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    Informe N°4 - FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

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    CARRERA(S): Enfermería

    PRÁCTICA DE LABORATORIO

    CURSO: Bioquímica

    PROFESOR(A): Quevedo Torres, Sergio Renan

    INFORME DE PRÁCTICA

    PRÁCTICA N°: 4

    TÍTULO: FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

    INTEGRANTES:
    Castro García, Catherine Isabel [email protected]

    Cahuana de la Cruz, Steffany Aracely [email protected]

    Yanama Yance, Myriam Rosmeri [email protected]

    Cano Rivera, Randy Alain [email protected]

    Hernández Vera Paulo Ademir [email protected]

    HORARIO DE PRÁCTICA

    FECHA DE REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA: 25 de abril de 2024

    FECHA DE ENTREGA DEL INFORME: 02 de mayo de 2024

    LIMA, PERÚ

    2024
    ÍNDICE
    1. OBJETIVOS ..................................................................................................... 3
    2. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 4
    3. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 5
    4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL ............................................................... 6
    5. RESULTADOS ................................................................................................. 8
    6. DISCUSIÓN .................................................................................................... 10
    7. CONCLUSIÓN ................................................................................................ 11
    8. RECOMENDACIONES ................................................................................... 12
    9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ............................................................... 13
    1. OBJETIVOS

    • Determinar el efecto de la concentración del sustrato, la concentración de la enzima, el


    efecto del pH sobre la actividad enzimática.

    • Determinar el Km y Vmáx a través de un gráfico de Michaelis-Mentes y de doble


    recíproco.

    • Interpretar el Km y Vmáx obtenidos en las representaciones gráficas.


    2. INTRODUCCIÓN

    Un catalizador se define como una sustancia que aumenta su velocidad o rapidez de


    una reacción química, que transcurre lentamente en condiciones normales [1]. Las
    enzimas tienen gran potencial catalítico; así como gran especificidad sobre sus
    sustratos y productos, es decir que rara vez producen productos laterales las
    actividades enzimática puede estar alterada por factores, principalmente por la
    concentración de sustrato y de enzima, el pH , la temperatura y el efecto de
    inhibidores y activadores en donde la cinética enzimática se estudia para encontrar
    una relación entre la velocidad de una reacción dada por una enzima y la cantidad
    de sustrato que interviene [2]. La velocidad de una reacción enzimática está
    controlada por la cantidad de enzimas y sustratos a medida que aumenta la
    concentración de productos, la concentración de sustratos baja, pero la cantidad de
    enzima no se altera. La velocidad máxima, es aquella donde ya no se puede
    sobrepasar la velocidad a pesar de aumentar la concentración de sustratos, ya que
    todos los centros activos de las enzimas están ocupados por el sustrato. Estos
    efectos fueron estudiados por Michaelis y Menten, que establecieron una constante
    conocida como constante de Michaelis (Km) [3].

    La Km representa la concentración de sustrato en la cual se alcanza la velocidad


    submáxima de la reacción. Está constante es aplicable para comparar la afinidad de
    una enzima por su sustrato, una Km alta significa que la enzima tiene baja afinidad
    por el sustrato y la Km baja, que tiene gran afinidad [4].

    En esta introducción, explicaremos algunos de los principales factores que influyen


    en la actividad enzimática. Desde la temperatura y el pH hasta la concentración de
    sustrato y la presencia de cofactores y finalmente se va a determinar el Km y Vmax
    experimental de la pepsina para la albúmina a partir de la gráfica que se mostrará.
    3. MATERIALES Y MÉTODOS

    I. MATERIALES EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

    • 01 gradilla

    • 05 tubos de ensayo 13x100mm

    • 01 piseta con agua destilada

    • 04 pipetas graduadas 5 mL

    • 04 propipeta

    II. REACTIVOS EN LA MESA DE LOS ESTUDIANTES

    • 01 solución de albúmina 25 mL

    • 01 pepsina 2% frasco 5 mL

    III. MATERIALES EN LA MESA CENTRAL DEL PROFESOR

    • 01 baño maría 37°C o plancha de calentamiento

    • 01 termómetro
    4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

    Determinar la actividad enzimática

    La actividad enzimática se medirá por la desaparición del substrato (disminución de


    la turbidez en los tubos que contiene albúmina), la cual se determinará en el
    Espectrofotómetro a 450 nm.

    1. Enumerar 5 tubos de ensayos de 13x100 mm:

    2. Adicionar los reactivos como se describen en la tabla para cada tubo de ensayo:

    1 2 3 4 5

    Agua
    destilada (mL) 4 3.5 3 2.5 2

    Albúmina 5% (mL)
    0.5 1 1.5 2 2.5

    3. Considerar estas Absorbancias como Lectura Final Mezclar

    4. Leer los tubos 1, 2, 3, 4, 5 en el espectrofotómetro. Considerar las Absorbancias


    como Lectura Inicial.

    5. Luego, Incubar todos los tubos a 37ºC por 5 min.

    6. Añadir 0.5 mL de pepsina a cada tubo e incubar a 37ºC por 5 min.


    8. Obtener las lecturas de los tubos 1, 2, 3, 4, 5 en el espectrofotómetro.

    9. Considerar estas Absorbancias como Lectura Final.

    10. Anotar los resultados


    5. RESULTADOS

    Determinación de la actividad enzimática

    C albumina Lf Li Actividad

    Tubo 1 0,56% 0,076 0,052 0,024

    Tubo 2 1,11% 0,077 0,198 -0,121

    Tubo 3 1,67% 0,729 0,186 0,543

    Tubo 4 2,22% 0,923 0,302 0,621

    Tubo 5 2,78% 0,989 0,376 0,613

    Tabla 1: Longitud de Onda


    Determinación de la concentración y la actividad enzimática

    1 / C [albumina] 1 / Actividad

    Tubo 1 1.78 41.67

    Tubo 2 0.90 -8.26

    Tubo 3 0.60 1.84

    Tubo 4 0.45 1.61

    Tubo 5 0.35 1.63

    Tabla 2: Concentración y actividad enzimática de la albumina 5%


    6. DISCUSIÓN
    Este estudio se siguió determinados pasos para identificar la actividad enzimática de
    la pepsina a través del espectrofotómetro analizado por la absorbancia de la
    albumina que ha sido colocado en diferentes concentraciones en cada tubo. Además,
    se comparó de cuál es el método mas recomendado o mas usado por la comunidad
    científica para realizar el grafico de Michaelis y Menten o Lineweaver-Burk. A
    continuación, se analizarán los resultados obtenidos.

    Absorbancia de la albumina frente la pepsina

    Se observo que al colocar 0,5mL de pepsina en tubos con diferentes concentraciones


    de albumina, y luego incubarlos durante 5 minutos antes de pasarlos por el
    espectrofotómetro, se obtuvieron niveles de absorbancia diferentes, de menor a
    mayor. Esto se debe a que la enzima pepsina, al entrar en contacto con la albumina
    a una temperatura de 37°C, acelera el proceso de conversión de sustrato a producto,
    lo cual indica que a mayor concentración de albumina, mayor cantidad de producto
    absorbido, por ende, mayor absorbancia obtenido, y a la vez permite correlacionar la
    actividad enzimática con el aumento y la disminución de la absorbancia [5].

    Grafico de Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk

    La comunidad científica indica que el método más usado es el Lineweaver-Burk


    debido a que es una herramienta gráfica para calcular parámetros cinéticos de una
    enzima y debido a que es muy sencillo y no requiere de muchos cálculos. Además,
    es más fácil evaluar estadísticamente a comparación del método de Michaelis-
    Menten, ya que se muestra una forma lineal, lo que facilita en la interpretación visual
    de la relación entre la velocidad de la reacción y la concentración del sustrato.
    También es menos propenso a errores de estimación debido a que los valores
    transformados son más lineales, lo que facilita la regresión lineal más precisa. Por
    último, es amplia en la aplicación práctica, lo cual permite que los estudiantes,
    investigadores y profesionales lo puedan usar con facilidad [6].

    En estos resultados hubo un error con valor negativo debido a que al momento de
    incubarlos el tubo n°2 se combino con restos de agua, lo cual inactivo a la enzima
    pepsina en la albumina afectando la absorbancia en el espectrofotómetro.
    7. CONCLUSIÓN

    • Mediante la experimentación y el análisis de los efectos de la concentración del


    sustrato, la concentración de la enzima y el pH sobre la actividad enzimática,
    se determinaron los factores clave que afectan la cinética de la reacción
    enzimática. Esto proporciona una comprensión más completa de cómo la
    enzima funciona en diferentes condiciones y facilita la optimización de procesos
    biotecnológicos
    • Los valores de Km y Vmáx se determinaron de manera efectiva mediante el
    análisis de los gráficos de Michaelis-Menten y de doble recíproco, estos
    parámetros son fundamentales para comprender la cinética de las reacciones
    enzimáticas. Tras comparar los resultados de ambos métodos, se encontró una
    consistencia significativa entre ellos.
    • Se logró determinar de manera precisa tanto el Km como el Vmáx mediante el
    análisis de las representaciones gráficas, lo que proporciona una comprensión
    más profunda de la cinética de la enzima estudiada y su interacción con el
    sustrato.
    8. RECOMENDACIONES

    • Realizar una calibración precisa y asegurarse de que la estándar tenga una


    concentración conocida, así se garantizará una calibración precisa del
    espectrofotómetro.
    • Asegúrate de mantener las muestras a temperatura indicada por el docente
    durante el procedimiento.
    • Seguir estrictamente el tiempo indicado y las condiciones de mezcla
    especificadas por el docente. Así se garantizará la reacción completa entre el
    reactivo de Pepsina y Albúmina presentes en la muestra.
    • Utilizar adecuadamente las micropipetas con la calibración indicada por el
    docente, para medir con precisión los volúmenes de muestra y reactivos.
    • Tener en cuenta que pequeñas variaciones en los volúmenes pueden afectar
    significativamente los resultados.
    • Asegurarse que los cálculos el Km y Vmáx de la pepsina en cada una de las
    gráficas, se hayan realizado correctamente para evitar errores en los resultados.
    9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
    [1] M. Solís (ed.) Ciencias de la Salud, Handbooks -USFX- Sucre, Bolivia, 20142004 (consultado 17 Sep 2021).
    Disponible en:
    https://www.usfx.bo/nueva/Dicyt/Handbooks/Ciencias%20de%20la%20Salud_2/Ciencias%20de%20la%20Salu
    d_Handbook_Vol%20I/PAPERS_28/Ciencias%20de%20la%20salud_Handbook_Vol%2015.pdf

    [2] LAS PROTEINAS PLASMATICAS [Internet]. Elsevier.es. [citado el 14 de abril de 2024]. Disponible en:
    https://www.elsevier.es/es-revista-endoscopia-335-pdf-X0014256557118675

    [3] Nordeste, U. N. (2008). Proteínas Plasmáticas. Obtenido de Proteínas Plasmáticas:


    https://med.unne.edu.ar/sitio/multimedia/imagenes/ckfinder/files/files/Carrera-Medici
    na/BIOQUIMICA/proteinas.pdf.

    [4] Laguna, J y Piña, G. Bioquímica. 8a ed. Salvat editores de México, S.A.2018 Roca P. Bioquímica: técnicas y
    métodos [En Línea]. Madrid: Editorial Hélice, 2004[consultado 17 Sep 2021]. Disponible en:
    http://elibro.net.cientifica.remotexs.co/es/ereader/ucsur/59642?page=149

    [5] Luna-Palafox YD. Digestión con pepsina. Zenodo; 2022. DOI: http://doi.org/10.5281/zenodo.7241081

    [6] Lira S, Jasso C. Comparación de los diferentes métodos de análisis cinéticos para determinar el tipo de
    inhibición de dos compuestos. Rev. educ. bioquím [revista en la Internet]. 2013 [citado 2024 mayo 01]; 32(1):
    19-32. Disponible en: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1665-
    19952013000100004&lng=es.

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