Cromatografía de Capa Fina

CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA
La cromatografía en capa fina (TLC) es un método de afinidad que se utiliza para separar
los compuestos de una mezcla. La TLC es un método de separación muy versátil que se
utiliza ampliamente para el análisis cualitativo y cuantitativo de las muestras. La TLC puede
utilizarse para analizar prácticamente cualquier clase de sustancia: plaguicidas, esteroides,
alcaloides, lípidos, nucleótidos, glucósidos, carbohidratos y ácidos grasos.
Se realiza sobre papel u otro material sólido. Suele llamarse también “en capa delgada”
porque la fase estacionaria recubre un soporte plano y rígido. Para la cromatografía en
capa fina (TLC) la fase estacionaria es una capa de partículas de unos milímetros de
espesor fijadas sobre un soporte sólido generalmente de aluminio, plástico o vidrio.
Después de aplicar el analito cerca de la parte inferior de la placa seca, el disolvente
empieza a producir la separación. La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en
un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo general
menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con
mayor velocidad serán los menos polares. Polaridad de los compuestos orgánicos en orden
creciente: hidrocarburos < olefinas < fluor < cloro < nitro < aldehído aldehído < éster <
alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas
Aplicación de las muestras
Los productos para examinar se disolverán, cuando sea posible, en una sustancia orgánica
no polar que tenga un punto de ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore
después de la aplicación. A menudo se necesitan disolventes polares; la mezcla
cloroformo: metanol (1:1) es efectiva. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de
manera que al aplicar 2 μl resulta en la carga 20 μg de producto sólido. Muchos reactivos
de revelado llegan a detectar 0.1 μg de material, de manera que con esta carga puede
llegarse a observar un 5% de impurezas. Existen una gran variedad de micropipetas y
microjeringuillas para realizar el proceso de siembra de la muestra a analizar, también
pueden usarse tubos capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del
capilar (micropipeta, jeringuilla, etc.) sobre la placa preparada, dejando una distancia al
borde inferior de 0.5 centímetros aproximadamente. A esto se le conoce como punto de
aplicación. Una vez colocada la muestra se deja secar para evaporar el disolvente, de
forma que en la placa solo quedará la muestra a analizar.
Elección del eluyente
La elección del eluyente dependerá del componente que se va a separar y del material en
el que la separación se lleva a cabo. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:
Éter de petróleo
Hexano
Tolueno
Benceno
Éter dietílico.
Tetracloruro de carbono
Cloroformo
Diclorometano
Acetato de etilo
Acetona
Etanol.
Metanol
Agua.
Ácido acético.
La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar la polaridad del
componente y probar con eluyentes cada vez menos polares. En primer lugar, se aplican
eluyentes poco polares, se puede seguir utilizando la misma placa para emplear otros
eluyentes más polares, hasta dar con el más apropiado.
Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar varias muestras
distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el
centro de cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por
capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza de una
manera más eficaz.
Desarrollo de la cromatografía
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el método

ascendente, esto es, al permitir que un eluyente suba por una placa casi en vertical, por la
acción de la capilaridad. La cromatografía se realiza en una cubeta o cámara
cromatográfica. Para conseguir la máxima saturación posible de la atmósfera de la cámara,
las parades se tapizan con papel impregnado del eluyente. A veces pueden obtenerse
separaciones mejores sin poner papeles en las paredes, cosa que no debe olvidarse.
Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado o hasta que se alcance una
línea dibujada a una distancia fija desde el origen. La mancha en una placa se caracteriza
por la distancia que recorre con relación a la distancia recorrida por la fase móvil. El grado
de retención en cromatografía plana de superficie se expresa como el factor de
retardación o índice de retención Rf:
La constante Rf es simplemente una manera de expresar la posición de un compuesto

sobre una placa como una fracción decimal, mide la retención de un componente. En la
Figura 3 se observa un ejemplo sobre el Rf, que mide la movilidad relativa de cada
componente con respecto al máximo posible, la distancia recorrida por el frente de fase
móvil.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se
desarrollan con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los Rf y si son distintos
puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto; si los Rf son
iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo. Si se sospecha que dos compuestos
son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de
menor polaridad, hasta apreciar una separación mínima. En este caso no se pueden usar
reveladores químicos, ya que alterarían los compuestos, sino un indicador ultravioleta.
Revelado de los componentes
Si los compuestos separados no son coloridos es necesario revelar la posición de dichos

compuestos, para ello existen dos tipos de métodos:
• Métodos químicos.
• Métodos físicos.
MÉTODOS QUÍMICOS
Consisten en realizar una reacción química entre un reactivo revelador y los componentes
de la placa. Generalmente se utiliza el yodo como reactivo revelador, el cual forma
complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos amarillo-marrón), pero
las manchas desaparecen con el tiempo; aquí es conveniente señalar las manchas
aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que reacciona con los
componentes orgánicos produciendo manchas negras. El tamaño de las manchas no está
relacionado con la cantidad de componente separado. Además de estos reveladores
generales, existen otros específicos: 2,4-dinitrofenilhidrazina (para aldehídos y cetonas).
Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos). para-dimetilaminobenzaldehido (para
aminas). Ninhidrina (para aminoácidos).
MÉTODOS FÍSICOS
El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador fluorescente, de tal forma que
al colocar la placa bajo una lámpara ultravioleta y, dependiendo del indicador y de la
longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay
componentes. En otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay
componentes. Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal)
con lo que pueden ser detectados directamente en una lámpara de ultravioleta. La
detección y localización de las manchas en la placa de TLC se hacen observando los
cambios en la fluorescencia o adsorción en el U.V. de un indicador que se incorporó a la
fase estacionaria. Cuando no hay solutos presentes toda la placa fluórese bajo luz UV, pero
si llega a residir el soluto aparecen como manchas oscuras. También podemos observar el
color de los compuestos después de reaccionar con reactivos específicos para grupos o
metales rociados sobre la placa, como la fluorescamina para aminas.
Ventajas de la cromatografía en capa fina
La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos
cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, etc.) ya que el utillaje que precisa
es más simple. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor
y la separación es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre
papel destruirían el cromatograma. El método es simple y los resultados son fácilmente
reproducibles, lo que hace que sea un método adecuado para fines analíticos. La ventaja
principal de la TLC es que se analizan simultáneamente la muestra y el patrón, mientras
que en la cromatografía en columna las muestras se analizan individualmente. Además, las
muestras que son difíciles de separar se pueden resolver utilizando dos disolventes
diferentes por desarrollo de la placa en direcciones perpendiculares. Otra ventaja es que,
si los componentes no se pierden en los vapores que rodean la placa, todos estarán en
algún lugar de esta, mientras que en la cromatografía en columna algunos componentes
no eluyen y se pierden. Y a esto se suma que la placa de TLC se usa una sola vez, por lo que
se pueden utilizar condiciones severas de separación.

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