UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS INFORME DE

Facultad de Ciencias básicas e ingenierías LABORATORIO

Departamento de Biología y Química BIOQUÍMICA

DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS POR COLORIMETRÍA

Lina María Larrota Corredor, 111004719 - Ingeniería agronómica - Rut Elisa Geronimo Bossa,
111004815 - Ingenieria agronomica - Esneyder lopez aldana , 111004819 - Ingeniería agronómica

grupo/ mesa 7

Docente: Lissette Jhoana Hernandez Arriet

Facultad de Ciencias Básicas e Ingenierías.

Programa de ingeniería agronómica

Resumen
En esta práctica se determinó la concentración de glucosa en una muestra utilizando la técnica de colorimetría.
Para ello, se prepararon soluciones estándar de glucosa y una muestra problema, que fueron tratadas con
orto-toluidina, un reactivo que reacciona con la glucosa para formar glucosamina, un compuesto coloreado. Las
muestras se calentaron y luego se midió la absorbancia a distintas longitudes de onda utilizando un
espectrofotómetro. Posteriormente, se compara y calcula la concentración de glucosa en la muestra problema.
Esta práctica permitió aplicar y comprender el uso de la espectrofotometría para análisis cuantitativo de
carbohidratos.

Palabras clave: Carbohidratos, colorimetría, frutos, glucosa, orto-toluidina.

1. Introducción. carbohidratos para producir un compuesto

La colorimetría es una técnica analítica que se basa coloreado que se puede medir mediante
en la medición de la absorción de luz por una espectrofotometría (Tietz, 1995).
sustancia en función de su concentración. En el La colorimetría se basa en la ley de Beer-Lambert,
caso de los carbohidratos, la colorimetría se utiliza que establece que la absorción de luz por una
para determinar su concentración en una muestra sustancia es directamente proporcional a la
mediante la reacción con un reactivo que produce concentración de la sustancia y al camino óptico
un compuesto coloreado (Kolthoff, 1923). recorrido por la luz (Beer, 1852; Lambert, 1760).
Esta ley se puede expresar matemáticamente como:
Uno de los métodos más comunes para la
determinación de carbohidratos por colorimetría es A=ε*c*l
el método de Fehling, que se basa en la reacción de
los carbohidratos con el reactivo de Fehling donde A es la absorción de luz, ε es la constante de
(CuSO4 y KNaC4H4O6) para producir un absorción, c es la concentración de la sustancia y l
compuesto coloreado (Fehling, 1849). Otro método es el camino óptico recorrido por la luz.
ampliamente utilizado es el método de Benedict,
que se basa en la reacción de los carbohidratos con La espectroscopia visible se basa en la medición de
el reactivo de Benedict (CuSO4 y KNaC4H4O6) la absorción de luz por una sustancia en función de
para producir un compuesto coloreado (Benedict, la longitud de onda. La longitud de onda es la
1909). distancia entre dos puntos consecutivos de una
onda electromagnética que están en fase (Tietz,
La colorimetría también se utiliza para determinar 1995). La longitud de onda se puede expresar en
la concentración de carbohidratos en fluidos nanómetros (nm) o en micrómetros (μm).
biológicos, como la sangre y la orina. En este caso,
se utiliza un reactivo que reacciona con los
La espectroscopia visible se utiliza para determinar monocromática (de una sola longitud de.onda)
la concentración de una sustancia en una muestra. sobre una solución homogénea, una parte de la luz
La técnica se basa en la medición de la absorción incidente es absorbida por el medio y otra
de luz por la sustancia en función de la longitud de transmitida, como consecuencia de la intensidad
onda. La absorción de luz se puede medir del rayo de luz sea atenuada desde Po a P (fig. 1),
utilizando un espectrofotómetro, que es un siendo Po la intensidad de la luz incidente (o
instrumento que mide la absorción de luz por una emitida por la fuente) y P la intensidad del rayo de
sustancia en función de la longitud de onda luz transmitido (o que no fue absorbido por la
(Kolthoff, 1923). solución). Dependiendo del compuesto y el tipo de
absorción a medir, la muestra puede estar en fase
La espectroscopia visible se utiliza en diversas líquida, sólida o gaseosa. La luz empleada puede ir
áreas de la ciencia, incluyendo la química, la dese la región visible y ultravioleta del espectro
biología y la medicina. La técnica se utiliza para electromagnético.
determinar la concentración de una sustancia en Cada sustancia tiene su propio **espectro de
una muestra, para identificar la presencia de una absorción**, el cual es una curva que muestra la
sustancia en una muestra y para estudiar la cantidad de energía radiante absorbida,
estructura y la función de las moléculas (Tietz, Absorbancia, por la sustancia en cada longitud de
1995). onda del espectro electromagnético, es decir, a una
determinada longitud de onda de la energía
2. Objetivos radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de
• Conocer las bases de la colorimetría o radiación que es distinta a la que absorbe otro
espectroscopia visible. compuesto (fig. 2)
• Aplicar la técnica a la determinación de la glucosa
en una muestra problema. La intensidad de un haz de luz monocromática
• Adquirir destreza en la aplicación de la disminuye exponencialmente al aumentar
espectroscopia. aritméticamente la concentración de la sustancia
• Medir la concentración de la glucosa en la absorbente, cuando este haz pasa a través de un
muestra problema. medio homogéneo. Esta es la ley de **Beer**.
3. Materiales y reactivos Dicha ley es aprovechada en los laboratorios para
implementación de técnicas que permiten la
cuantificación de muestras con la utilización de
equipo materiales reactivos/sus
ustancias diferentes tipos de espectrofotómetros (fig. 3 y fig.
4).
espectrofotóm (16) tubos de agua destilada
etro ensayo La espectrofotometría es un método analítico
fundamental en los laboratorios clínicos, utilizado
(1)pipeta de 1 orto-toluidina para identificar sustancias desconocidas y
ml
cuantificar su concentración. Su base se encuentra
gradilla glucosa al en la interacción de la luz monocromática (de una
0.2% sola longitud de onda) con una solución
homogénea. Un rayo de luz incide sobre la muestra,
pera muestra donde una parte se absorbe y otra se transmite. La
problema intensidad del rayo transmitido es proporcional a la
concentración de la sustancia en la muestra.
4. Marco teórico Espectro de Absorción: Cada sustancia posee un
La espectrofotometría: es uno de los métodos de espectro de absorción único, que muestra la
análisis más usados siendo fundamental en los cantidad de energía radiante absorbida por la
laboratorios clínicos, tanto para identificar las sustancia a diferentes longitudes de onda del
muestras desconocidas como cuantificar su espectro electromagnético. Esta característica
concentración. Se basa en la relación que existe en permite identificar y cuantificar sustancias.
la absorción de luz por parte de un compuesto y su
concentración. Cuando se hace incidir luz
-Ley de Beer-Lambert: Define la relación entre la
absorción de luz, la concentración de la sustancia y
el camino óptico que recorre la luz. Esta ley
establece que la absorción de luz es directamente
proporcional a la concentración de la sustancia y a
la longitud del camino óptico. Se deben tomar 7 tubos de ensayo y rotularlos con
las letras B', 1', 2', 3', 4', 5' y M'.
- Transmitancia y Absorbancia:
- La transmitancia (T) es la fracción de luz En los primeros seis tubos (B', 1', 2', 3', 4', 5') se
incidente que atraviesa la muestra. deben colocar soluciones en un orden específico.
- La absorbancia (A) es una medida logarítmica
de la cantidad de luz absorbida por la muestra, es En el tubo B' se coloca 1 ml de la solución B.
decir, la luz no transmitida. En el tubo 1' se coloca 1 ml de la solución 1.
En el tubo 2' se coloca 1 ml de la solución 2.
Cálculos y Aplicaciones: En el tubo 3' se coloca 1 ml de la solución 3.
En el tubo 4' se coloca 1 ml de la solución 4.
- La absorbancia se calcula a partir de la En el tubo 5' se coloca 1 ml de la solución 5.
transmisión, utilizando la ley de Beer-Lambert. En el tubo M', se coloca 1 ml de la muestra (M).
- La espectrofotometría permite cuantificar la
concentración de una sustancia en una muestra, Luego, a todos los tubos (desde B' hasta M') se les
mediante la comparación de la absorbancia de la agrega 4 ml de o-toluidina. Esta sustancia reacciona
muestra problema con una curva de calibración. con las soluciones para desarrollar un color.

Importancia de la Espectrofotometría: Los tubos se calientan en un baño de agua

hirviendo durante 30 minutos. Para evitar la
- Permite identificar sustancias desconocidas y evaporación de las soluciones, se colocan bolas de
determinar su concentración. cristal en la boca de los tubos.
- Es una técnica versátil con aplicaciones en
diversas áreas, incluyendo la química, la biología, Con el calentamiento, se espera que aparezca una
la medicina, la farmacología y la industria coloración verde.
alimentaria.
2. Configuración del espectrofotómetro:
* Configurar el espectrofotómetro para medir la
absorbancia a una longitud de onda de 340 nm.
* Calibrar el instrumento con una solución de agua
destilada.
3. Medición de la absorbancia:
* Medir la absorbancia de cada solución de
glucosa estándar y la solución de glucosa problema
en cubetas de cuarzo.
* Registrar los valores de absorbancia para cada
solución.
4. Análisis de los datos:
* Construir una curva de calibración utilizando los
valores de absorbancia y concentración de las
soluciones de glucosa estándar.
5. Sección experimental * Utilizar la curva de calibración para determinar
Procedimiento: la concentración de glucosa en la solución
problema.
1. Preparación de las soluciones:
 6. Resultados y análisis Tabla 3. Concentración y absorbancia de lo tubos
prima
se plasmaron en unos cuadros o tablas del
Tubo Concentració Absorbancia
procedimiento anterior, los datos experimentales n glucosa
obtenidos. (mg/ml)
de manera que se busca que los resultados sean más
didácticos. B’ 0.00 0,00

Tabla 1. Absorbancia de cada longitud de onda 1’ 0.04 0,048

2’ 0.08 0,095
Longitud de %T T A
onda (nm) 3’ 0.12 0,142

550 70.7 0.707 0.125 4’ 0.16 0,189

570 68.8 0.688 0.158 5’ 0.20 0,236

590 63.0 0.630 0.202 M’ 0.00 0,00

610 56.4 0.564 0.246

con estos datos procederán a elaborar una gráfica y
625 51.3 0.513 0.269 calcular la r.

630 48.4 0.484 0.272

635 56.7 0.537 0.271

650 56.2 0.562 0.251

670 67.6 0.676 0.171

690 83.2 0.083 0.083

710 91.1 0.911 0.037

Figura 1. se demuestra la curva de dispersión.

por otro lado la longitud de onda con más De modo que r^(2) es el porcentaje o medida
absorbancias es = 639 nm y producen una estadística de qué tan cerca están los datos de la
absorbancia (A) = 0.272. línea de regresión ajustada. También se conoce
como coeficiente de determinación, o coeficiente
Tabla 2. Concentraciones resultantes de la glucosa de determinación múltiple si se trata de regresión
Tubo Concentra Tubo Concentra múltiple.
ción ción 2
glucosa glucosa 𝑅 = 0, 019
(mg/ml) (mg/ml) por lo tanto aplicamos 0, 019 = 0, 137
R = 0,137
B 0.00 B’ 0.00

1 0.04 1’ 0.04

2 0.08 2’ 0.08

3 0.12 3’ 0.12

4 0.16 4’ 0.16

5 0.20 5’ 0.20
 Annalen der Chemie und Pharmacie,
72(2), 106-115.
- Kolthoff, I. M. (1923). Die
colorimetrische Bestimmung von Zucker.
Zeitschrift für analytische Chemie,
63(1-2), 1-12.
- Lambert, J. H. (1760). Photometria sive de
mensura et gradibus luminis, colorum et
umbrae. Augsburg: Eberhard Klett.
- Tietz, N. W. (1995). Clinical guide to
laboratory tests. W.B. Saunders Company.

Figura 2. Ejemplo 2 de lo que es la curva de

dispersión con una línea de tendencia agregada y su
interpretación.
en la cual podrán observar su R^(2) y su ecuación.
Y = -007 X^(2) + 0,0628 X

R^(2) = 0,3868
R = 0,621

7. Conclusiones

Se logró comprender las bases de la colorimetría y

espectroscopia visible, evidenciado por la
capacidad de medir la absorbancia a diferentes
longitudes de onda y seleccionar la óptima (630
nm) para la máxima absorbancia.

La técnica colorimétrica fue aplicada exitosamente

para determinar la concentración de glucosa en la
muestra problema. Se estableció una relación entre
la absorbancia y la concentración de glucosa,
permitiendo la cuantificación

Se midió la concentración de glucosa en las

muestras problema, utilizando la curva de
dispersión y la ecuación de la línea de tendencia.
Aunque el coeficiente de determinación ($R^2 =
0.3868$) indica una correlación moderada, se logró
establecer una relación cuantitativa.

Referencias bibliográficas
- Beer, A. (1852). Bestimmung der
Absorption des rothen Lichts in farbigen
Flüssigkeiten. Annalen der Physik, 86(2),
78-87.
- Benedict, S. R. (1909). A method for the
determination of sugar in the blood.
Journal of Biological Chemistry, 5(4),
485-491.
- Fehling, H. (1849). Über die quantitative
Bestimmung von Zucker und Stärke.