin. El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa.

FIGURA 1.- Biorreactores que emplean enzimas inmovilizadas.

INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR RETENCIN FSICA (ATRAPAMIENTO) Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmeros fotoentrucruzables o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano.

FIGURA 2. Mtodos de inmovilizacin mediante retencin fsica. El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima en una solucin del monmero. Seguidamente se inicia la polimerizacin por un cambio de temperatura o mediante la adicin de un reactivo qumico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser ms resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sinttica. El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerizacin, as como la comprobacin de que la naturaleza qumica del proceso no altera los grupos reactivos de la protena.

MATERIALES Y REACTIVOS Si no se tiene agar-agar, el atrapamiento se puede hacer con Alginato de Sodio Buretas de 300 ml

Jeringas desechables de 20 o 50 ml o Pipetas partidas de 5 ml Columnas de Vidrio o PVC Solucin de Enzima (quimosina animal del Cuajo) Atrapamiento en Alginato

Alginato de Sodio al 1% Buffer de Acetato de sdio 0.1 M pH 6.0 Acido Actico Solucin de CaCl2 0.2 M Atrapamiento en Agar

Aceite Vegetal Fri Agar-Agar Plancha de calentamiento Termmetro PROCEDIMIENTO Atrapamiento en Alginato. El extracto enzimtico se inmoviliza con Alginato de sodio. El alginato es un polisacrido producido por algas solubles en agua, en una solucin con iones bivalentes como Ca2+ polimeriza ya que los iones producen entrecruzamiento de los polisacridos. Al polimerizar una solucin de alginato de sodio, conteniendo enzimas, estas quedan atrapadas dentro de las esferas que se generan. Para la inmovilizacin se colocan 10 ml del extracto enzimtico en un beaker y se le agrega alginato de sodio al 1%. Se homogenizan y se toma con una jeringa de 50 ml. Se hace gotear la solucin en un beaker que contiene la solucin de CaCl 2,

200 mM. Para producir esferas de 3 5 mm de dimetro, que polimerizan al entrar en contacto con la solucin de CaCl2. Las esferas se estabilizan durante 1 Hora en la solucin CaCl2, a temperatura ambiente. Las esferas se lavan con buffer de acetato sodio 0.1M, pH: 6.0 Atrapamiento en Agar-Agar Preparar una solucin de 3% de agar, Calentar hasta 200 grados para disolver el agar, Bajar la temperatura a 40 C una vez disuelto el agar (confirmar temperatura con termmetro) Para la inmovilizacin se adicionan 10 ml del extracto enzimtico en el beaker con el agar, solo cuando la temperatura este por debajo de 45 C, para que no se de una desnaturalizacin de la enzima. Homogenice las soluciones: con una jeringa de 50 ml tome de la solucin, gotee la solucin de enzima-agar sobre una probeta llena de aceite vegetal frio. Si desea tamaos de esferas ms grandes gotee solucin varias veces sobre el mismo sitio hasta obtener el tamao de esfera deseado. Repita esto hasta obtener un volumen adecuado de esferas. Lave las esferas con abundante agua (Agua de la llave), utilizando tela o tamiz de plstico. Determinacin del titulo de la Enzima Determine el titulo de la enzima (fuerza para ejercer su catlisis) y la dosis necesarias sin caer en los errores que conlleva emplear dosis bajas o muy altas a las necesarias. El ttulo o fuerza de cuajo se define como la cantidad de leche en mililitros que cuaja a 35 C en 40 minutos, cuando se le adiciona un gramo o mililitro de enzima. Se puede calcular mediante la siguiente formula:

F=

V x 2400 C xt

F: Fuerza de la enzima, V: Cantidad de leche, C: Cantidad de Enzima y t: tiempo tardado en coagular la leche. Cuando se conoce la fuerza, se puede calcular la cantidad necesaria a utilizar por medio de la siguiente formula:

C=

L x 34 x 40 F xT xM

F: Fuerza de la enzima, L: Volumen de leche, C: Volumen de la Enzima, T: Temperatura en C y M: Duracin en minutos. Tome 10 ml de leche cruda y adicinele 2 ml de la enzima del cuajo, con un cronmetro establezca el tiempo que demora la enzima en catalizar el sustrato, calcule el titulo y el volumen de la enzima sin inmovilizar Empacamiento de la columna Determine la longitud de la columna de vidrio o PVC, y rellene hasta el 75 % de esta. Con las esferas creadas. Figura 3

Haga circular el sustrato a catalizar, se puede realizar con bomba peristltica o manualmente si no se posee. Mida el tiempo que tarda la enzima en catalizar el sustrato. Monte tres columnas empacadas y haga circula el sustrato (leche), durante varios minutos, segn la tabla siguiente Columna empacada 1 2 3 Tiempo de residencia del sustrato en la columna (min.) 15 30 45 Tiempo catlisis de

CURVAS DE CALIBRACIN

PRODUCTO, SUSTRATO Y MICROORGANISMOS

Preparacin del Biuret Sustancia CuS04. 5H20 EDTA Kl Na(OH) (2.5N) Cantidad 1.5 g 6.0 g 1.0 g 300 mL

Solucin Estndar BSA: Albmina suero bovino (10g/L 10mL) Preparar las soluciones como se muestra:

Tubos

1 Solucin (ml) Biuret Solucin Estndar BSA H2O 8.0 2.0 0.0

2 8.0 1.6 0.4

3 8.0 1.2 0.8

4 8.0 0.8 1.2

5 8.0 0.4 1.6

6 8.0 0.0 2.0

Mezclar bien, dejar reposar por 30 minutos y luego leer en el colormetro a una longitud de onda (. = 550 nm). Realizar la curva Absorbancia versus concentracin. NOTA: Absorbancia = 2 - Lg Tramitancia

ALCOHOL

Partir de una solucin de etanol al 99.9 % y preparar las soluciones como se muestra: Tubos

1 Reactivos Etanol (ml) H2O (ml) 1 10

2 1 8

3 1 6

4 1 4

5 1 2

6 1 0

Mezclar bien, luego leer en el refractmetro el ndice de refraccin. Realizar la curva ndice de refraccin versus concentracin. SUSTRATO - DETERMINACIN DE GLUCOSA Y AZCARES REDUCTORES CON DNS (cido dinitro saliclico). Pasos para preparar DNS: Disolver 1.6 g de NaOH en H2O destilada. Adicionar 30 g de tartrato de Na y K Adicionar 1 g de DNS Aforar a 100 mL con H2O destilada Almacenar en frascos mbar a 4 C Stock de glucosa 4 mg/mL, preparar 50 mL y distribuirlos en ependorf, almacenar a 4C Curva:

No Dilucin Glucosa mL stock H2 destilada mL Volumen total Muestras:

1 0.025 0.475 0.5

2 0.05 0.450 0.5

3 0.075 0.425 0.5

4 0.1 0.4 0.5

5 0.125 0.375 0.5

6 0.15 0.35 0.5

Tomar 0.5 mL de cada dilucin y agregar 0.5 mL de reactivo DNS. Preparar una muestra blanco por dilucin de 0.5 mL de H20 destilada a 0.5 ml del reactivo de DNS. Agitar todas las muestras. Colocar a ebullir las muestras en bao mana por 5 minutos. Enfriar con hielo. Adicionar 5 mL de H20 destilada. Agitar y dejar en reposo 15 min. Leer a 540 nm.

Realizar la curva Absorbancia versus concentracin. NOTA: Absorbancia = 2 - Lg Tramitancia

DETERMINACIN DE BIOMASA - LEVADURAS , HONGOS y BACTERIAS MTODO COLORIMETRICO Preparar una solucin de 1g / L de levadura (100 mL) Diluir la muestra patrn como se muestra

Tubos

1 Solucin (ml) Solucin de Levadura H2O 10 0

2 1 10

3 1 8

4 1 6

5 1 4

6 0 10

Leer en el colormetro a una longitud de onda (\= 640 nm). Realizar la curva Absorbancia versus concentracin. NOTA: Absorbancia = 2 - Lg Tramitancia

MTODO: CONTEO DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIA Sembrar 1 ml por vaciado en 5 cajas de petri, las muestras del 1 al 5, luego de 24 horas contar las colonias en cmara cuenta colonias. Las unidades resultantes al hacer las lecturas de colonias en esos equipos son: Ufc/ml (unidades formadoras de colonia / ml). CMARA DE NEWBAUER: Se lee en el microscopio a 40X. La cmara est dividida en secciones as: Se cuentan los campos 1, 3, 7,9, el nmero de microorganismos y se divide por 1 mm2, y por la profundidad dada en la cmara.

4 7

5 8

6 9

Los microorganismos resultantes se dividen por 4. Si se cuanta en el campo No 5, se calcula el numero de microorganismos y se divide por 1 mm2, y por la profundidad dada en la cmara. DETERMINACIN DE BIOMASA - HONGOS

Se realiza por tos mtodos: Peso seco Volumen de centrifugado

FERMENTACIN AEROBIA

OBJETIVO GENERAL: Medir todos los Parmetros Cinticos de la Fermentacin y Proponer un modelo cintico.

OBJETIVOS ESPECFICOS: Determinar la concentracin de Biomasa, Producto (Protena) y Sustrato (Glucosa) a lo largo de la fermentacin. Hacer las curvas de calibracin respectivas. Hacer la curva de crecimiento y determinar los parmetros cinticos. Proponer modelos que se ajusten a la fermentacin, proponer los parmetros cinticos apropiados.

MEDIO DE CULTIVO REACTIVO Peptona Universal Extracto de levadura Extracto de carne D(+)-Glucosa K2HP04 Hidrogencitrato diamnico Acetato sdico Sulfato de manganeso MgS04 Tween 80 (g/L) 10 4 8 20 2 2 5 0.04 0.2 1

INOCULO Ser suministrado por el profesor a partir de un cultivo en medio lquido MRS de Lactobacllus sp. El inoculo debe ser el 10% del volumen final de la fermentacin. FERMENTACIN AEROBIA Realizar el montaje tal como lo muestra la Figura 1

Figura 1. Montaje de la fermentacin Nota: La aireacin puede ser suministrada mediante un compresor o por agitacin. TOMA DE MUESTRAS

Se toman 10 mL de muestra cada hora durante 1

das. Inmediatamente

despus de la recoleccin las muestras deben ser centrifugadas durante 5 min.; el sobrenadante debe cambiarse a otro tubo de ensayo para evitar que la biomasa centrifugada siga aumentando. Almacene las muestras, tanto el centrifugado como el sobrenadante, a 4C.

DOSIFICACIN DE LAS MUESTRAS El sobrenadante es empleado para medir sustrato (glucosa), producto (protena) y pH. El precipitado es resuspendido en 10 mL de agua destilada para medir biomasa (Lactobacillus sp.). (Procedimientos similares a las de las curvas de calibracin). DILUCIONES De cada una de las muestras para cuantificar sustrato y producto, hacer una dilucin 1/5, 1/10, 1/100. Leer protena, sustrato y biomasa en el colormetro a sus respectivas longitudes de onda. INFORME

Hacer la curva de Crecimiento de Biomasa. Graficar X, S, P, pH vs tiempo. Determinar Max y Ks. Encontrar los parmetros cinticos tanto de crecimiento como de formacin de Productos de los siguientes datos tomados en el laboratorio X, S, P y t.

LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES MICROPROPAGACION

INTRODUCCION. Una tcnica del cultivo de tejidos vegetales que sea til en el mejoramiento de las plantas y en los programas de produccin de semillas, es el procedimiento de la propagacin in Vitro, basado en la proliferacin de explantes de pices o en la produccin de pices adventicios. Cientos de plantas idnticas (clones) pueden ser producidos de hibridaciones y/o de semillas en un periodo relativamente corto usando estos procedimientos. Las lneas obtenidas pueden incluir esterilidad masculina, tipos de flores femeninas, y lneas que sean autoincompatibles. La tcnica de la propagacin in Vitro podra por ejemplo, eliminar la necesidad de guardar lneas restauradoras o poblaciones de plantas las cuales segregan por virtud del rgimen de las restauradoras. Dos mtodos son comnmente usados para lograr una multiplicacin rpida de una planta seleccionada. Primero, mediante la proliferacin de yemas sub-terminal de los pices o en segundo lugar, colocando tejidos de la planta en cultivo e inducir pices adventicios. mantenida, los pices son los que deben ser empleados. En un esquema de propagacin donde la integridad de la capa histognica debe ser

OBJETIVO

Familiarizarse con la tcnica del cultivo de tejidos, equipos, formulacin de medios y estrategias para llevar a cabo la propagacin in Vitro va la formacin de pices adventicios en tomate de rbol y lulo.

MATERIALES Y METODOS Los estudiantes trabajarn independientemente en la ejecucin de los

experimentos. A cada estudiante se le suministrar el material necesario, medio de cultivo semislido preparado y el equipo indispensable. Preparacin de los explantes. Los explantes a usar sern de plntulas in Vitro, de modo que no necesitarn de limpieza del tejido. Tome de la plntula microestacas (explantes) con al menos dos nudos y simbrelos en el medio de cultivo. Cuide de mantener la polaridad adecuada de la plntula. Mantenga siempre la asepsia mientras se encuentre trabajando.

Tratamientos. 1 MS MS + 0.5 BAP + 0.5 IBA MS + 0.1 BAP + 0.5 IBA MS + 0.5 BAP + 0.1 IBA 5 repeticiones por tratamiento y 5 explantes por unidad experimental, siendo la unidad experimental un frasco tipo compota.

TOMA DE DATOS Y REPORTE

Use el formato para reportar sus resultados y observaciones. Responda las preguntas sobre la Micropropagacin. Examine sus cultivos peridicamente para determinar las respuestas a las concentraciones y combinaciones de los reguladores de crecimiento.

LABORATORIOS

BIOTECNOLOGIA

UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA FACULTAD DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL MONTERIA