04/11/2020

TEMA 2. NUEVAS METODOLOGÍAS

Y CONCEPTOS ANALÍTICOS
ESPECIES QUÍ MICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍ TI CA.
ANÁLI SI S DE ANALI TOS EN MATRI CES SÓLI DAS (I MAGI NG).
BI OANÁLI SI. METABOLÓMI CA,.
QUI MIOMETRIA

TENDENCIAS DE LA QUÍMICA
ANALÍTICA
• Catalogo no exhaustivo de las
tendencias más globales de la
Química Analítica partiendo de la
situación presente donde ya se
vislumbran
• De cada una de estas temáticas se
derivan otras muchas donde pueden
encontrarse los “nichos” donde
muchos químicos analíticos españoles
trabajan
• Que entre ellas existen relaciones
técnicas obvias
• Que algunas de ellas tienen un
marcado carácter transversal como
la interdisciplinariedad y la
responsabilidad social.

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ESPECIES QUÍMICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍTICA

• Los metales pesados forman parte de la corteza terrestre como

constituyentes naturales y se distribuyen por la
atmósfera, hidrosfera, litosfera y biosfera, a través de los ciclos
biogeoquímicos

ESPECIES QUÍMICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍTICA

• La forma en que se encuentra un contaminante en los sistemas

medioambientales o los organismos vivos va a influir
significativamente en sus propiedades y, en particular, en su
toxicidad, movilidad o biodisponibilidad.
• Además influirá en su acumulación, biomodificación, detoxificación
y excreción en los diferentes tejidos y, por tanto, en la
biomagnificación que se produce a lo largo de la cadena trófica.

El mercurio elemental apenas es tóxico por

vía oral, ya que su absorción es muy baja y
se elimina con mucha rapidez. En cambio,
en forma de vapor, es altamente tóxico
porque es absorbido rápidamente por los
pulmones pudiendo dar lugar a
intoxicaciones tanto agudas como crónicas

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ESPECIES QUÍMICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍTICA

• El mercurio es un elemento químico que

forma parte de la composición natural de la
corteza terrestre, y que también se
desprende al medio ambiente por
combustión en las actividades industriales.
• Es un metal muy persistente, permaneciendo
en la atmósfera hasta dos años, y
depositándose finalmente en la superficie
terrestre y acuática.
• Por acción microbiana (fitoplancton), el
mercurio se transforma en
metílmercurio, forma orgánica muy tóxica.
• Los peces pequeños ingieren el
metílmercurio que se acumula en su tejido
graso, y a su vez los peces más grandes y
depredadores se alimentan de los
pequeños, acumulando mayores
concentraciones de metílmercurio a lo largo
de su vida.

ESPECIES QUÍMICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍTICA

• Para evaluar la contaminación

• Para explicar la actividad biológica en
el medio ambiente y/o seres vivos

• no es suficiente la determinación de
contenidos totales, sino que se hace necesaria
la especiación en niveles de concentración del
orden de ultratrazas.

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ESPECIES QUÍMICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍTICA

Concepto de especiación

Definiciones (IUPAC) :

Especies químicas

Formas específicas de un elemento, definidas por su

composición isotópica, estado de oxidación y/o
forma molecular o complejo

Análisis de Especiación

Actividades analíticas para identificar y/o cuantificar

una o varias Especies químicas en una muestra

ESPECIES QUÍMICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍTICA

Necesidad de la especiación

-Diferentes impactos, comportamiento, toxicidad,

¿ Por qué ? movilidad, biodisponibilidad

Ejemplos de
toxicidad

Cr(III) y Cr(VI) Hg y MeHg As(III) y AsB

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ESPECIES QUÍMICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍTICA

Clasificación
• diferenciación de especies redox, una de
las cuales es a menudo tóxica, mientras
que la otra es prácticamente inocua o
incluso puede ser esencial.

• El segundo grupo está formado por

especies simples organoelementos (alquil y
aril). Las especies metilelemento suelen ser
de origen natural (excepto Pb y
parcialmente Hg) mientras que por lo
general, las especies con un número
elevado de átomos de carbono se
sintetizan con un propósito específico.

• El último grupo de interés en análisis de

especiación son los metalocompuestos de
elevada masa molecular, particularmente
importantes en química clínica y en
toxicología, así como en la industria
relacionada con la energía
(metaloporfirinas).

ESPECIES QUÍMICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍTICA

Ejemplos de compuestos organometálicos

Especies inorgánicas: As(III) As(V)

Arsénico
Especies orgánicas: MMA DMA AsB AsC

Especies inorgánicas: Se(IV) Se (VI)

Selenio
Especies orgánicas: seleaminoácidos
(SeMet, Se Cys)

Especies inorgánicas: Hg(0)

Mercurio
Especies orgánicas: MeHg, DMetHg

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ESPECIES QUÍMICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍTICA

Especies y campos de interés en los análisis de especiación

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ESPECIES QUÍMICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍTICA

Aspectos relacionados con el análisis de especiación

la estabilidad termodinámica
dos parámetros la cinética de transformación entre las diversas especies

es de vital importancia que el tiempo de análisis se ajuste al

tiempo de vida de la especie que queremos analizar.

la estabilidad cinética: afectada por pequeños cambios en las condiciones

equilibrios ácidobase, redox y de ambientales pueden modificar estos
complejación. equilibrios físico-químicos existentes

desarrollo de una nueva generación de menor número de etapas

métodos analíticos suficientemente sensibles posibles para evitar
y selectivos para permitir la contaminación, pérdidas y
modificaciones de los
identificación, caracterización y
equilibrios entre las especies
determinación de las distintas formas físico- presentes.
químicas en matrices complejas. 12

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ESPECIES QUÍMICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍTICA

Aspectos relacionados con el análisis de especiación

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ESPECIES QUÍMICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍTICA

Aspectos relacionados con el análisis de especiación

Toma de muestras y almacenamiento

PRINCIPALES PROBLEMAS:

- Representatividad y contaminación
- Interconversión de especies, pérdidas

• Actividad enzimática:
- Congelación (-20 ºC), ultracongelación (-80 ºC) , liofilización

• Contenedor:
- PE (polvo, temperaturas no muy bajas)
- PTFE (polvo, temperaturas bajas)
• Almacenamiento:
- Ajuste de pH, exposición a la luz, adición de 14
reactivos

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ESPECIES QUÍMICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍTICA

Aspectos relacionados con el análisis de especiación

Tratamiento de la muestra
PRINCIPALES PROBLEMAS:
- Recuperación cuantitativa
- Transformación de especies
- Etapa de clean-up

• Especies unidas a proteínas:

- Hidrólisis enzimática
• Extracción:
- Extractantes suaves (H2O, MeOH, EtOH)
- Energía (Tª , ultrasonidos, microondas)
- Extracción con Fluidos Supercríticos (SFE) 15

ESPECIES QUÍMICA Y MÉTODOS DE ESPECIACIÓN ANALÍTICA

Aspectos relacionados con el análisis de especiación

Análisis

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ESPECIACIÓN DE ARSÉNICO

• Especies de origen natural y biológico

Especies arsenito H3AsO3 As(III)

inorgánicas arseniato H3AsO4 As(V)

monometil arsénico (MMA)

Especies dimetil arsénico (DMA)
orgánicas arsenobetaína (AsB)
arsenoazúcares

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ESPECIACIÓN DE ARSÉNICO

compuesto LD50 (mg Kg-1)

Toxicidad del As
Arsina 3
Arsenito potásico 14
Estricnina* 16
más tóxico
As(III) As(V) Trióxido de As 20
Arseniato cálcico 20
Ácido fenil arsónico 50
más tóxico Atoxyl 75
Asorgánico Asinorgánico Arsfenamina 100
Melarsoprol 250
Ácido arsinílico 216
MMA 700-1800
DMA 700-2600
Aspirina* 1000-1600

* como comparación

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ESPECIACIÓN DE ARSÉNICO

Ciclo del arsénico

• En el medio marino hasta AsB

• En el medio terrestre hasta DMA

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ESPECIACIÓN DE ARSÉNICO

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ESPECIACIÓN DE ARSÉNICO

Hamilton PRP-X100, pH
6.0

Diagrama esquemático de una técnica instrumental híbrida involucrando HPLC- 21

ICP-MS y ejemplo de información obtenida para el análisis de especiación de As.

TRATAMIENTO DE MUESTRAS

desarrollo de estrategias que permitan:

1. reducir el tiempo de tratamiento de muestra Miniaturización/
2. y mejorar la eficiencia de los procesos de Automatización
extracción.

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TRATAMIENTO DE MUESTRAS
PURIFICACIÓN Y PRECONCENTRACIÓN DE
ANALITOS

Extracción líquido-líquido extracción en fase sólida

más aceptada, utilizada y versátil
instrumentación económica, sencilla, con
la LLE convencional consume grandes un consumo de disolvente relativamente
cantidades de disolventes orgánicos, de alto bajo, de fácil automatización y sin
coste y potencialmente peligrosos. formación de emulsiones.

baja recuperación de los analitos

técnicas de extracción miniaturizadas poca retención de los analitos
1. reducción de las dimensiones de la técnica
tradicional (extracción en vial)
2. nuevas modalidades de extracción como la
microextración en fase líquida (LPME)). microextracción en fase sólida (SPME)
• volúmenes muy pequeños de disolvente
orgánico
• manipulación de la muestra es mínima.

Nuevas fases adsorbentes

EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (SPE)

PARA ESPECIACIÓN

• La SPE se puede miniaturizar y automatizar mediante inyección en flujo (FI)

• Nuevos materiales adsorbentes: nanopartículas(propiedades químicas
superficiales)
• nanotubos de carbono
• Polímeros de impresión molecular

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EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (SPE)

PARA ESPECIACIÓN
empleo de nanopartículas como material adsorbente
◦ Nanotubos de carbono
◦ MIPs

MOLECULAR IMPRINTED POLIMERS

(MIPS)
Uno de los principales problemas con los que se encuentra el químico
analítico en la determinación de los contenidos de contaminantes en el
medio ambiente es la complejidad de las muestras a analizar.
etapa de extracción
etapa de limpieza adicional de los extractos

más eficaz cuanto más selectivo sea el

material empleado

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MIPS PARA LA EXTRACCIÓN DE

CONTAMINANTES

• La tecnología de impresión molecular

se basa en la síntesis de polímeros
altamente entrecruzados con
propiedades de reconocimiento
molecular selectivo hacia los
compuestos para los cuales fueron
generados.
• Dicho reconocimiento se basa en la
creación, durante el proceso de
polimerización, de cavidades que son
complementarias, en tamaño, forma y
funcionalidad química al analito que
fue empleado como plantilla en la
síntesis de los polímeros

¿QUÉ ES UN POLÍMERO DE IMPRONTA

MOLECULAR (MIP)?
• Se puede describir como una manera
de hacer “cerraduras artificiales” para
“llaves moleculares”

Los polímeros de impronta molecular 1. La especie a determinar se mezcla con

(MIPs) son redes poliméricas monómeros.
entrecruzadas en presencia de una 2. Los monómeros y la “molécula molde” se
molécula molde. La posterior unen entre sí.
liberación de la molécula molde 3. La adición de un entrecruzador fija la
permite la obtención de un material estructura del aducto en una red
nanoestructurado, con “memoria” tridimensional.
selectiva para el molde, y que simula 4. La eliminación de la molécula molde da
el reconocimiento molecular típico en lugar a la obtención de un material con
sistemas biológicos. “memoria selectiva” para dicha molécula

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VENTAJAS DE LOS MIPS

1. Selectividad y sensibilidad más alta que en los soportes

habituales.
2. Posibilidad de desarrollar MIPs frente a muy diversos analitos,
incluyendo especies para las que aún no se ha encontrado un
elemento de reconocimiento biológico.
3. Especificidad predecible teóricamente aunque, en la práctica, la
existencia de interacciones de carácter no específico hace difícil
su determinación.
4. Fáciles de preparar.
5. Pueden ser almacenados en atmósfera seca a temperatura
ambiente durante varios años.
6. Pueden ser reutilizados muchas veces.
7. Presentan elevada estabilidad mecánica, térmica y química
debido a su naturaleza fuertemente entrecruzada, por lo que
son muy robustos.

SPE CON NANOESTRUCTURAS DE

CARBONO

• Los nanotubos de carbono están

compuestos por átomos de
carbono.
• Su estructura es cilíndrica con
dimensiones nanométricas en su
diámetro (1 – 30 nm, según tipo) y
nano/micrométricas en su longitud
(10 nm – varios µm).
• Estructuralmente podemos pensar
que proceden del enrollamiento
de láminas de grafeno):
• cuando se trata de una sola lámina se
producen los “nanotubos de carbono
de pared simple” (SWCNTs)
• si son varias láminas se obtienen los
“nanotubos de carbono de pared
múltiple” (MWCNTs).

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SPE CON NANOTUBOS DE CARBONO

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SPE CON FULLERENOS:

AUTOMATIZACIÓN CON SISTEMA FIA

J. Muñoz, M. Gallego, M. Valcárcel “Speciation Analysis of Mercury and Tin Compounds in Water and Sediments by GC-MS
Following Preconcentration on C60 Fullerene”. Anal. Chim. Acta, 548, 66-72, 2005.

LIQUID PHASE MICROEXTRACTION

(LPME)

• procedimientos alternativos de extracción, entre los que destaca el uso de

membranas líquidas soportadas

todas las técnicas que comparten estas características de membranas liquidas se

suelen agrupar bajo la denominación de LPME (liquid phase
microextraction, LPME), una interesante alternativa a la SPE.

• Estas técnicas miniaturizadas han adquirido una enorme popularidad debido

a que los volúmenes de disolvente orgánico empleados son muy pequeños y
la manipulación de la muestra es mínima.

Principio de funcionamiento de separación

mediante membrana líquida

El funcionamiento general de una membrana líquida soportada,

consiste inmovilizar en el interior de los poros de un soporte
microporoso la fase orgánica o extractante, y por el exterior de
esta membrana se hacen circular la fase acuosa.
La muestra se encuentra en contacto con un lado de la
membrana y la membrana actúa como una barrera selectiva.
Los analitos pasan desde la fase donadora a través de la
membrana hasta la fase aceptora.

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LIQUID PHASE MICROEXTRACTION

(LPME)
(Single drop ME)

Dispersive LLME Hollow fiber LPME

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LIQUID PHASE MICROEXTRACTION

(LPME)

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ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING).
• El uso de imágenes químicas es un nuevo enfoque analítico que
permite la identificación espacial y la determinación cuantitativa de
las especies químicas en una muestra. En términos muy sencillos se
puede considerar como un mapa de un compuesto/s químico.

exploración espacial y temporal de los analitos

tecnologías analíticas de superficie y la

aplicación de técnicas de imagen molecular

comprender los procesos

metabólicos en los seres vivos

ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING).
• espectrometría de masas de imágenes (MSI)
• MSI es una forma de análisis de superficie, donde los iones son generados a
partir una superficie y detectados usando un espectrómetro de masas.
• Varios métodos:
• métodos basados en láser: la ablación láser inductivamente acoplado plasma-MS (LA-ICP-MS y
MALDI
• otras técnicas: la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS), desorción ionización por
electrospray (DESI)

En MSI basada en láser, la

superficie de interés se
irradia con un láser cuya
energía desorbe átomos y
moléculas de la superficie
de la muestra

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ANÁLISIS DE ANALITOS EN
MATRICES SÓLIDAS (IMAGING).

• espectrometría de
masas de imágenes
(MSI)
• Lo que diferencia a MSI de otros
experimentos de MS desorción/
ionización láser es que las
coordenadas espaciales, x e y, se
asignan a los espectros de masas
generados.
• Esta información espacial se
puede utilizar para hacer un mapa
de iones de la superficie
investigada, normalmente usando
una escala de colores para indicar
la intensidad de iones.

• Typical MSI workflow

ANÁLISIS DE ANALITOS EN
MATRICES SÓLIDAS (IMAGING).
espectrometría de masas de imágenes (MSI)
• Dos formas de adquisición:
• Microsonda:
• Una pequeña área de la muestra
se irradia con el láser y las
coordenadas y el espectro de
masas son registrado para este
locus. La muestra se mueve y el
proceso se repite muchas veces
para cubrir el área deseada para
ser analizada
• Los espectros individuales se
registran secuencialmente y se
combinan en un único conjunto
de datos
• Microscopio
• amplias áreas de tejido se
muestrean mediante un láser de
enfoque amplio,
• Los iones resultantes se detectan
usando un detector sensible a la
posición y al tiempo como TOF lo
que permite la determinación de
m / z y la distribución espacial
discreta de iones dentro del área
de la muestra.
• Se hacen múltiples mediciones de
los tejidos a través de la sección
de tejido completo con los datos
reconstruidos
computacionalmente para formar
un conjunto completo de datos.
Phytochem Rev (2016) 15:445–488

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ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING).
Espectrometría de masas

introducción Fuente Analizador

detector
de la muestra ionización de masas

Directamente iones en fase gaseosa : Separación de los Medida de las masas en un

acoplamiento a • ionización-desorción iones según su detector (fotomultiplicador
LC ó CE con láser asistida por relación o copa de Faraday)
matriz (MALDI) a partir de m/z : TOF, Q, TI obteniendo un espectro de
una muestra en estado masas que refleja la
sólido, abundancia de los iones
•ionización mediante frente a su valor m/z.
electrospray (ESI) de una
muestra en solución espectrómetros de masas en tandem

fragmentación opcional de determinados iones seleccionados, mediante descomposición

metaestable o mediante disociación inducida por colisión (CID).
Combinando dos analizadores iguales o diferentes.

ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING).
espectrometría de masas de imágenes (MSI): técnicas de ionización
Principals of different ionization sources used for MSI
imaging of plant tissues
A Secondary ion mass spectrometry (SIMS) showing
primary ion beam impacting surface and generating
secondary ions

B matrix assisted laser desorption ionization (MALDI)

with UV laser photons absorbed by matrix layer causing
desorption and ionization

C desorption electrospray ionization (DESI) showing

electrospray stream and desorbed ions,

D laser ablation electrospray ionization (LA-ESI) showing

ablation plume and secondary ESI stream generating
multiply chargedi ons,

E laser ablation inductively couple plasma (LA-ICP)

showing ablation plume transferred through ICP to
generateions,

F nano-desorption electrospray ionization (nano-DESI)

demonstrating micro-extraction and liquid junction
followed by nano-ESI,

G liquid extraction surface analysis (LESA) showing

localized extraction and ionization through ESI capillary,

I MALDI-2 showing primary MALDI sourcecoupled to secondary MALDI laser inducing H low temperature plasma showing plasma beam ionizing
secondary ionization in the ablation plume. surface metabolites,

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ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING).
Ionización/desorción por láser asistida por matriz (MALDI)
utilizan pulsos de luz láser de nanosegundos en la frecuencia del ultravioleta (nitrógeno a 337 nm) o del infrarrojo
lejano para desorber e ionizar una muestra previamente cristalizada en una placa junto a un compuesto
denominado matriz (constituida por moléculas orgánicas pequeñas)

Funciones de la matriz:
-incorporación y dispersión de las moléculas de analito
- absorción de la energía de radiación para producir iones del analito a través de una
serie de reacciones de tipo fotoquímico.

grupos aromáticos, para absorber la radiación láser, y un

grupo hidroxilo (-OH) en posición orto respecto a un grupo
carbonilo (-OOH, - CO, -CONH2), para facilitar la
transferencia protónica.

ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING).
Ionización/desorción por láser asistida por matriz (MALDI)
Uno de los mecanismos más aceptados para explicar la
ionización por MALDI es un proceso fotoquímico

la radiación láser es absorbida por las

moléculas de la matriz generándose una
nube en la que hay iones, moléculas neutras
y agrupamientos de estas.
Los iones de los analitos se formarían por
protonación, desprotonación, o
cationización tras el choque con iones de la
matriz en la fase gaseosa .
Se producen así iones monocargados
estables, aunque también se observan iones
con dos o más cargas en el caso de
proteínas con pesos moleculares superiores
a 5 kDa.
Con esta técnica pueden detectarse
proteínas de más de 300 kDa.

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ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING)
Tradicionalmente, la fuente de ionización MALDI se suele acoplar con
analizadores de tiempo de vuelo (TOF), constituyendo este sistema MALDI-TOF
(MALDI-TOF) un método estándar para el análisis de péptidos y
proteínas, caracterizándose por su alta sensibilidad, robustez, sencillez de
manejo y capacidad de automatización, así como por su alta tolerancia a
contaminantes.

Los iones formados en la fuente se aceleran mediante la

aplicación de un campo eléctrico para, a
continuación, ser separados en un tubo de vuelo a alto
vacío, en el que se desplazan libremente sin ser
sometidos a ningún campo eléctrico o
magnético, gracias a la energía cinética que adquirieron
en la fuente.
Estos iones adquieren la misma energía cinética durante
la aceleración, pero su velocidad, y por tanto el tiempo
que tardan en atravesar el tubo de vuelo, varía.
Este tiempo depende de su relación m/z y de su energía
cinética. Como la energía cinética es constante para un
voltaje de aceleración dado, la medida del tiempo de
vuelo de un ión permite determinar de forma muy
precisa su m/z.

ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING)
MALDI
Schema of MALDI-MSI.
(a) Tissue sampling.
(b) Preparation of fresh-frozen sample.
(c) Sectioning. Preparation of rice section is
needed to use adhesive film.
(d) Application of matrix.
(e) Laser scanning.
(f) Obtaining mass spectrum.
(g) Data mining (if necessary).
(h) Visualization of the distribution of molecules of
interest.
(i) Identification can be performed by MS/MS on
tissue section.

Y. Yoshimura et al. / Food Chemistry 210 (2016) 200–211

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ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING)
MALDI

ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING)
MALDI Lipidómica:
Los lípidos son un grupo importante
de biomoléculas que pueden ser
biomarcadores de enfermedades
-infarto
-tumores
Examples showing possible applications of MALDI MSI.
Imaging of the pharmaceutical compound olanzapine
from a whole-body rat section, imaging of a
lysophospholipid (B) and another phospholipid (C) from a
myocardial infarction model quantitative imaging of b-N-
methylamino-L-alanine (L-BMMA) from brain sections (D:
MS images of L-BMMA from the different brain samples (A1:
different concentrations spotted on control brain, A2 and
A5: brain of untreated control animals, A3 and A6: brain of
animals dosed with 150 mg/kg L-BMMA, A4 and A7: brain
of animals dosed with 460 mg/kg L-BMMA), E: calibration
curve of L-BMMA obtained from sample A1, F: L-BMMA
concentration in the whole brain section (samples A2-A7)
and in different areas of the brain samples (Cx: cortex,
CPu: Caudate-Putamen, Cb: Cerebellum); reproduced
with permission from [103]).

A. Kiss, G. Hopfgartner / Methods 104 (2016) 142–153

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ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING).
Ablación láser - plasma de acoplamiento Inductivo - espectrometría de
masas (LA-ICP-MS)

• La técnica de LA-ICP-MS es una técnica multielemental que ha sido

utilizada para el mapeo de la distribución de elementos en muestras
ambientales y biológicas, incluidos los tejidos vegetales, desde 1992.
• La aplicación de esta técnica abarca campos tan variados como la
biomedicina (análisis de metales traza en riñón y corazón de
ratón, ganglios linfáticos y tejidos del sistema respiratorio, cáncer de
próstata y mama, y en secciones cerebrales), la paleozoología (análisis
de dientes y huesos provenientes de fósiles prehistóricos) o la
climatología (análisis de núcleos de hielo antárticos).
• LA-ICP-MS es una técnica que permite el análisis elemental e isotópico
de sólidos con una resolución lateral y en profundidad en el rango de
unas pocas micras y milímetros, respectivamente. Además de las
importantes ventajas del ICP-MS (robustez, rapidez, bajos límites de
detección), la ablación láser ICP-MS ofrece un manejo sencillo y
rápido, sin preparación de muestras y un amplio rango lineal para llevar
a cabo la cuantificación, permitiendo la adquisición simultánea de
elementos mayoritarios, minoritarios y traza.

ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING).
Ablación láser - plasma de acoplamiento Inductivo - espectrometría de
masas (LA-ICP-MS)

• La ablación láser consiste en la atomización de la

muestra de interés por medio de un láser de alta
potencia. El haz láser impacta en la superficie de
la muestra dispuesta en una celda de ablación
en una atmósfera inerte (como por ejemplo
Argon o Helio) a presión atmosférica.
• El haz convierte instantáneamente la zona de
impacto de la muestra sólida en un aerosol de los
constituyentes en fase vapor, el cual es
transportado por una corriente de Ar o He hacia
la fuente de ionización del ICP-MS.
• El aerosol generado por el láser es entonces,
atomizado e ionizado. Finalmente los iones
cargados positivamente pueden ser analizados
utilizando diversos tipos de espectrómetros de
masas (por ejemplo, cuadrupolo, tiempo de
vuelo, sector magnético o multicolector) en los
que se detectarán y separarán por su diferente
relación masa/carga.

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ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING).
Ablación láser - plasma de acoplamiento Inductivo - espectrometría de
masas (LA-ICP-MS)

• Esquema de un equipo LA-ICP-MS

ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING).
Ablación láser - plasma de acoplamiento Inductivo - espectrometría de
masas (LA-ICP-MS)

• Los láseres más comúnmente utilizados en aplicaciones analíticas están

basados en la amplificación de luz en un medio gaseoso o sólido que se
encuentra situado entre dos espejos paralelos. El haz láser es generado
aplicando una fuente de energía externa que excita los átomos o moléculas
de este medio y hace que emitan radiación monocromática, coherente y
colimada de alta energía.

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ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING).
Ablación láser - plasma de acoplamiento Inductivo - espectrometría de
masas (LA-ICP-MS)
• diseño de la celda de ablación
• (1) cuerpo de poliamida, aislante térmico y eléctrico
excelente.
• (2) En el centro de la tapa hay un cristal recubierto de
cuarzo.
• (3) La muestra a analizar es colocada en una platina
microscópica (3) que a su vez se encuentra en la
plataforma de un plato de cobre de alta pureza (4).
• El plato de cobre es refrigerado por un sistema de
refrigeración interno circular que incluye ocho
pequeños peltiers (5) situados justo debajo del plato y
que se controla mediante un termopar flexible (6).
• La celda dispone además de un intercambiador de
calor externo (7) para extraer el calor generado que
se localiza debajo del sistema de refrigeración
interno.

ANÁLISIS DE ANALITOS EN MATRICES

SÓLIDAS (IMAGING).
Ablación láser - plasma de acoplamiento Inductivo - espectrometría de
masas (LA-ICP-MS)
CLOROSIS FÉRRICA EN PLANTAS
• Cuando una planta se
desarrolla en un suelo
calcáreo, presenta síntomas de
clorosis férrica como
consecuencia de que el Fe ha
precipitado y no se encuentra
en una forma disponible para
ser absorbida por las plantas.
En la planta la clorosis se
observa por el amarilleo total o
parcial de las hojas jóvenes
mientras los nervios aparecen
verdes.
• El desarrollo de técnicas
avanzadas de análisis que
permiten la detección
específica de bajas
concentraciones de Fe, no sólo
en la zona de crecimiento sino
también en el tejido vegetal es
importante para optimizar el
aporte de fertilizante

27
 04/11/2020

BIOANÁLISIS
• Bioanálisis es una tendencia químico-analítica bien consolidada
• Definición: difícil
1. Cuando la muestra es de naturaleza bioquímica o biológica: orina, tejido
animal o vegetal, líquido cefalorraquídeo, etc.
2. Cuando el analito es bioquímico o biológico: proteínas
(Proteómica), metabolitos (Metabolómica)
3. Cuando alguna de las herramientas involucradas en el proceso analítico
son de naturaleza bioquímica o biológica: enzimas inmovilizadas en una
amplia variedad de soportes, o de tejidos animales o vegetales.

BIOANÁLISIS
Selección del procedimiento analítico

Dos posibles enfoques

1. Análisis en base a una hipótesis (TARGET ANALYSIS)

2. Análisis generador de una hipótesis (NON-TARGET

ANALYSIS)

Selección de la metodología analítica más adecuada

56

28
 04/11/2020

TARGET ANALYSIS

Definición: análisis de un conjunto de analitos, preestablecidos en

función del problema que se quiere resolver

Análisis siempre (semi)cuantitativo, no cualitativo

Procedimientos de análisis bien establecidos (a menudo normalizados)

Procedimientos de análisis sensibles y selectivos para los analitos de

interés

57

TARGET ANALYSIS

WORKFLOW

1. Muestreo

2. Tratamiento de la muestra
1. Extracción
2. Purificación
3. Preconcentración

3. Análisis

58

29
 04/11/2020

TARGET ANALYSIS

ÁCIDOS GRASOS LIBRES EN SUERO SANGUÍNEO

Los ácido grasos son compuestos lipídicos con numerosas funciones en

los seres vivos:
• Función energética (β oxidación lipídica)
• Función estructural (fosfolípidos de membrana)
• Función reguladora (inflamación, estrés oxidativo)

Gran importancia en la salud:

• ácidos grasos saturados vs insaturados (grasas trans)
• ácidos ω3 y ω6 (envejecimiento)

59

TARGET ANALYSIS

ÁCIDOS GRASOS LIBRES EN SUERO SANGUÍNEO

Procedimiento analítico: extracción del suero y derivatización

para posterior análisis por cromatografía de gases

1. Muestreo: extracción sanguínea y obtención de suero

mediante coagulación de los glóbulos rojos

2. Tratamiento de muestra
1. Eliminación de proteínas (adición de ácido o disolventes
orgánicos)
2. Extracción de los ácidos grasos (LLE acetato etilo)
3. Preconcentración (evaporación con N2)
4. Derivatización (formación de compuestos volátiles):
formación de ésteres metílicos mediante la adición de
metanol y ácido sulfúrico
60

30
 04/11/2020

TARGET ANALYSIS

ÁCIDOS GRASOS LIBRES EN SUERO SANGUÍNEO

1. Muestreo
2. Tratamiento de muestra
3. Análisis: separación de los distintos analitos mediante
cromatografía de gases y detección con FID ó MS

1, C14:0; 2, C16:0;
3, C16:1; 4, C17:0;
5, C18:0; 6, C18:1;
7, C18:2; 8, γ-C18:3;
9, C18:3; 10, C20:2;
11, C20:4; 12, C20:5;
13, C22:5; 14, C22:6;
15, C24:0; 16, C24:1

61

NON TARGET ANALYSIS

Definición: análisis masivo de un gran número de analitos, no dirigido a

un compuesto o familia en particular

Análisis tanto (semi)cuantitativo como cualitativo

Requiere de procedimientos analíticos genéricos, que permitan el

estudio del mayor número posible de compuestos

62

31
 04/11/2020

NON TARGET ANALYSIS

Obtención de perfiles (fingerprints) amplios de analitos que

permitan estudiar sistemas complejos

Útil en investigación “básica”, en el descubrimiento de los

procesos subyacentes (frente al análisis dirigido, investigación
“aplicada”)

Normalmente basado en análisis comparativo: comparación

de perfiles para varios grupos de estudio relacionados

63

NON TARGET ANALYSIS

APLICACIONES

• Etiología de enfermedades
• Biomarcadores de enfermedades
• Mecanismos de acción de tóxicos o fármacos
• Estudios nutricionales
• Estudios epidemiológicos
• Análisis medioambiental
• Caracterización de productos

64

32
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NON TARGET ANALYSIS

WORKFLOW

1. Muestreo

2. Tratamiento de la muestra

3. Análisis

4. Interpretación de resultados

65

NON TARGET ANALYSIS

Interpretación de resultados

Comparación de un elevado número de variables entre

distintos grupos de estudio

ANÁLISIS MULTIVARIANTE

• Visualización de diferencias o parecidos entre grupos

• Búsqueda de variables que causan las diferencias entre los
grupos
• Construcción de modelos predictivos

66

33
 04/11/2020

NON TARGET ANALYSIS

NON TARGET ANALYSIS

CIENCIAS ÓMICAS

Estudio global de los distintos componentes biológicos

68

34
 04/11/2020

NON TARGET ANALYSIS

CIENCIAS ÓMICAS

1. GENÓMICA

Estudio integral del genoma: aunque contiene toda la

información necesaria para el funcionamiento de un
organismo, muchos genes no se expresan

Lo que puede que ocurra

2. TRANSCRIPTÓMICA

Estudio del ARN transcrito por expresión génica, que

puede desembocar en síntesis de proteínas

Lo que parece que ocurre

69

NON TARGET ANALYSIS

CIENCIAS ÓMICAS

3. PROTEÓMICA

Estudio del conjunto de proteínas expresadas:

información no completa, ya que muchas proteínas
sufren modificaciones postraduccionales

Lo que hace que ocurra

4. METABOLÓMICA

Estudio de todos los metabolitos que directamente

intervienen en las distintas rutas metabólicas

Lo que está ocurriendo

70

35
 04/11/2020

CIENCIAS ÓMICAS
visión holística de los procesos biológicos

Bioinformatics
Meta
bolomics
Cheminformatics

Proteomics Systems
Biology
Genomics

CIENCIAS ÓMICAS

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METABOLÓMICA

La metabolómica estudia el conjunto de los metabolitos (moléculas de

bajo peso molecular, <1500 Da) que participan en los procesos celulares
Mientras que la genómica y la proteómica nos indica la probabilidad de
que un proceso ocurra, la metabolómica proporciona información de lo
que realmente está ocurriendo, ya que en el perfil metabolómico además
de la expresión génica intervienen los factores externos (alimentación,
ejercicio, etc)

Metabolomics
Environmental Influence

8000
Chemicals
Proteomics The Pyramid of Life
7500 Enzymes

Genomics
25,000 Genes
73

METABOLÓMICA

Ácidos
Carbohidratos orgánicos
Glicerolípidos

METABOLOMA
Aminoácidos
Esteroles

Fosfolípidos Ácidos grasos

74

37
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METABOLÓMICA

Metaboloma

• Gran variedad de metabolitos, de muy diversa naturaleza química

• Amplio rango de concentraciones (pM-mM)
• Variabilidad temporal e individual

DISEÑO EXPERIMENTAL

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METABOLÓMICA
WORKFLOW

76

38
 04/11/2020

METABOLÓMICA

TRATAMIENTO DE MUESTRA

Procedimientos genéricos: evitar pérdidas de determinados

metabolitos

Extracciones no selectivas

Evitar el uso de aditivos (interferencias en análisis)

Evitar etapas de purificación

Preconcentración??

77

METABOLÓMICA

TÉCNICAS DE ANÁLISIS
• Sensibilidad
• Especificidad
• Rango de aplicabilidad

Resonancia Espectrometría de
magnética nuclear masas (MS)
(RMN)

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39
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METABOLÓMICA
RMN MS
High-throughput Elevada sensibilidad
fingerprinting Elevada selectividad
Preparación de muestra Fácil acoplamiento a sistemas de
simple separación
No discriminante Muestras complejas
No destructivo
Preparación de muestra
Baja sensibilidad Discriminación en el análisis
Mezclas complejas (introducción de muestra, sistema
de ionización)

79

METABOLÓMICA
PREPROCESADO DE LOS DATOS

1. Búsqueda de los picos

(deconvolución)

2. Alineamiento: corrección
variabilidad en tr
3. Normalización: corrección
variabilidad en sensibilidad

TÉCNICAS BIOINFORMÁTICAS
80

40
 04/11/2020

METABOLÓMICA
TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS

Reducir la complejidad de la
Análisis multivariante
matriz de datos para su posterior
interpretación

Búsqueda de las estructuras latentes (componentes): combinaciones

matemáticas de las variables originales, capaces de explicar la
variabilidad original de los datos

Métodos no supervisados (PCA) Métodos supervisados (PLS-DA)

• Muestra la varibilidad • Construcción de modelos
sistemática analítica de la estadísticos de clasificación y
experiencia predicción

81

METABOLÓMICA
TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS

PCA 10
outlier

5
t[2]

-5

-10

-10 0 10
t[1]

10
PLS-DA 8

2
Diferencias
metabolómicas entre los
t[2]

-2

-4
grupos de estudio
-6

-8

-10
-11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
t[1]

82

41
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METABOLÓMICA

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Identificación de metabolitos alterados

• Selección mediante estudio de los modelos estadísticos (PLS) y
estadística univariante (t test, ANOVA)
• Identificación mediante MS/MS y búsqueda en bases de datos

Interpretación bioquímica
• Marcadores de diagnóstico
• Marcadores toxicológicos
• Estudio de patología de enfermedades

83

METABOLOMIC INVESTIGATION OF
ALZHEIMER’S DISEASE

Journal of Proteome Research

42
 04/11/2020

QUIMIOMETRIA

• Definiciones
Svante Wold empleó la palabra “chemometrics” en 1972 para
describir la disciplina de extraer información química relevante
partiendo de un sistema químico experimental
En 1975, la International Chemometrics Society (ICS) la definió como:
...la disciplina química que utiliza métodos matemáticos y estadísticos
para diseñar o seleccionar procedimientos de medida y experimentos
óptimos, y para proporcionar la máxima información química mediante el
análisis de datos químicos.

En 1997, Massart et al. dio la siguiente definición:

“La quimiometría es la parte de la química que se sirve de las matemáticas,
estadística y lógica formal para: diseñar o seleccionar procedimientos
experimentales óptimos; proporcionar información química relevante a partir
del análisis de señales analíticas y, finalmente, adquirir conocimiento de los
sistemas químicos”.

QUIMIOMETRIA

Muestreo y Optimización Tratamiento de Análisis e

métodos instrumental datos Información de
conjuntos de datos

¿Conjunto de datos iguales o

Calibración equipos distintos?
Exactitud y Precisión.
Análisis ANOVA
Recogida de muestras Distribución

Gráficas de Shewhart Cálculo estimadores Interlaboratorios

Validación de métodos
(verificación equipos)
Medida ± Incertidumbre

Calidad de medida:
Cálculo de incertidumbre

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 04/11/2020

CONTEXTO: ESQUEMA DEL

PROCESO ANALÍTICO GENERAL
• El proceso analítico comienza con un problema
que tenemos que resolver y para resolverlo
necesitamos información química

¿ESTE ALIMENTO TIENE NIVELES DE

METALES TÓXICOS POR ENCIMA DEL
VALOR PERMITIDO?

ETAPAS
1.a selección del método

1. DESARROLLO DEL MÉTODO

1.b optimización

2.a preparación de muestra

2. DETERMINACIÓN 2.b medida (cromatografía,

espectrometría, ..)

3.a adquisición de datos

3.b señal → información química

3. INTERPRETACIÓN DE DATOS
3.c información química →
información útil

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SELECCIÓN DE MÉTODOS

• Comparar varios métodos de acuerdo a sus

características de funcionamiento:
• Exactitud
• Precisión

S (%) (p/p)
3,29
Análisis 3,22
3,30
3,23
Carbón Analizador S
Material Referencia Certificado Media 3,26
NIST 3,19 % S (p/p) s 0,04

Media-MRC= 0,07%

SELECCIÓN DE MÉTODOS
MÉTODO A
Centeno

n= 5
x = 1,48 mg/kg ¿Estos métodos están
S = 0,28 mg/kg dando resultados
comparables ?

¿La diferencia se debe a

MÉTODO B solo a errores
aleatorios?
n= 5
x = 2,33 mg/kg
¿Concentración Cr? S = 0,31 mg/kg

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 04/11/2020

OPTIMIZACIÓN
Desarrollo procedimiento analítico

Efecto de algunos factores y la interacción entre ellos sobre los

resultados
En un procedimiento colorimétrico se investiga el efecto
sobre la absorbancia de :
1. Concentración de un reactivo A
2. Concentración de un reactivo B
3. La temperatura de reacción

Podremos investigar si un factor o una

combinación de factores (interacción) tiene una
influencia significativa sobre la respuesta.

Diseño y Optimización de
experimentos

OPTIMIZACIÓN
Determinación de Cu en muestras de suelos (2 factores)

¿Cómo procedemos para

conocer si los dos factores
influyen o no?

Si hay influencia ¿cual de

ellos es el responsable en
mayor medida?

Factor A
procedimientos de mineralización de la muestra

Factor B
Diferente tipo de desecado

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 04/11/2020

OPTIMIZACIÓN

5
4,1
4 3,4
3
2,8
Variación de medida

Ejemplo
(concentración)

2
1,1 1,0
1 El factor que más influye
0 (más sensible) es el
-1 A B C D E F G cambio de volumen de
-2
HCl de digestión de 40 a
-1,8
-3
20 ml.
-3,2
-4
Factor

INTERPRETACIÓN DE DATOS
Hay que establecer la relación
Señal / Concentración

Muestra Concentración?
Calibración

Patrón primario certificado

Patrones secundarios de concentraciones conocidas o
Patrones primarios certificado

Interpolar la señal en la
curva de calibración

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 04/11/2020

INTERPRETACIÓN DE DATOS

Niveles máximos/mínimos permitidos

Contaminación
Producción fábrica
Dopaje deportistas…
Verificación métodos
Utilización de patrones certificados
Etc.

µMax.permitido
¿Son la misma
medida?
Son pruebas para
Xmedido evaluar la exactitud
(detección de un
sesgo)

TIPOS DE DATOS
Atendiendo a la estructura de datos y los ámbitos de aplicación

UNIVARIANTES Análisis una única

variable por muestra

Estadística univariante clásica

Análisis exploratorio
Descriptiva
Estimación incertidumbres
Contraste simple de hipótesis…

Calidad medida
Calibraciones instrumentales
Validaciones métodos

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 04/11/2020

TIPOS DE DATOS
BIVARIANTES
Cromatografía de HPLC
gases (GC)
Análisis dos variables
por muestra o
distintas muestras

Análisis de una variable y una

variable controlada
(t, espacio, etc.) ICP
Absorción Atómica
Llama (AAF)

Estadística bivariante clásica

Análisis de varianzas Calidad medida
Contrastes de hipótesis compuestos Calibraciones instrumentales indirectas
Intervalos de confianza compuestos Gráficas control
Regresión y correlación
Detección de correlación entre variables
Comparación de datos de diferentes
laboratorios o áreas
Validaciones métodos

TIPOS DE DATOS
MULTIVARIANTES
Reducir la dimensionalidad de la matriz de datos
Esta es una estructura de datos más Análisis Factorial (FA), Análisis de Componentes
Principales (PCA) y Análisis Factorial de
compleja y que corresponde a una
Correspondencias (FCA).
disposición matricial de los datos, de
forma que en columnas se disponen las Detectar y establecer de agrupaciones de muestras
variables determinadas Métodos de clasificación, Análisis discriminante lineal
experimentalmente y cada fila (LDA) o cuadrático (QDA), k vecinos más próximos (k-
corresponde a cada una de las NN) y el método de redes neuronales artificiales (ANN).
muestras estudiadas
Establecer modelos que permitan la predicción de los
valores de alguna(s) variable(s) en función de los de
las restantes
Regresión lineal simple, la regresión lineal múltiple
(MLR), la regresión polinomial o los métodos de
regresión no lineal (NLRM), la regresión en
componentes principales (PCR) y la regresión en
mínimos cuadrados parciales (PLS1, PLS2)

Algoritmos genéticos (GA) para la selección de

variables o el modelado mediante el uso de redes
neuronales artificiales (ANN)

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 04/11/2020

ANÁLISIS DISCRIMINANTE

Root 2

CIELAB:
L*, a*, b*, hab y C*ab

diamante
medina
aroma
-6 camarosa
-10 0
ventana
Root 1

ANÁLISIS DISCRIMINANTE

INFLUENCIA DE LA MACERACIÓN PREFERMENTATIVA A TEMPERATURA CONTROLADA SOBRE EL

COLOR DE VINOS DE SYRAH EN CLIMAS CÁLIDOS

4 Testigo
Corto
Largo
2
Raíz 2

-2

-4
-3 -2 -1 0 1 2 3

Raíz 1

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ACP
INFLUENCIA DE LA MACERACIÓN PREFERMENTATIVA SOBRE LA COMPOSICIÓN
FENÓLICA DE VINOS BLANCOS ELABORADOS A DOS ESCALAS: EXPERIMENTAL E
INDUSTRIAL
INDUSTRIAL
EXPERIMENTAL

TEMPERATURA: 5, 10, 20 ºC TEMPERATURA: 10, 20 ºC

TIEMPO: 2, 6, 12, 24 horas TIEMPO: 2, 6 horas

51