Lectura 8 Centrómero de Vertebrados

“Año del Bicentenario, de la consolidación de nuestra
Independencia, y de la conmemoración de las heroicas batallas

de Junín y Ayacucho”
UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO
VILLAREAL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMATICA
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGIA
INFORME N°3: CUANTIFICACION DE ADN
ASIGNATURA: BIOLOGIA MOLECULAR I

DOCENTE: Mg. Maribel Riveros Ramírez
ESTUDIANTE:
Ponce Flores, Mariela Giuliana
2024- I
0
INTRODUCCION
La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR, es una

técnica de biología molecular cuyo objetivo es obtener un gran número de
copias de un fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN). La PCR con
transcripción inversa (RT-PCR) es una variante de la PCR convencional
donde se utiliza ácido ribonucleico (ARN) como molde para sintetizar ADN
complementario (ADNc), con el que posteriormente se realiza la PCR
correspondiente. El ARN es un material susceptible a la degradación debido
a la acción de las ribonucleasas. En general, se obtiene muy poca cantidad,
por lo que cuantificarlo implica perder una parte apreciable del ARN. Los
espectrofotómetros convencionales utilizan grandes volúmenes de muestra
y aunque es posible realizar una dilución, se compromete la concentración
que en ocasiones puede llegar a no ser detectable. Se estudió sangre
medular de 10 pacientes con diferentes entidades hematológicas. El
volumen del aspirado varió entre 5 y 8 mL. La extracción y purificación de
ARN se realizó de forma manual. La cuantificación se realizó en un
espectrofotómetro de volumen múltiple utilizando solo 2 µL de muestra. Se
realizó lectura de densidad óptica a 260 y 280 nm, para medir ácidos
nucleicos y proteínas, respectivamente. La integridad del ARN se analizó
mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 2 % con bromuro de
etidio como marcador de fluorescencia. Las concentraciones variaron
desde 444,4 a 2515,5 ng/µL. La razón de pureza varió entre 1,111 y 2,091. No
se observó degradación total de ninguna de las muestras. Son múltiples los
factores que pueden afectar el rendimiento y la preservación del ARN, por lo
que el análisis integral de su cantidad y calidad se hacen imprescindibles
para llevar a cabo la transcripción inversa y las posteriores PCRs, de manera
exitosa.(1)
La técnica de PCR en tiempo real (PCR-TR) permite visualizar de forma
inmediata cada ciclo de amplificación, a través de la aparición de una señal
de fluorescencia, que permite determinar la concentración de ADN presente
en una muestra. La cantidad de ADN de un microorganismo, al igual que la
concentración de un gen en una muestra, se evalúan mediante la
determinación de un valor Ct (Ciclo umbral) en cada ciclo de amplificación.
Este valor Ct es el ciclo de la PCR en el cual la fluorescencia es detectada y
se correlaciona con la concentración del producto de ADN amplificado. Así,
el valor Ct es inversamente proporcional a la cantidad de ADN presente en
una muestra, lo que significa que una alta concentración de ADN tendrá un
valor Ct menor que se expresa y visualiza tempranamente (por una señal de
1
fluorescencia). En la PCR-TR, los fluorocromos como el SYBR Green o
sondas marcadas, son adicionados a la reacción de PCR para producir las
señales de fluorescencia. El SYBR Green produce estas señales
fluorescentes cuando se une al ADN de doble cadena (ADNds), con lo cual
si se obtienen productos inespecíficos, estos generan fluorescencia junto
con la del amplicón deseado. Con el fin de obtener valores de Ct producto
de amplificaciones específicas, se determina la temperatura de disociación
(Tm) de los amplificados. En ésta temperatura la mitad del ADN amplificado
se encuentra denaturado, donde fragmentos largos tienen una Tm mayor a
la de los fragmentos cortos, y también puede aumentar si el fragmento tiene
mayor contenido de guanina y citosina. Cuando una reacción de PCR es
inespecífica se obtienen varias temperaturas, por lo tanto un valor de Ct es
correcto cuando se reporta una sola temperatura de disociación en cada
reacción de PCR-TR. La eficiencia de una reacción de PCR-TR se determina
con una curva de calibración, realizada con diluciones seriadas de una
concentración de ADN conocida y sus valores de Ct. Dicha eficiencia debe
ser aproximadamente 2 o cercana al 100%, si estos valores no se obtienen,
se deben mejorar las condiciones de corrida de la reacción (2).
OBJETIVOS
Determinar la cantidad de ADN en las cepas de Escherichia coli
MATERIALES Y MÉTODOS
• Tubos de 1,5 mL y microtubos para PCR.

• Tips con filtro para 2 µL, 10 µL, 100 µL, 1000 µL.
• Micropipetas de 2 µL, 10 µL, 100 µL, 1000 µL.
• Rack para microtubos.
• H2O PCR.
• Reactivos del Kit de Promega (Buffer, dNTP, MgCl2, Enzima Taq
Polimerasa).
• Set de primers (Tabla 2).
• Muestras de ADN (controles y problema).
• Vortex.
• Termociclador.
• Agarosa.
• Buffer TBE 0.5X.
• Marcador de ADN.
• SYBR Safe
• Cámara de electroforesis.
• Fuente de poder.
2
CONCLUSIONES
• Se realizo la cuantificación de ADN en las cepas llevadas obteniendo

los siguientes resultados:
# Sample ID User name Date and Time Nucleic Acid Conc. Unit A260 A280
260/280 260/230 Sample Type Factor
1 bryan Cayetano 08/08/2024 12:14:13 p.m. 176.6 ng/µl 3.532 1.954 1.81 1.49 DNA
50
2 victor Cayetano 08/08/2024 12:17:15 p.m. 164 ng/µl 3.279 2.193 1.5 1.07 DNA
50
3 Sandra Cayetano 08/08/2024 12:19:37 p.m. 46.5 ng/µl 0.929 0.573 1.62 0.65
DNA 50
4 jhoanna Cayetano 08/08/2024 12:25:23 p.m. 97.7 ng/µl 1.954 1.007 1.94 1.12
DNA 50
5 alvaro Cayetano 08/08/2024 12:27:42 p.m. 141.1 ng/µl 2.822 1.978 1.43 0.76 DNA
50
6 marilu Cayetano 08/08/2024 12:29:42 p.m. 171.6 ng/µl 3.431 3.101 1.11 0.86 DNA
50
7 mariela Cayetano 08/08/2024 12:32:38 p.m. 174.1 ng/µl 3.482 3.046 1.14 0.95
DNA 50
• Se obtuvo buena cantidad de ADN por la mayoría de los participantes

Sandra tuvo la peor cantidad de ADN.
Imagen 1
3
• Bryan tuvo la mejor cantidad de ADN.
• Marilu y Mariela obtuvieron una cantidad de ADN mayor a 170 ng/µl.
DISCUSIONES
En el presente trabajo presenta diferentes concentraciones de ADN, esto

pueda deberse a una mala purificación de ADN, por los participantes.
Se pudo emplear otro método de extracción para maximizar la purificación
de ADN de todos los participantes.
La diferencia de ADN obtenido en bryan y Sandra pueda deberse a el manejo
de la muestra, siendo bryan más cauteloso y teniendo en cuenta las
medidas de bioseguridad.
REFERENCIA
1. Díaz-Alonso, Carmen, Garrote-Santana, Heidys, Amor-Vigil, Ana
María, Suárez-González, Yandi, & González-Mugica Romero, Raúl. (2013).
Cuantificación de ácido ribonucleico para la realización de la técnica de RT-
PCR. Revista Cubana de Hematología, Inmunología y Hemoterapia, 29(3),
298-303. Recuperado en 25 de agosto de 2024, de
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-
02892013000300010&lng=es&tlng=pt.
2. Phandanouvong L, Vienvilay, Betancourt L, Liliana, & Rodriguez V,
Fernando. (2010). Determinación y cuantificación de bacterias
acidolácticas por PCR en tiempo real. Revista MVZ Córdoba, 15(1), 1897-
1906. Retrieved August 25, 2024, from
http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0122-
02682010000100002&lng=en&tlng=es.

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La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR, es una

• Tubos de 1,5 mL y microtubos para PCR.

• Se realizo la cuantificación de ADN en las cepas llevadas obteniendo

• Se obtuvo buena cantidad de ADN por la mayoría de los participantes

En el presente trabajo presenta diferentes concentraciones de ADN, esto

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