FACULTAD DE BIOLOGÍA

Departamento de Biología Celular y Parasitología

Programa: Neurociencias Básicas y Aplicadas

TESIS DOCTORAL

FACTORES IMPLICADOS EN LA REGULACIÓN

DEL DESARROLLO DE LAS VÍAS DEL DOLOR

Teresa Valdés Sánchez

Valencia, 2015

Directora: Martina Kirstein

Dña. Martina Kirstein, Profesora Titular del Departamento de Biología Celular y
Parasitología, de la Facultad de Biología de la Universitat de València

CERTIFICA QUE:

La presente Tesis Doctoral titulada, “Factores implicados en la regulación del

desarrollo de las vías del dolor”, elaborada por la licenciada en Biología, Dña. Teresa
Valdés-Sánchez, ha sido realizada bajo su dirección en el Laboratorio de Neurobiología
Molecular, del Departamento de Biología Celular y Parasitología, Facultad de Biología
de la Universitat de València, y que hallándose concluida, autoriza su presentación a fin
de que pueda ser juzgada por el tribunal correspondiente.

Fdo: Martina Kirstein

Valencia, a 28 de Octubre del 2015

A mis padres,
Kake, Ramón y Juan.

A mi familia.

A todos los míos.

 Agradecimientos

Quisiera agradecer y dedicar mi trabajo de tesis a todas aquellas personas que me han
acompañado durante todos estos años y que han aportado infinidad de elementos
fundamentales a todos los niveles, que han sido y son, necesarios para mi formación como
investigadora, pero sobre todo como persona.
En primer lugar y muy en especial, a mi directora de tesis la Dra. Martina Kirstein sin la que
este trabajo no hubiera existido. Gracias además por tu apoyo incondicional y por tu magnífica
amistad. No tengo palabras para agradecer todo lo que me has aportado.
Gracias a la Dra. Sacramento Rodriguez, para mi, Sacri, mi amiga y mi compañera durante
tantísimos años. He aprendido muchísimo de ti a todos los niveles.
Gracias al Dr. Paco Pérez y a la Dra Rosana Sáez, por tanta ayuda que me habéis
prestado, por tantos conocimientos y por tantos consejos. Sin vosotros este trabajo no estaría
completo. En especial a Rosana por todo ese cariño y apoyo.
Gracias a todos y cada uno de los miembros del departamento, porque he crecido con
vosotros en esta profesión y me habéis aportado tanto.. En especial a la memoria del Dr.
Francisco Guijarro que ha sido para mi y para todos, un ejemplo de sencillez, valor y pasión por
la Ciencia.
Gracias al Dr. José Luis López Barneo y al Dr. Juan José Toledo-Aral a por confiar en mí
en la que fue mi primera colaboración científica y por haberme enseñado tantas cosas durante
todos estos años. Es un privilegio haberme formado cerca de vosotros.
Al Dr. Carlos López Otín por cedernos las herramientas que han permitido llevar a cabo
gran parte de este trabajo.
A la Dra. Rosa Planells por su colaboración y por acogerme en su laboratorio para realizar
algunos de los experimentos de esta tesis, siempre con la ayuda de Sergio Lainez. Una de
esas colaboraciones que te enriquecen en conocimientos y que son ejemplo de profesionalidad
y humildad. Me alegro de seguir cerca de vosotros.
A todo el personal de administración, a Pilar, Carmen, Asún y Sabina, por su apoyo y
paciencia, y como no, al personal del SCSIE: Maritere, Enrique y Pilar, con quienes he
compartido tantísimas horas y me han enseñado tanto.
Gracias a todos mis compañeros y compañeras, los del pasado y los del presente:
A Pili, a Miguel, a Elena y a Mª Fe con quienes empecé esta aventura y a quenes siempre
tendré en mi corazón. A Celia por compartir tantos momentos conmigo, ofrecerme tanta
amistad y enseñarme tanto. A Mª Ángeles por tu increíble carácter, tesón y cariño. A Laura, a
Alfredo de Barcelona, a Nati, a Zoraida, a Mireia, a Josema, a Mª José, a Mª Paz, a Helena y a
Pili, ha sido estupendo trabajar con vosotros, con todos sin excepción porque todos me habéis
ayudado a crecer y de todos he aprendido muchísimo. Gracias a a mis compañeros Toni,
Miguel e Ignasi, por responder a tantas dudas, por ayudarme tanto y por tanto humor sano.
Gracias a mis amigos, aquellos que han creido en mi y que siempre me han empujado a
lograr mis metas, con amor y con mucho humor, algo sin lo que no sabría vivir.
Muy especialmente a Lucia, a la que tanto he echado de menos en el laboratorio, pero que
siempre ha estado y está a mi lado, porque es parte de mi vida.
A Silvia, que se ha convertido en mi hermana. Parte de esta tesis te pertenece, por ser tan
única como persona y tan magnífica como amiga.
A Belen y a Bene, mis compañeras en mis inicios y que aún forman parte de mi vida. Sois
mi familia.
A Blanca, que aunque esté físicamente más lejos ahora, siempre se mantiene cerca.
A Joan, por todo tu apoyo y tu cariño incondicional.
Y por último a mi familia, en especial a mi madre, a mi padre y a Juan que siempre me han
ayudado y apoyado en todo. A mis tíos Teresa, José, Amparo y Bill, por su cariño, sus ánimos
y por creer en mi siempre. A Inma y a mi abuela, que me ayudan cada día.
Todos y cada uno de vosotros, lo sabéis todo, cada bache, cada éxito y cada alegría. Esta
tesis lleva vuestro nombre.
 “Todo hombre puede ser, si se lo propone, escultor de su propio cerebro”

Santiago Ramón y Cajal.

“Nunca consideres el estudio como una obligación, sino como una oportunidad
para penetrar en el bello y maravilloso mundo del saber.”

Albert Einstein
 Índice

ÍNDICE

I
 Indice

INDICE

INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................................... 1

1. Nocicepción. ...................................................................................................................................... 3

1.1 Sistema nervioso somático-sensorial. ................................................................................................. 3

1.2 Modalidades sensoriales del dolor. .................................................................................................... 6

1.3 Vías moleculares del dolor. Dolor inflamatorio e hiperalgesia. .......................................................... 7

2. Desarrollo de la neurobiología del dolor. ......................................................................................... 12

2.1. La familia de las neurotrofinas y sus receptores.............................................................................. 12

2.2. La hipótesis neurotrófica y el desarrollo sensorial embrionario. ..................................................... 18

3. Modulación de la fisiología del dolor. .............................................................................................. 20

3.1. Matriz extracelular y su remodelación proteolítica. ........................................................................ 21

3.2. Moléculas de adhesión célula-célula. .............................................................................................. 25

3.3. Neuritogénesis, elongación y guía axónica. .................................................................................... 32

3.4. El papel de la N-cadherina en la neuritogénesis. ............................................................................. 35

4. Metaloproteasas. ............................................................................................................................. 36

4.1. La familia de las metaloproteasas (MMPs y ADAMs)...................................................................... 36

4.1.1. Miembros y estructura de las metaloproteasas. ...................................................................... 36
4.1.2. Regulación, activación e inhibición de las MMPs. .................................................................... 39

4.2. Papel de las MMPs y ADAMs en el sistema nervioso: regulación de la neuritogénesis................... 40

4.3. Expresión y función de MT5-MMP en el SN. .................................................................................... 43

5. Sistema neuro-inmune. .................................................................................................................... 44

5.1. Mastocitos. ...................................................................................................................................... 44

5.2. Papel de los MC en el dolor inflamatorio. ........................................................................................ 46

5.3. Bases moleculares de la interacción neuroinmune.......................................................................... 48

III
Indice

OBJETIVOS ........................................................................................................................................... 51

MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................................... 55

1. Animales. ......................................................................................................................................... 57

1.1. Cepas de ratones. ............................................................................................................................ 57

1.2 Genotipado de los animales. ............................................................................................................ 57

2. Técnicas histológicas. ....................................................................................................................... 59

2.1. Procesamiento histológico............................................................................................................... 59

2.2. Técnicas inmunohistoquímicas, histoquímicas e impregnación argéntica. ..................................... 60

2.3. Preparación de muestras para microscopía electrónica de transmisión. ........................................ 61

3. Preparación del mesenterio para el análisis de mastocitos in vivo. .................................................. 61

4. Cultivos celulares. ............................................................................................................................ 62

4.1. Cultivos primarios de neuronas sensoriales. .................................................................................... 62

4.1.1. Preparación de las placas para cultivos de neuronas sensoriales. ........................................... 62
4.1.2. Recolección y siembra de las células. ....................................................................................... 63
4.1.3. Estudio de la supervivencia neuronal. ...................................................................................... 64
4.1.4. Ensayos de bloqueo de supervivencia in vitro. ......................................................................... 64

4.2. Cultivos y co-cultivos organotípicos. ................................................................................................ 64

4.3. Cultivo de mastocitos derivados de la médula ósea (BMMCs). ....................................................... 65

4.4. Co-cultivos de neuronas sensoriales de los DRGs y BMMCs. ........................................................... 66

4.5. Ensayos de bloqueo de adhesión in vitro. ........................................................................................ 66

5. Técnicas inmunocitoquímicas. ......................................................................................................... 66

6. Análisis morfométrico y estereología. .............................................................................................. 67

6.1. Recuentos neuronales...................................................................................................................... 67

6.2. Recuentos de fibras nerviosas al microscopio óptico. ..................................................................... 68

6.3. Recuentos de fibras nerviosas al microscopio electrónico. .............................................................. 68

IV
 Indice

6.4. Análisis morfométrico de estructuras. ............................................................................................. 68

6.5. Análisis morfométrico de neuritas. .................................................................................................. 69

7. Medida del flujo intracelular de Ca2+. ............................................................................................... 69

8. Inmunodetección de proteínas mediante western blot. ................................................................... 70

8.1. Extracción de proteína total. ........................................................................................................... 70

8.2. Electroforesis y transferencia a membrana. .................................................................................... 70

8.3. Bloqueo de membranas e incubación con anticuerpos. .................................................................. 70

9. Análisis de la expresión de ARNs mensajeros................................................................................... 71

9.1. Extracción de RNA total y retro-transcripción. ................................................................................ 71

9.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). ................................................................................... 71

9.3. PCR en tiempo real o cuantitativa (RT- PCR). .................................................................................. 72

10. Análisis estadísticos. ...................................................................................................................... 74

11. Anexo............................................................................................................................................. 74

Tabla 1. Anticuerpos primarios utilizados para inmunohistoquímica o inmunocitoquímica. ............ 74

Tabla 2. Anticuerpos primarios utilizados para inmunodetección de proteínas por Western-blot. . 75
Tabla 3. Anticuerpos secundarios. ..................................................................................................... 75

RESULTADOS........................................................................................................................................ 77

1. El BDNF es un factor neurotrófico esencial para la supervivencia de las neuronas nociceptivas y la

regulación de su heterogeneidad ......................................................................................................... 79

1.1. Caracterización de las poblaciones de neuronas sensoriales que dependen de BDNF in vivo ......... 79

1.2. Caracterización de los diferentes grupos de receptores cutáneos que dependen de BDNF in vivo. 85

1.3. Caracterización in vitro de la población de neuronas sensoriales nociceptivas que depende de

BDNF ....................................................................................................................................................... 90

1.4. Papel paracrino/autocrino de BDNF en el desarrollo postnatal de las neuronas nociceptoras....... 94

V
Indice

2. La metaloproteasa MT5-MMP está implicada en la regulación de la inervación cutánea nociceptiva

neuro-inmune ...................................................................................................................................... 97

2.1. MT5-MMP modula la inervación cutánea nociceptiva in vivo ......................................................... 97

2.2. MT5-MMP no está implicada en la supervivencia de las neuronas nociceptivas ............................ 99

2.3. MT5-MMP modula el crecimiento neurítico in vitro ...................................................................... 102

2.4. MT5-MMP está implicada en la respuesta al dolor térmico agudo .............................................. 105

2.5. MT5-MMP modula el procesamiento de la N-cadherina .............................................................. 105

3. La metaloproteasa MT5-MMP está relacionada con la interacción entre los mastocitos y las fibras
nerviosas nociceptivas. ...................................................................................................................... 107

3.1. MT5-MMP está implicada en la regulación del proceso de “de-granulación” de los mastocitos . 108

3.2. Obtención de mastocitos maduros a partir de cultivos de médula ósea (BMMCs) ....................... 110

3.3. Estudio de las interacciones celulares entre mastocitos y neuronas sensoriales .......................... 110

3.4. Implicación de la N-cadherina en la interacción mastocito-neurona sensorial ............................. 114

DISCUSIÓN ......................................................................................................................................... 117

CONCLUSIONES .................................................................................................................................. 129

BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................................... 133

ANEXO ............................................................................................................................................... 171

VI
 Abreviaturas

ABREVIATURAS

VII
 Abreviaturas

Abreviatura Descripción
ADAMs Desintegrinas y metaloproteinasas
ADAMTS Desintegrinas y metaloproteinasas con actividad trombospondina
Akt Proteína kinasa de serina-treonina
BAD Promotor de muerte asociado a Bcl-2/Bcl-x
BDNF Factor neurotrófico derivado del cerebro
BMMC Mastocitos derivados de médula ósea
BMP Proteínas morfogenéticas del hueso.
BSA Albúmina de suero bovino
CADM1 Molécula de adhesión celular-1
CAM Molécula de adhesión celular
cAMP Adenosín monofosfato cíclico.
CGRP Péptido relacionado con el gen de la calcitonina
CNG Ganglio Nervioso Craneal
CNTF Factor Neurotrófico Ciliar
CP Citoplasma
CRE Elementos de respuesta a cAMP
CREB Proteína vinculante a CRE
CSF Factor estimulador de colonias
CSPG Proteoglicano condroitín sulfato
CTMC Mastocitos de tejido conjuntivo
DAPI 4,6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro
DIV Días in vitro
DNA Ácido desoxirribonucleico
DMSO dimetilsulfóxido
DRG Ganglio de la Raíz Dorsal
ECM Matriz extracelular
EDTA Ácido etilen-diamino-tetra-acético
EGF Factor de crecimiento epidérmico
EPR1 Receptor de proteasas de células efectoras 1
ERK Proteína kinasa extracelular reguladora
FAS3 Fasciclina III
FBS Suero fetal bovino
FGF Factor de crecimiento fibroblástico.
FKHRL1 Factor de transcripción de la familia Forkhead
FP N-formil-péptidos
Gab-1 Proteína de unión a Grb2
GAG Glicosaminoglicanos

IX
Abreviaturas

GDNF Factor neurotrófico derivado de célula glial

GF Factor de crecimiento
GPCR Receptor acoplado a proteínas G
Grb-2 Proteína adaptadora de unión al receptor del factor de crecimiento
GSK Proteína kinasa glicógeno sintasa
HEPES Ácido (2-(4-2-hidroximetil)-1-piperalcinil)-etanosulfónico
HIHS Suero equino inactivado por calor
HMGB1 Proteína del Grupo de Alta Movilidad Box1
HSP Proteínas de choque térmico
IB4 Isolectina B4
ICAM Molécula de adhesión intercelular
ICAM-1 Molécula de adhesión intercelular-1
IFN Interferones
Ig Inmunoglobulina
IgCAM Molécula de adhesión celular tipo inmunoglobulina
IGF Factor de crecimiento insulínico
IL Interleuquina
IRS-1 Receptor de insulina-1
LPS Lipopolisacárido
IkB Inhibidor de kinasa B
MAK/ERK Kinasa activada por mitógenos o por señales extracelulares
MAPK/ERK Proteína de kinasa activada por mitógenos/o por señales extracelulares
MCP Fenotipo de progenitores de mastocitos
MMC Mastocitos de mucosa
MMP Metaloproteinasa de matriz extracelular
mRNA RNA mensajero
MT-MMP Membrana-tipo MMP
N-CAM Molécula de adhesión celular neural
NFkB Factor nuclear - kappa B
NGF Factor de crecimiento nervioso
NGS Suero de cabra normal
NK Neuroquinina
NT Neurotrofina
P Postnatal
p75 LNGFR Receptor de Baja Afinidad del Factor de Crecimiento Nervioso p75
p75NTR Receptor para las Neurotrofinas p75
PAF Factor activador de plaquetas
PAR Receptor proteinasa activado.

X
 Abreviaturas

PB Tampón fosfato
PBS Tampón fosfato salino
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PDGF Factor de crecimiento derivado de plaquetas
PDK Proteína kinasa dependiente de fosfoinositol.
PFA Paraformaldehido
PKC Proteína kinasa C
Pl3K/Akt Vía de señalización de la fosfatidilinositol-3-kinasa
PLC-1 Fosfolipasa C-1
PTB Dominio de unión de fosfotirosinas
RAGE Receptor de productos finales de la glicación avanzada
Ras/Erk Ras/Kinasas reguladas por señales extracelulares
RNA Ácido ribonucleico
RSK Proteína kinasa ribosomal 6
SAM Moléculas de adhesión del sustrato intercelular
SgIGSF Superfamilia de las inmunoglobulinas espermatogénicas.
Shc Proteína con dominio de homología Src 2
SNC Sistema Nervioso Central
SNP Sistema Nervioso Periférico
SynCAM Molécula de adhesión celular sináptica
TBE Tampón Tris borato EDTA
TEM Microscopio electrónico de transmisión
TGFβ1 Factor de crecimiento transformante beta-1
TNF Factor de necrosis tumoral
Trk Tirosina kinasa
VCAM-1 Molécula de adhesión celular vascular

XI
 Figuras y Tablas

FIGURAS Y TABLAS

XIII
 Figuras y Tablas

FIGURAS Y TABLAS

Figura 1 Organización anatómica y funcional del tacto. ............................................ 4

Figura 2 Clasificación de los principales síndromes de dolor. ................................... 7

Figura 3 Dolor fisiológico vs dolor inflamatorio. ......................................................... 8

Figura 4 Las neurotrofinas y modelos de activación de los receptores Trk y p75.... 13

Figura 5 Subclases de neuronas de los ganglios de la raíz dorsal y del “input”

de la espina dorsal.................................................................................... 19

Figura 6 Esquema general de la estructura y composición de la ECM de la piel. 22

Figura 7 Diagrama esquemático de diversas estructuras de dominios de las

diferentes superfamilias de CAMs. ........................................................... 27

Figura 8 Representación esquemática de los miembros de la familia de las

cadherinas, que todos comparten un motivo estructural común: “el dominio
cadherina extracelular (CE)”. .................................................................... 30

Figura 9 Guía axónica y el papel de las cadherinas en los procesos crecimiento

axónico. .................................................................................................... 34

Figura 10 Estructura y sustratos específicos de las metaloproteinasas. ................... 37

Figura 11 La proximidad entre mastocitos y fibras nerviosas en los tejidos, facilita la

comunicación neuro-inmune implicada en la modulación del dolor. .......... 47

Figura 12 Pérdida de fibras mielínicas y amielínicas en las raíces dorsales y nervios

safenos. .................................................................................................... 80

Figura 13 Esquema de la inervación lumbar del ratón y el porcentaje de pérdida

de fibras mielínicas en los ratones deficientes en BDNF. ......................... 84

Figura 14 Efecto de la falta de señalización de BDNF en la inervación general y

sobre los diferentes receptores de la piel pilosa y glabra de ratón. ........... 86

Figura 15 Efecto de la falta de señalización de BDNF en la inervación cutánea y

en diferentes nociceptores. ...................................................................... 89

Figura 16 Supervivencia in vitro de neuronas DRG postnatales tempranas en

presencia de diferentes factores de crecimiento. ...................................... 90

XV
Figuras y Tablas

Figura 17 Supervivencia in vitro de neuronas DRG postnatales tempranas en

presencia de diferentes factores de crecimiento.. ..................................... 91

Figura 18 Expresión in vitro del receptor TrkB. ......................................................... 92

Figura 19 Supervivencia in vitro de las neuronas DRG de pequeño diámetro en

presencia de diferentes factores de crecimiento. ...................................... 93

Figura 20 Expresión del mRNA de NGF, BDNF y GDNF en la piel y los DRGs

y sus efectos autocrinos / paracrinos. ....................................................... 95

Figura 21 Efectos autocrinos/paracrinos de BDNF. .................................................. 96

Figura 22 Modificación genética dirigida del gen MMP-MT5. .................................... 97

Figura 23 Expresión MT5-MMP e hiperinervación de la piel en las almohadillas

plantares y en la lengua de los ratones de tipo salvaje y deficientes en
Mmp24.. ................................................................................................... 98

Figura 24 Análisis de fibras mielínicas y amielínicas en L4 raíces dorsales de ratones

adultos Mmp24 - / -. ................................................................................. 100

Figura 25 El crecimiento normal del CGRP mutante + fibras centrales en la médula

espinal. ................................................................................................... 101

Figura 26 Fenotipo de las neuritas de las neuronas sensoriales de ratones mutantes

de Mmp24 en co-cultivo de explantes de DRGs y piel. ........................... 102

Figura 27 Fenotipo de las neuritas de las neuronas sensoriales mutantes de

Mmp24. .................................................................................................. 103

Figura 28 Medida del crecimiento neurítico en las neuronas sensoriales Mmp24. .. 104

Figura 29 Los niveles normales de TRPV1 en neuronas sensoriales y mastocitos

deficientes en Mmp24............................................................................. 105

Figura 30 Aumento de los niveles de N-cadherina en ausencia de MT5-MMP. ...... 106

Figura 31 Reducción de procesamiento N-cadherina y el aumento de los niveles

de β-catenina en Mmp24 deficiente en las neuronas sensoriales y

mastocitos. ............................................................................................. 107

XVI
 Figuras y Tablas

Figura 32 Alteración de las respuestas de capsaicina y degranulación de mastocitos

en ratones deficientes en Mmp24. ......................................................... 109

Figura 33 Expresión in vitro de MT5-MMP en DRGs y BMMCs.. ............................ 111

Figura 34 Contactos físicos alterados entre los mastocitos mutantes de Mmp24 ... 112

Figura 35 Papel de N-cadherina y MT5-MMP en la interacción funcional entre

neuronas de los DRGs y los BMMCs. ..................................................... 115

Tabla 1 Principales clases de receptores sensoriales somáticos. ............................ 5

Tabla 2 Recuentos neuronales en los DRGs de ratones BDNF +/+ y BDNF -/- ........ 79

Tabla 3 Recuentos de fibras mielínicas y amielínicas en los DRGs y en diferentes

nervios perféricos de ratones. ................................................................... 82

Tabla 4 Combinaciones de receptores en las neuronas sensoriales de tamaño

pequeño ................................................................................................... 94

Tabla 5 Porcentaje de mastocitos degranulados (BMMCs) en co-cultivos de

neuronas disociadas de DRGs adultos y BMMCs, de diferentes genotipos y
con diferenetes tratamientos................................................................... 113

Tabla 6 Porcentaje de mastocitos degranulados (BMMCs) en experimentos de

bloqueo de función de N-cadherin en co-cultivos de neuronas disociadas
de DRGs adultos y BMMCs de diferentes genotipos. ............................. 116

XVII
XVI
 Introducción

INTRODUCCIÓN

1
2
 Introducción

1. Nocicepción.
El dolor es una experiencia sensorial y emocional necesaria para la supervivencia de los
seres vivos que está asociada a la detección de un daño tisular actual o potencial. Todos los
organismos necesitan ser capaces de reaccionar ante los estímulos nocivos y evolutivamente
adquirir la capacidad de detectar y recordar el peligro. Sin embargo el dolor no es un proceso
homogéneo y comprende tres categorías, el dolor fisiológico, el dolor inflamatorio y el dolor
neuropático. La persistencia patológica del dolor puede derivar en ansiedad, depresión y una
pérdida importante de la calidad de vida. Estudios recientes han identificado nuevos tipos
celulares y moleculares implicados en la regulación de la sensibilidad al dolor y las vías
paralelas que distribuyen la información nociceptiva por las diferentes áreas límbicas o
sensoriales del prosencéfalo. El objetivo de esta tesis es profundizar en el estudio de aquellos
procesos neurobiológicos y celulares resultantes del dolor, especialmente los derivados de la
generación y el mantenimiento del dolor hiperalgésico. Los posibles nuevos conocimientos
adquiridos sobre su procesamiento podrían cambiar de forma significativa nuestro enfoque
preventivo o de control y posibilitaría el desarrollo de nuevas terapias analgésicas en multitud
de patologías.

1.1 Sistema nervioso somático-sensorial.

Los sistemas sensoriales nos permiten percibir el entorno y protegernos de él en función de las
señales recogidas por los diferentes receptores periféricos que consisten en terminales
nerviosos especializados procedentes de las neuronas sensoriales. En las últimas dos décadas
la investigación ha revolucionado nuestra comprensión de cómo el cerebro es capaz de adquirir
y procesar la información visual, auditiva, gustativa, olfativa y somático-sensorial. Las vías
ascendentes del sistema somático-sensorial están divididas básicamente en tres componentes:
Un subsistema que transmite la detección de estímulos mecánicos cutáneos tales como el
tacto suave, la vibración y la presión; un segundo subsistema que recibe información de
receptores especializados, asociados a músculos, tendones y articulaciones y que se encargan
de la propiocepción, que es la habilidad que tiene el organismo para percibir la posición exacta
en el espacio de sus extremidades y otras partes del cuerpo; y por último, un tercer subsistema
especializado en la detección del dolor y la temperatura (Scott, 1992).

La percepción somatosensorial se inicia a partir de la activación de las vías aferentes nerviosas

que se ramifican y distribuyen por toda la piel o los músculos. Los cuerpos celulares de las
fibras aferentes se localizan, bien en una serie de ganglios pares dispuestos a lo largo de toda
la médula espinal denominados ganglios de la raíz dorsal (DRGs) y que inervan el cuerpo o
bien en el tronco cerebral, denominados ganglios nerviosos craneales (CNGs) encargados de
la inervación de la cabeza.

Las neuronas sensoriales de los DRGs poseen estructuras pseudounipolares de manera que el
potencial de acción generado a partir de los estímulos de los receptores es transmitido desde la

3
Introducción

porción periférica de la fibra aferente directamente hasta la porción central y el terminal

sináptico que conecta con la neurona de segundo orden en la médula espinal, de manera que
la conducción de la actividad eléctrica a través de la membrana del soma neuronal no es un
paso obligatorio para el transporte de la información sensorial hasta el sistema nervioso central.
Sin embargo, los cuerpos celulares sí que juegan un papel muy importante en el mantenimiento
y regulación de los mecanismos moleculares que median la transducción, conducción y
transmisión de señales a través de las fibras aferentes sensoriales, así como la supervivencia,
maduración y especificación de las diferentes poblaciones de neuronas sensoriales durante el
desarrollo del sistema nervioso periférico (Figura 1).

Figura 1. Organización anatómica y funcional del tacto.

a) Los nervios espinales, formados por la unión de las raices aferentes (sensoriales) y eferentes (motoras),
proporcionan inervación periférica a la piel, músculo esquelético, vísceras y glándulas. Las flechas indican la dirección
de los impulsos sensoriales y motores, de entrada y salida respectivamente. Los cuerpos celulares de las neuronas
motoras se encuentran dentro del asta ventral de la médula espinal (láminas VII-IX), mientras que los cuerpos celulares
de las neuronas sensoriales se encuentran en los ganglios de la raíz dorsal (DRGs). Dentro de los DRGs, existen
subclases de neuronas sensoriales, denominadas propioceptivas (en azul), mecanosensitivas ( en rojo) y neuronas de
detección de temperatura y de dolor (en verde). Estas neuronas proyectan centralmente a las interneuronas del asta
dorsal (láminas I-IV de la médula espinal) y periféricamente, a los tejidos diana. Las neuronas propioceptivas,
proyectan e innervan (fibra azul) estructuras especializadas dentro de los tejidos diana, como en el caso del músculo y
la sensación de extensión muscular. b) Las neuronas mecanosensitivas de bajo umbral (fibras rojas), proyectan hacia
los órganos diana que transmiten estímulos mecánicos, como los corpusculos de Meissner o de Paccini, los terminales
de Ruffini, los plexos de los folículos pilosos y las células de Merkel. En la figura se ilustran los cinco tipos de
modalidades mecanosensitivas que se han descrito. Las neuronas sensoriales que detectan la temperatura y el dolor
(verde) no innervan órganos diana especializados, sino que, forman terminaciones nerviosas libres en todas las capas
de la piel y cerca de los vasos sanguíneos y folículos pilosos. c) Sección de la piel que muestra las terminaciones
nerviosas libres (fibras verdes) teñidas con PGP9.5, un marcador pan-neuronal. Los núcleos de las células de la piel se
tiñeron (azul) con fenilindol 4,6-diamino-2- (DAPI). Las terminaciones nerviosas libres se encuentran tanto en la
epidermis como en capas de la dermis. Modificado de Patapoutian et al., 2003.

4
 Introducción

Clasificación de las fibras nerviosas aferentes cutáneas.

La transducción sensorial, que es el mecanismo primordial para que la energía de un estímulo

sea transformada en una señal eléctrica neuronal, es similar en todos los aferentes sensoriales
somáticos. En función de sus propiedades electrofisiológicas, la velocidad de conducción del
impulso nervioso, y del diámetro de sus axones, las fibras nerviosas sensoriales se han
clasificado en tipo A (Aα, Aβ y Aδ) y tipo C (Erlanger y Gasser et al, 1930; Gasser et al, 1941;
Manzano et al., 2008, Tabla 1):

Axones Velocidades
Tipo de Características Tasa de Umbral de
asociados axonales de Localización Función
receptor anatómicas adaptación activación
(y diámetros) conducción
Terminaciones Dolor,
Terminaciones
nerviosas C, Aδ temperatura,
nerviosas 0,5-30 m/s Toda la piel Lenta Alto
mínimamente (0,2-5 µm) tacto grueso,
libres
especializadas picor
Corpúsculos Encapsulados; entre Aβ Principalmente Tacto, presión
35-75 m/s Rápida Mínimo
de Meissner las papilas dérmicas (6-12 µm) la piel glabra (dinámica)
Tejido
Presión
Encapsulados; en subcutáneo,
Corpúsculos Aβ profunda,
capas, como una 35-75 m/s membranas Rápida Mínimo
de Pacini (6-12 µm) vibración
cebolla interóseas,
(dinámica)
vísceras
Encapsulados;
Tacto fino,
Discos de asociados a células Aβ Toda la piel,
35-75 m/s presión Lenta Mínimo
Merkel liberadoras de (6-12 µm) folículos pilosos
(estática)
péptidos
Encapsulados;
Corpúsculos Aβ Estiramiento
orientados a lo largo 35-75 m/s Toda la piel Lenta Mínimo
de Ruffini (6-12 µm) de la piel
de líneas estriadas
Tanto lenta
Husos Áltamente Ia y II Longitud
35-120 m/s Músculos como Mínimo
musculares especializados (6-20 µm) muscular
rápida
Órganos
Áltamente Ib Tensión
tendinosos de 80-120 m/s Tendones Lenta Mínimo
especializados (12-20 µm) muscular
Golgi

Receptores Mínimamente Posición

--- Articulaciones Rápida Mínimo
articulares especializados articular

Tabla 1: Principales clases de receptores sensoriales somáticos. Modificado de Purves, 2001.

- Las fibras aferentes tipo Aα tienen una velocidad de conducción entre 80-120 m/s, un
diámetro de axón entre 12-20 µm, su principal función es la propiocepción y reciben la
información sensorial de receptores como los husos neuromusculares, el órgano tendinoso de
Golgi y los receptores articulares.

- Las fibras aferentes tipo Aβ poseen velocidad de conducción entre 35-75 m/s, un diámetro de
axón entre 6-12 µm y son responsables de la transmisión del tacto y de la presión. Los
receptores cutáneos que inervan son las células de Merkel, los corpúsculos de Meissner,
Paccini o Ruffini y los folículos pilosos.

5
Introducción

- Los aferentes Aδ tienen velocidad de conducción entre 5-30 m/s, un diámetro de axón entre
1-5 µm y transmiten la sensación de dolor, temperatura y tacto. Este tipo de fibra inerva los
folículos pilosos o forma terminales libres que se ramifican en la epidermis.

- Finalmente las fibras de tipo C, son la únicas que carecen de mielina, tienen una velocidad de
conducción entre 0.5-2 m/s, un diámetro de axón entre 0.2-1.5 µm, su función es la percepción
del dolor, de la temperatura y del picor y al igual que las fibras Aδ, forman terminaciones libres
en la piel.

1.2 Modalidades sensoriales del dolor.

En muchas ocasiones se hace referencia al dolor en ausencia de daño tisular u otra causa
conocida, y esta experiencia debe ser considerada también como dolor ya que no puede
distinguirse del producido por un daño tisular real. Por lo tanto, el dolor debe ser considerado
una experiencia altamente subjetiva que se completa con experiencias físicas, psicológicas y
sociales del individuo, siendo importante diferenciar entre la sensación dolorosa y los
mecanismos nerviosos de la nocicepción, ya que la activación de estos últimos no conduce
necesariamente a la percepción de dolor. En definitiva, la percepción del dolor tiene un
componente individual y subjetivo que dificulta su definición y su estudio.

Clásicamente se distinguen tres tipos de dolor de acuerdo con la evolución del mismo:

- El dolor fisiológico: Producido por la estimulación breve de los nociceptores de la piel u otros
tejidos en ausencia de daño tisular y considerado como necesario para la supervivencia y el
bienestar del individuo.

- El dolor agudo: Producido por un daño tisular importante y cuya duración depende del tiempo
que puedan tardar los tejidos en sanar; los factores psicológicos tienen una influencia
importante en la manera en que se experimenta este tipo de dolor, que puede desencadenar
una serie de acontecimientos que lo perpetúan y favorecen su evolución a dolor crónico.

- El dolor crónico: Producido a consecuencia de la estimulación constante de los nociceptores

en zonas en las que se ha producido un daño tisular. Tiene grandes efectos psicológicos sobre
el paciente y podría decirse que mientras el dolor agudo es un síntoma de una enfermedad, el
dolor crónico constituye una enfermedad por sí mismo.

De acuerdo con su origen, el dolor puede dividirse en: dolor somático, inflamatorio o
nociceptivo, que aparece cuando un estímulo potencialmente dañino estimula los receptores
nociceptivos, y que incluye el dolor originado en cualquier parte del cuerpo que no pertenezca
al sistema nervioso central (SNC); o dolor neuropático, que es el causado por una lesión
primaria o una disfunción en el sistema nervioso somatosensorial (definición oficial de la IASP)
(Figura 2)

6
 Introducción

Figura 2. Clasificación de los principales síndromes de dolor.

El dolor se puede dividir en tres grandes categorías: nociceptivo, inflamatorio y neuropático. Esta división se basa en el
estímulo inicial (presencia de un estímulo nocivo, inflamación o daño neural), en el sustrato neuronal del que se trate
(nociceptores o no nociceptores y la relativa contribución / participación del sistema nervioso periférico (PNS) o del
sistema nervioso central (CNS)), y la participación relativa de los canales o receptores de potencial transitorio (TRP),
las condiciones clínicas típicas, el papel biológico de dolor, y el umbral de dolor. El dolor nociceptivo es generado por
estímulos dañinos que actúan sobre los nociceptores en el PNS, activando los canales TRP, mediante estímulos
térmicos y químicos irritantes. Este dolor se produce clínicamente en el contexto de un traumatismo agudo, tiene
carácter protector y sirve para advertir de daños. El dolor inflamatorio se produce en presencia de tejido dañado o
inflamado. Los mediadores inflamatorios pueden sensibilizar a los nociceptores, lo que implica alteraciones en el
umbral de los canales TRP. También se inducen cambios en el sistema nervioso central (sensibilización central), de tal
manera que el dolor se puede desencadenar por activación de no-nociceptores. Este estado de dolor clínico suele ser
reversible y asociado con hipersensibilidad (los estímulos nocivos ya no son necesarios para evocar el dolor). El dolor
neuropático es el resultado de daños y lesiones al sistema nervioso. Los cambios fisiopatológicos responsables del
dolor espontáneo y de la hipersensibilidad al dolor experimentada por pacientes, se producen tanto en el PNS como en
el CNS y representan cambios patológicos no adaptativos. Algunos antagonistas de los canales TRP reducen este
dolor, pero el mecanismo de intervención en este proceso aún no se entiende bien. Modificado de Patapoutian et al.,
2010.

1.3 Vías moleculares del dolor. Dolor inflamatorio e hiperalgesia.

El dolor proviene de la transmisión de impulsos por aferentes primarios nociceptivos hacia la
médula espinal y desde ahí hasta el cerebro. Sin embargo, el dolor que es producido por un
estímulo que normalmente no es doloroso y que está asociado a un proceso inflamatorio,
conlleva un proceso muy diferente. Las neuronas sensoriales en condiciones fisiológicas son
activadas por estímulos dolorosos agudos y en situaciones de lesión nerviosa o de inflamación,
la sensibilización de estas neuronas sensoriales primarias, provoca la persistencia de un dolor
neurogénico o inflamatorio, respectivamente. Múltiples investigaciones dentro del campo
evidencian la contribución de las células gliales e inmunes en el desarrollo de los procesos

7
Introducción

nociceptivos de estos tipos de dolor. Para entender la fisiología del dolor y desarrollar nuevas
estrategias terapéuticas para su control, es importante describir y profundizar en las vías de
señalización mediante las cuales se regulan y relacionan los aferentes nociceptivos primarios y
las células inmunes.

Una lesión en la piel produce dolor continuo y dos tipos de hiperalgesia: primaria
y secundaria (Meyer et al., 2006). La hiperalgesia primaria se produce en el lugar de la lesión
tisular y está mediada en parte por la sensibilización de los aferentes primarios nociceptivos.
Esto se refleja, por ejemplo, en las respuestas al aumento de los estímulos de calor. La
hiperalgesia secundaria se produce en el tejido lesionado que rodea el sitio de la lesión y se
piensa que es debida a la sensibilización en el sistema nervioso central. La hiperalgesia
secundaria se caracteriza por obedecer a un estímulo mecánico no calórico. Esta hiperalgesia
mecánica es comparable a la producida en pacientes con dolor neuropático. Se han descrito
dos tipos de esta hiperalgesia: en primer lugar, el dolor producido por estímulos de tacto suave
(es decir, alodinia) y en segundo lugar por aumento mayor del dolor ante estímulos punzantes
(Figura 3).

Figura 3. Dolor fisiológico vs dolor inflamatorio.

a) Los nociceptores responden a los estímulos agudos que dañan los tejidos (tales como el calentamiento de la piel),
ya sea directamente, a través de la transducción de la energía del estímulo mediante receptores (como el canal iónico,
receptor de potencial transitorio (TRP), TRPV1) en los terminales nerviosos, o indirectamente, a través de la activación
de canales TRP en los queratinocitos (por ejemplo, TRPV3) y/o la liberación de moléculas intermedias (tales como
ATP), que a su vez actúan sobre los receptores de las neuronas sensoriales. Las células inmunes parecen tener poca
parte en este proceso. ASIC, canal catiónico sensible a amiloridos 2; P2X, purinoceptor ionotrópico; P2Y, receptor
pirimidinérgico acoplado a la proteína G; canales TRPA1, TRPM8, TRPV3, PRT. b) Después de la lesión tisular, los
mastocitos y los macrófagos se activan, y algunas células inmunes de origen sanguíneo, incluyendo neutrófilos,
pueden ser reclutados para el proceso inflamatorio. Se liberan varios mediadores inmunes, tales como el factor de
necrosis tumoral alfa (TNF), la interleukina-1 beta (IL-1beta), la interleukina-6 (IL-6), el óxido nítrico (NO), la
bradiquinina, el factor de crecimiento nervioso (NGF) y protones, que ejercen sus efectos algésicos, actuando
directamente sobre los nociceptores o indirectamente a través de la liberación de otros mediadores, principalmente
prostanoides. Cada vez se conocen con más detalle las cascadas intracelulares que se activan en los nociceptores a
través de estos mediadores moleculares que, en última instancia, activan o sensibilizan estas neuronas. COX2,
ciclooxigenasa 2; B1 / B2, receptor de bradiquinina; EP / IP, receptor prostanoide; ERK1 / 2, proteina kinasa
extracelular reguladora; Nav, canal de sodio voltaje-activado; PGs, prostaglandinas; PKA / PKC, proteína kinasa A / C;
TrkA, receptor tirosina kinasa A; TRPV1, canal receptor de potencial transitorio. Modificado de Marchand et al., 2005.

8
 Introducción

La inyección de capsaicina in vivo puede provocar la inflamación neurogénica, ya que puede

activar los nociceptores y produce hiperalgesia central y periférica (revisado por Fitzgerald et
al., 1983; Buck y Burks, 1986; Holzer et al., 1991; Szolcsanyi et al., 1993). Sin embargo, los
efectos de la capsaicina en los efectos conductuales del dolor, también parecen requerir de la
intermediación de los productos secretados por los mastocitos (Saadé et al, 2002; Massaad et
al, 2004).

Por lo tanto, es muy relevante la aclaración de las cascadas de señalización que actúan en
esta relación, entre aferentes nociceptores primarios y las células inmunes periféricas, para
comprender la fisiología del dolor y para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas de su
control.

La respuesta tisular a la agresión o inflamación en sentido estricto contempla en esquema

cuatro acontecimientos interrelacionados: a) la estimulación de las terminaciones nerviosas
libres provoca dolor y liberación de unos péptidos bioactivos llamados neuropéptidos; b) el
daño celular o piroptosis, conduce a la liberación de proteínas constitutivas intracelulares tales
como la HSP, el factor nuclear HMGB1 y los N-formil-péptidos (FP) mitocondriales; c) los
microorganismos y sus diferentes productos incitan, en colaboración con los anteriores, a una
respuesta inmunológica innata; y d) las señales que emana el foco inflamatorio reclutan
leucocitos en el lugar de la lesión. Las terminaciones nerviosas sensoriales libres liberan, tras
la lesión o el estímulo correspondiente, neuropéptidos pertenecientes a la clase taquininas
(sustancia P y neuroquininas), que representan el estímulo inicial de los mastocitos que
exponen sobre su membrana receptores específicos para tales mediadores proinflamatorios.

Una vez iniciada la secuencia inflamatoria, las triptasas liberadas por esas mismas células y
por otras participantes en el proceso que actuando sobre receptores activados por proteasas
(Protease-activated receptor, PAR) de los tipos PAR2 y EPR1 (Effector cell protease receptor)
refuerzan la respuesta inicial de las terminaciones nerviosas, que incrementan la producción y
liberación de CGRP (Calcitonin gene related product) y de sustancia P. El primero actúa sobre
receptores arteriolares provocando vasodilatación, responsable de los signos inflamatorios
rubor y calor, y el segundo sobre receptores venulares, provocando un incremento de la
permeabilidad venular y extravasación responsable del edema o tumor inflamatorio. Se ha
demostrado que las HSP, liberadas al compartimento extracelular, tienen una serie de efectos
inmunológicos, que incluyen la inducción de secreción de citoquinas proinflamatorias y de
expresión de moléculas de adhesión por diversos tipos celulares. La HSP60 activa, en
humanos, las células endoteliales vasculares para expresar selectina-E, ICAM-1 (Intercellular
adhesion molecule-1) y VCAM-1 (Vascular cell adhesion molecule-1). La misma proteína de
estrés induce la secreción de interleuquina-6 (IL-6) por células endoteliales, células musculares
lisas y macrófagos. De manera similar al lipopolisacárido (LPS) de las bacterias gram
negativas, la HSP60 induce la rápida liberación de TNF-α y de óxido nítrico (Nitricoxide, NO)
por los macrófagos, así como la expresión de IL-12 e IL-15. Las HSP, en su función

9
Introducción

extracelular como citoquinas (caperoquinas), activan a los monocitos y macrófagos a través de

los mismos correceptores CD14 (del inglés, CD: Cluster designation o cluster of differentiation)
que utilizan los LPS bacterianos para incitar una respuesta inmunológica innata.

La HMGB1 es una proteína abundante, no histona, miembro de la superfamilia que agrupa

proteínas nucleares que presentan una movilidad electroforética muy alta. Este grupo de
proteínas incluye tres familias. Los miembros de la familia HMGB se encuentran entre las
proteínas más ubicuas, abundantes y evolutivamente más conservadas entre las especies
eucarióticas; todos ellos comparten un dominio box que media el acoplamiento de la proteína al
DNA (Goodwin et al., 1973; Weir et al., 1993; Bustin et al., 1999).

La HMGB1, como factor nuclear, actúa como un elemento estabilizador de la arquitectura del
DNA y juega un papel relevante en la transcripción, pero cuando abandona su ubicación
normal y alcanza el medio extracelular, bien pasivamente por ruptura celular o por secreción de
células inflamatorias activadas por citoquinas, actúa como un potente mediador inflamatorio
con características citoquínicas y quimioquínicas (Wang et al 1999; Li et al., 2003).

Su receptor RAGE (del inglés Receptor for advanced glycation end products), que pertenece a
la superfamilia de las inmunoglobulinas, se localiza en los endoteliocitos y los miocitos
vasculares y en los fagocitos, entre otras células. Su actuación sobre estas células potencia el
proceso inflamatorio, provocando la disrupción de la pared vascular favoreciendo la
extravasación de líquido y de células intravasculares, y es una potente citoquina sobre los
fagocitos (revisado en Klune et al., 2008). Los fagocitos profesionales, neutrófilos
polimorfonucleares y células mononucleadas (monocitos y macrófagos), juegan un papel clave
en la defensa del huésped contra las bacterias invasoras. Las señales quimioatrayentes
clásicas de los fagocitos son: los FP bacterianos y mitocondriales, el factor 5a del complemento
(C5a), la interleuquina 8 (IL-8) y el factor activador de plaquetas (Platelet-activating factor,
PAF). Cuando los quimioatractores están presentes a altas concentraciones activan las
funciones citotóxicas de los fagocitos y liberan enzimas lisosómicas y otros mediadores
inflamatorios.

Mediadores inflamatorios.

Numerosos estudios señalan la importancia del reclutamiento de leucocitos en el foco

inflamatorio a partir del “pool” circulante, sin embargo, una rápida respuesta se requieren
células centinelas estacionadas en los tejidos, los macrófagos y especialmente los mastocitos,
cumplen tal función. Los mastocitos perivasculares responden a los neuropéptidos liberados
por las terminaciones nerviosas dañadas y estimuladas liberando histamina, triptasa y otras
proteasas y TNF-α preformados, y eicosanoides (prostaglandinas inflamatorias, tromboxanos y
leucotrienos), citoquinas y quimioquinas neoformadas. La histamina, los eicosanoides y las
triptasas causan vasodilatación (responsable del calor y rubor inflamatorios) y extravasación
(responsable del tumor o edema inflamatorio). Las triptasas mastocíticas cortan el extremo N-

10
 Introducción

terminal de receptores activados por proteasas, desenmascarando las secuencias que

autoactivan el propio receptor. Por ejemplo, los receptores PAF que pertenecen a la familia de
los GPCR (del inglés, G Protein Coupled Receptor) y que están presentes en mastocitos,
terminaciones nerviosas libres sensitivas, endotelio vascular, plaquetas y neutrófilos. Su
activación potencia la estimulación de los mastocitos y de las terminaciones nerviosas, refuerza
la adhesividad endotelial que conduce a la migración leucocitaria desde el vaso al foco
inflamatorio e induce en aquellos la expresión de receptores de quininas, responsables de la
vasodilatación (Martin et al., 2007).

Las citoquinas son pequeñas proteínas o glicoproteínas que actúan como autacoides o como
hormonas, producidas generalmente como formas precursoras por células activadas que
median el proceso inflamatorio. Algunas de ellas se comportan como factores de supervivencia
al prevenir la apoptosis. Las citoquinas también median, de manera directa, interacciones
célula-célula. En el sentido más restrictivo, las citoquinas comprenden las interleuquinas,
linfoquinas, monoquinas, interferones (IFN), quimioquinas, CSF (del inglés, Colony Stimulating
Factor,) y los GF (Growth Factor). El término citoquinas de tipo 1 se refiere a aquellas
producidas por células Th1 (células T helper- 1 o asistentes): IL-2, IFN-γ (Interferón-γ), IL-12 o
TNF-β). Las citoquinas de tipo 2 son las producidas por Th2: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 o IL-13.

Tras la expresión génica, la mayoría de las citoquinas son secretadas por las células utilizando
las vías secretoras clásicas, existiendo formas que se asocian a las membranas y otras a la
matriz extracelular. Se denominan citoquinas proinflamatorias aquellas que favorecen la
inflamación, siendo prototípicas IL-1, IL-6 y TNF-α (Watkins et al., 1999).

Además, actúan como pirógenos endógenos, inducen la síntesis de mediadores secundarios y

de citoquinas proinflamatorias por macrófagos y por células mesenquimales, estimulan la
producción de proteínas de fase aguda y atraen células inflamatorias. Por ejemplo, el TNF
amplifica y prolonga la respuesta inflamatoria al activar otras células que, como respuesta,
liberan citoquinas tales como IL-1 y HMGB1, y otros mediadores como eicosanoides, óxido
nítrico y especies reactivas de oxígeno, que potencian la inflamación y provocan lesiones
tisulares. El TNF es esencial para la completa expresión inflamatoria; por el contrario, la
autolimitación del proceso inflamatorio se caracteriza por una atenuación de la actividad del
TNF (Watkins et al., 1999).

Las quimioquinas constituyen una familia de pequeñas proteínas proinflamatorias que juegan
un papel fundamental en la inflamación por atraer y activar clases específicas de leucocitos,
participando en tres de las cinco etapas de la cadena de adherencia leucocítica. En primer
lugar, favorecen el rodamiento lento y la adherencia de los leucocitos al activar las integrinas
leucocitarias; son potentes quimioatractores que guían a los leucocitos hacia el foco
inflamatorio y además, activan las funciones efectoras de los leucocitos, incluyendo la
producción de productos intermedios reactivos durante el metabolismo del oxígeno y la
exocitosis de enzimas hidrolíticas. Las quimioquinas se unen a glicosaminoglicanos y heparina,

11
Introducción

formando complejos que se creen de gran importancia en su capacidad para atraer localmente
a los leucocitos (Abbadie et al., 2009; Gao and Ji, 2010; Milligan et al., 2008).

2. Desarrollo de la neurobiología del dolor.

2.1. La familia de las neurotrofinas y sus receptores.
Los factores neurotróficos son importantes reguladores en el desarrollo y fisiología del
sistema nervioso de los vertebrados. Dentro de este grupo, las neurotrofinas fueron
identificadas como moléculas promotoras de la supervivencia neuronal, pero en la actualidad
se sabe que regulan muchos aspectos del desarrollo y funciones de las neuronas, incluyendo
la diferenciación y la plasticidad sináptica (Lewin y Barde, 1996; Reichardt y Fariñas, 1997;
Huang y Reichardt, 2001, 2003; Chao, 2003; Reichardt et al, 2006).

Las neurotrofinas fueron identificadas como moléculas promotoras de la supervivencia

neuronal y en la actualidad se sabe que regulan muchos aspectos del desarrollo y función
neuronal de las mismas, incluyendo la diferenciación y plasticidad sináptica (Revisión en Lewin
y Barde, 1996; Reichardt y Fariñas, 1997; Huang y Reichardt, 2001; Reichardt et al., 2006). En
la década de los 50, Levi-Moltacini y Hamburguer descubrieron que un tumor de sarcoma de
ratón, implantado cerca de la médula espinal de un embrión de pollo en desarrollo, secretaba
un factor soluble que inducía la hipertrofia y el crecimiento de las fibras de las neuronas
simpáticas. Seguidamente, estudios in vitro, revelaron que este factor era una proteína de
relativamente bajo peso molecular que fue identificada como el factor de crecimiento nervioso
(Nerve Grow Factor NGF), (Cohen y Levi-Montalcini, 1956; Cohen et al., 1960). Este
descubrimiento abrió otro campo de investigación en la neurobiología dedicado a la
identificación y elucidación de las funciones celulares de los llamados factores neurotróficos,
que actualmente incluyen a la familia de las neurotrofinas, la familia del GDNF (Glial cell
Delivered Neutrotrophic Factor), ciertas citocinas como la cardiotropina-1 o el CNTF (Ciliary
Neurotrophic Factor) y otros factores de crecimiento demostrándose recientemente que ejercen
funciones en la supervivencia neuronal, tales como: TGF-β, IGF, EGF, FGF, BMPs y PDGF.
Entre estos factores neurotróficos, la familia de las neurotrofinas es de gran importancia,
debido a su amplia expresión en diferentes poblaciones neuronales del SNC y SNP.

El hallazgo del NGF validó la hipótesis de acción de un factor neurotrófico: los tejidos
diana secretan cantidades limitantes de factores de supervivencia, que permiten un balance
entre el tamaño del tejido diana y el número de neuronas que lo inervan. Dos décadas después
de la identificación del BDNF como el prototipo de neurotrofina para las neuronas del SNP,
(Barde et al., 1982) purificaron una segunda neurotrofina a partir del cerebro de cerdo, la cual
se comportaba como un factor de supervivencia para algunas poblaciones neuronales y se
denominó factor neurotrófico derivado del cerebro (Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF).
Las secuencias conservadas de estas dos proteínas permitieron el aislamiento de clones que
codifican para miembros adicionales de esta familia, como la neurotrofina-3 (NT-3; Ernfors et
al., 1990; Hohn et al., 1990; Jones et al., 1990) y la neurotrofina-4/5 (NT-4; Hallböök et al.,

12
 Introducción

1991; Ip et al., 1992). En la actualidad se conocen cuatro neurotrofinas en los mamíferos: NGF,
BDNF, NT-3 y NT-4. En peces se han aislado otras neurotrofinas denominadas NT-6 Y nt-7, las
cuales no tienen ortólogos en mamíferos y aves, pero parece que interactúan con los mismos
receptores que las proteínas de mamíferos (Goltz et al., 1994; Lai et al., 1998)

Figura 4. Las neurotrofinas y modelos de activación de los receptores Trk y p75.

La unión de las neurotrofinas resulta en la dimerización de cada receptor. Las neurotrofinas se unen selectivamente a
receptores específicos Trk, mientras que todas las neurotrofinas se unen a p75. Los receptores Trk, contienen dominios
extracelulares inmunoglobulina G (IgG) de unión al ligando y una secuencia catalítica de tirosina kinasa, en el dominio
intracelular. Cada receptor activa varias vías de señal de transducción: NGF se une específicamente a TrkA, BDNF y
NT4 reconocen a TrkB, y NT3 activa TrkC. En algunos contextos celulares NT3 podría activar a TrkA y TrkB pero con
menos eficiencia. La porción extracelular de p75 contiene cuatro repeticiones ricas en cisteína, y la parte intracelular
contiene un dominio de muerte celular. La unión de las neurotrofinas al receptor p75 media supervivencia, migración
celular y mielinización a través de varias vías de señalización. Las interacciones entre los receptores Trk y p75 pueden
conducir a cambios en la afinidad de la unión de las neurotrofinas. BDNF, factor neurotrófico derivado del cerebro; JNK,
kinasa N-terminal Jun; MAPK, Vía MAPK; NGF, factor de crecimiento nervioso; NT, neurotrofina; PI3K, fosfatidilinositol
3-kinasa; PLC, fosfolipasa C. Modificado de Chao, 2003.

Las neurotrofinas han tenido un papel clave en el desarrollo neurobiológico. Los ensayos que
llevaron a su descubrimiento revelaron una función esencial en el control de la supervivencia
celular y la diferenciación. Ciertos estudios demostraron que el GDNF era internalizado
mediante un proceso mediado por un receptor y transportado mediante vesículas
membranosas a lo largo del axón hacia el soma utilizando el citoesqueleto y la energía
necesaria (Thoenen y Barce, 1980). Se ha determinado que la señalización local regula la
motilidad del cono de crecimiento, mientras que la señalización en el soma celular controla la
supervivencia celular y la expresión génica. Trabajos posteriores, además, han revelado una
diversidad de funciones de estos factores fuera del sistema nervioso, como por ejemplo en el

13
Introducción

desarrollo del sistema cardiaco, la neovascularización y la función del sistema inmune

(Donovan et al., 2000; Lin et al., 2000; Copolla et al. , Kermani et al., 2005).

Las neurotrofinas y sus genes comparten homologías en la secuencia y estructura, la

organización de los segmentos genómicos adyacentes a estos genes es también similar, por lo
que se considera que los genes se han originado por duplicaciones sucesivas de una porción
del genoma derivado de un cordado ancestral (Hallböök et al, 1999). Sus genes comparten
muchas similitudes, incluyendo la existencia de múltiples promotores y la proteína producto de
cada gen incluye una secuencia señal y un pro-dominio, seguido por la secuencia de la
proteína madura. De este modo, cada producto génico debe ser procesado por proteólisis para
formar una proteína madura. La regulación de la maduración es clave en el control post-
transcripcional que limita y añade especificidad a sus acciones. Las proteínas maduras de las
neurotrofinas son homodímeros asociados de manera no covalente y, aunque algunos
monómeros in vitro son capaces de formar heterodímeros con monómeros de otra neurotrofina,
in vivo no hay evidencias de que estos heterodímeros existan en concentraciones significativas.
(McDonals et al., 1991; Robinson et al., 1995; Butte et al., 1998)

Todas las neurotrofinas son generadas como precursores pre-pro-neurotrofinas (de

aproximadamente 240-260 aminoácidos), que posteriormente son procesadas hasta que se
secretan como proteínas homodiméricas maduras hacia el espacio extracelular (longitud del
monómero: 118-129 aminoácidos). Su actividad es regulada por las proteasas responsables de
la conversión de pro-neurotrofinas en neurotrofinas maduras. El interés de estas proteasas se
ha incrementado debido a ciertos ensayos donde se ha demostrado que las pro-neurotrofinas
son secretadas por células y son biológicamente activas (Lee et al., 2001). El procesamiento
intracelular de las pro-neurotrofinas no siempre es eficiente, ciertas cantidades de estas
moléculas son secretadas en algunos tejidos. Las pro-neurotrofinas se unen con gran afinidad
al p75NTR y activan las vías de señalización controladas por este receptor, el cual en muchas
células termina promoviendo la apoptosis (Lee et al., 2001). Los datos sugieren que la
secreción de las pro-neurotrofinas está incrementada después de una lesión o degeneración
cerebral, y la unión de estas proteínas a p75NTR puede aumentar la pérdida neuronal en
lesiones y modelos de enfermedades (Pedraza et al., 2005).

En el interior celular las formas maduras del NGF, BDNF, y NT-3 son generadas por furina y
otras prohormonas convertasas (Seidah et al., 1996). Como resultado, tamaños variados de
pro-neurotrofinas son detectadas en extractos cerebrales (Lee et al., 2001). La pro-BDNF
extracelular es fragmentada por plasmita (Pang et al., 2004) y la regulación de esta
fragmentación es de gran interés debido a los datos que indican que el BDNF maduro y la pro-
BDNF promueven distintas formas de plasticidad sináptica en el hipocampo a través de
receptores diferentes (Zakharenko et al., 2003; Pang et al., 2004).

Algunos estudios sobre la expresión de las neurotrofinas dentro de las neuronas se han
enfocado principalmente en el BDNF ya que es un importante modulador de la plasticidad

14
 Introducción

sináptica. La expresión del BDNF está controlada a través de cuatro promotores diferentes. La
expresión de uno de estos promotores está regulada por el flujo de Ca2+. Este a su vez activa la
transcripción del BDNF a través de cascadas de proteína kinasas que activan ciertos factores
de transcripción (Tao et al., 2002).

Los receptores de las neurotrofinas.

Las neurotrofinas interactúan con dos clases distintas de receptores. En mamíferos, los
tres miembros de la subfamilia de receptor tirosina kinasa (Trk) constituyen la segunda clase de
receptores para las neurotrofinas (Chao et al, 2003; Huang y Reichardt, 2003). El dominio
extracelular de cada receptor Trk está formado por un grupo rico en cisteína seguido por tres
repeticiones ricas en leucinas y otro grupo rico en cisteína, cada receptor se expande a través
de la membrana y termina en un dominio citoplasmático tirosina kinasa. Las tirosinas que
rodean a este dominio sirven como sitios de anclaje y son dependientes de fosforilación para
adaptadores citoplasmáticos y enzimas. Las cuatro neurotrofinas exhiben especificidad en su
interacción con los tres miembros de esta familia de receptores, así tenemos que el NGF activa
TrkA, BDNF y NT-4 activan TrkB, mientras que la NT-3 activa TrkC, aunque esta última
neurotrofina puede activar a los otros receptores Trks con menos eficacia. El lugar por el cual
las neurotrofinas interactúan con estos receptores es el domino inmunoglobulina proximal a la
membrana, cuya estructura tridimensional para cada uno de los receptores Trks ha sido
resuelta (Ultsch et al., 1999). (Figura 4).

La expresión de un receptor específico Trk confiere sensibilidad a las neurotrofinas l que

se unen, sin embargo, los diferentes procesamientos alternativos introducen algunas
limitaciones a esta generalización. Por ejemplo, diferentes procesamientos a través de
inserciones de secuencias cortas de aminoácidos en el dominio extracelular del TrkA, TrkB y
TrkC afectan a la interacción del ligando con cada receptor (Meakin et al., 1992; Clary y
Reichardt, 1994; Shelton et al., 1995; Garner et al., 1996; Strohmaier et al., 1996). Para TrkA y
TrkB la inserción de una secuencia que codifica para un pequeño exón, potencia la unión del
receptor a ligandos no específicos. Las isoformas del TrkA y TrkB que carecen de estos
insertos son activadas únicamente por el NGF y BDNF respectivamente, la isoforma del TrkA
que incluye el inserto es activada por NT-3, además del NGF (Clary y Reichardt, 1994), y la
isoforma similar del TrkB es activada por NT-3 y NT-4 además de por el BDNF (Strohmaier et
al., 1996).

Los diferentes procesamientos de los exones que codifican para porciones de los dominios
intracelulares de los receptores Trks también regulan la señalización iniciada por la unión de
las neurotrofinas. Ciertas isoformas de TrkB y TrkC incluyen pequeños motivos citoplasmáticos
sin el dominio tirosina kinasa y la expresión de esta isoforma inhibe la dimerización de los
receptores Trks que contienen el dominio kinasa (Eide et al., 1996). Durante muchos años se
pensó que estos receptores truncados no señalizaban, pero de hecho limitan la difusión de las
neurotrofinas y posiblemente participan en la transducción de la señal por parte de los

15
Introducción

receptores. El procesamiento del mRNA de TrkC produce una isoforma de TrkC con un inserto
de aminoácidos dentro del dominio tirosina kinasa, y este inserto modifica la especificidad de
este dominio, inhibiendo la activación de algunos sustratos e interfiriendo con la habilidad para
promover la diferenciación neuronal (Guiton et al., 1995; Meakin et al., 1997). El procesamiento
diferencial de los mRNA de los receptores Trks no es la única influencia que modula la acción y
unión de las neurotrofinas. En algunas neuronas del SNC, muchos receptores están
localizados en vesículas intracelulares. Segundos mensajeros, tales como cAMP o Ca2+,
promueven la inserción de los receptores en la superficie de la membrana, donde son
accesibles a las neurotrofinas (Meyer-France et al., 1998; Du et al., 2000).

Antes del descubrimiento de los receptores Trks, el primero que se descubrió, se

denominó receptor para las neurotrofinas p75 (p75NTR) y fue identificado como un receptor de
baja afinidad para el NGF. Seguidamente se descubrió que era capaz de unir a cada
neurotrofina con similar afinidad (Rodriguez-Tebar et al., 1990; Frade y Barde, 1998). p75NTR
es un miembro de la superfamilia de receptores de necrosis tumoral con un dominio
extracelular que incluye cuatro motivos ricos en cisteína, un dominio transmembrana y un
dominio citoplasmático que incluye un dominio “muerte” similar a los presentes en miembros de
esta familia (Liepinsh et al., 1997; He y García, 2004). Aunque este receptor no contiene
motivos catalíticos, es capaz de interactuar con algunas proteínas, que transmiten señales
claves que regulan la supervivencia y diferenciación neuronal así como la plasticidad sináptica.
Por ejemplo, el receptor se une a NGF en la interfase entre los dos monómeros y el resultado
de la unión termina con un cambio en la conformación de NGF. Esto sugiere que la unión de
receptor y ligando podría disociar los multímeros de p75NTR siendo compatible con la
posibilidad de que los Trks y los monómeros de p75NTR se unan al mismo dímero de
neurotrofina. Además, la función de los receptores TrkA está regulada en ocasiones por la
presencia de p75NTR. Este receptor inhibe la activación de los Trks por neurotrofinas no
específicas, tanto in vitro como in vivo (Benedetti et al., 1993; Brennan et al., 1999; Bibel et al.,
1999), es capaz de potenciar la activación de TrkA por concentraciones subóptimas de NGF,
(Davies et al., 1993; Mahadeo et al., 1994), colabora con TrkA para formar sitios de unión de
alta afinidad para NGF (Espósito et al., 2001) y además de promover la unión del NGF al TrkA,
es capaz de promover el transporte retrógrado de otras neurotrofinas (Curtis et al., 1995).

Señalización activada por neurotrofinas.

La teoría clásica sobre los factores neurotróficos sugiere que las neurotrofinas son
secretadas en cantidades limitantes por el tejido diana piel, músculo, glándulas, neuronas y
mantienen la supervivencia y diferenciación de las neuronas que inervan esta diana (Levi-
Montalcini et al, 1987; Toenen et al, 1991). Teniendo en cuenta esta teoría, se espera que las
neurotrofinas sean expresadas por células no neurales así como en el soma y dendritas de
neuronas sobre las cuales terminan los axones. Después de la secreción por parte del tejido
diana, las neurotrofinas se unen a los receptores Trks y/o p75NTR, son endocitadas y

16
 Introducción

transportadas de manera retrógrada del axón hacia el soma celular donde pueden activar
diferentes cascadas de señalización (revisión en Heerssen y Segal, 2002). Se ha demostrado
que cada una de las neurotrofinas, través de la interacción con el receptor, internalización y
transporte retrógrado, tiene una acción local que afecta al comportamiento del cono de
crecimiento y a la función sináptica, así como a las acciones en el cuerpo celular y el núcleo
(Fariñas et al., 1996; Yee et al., 2003)

El transporte retrógrado clásicamente lo utilizan las neurotrofinas para ejercer efectos de

duración relativamente larga, como por ejemplo, aquellos que impliquen la transcripción de
nuevos genes. Sin embargo, existe un transporte anterógrado dirigido hacia los terminales
sinápticos, y este proceso parece ser relevante en algunas regiones del cerebro (revisión en
Altar y DiStefano, 1998). Por último, pero no por ello menos importante, las neurotrofinas
pueden ejercer acciones rápidas (Blum et al., 2002) que conducen a la activación de corrientes
de iones de Na+. Debido a la desensibilización rápida de estas respuestas, las neurotrofinas
son almacenadas en compartimentos especializados que permiten su rápida secreción.

La activación de un receptor Trk produce la fosforilación de algunas de las tirosinas del

dominio citoplasmático conservadas evolutivamente, potenciando la actividad tirosina kinasa
(Cunngham et al., 1998) y también la fosforilación de residuos adicionales que sirven como
sitios de reclutamiento y anclaje de proteínas que contienen dominios PTB (del inglés phopo-
tyrosine-binding domains) o SH2 (del inglés homology domain 2). Las vías de señalización
intracelular activadas por estas proteínas incluyen: Ras/Erk (del inglés Ras/extracelular
regulated kinase), Pl3K/Akt (del inglés phosphatidilinositol-3 /Akt Kinase), PLC-y1 (del inglés
phospholipase C-1), NFkB (del inglés nuclear factor-kappa B), y PKC (del inglés Protein Kinase
C) (Wooten et al., 199; Foeht et al., 2000; Kaplan y Miller, 2000).

La familia de proto-oncogenes Ras incluye proteínas que regulan la diferenciación

neuronal. En muchas neuronas Ras promueve la supervivencia neuronal a través de Pl3K o por
la vía MAK/ERK. Si la respuesta a la neurotrofina induce proliferación o diferenciación parece
depender de la activación de la vía de MAPK/ERK (Grewal et al., 1999). Shc puede también
estimular la actividad transitoria de Ras a través de SOS.

Entre las dianas de ERK están las RSKs (del inglés Ribosomal S6 kinase), que junto con
MAPK-2 (del inglés Mitogen Activated Protein Kinase) pueden fosforilar la proteína de unión a
CRE (CREB, CRE-binding protein) y otros factores de trascripción. Se ha demostrado que
CREB regula genes esenciales para la supervivencia de las células granulares del cerebelo y
neuronas simpáticas (Bonni et al., 1999; Riccio et al., 1999). En las células PC12, la activación
prolongada de la señalización por B-raf y ERK (York et al., 1998, 2000; Nosaka et al., 1999).
Frs-2 también se une a la familia de las Src que están implicadas en la endocitosis del receptor
y otras respuestas celulares (Silde et al., 1999; Beattie et al., 2000).

17
Introducción

Los receptores Trks pueden activar Pl3K a través de al menos dos vías distintas. En
muchas neuronas, la activación de Pl3K dependiente de Ras es la vía más importante a través
de la cual las neurotrofinas promueven la supervivencia (Vaillant et al., 1999). Sin embargo,
Pl3K también puede ser activada a través de tres proteínas adaptadoras, Shc, Grb-2 y Gab-1
(Holgado-Madruga et al., 1997) o de forma indirecta a través de la fosforilación del sustrato del
receptor de insulina IRS-1 que a su vez conduce a la activación de Pl3K (Yamada et al., 1997).
Los productos lipídicos generados por Pl3K reclutan muchas proteínas entre las que se
encuentran Akt kinasa y PDKs (del inglés 3- phosphoinositide-dependent kinase). Akt es
activado en la membrana por PDK y fosforila a algunas proteínas importantes en el control de
la supervivencia celular (Datta et al., 1999; Yuan y Yanker, 2000); entre estas se encuentran
BAD (del inglés Bcl-2/Bcl-x-associated death promotor), lκB (del inglés Inhibitor kinase B),
FKHRL1 (del inglés Forkhead family transcription factor), GSK 3-β (del inglés glycogen
synthase kinase) y la caspasa-9 (Brunet et al., 1999), muchas de las cuales regulan el proceso
de apoptosis celular (revisión general de la señalización por Trks en Patapoutian y Reichardt,
2001; Reichard et al, 2006).

2.2. La hipótesis neurotrófica y el desarrollo sensorial embrionario.

La muerte neuronal que tiene lugar de forma natural en el desarrollo del sistema nervioso
de los vertebrados, está fuertemente regulada por factores neurotróficos (Kirstein y Fariñas,
2002). Dentro de estos factores las neurotrofinas constituyen una pequeña familia que en los
mamíferos está compuesta por NGF (nerve growth factor), BDNF (brain-derived neurotrophic
factor), NT-3 (neurotrophin-3) y NT-4/5 (neurotrophin-4/5). Originalmente se demostró que
estas moléculas eran producidas en cantidades limitantes por los órganos diana justo en el
momento de su innervación.

De esta forma, las neuronas compiten por su supervivencia y se establece un equilibrio

entre el número de neuronas inervantes y el tamaño del órgano inervado. Actualmente se sabe
que estas proteínas de secreción regulan otros muchos aspectos del desarrollo del sistema
nervioso como son la diferenciación neuronal o la elongación de los axones, entre otros
procesos (Kirstein y Fariñas, 2002). Las neurotrofinas interaccionan con dos tipos de
receptores extracelulares: el receptor de baja afinidad de NGF, p75 LNGFR, que es capaz de
unir cualquiera de las neurotrofinas con similar afinidad, y los receptores de alta afinidad
pertenecientes a la familia Trk de receptores de membrana tirosina kinasa. NGF activa
específicamente TrkA; BDNF y NT-4/5 activan TrkB; NT-3 activa TrkC y ocasionalmente puede
activar TrkA o TrkB (Bothwell et al., 1995).

En los últimos años, se han generado numerosas cepas de ratones, con deleciones
dirigidas en los genes que codifican para las distintas neurotrofinas o sus receptores. Su
análisis ha proporcionado información sobre los requerimientos neurotróficos de determinadas
poblaciones neuronales, en el sistema nervioso central y periférico de mamíferos (Reichardt y
Fariñas, 1997; Kirstein y Fariñas, 2002). Las neuronas sensoriales de los ganglios de la raíz

18
 Introducción

dorsal (DRG) son células morfológica y funcionalmente heterogéneas (revisiones en Scott et

al., 1992). Las diferentes subpoblaciones están especializadas en la transducción de diferentes
modalidades de información sensorial como la posición espacial (propiocepción), el tacto
(mecanorrecepción), el dolor (nocicepción), etc… También inervan diferentes tipos de
receptores periféricos y proyectan a distintas áreas del sistema nervioso central. Estas
neuronas difieren en sus propiedades electrofisiológicas y expresan diferentes
neurotransmisores y neuropéptidos. Además, todas ellas expresan los receptores de alta
afinidad de las neurotrofinas (Trks) durante el desarrollo embrionario y el periodo postnatal (Mu
et al., 1993; McMahon et al., 1994; Fariñas et al., 1998). Todas estas características convierten
a los DRGs en un sistema excelente para el análisis de la especificidad de acción de las
diferentes neurotrofinas. Durante el desarrollo embrionario y en el momento del nacimiento, el
70-80% de las neuronas sensoriales de los DRGs expresan el receptor TrkA y requieren la
presencia de NGF para su supervivencia (Smeyne et al., 1994; White et al., 1996). Este grupo
está formado por neuronas de tamaño pequeño o intermedio y con axones envueltos por una
fina capa de mielina (fibras tipo Aδ) o totalmente amielínicos (fibras tipo C). (Figura 5)

Figura 5. Subclases de neuronas de los ganglios de la raíz dorsal y del “input” de la espina dorsal.
Las fibras mielínicas Aβ de las neuronas de tamaño mediano de los ganglios de la raíz dorsal (DRG) son
mecanorreceptores de bajo umbral que median las sensaciones de tacto, presión y vibración. Estas fibras terminan en las
interneuronas loclizadas en las láminas III y IV del asta dorsal y a su vez proyectan sus axones por la cara rostral de las
columnas dorsales. Las fibras mielinizadas más finas de tipo Aδ y las fibras C no mielinizadas de las neuronas pequeñas
de los DRG, median el dolor o las respuestas nociceptivas de los estímulos térmico (frío, calor) y punzantes. Estas fibras
de pequeño tamaño ( Aδ y C) terminan en las láminas I, II y V del asta dorsal, en las neuronas de segundo orden que dan
lugar al tracto espinotalámico ascendente (STT). Las neuronas pequeñas de los DRG expresan diferentes subconjuntos de
neurotransmisores (la sustancia P (SP) y el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP)) y receptores de
neurotransmisores (el receptor vaniloide subtipo 1 (VR1), el canal de iones dependiente de ATP (purinoceptor) subtipo
(P2X3)). Estas neuronas también se pueden clasificar en base a sus receptores para el factor de crecimiento nervioso
(NGF) (receptor neurotrófico del tipo tirosina kinasa 1 (TRKA)), para el factor neurotrófico derivado de la glía (GDNF)
(GFRalpha1, RET) y para artemina (ART) (GFRalpha3, RET). Dentro de las neuronas pequeñas que dan lugar a las fibras
C, un subconjunto expresa TRKA, mientras que el otro se une al isolectina IB4 y contiene la enzima monofosfatasa tiamina
(TMP), existendo un pequeño solapamiento entre estos dos subconjuntos. Modificado de Sah et al, 2003

La mayoría de ellas expresan un neuropéptido asociado a la nocicepción llamado CGRP

(calcitonin gene-related peptide). Sin embargo, 15 días después del nacimiento, solo el 40% de

19
Introducción

las neuronas sensoriales expresan TrkA o CGRP. El resto de la población original sufre un
cambio fenotípico en este periodo del desarrollo postnatal, generando así una nueva población
de neuronas de pequeño tamaño que constituyen el 25-35% del ganglio, dejan de depender de
NGF, expresan c-ret y se marcan con IB4, una lectina de la planta Bandeiraea simplicifolia (Mu
et al., 1993; Molliver and Snider, 1997; Molliver et al., 1997; Silos-Santiago et al., 1995; Bachy
et al., 2011; Lallemend y Ernfors, 2012).

Los estudios en DRGs de ratones que carecen de NT-3 o de su principal receptor TrkC
han demostrado que la presencia de esta neurotrofina es esencial para la supervivencia de una
pequeña población de neuronas sensoriales (<20%) de gran tamaño, que expresan
parvalbúmina y son responsables de la propiocepción. Estas neuronas inervan receptores que
informan sobre el grado de tensión en los músculos y tendones como es el caso de los husos
musculares y los órganos tendinosos de Golgi (Ernfors et al., 1994; Fariñas et al., 1994; Klein
et al., 1994; Tessarrollo et al., 1994; Tojo et al., 1995).

Tanto BDNF como su principal receptor, TrkB, se expresan ampliamente durante el

desarrollo embrionario y postnatal (Klein et al., 1990; Ernfors et al., 1990; Schecterson and
Bothwell, 1992). Sin embargo, las poblaciones que responden a BDNF o a su receptor TrkB en
los DRGs, no han sido caracterizadas. En determinadas cepas de ratones mutantes nulos de
BDNF y TrkB, se ha descrito un déficit en el número de neuronas sensoriales de los DRGs (30-
35%) a los 15 días postnatales, pero no en el momento del nacimiento (Klein et al., 1993;
Jones et al., 1994; Ernfors et al., 1994; Silos-Santiago et al., 1997). No obstante, se han
descrito déficits prenatales en cepas diferentes de ratones mutantes nulos de BDNF y TrkB
(Minichiello et al., 1995; Liebl et al., 2000) e incluso se ha descrito una ausencia total de déficit
en otros trabajos (Carroll et al., 1998). También existe una gran controversia acerca del periodo
del desarrollo en el que se produce la muerte de las neuronas que se pierden. Todo esto puede
ser debido a la existencia de diferentes cepas de mutantes nulos de BDNF, con fondos
genéticos que afectan de distinta manera a la supervivencia de los animales o a problemas con
el análisis fenotípico de las cepas.

3. Modulación de la fisiología del dolor.

Como ya hemos descrito, las neuronas sensoriales que inervan la piel son los primeros
mediadores en la percepción de los estímulos externos tanto dolorosos como no dolorosos. En
condiciones fisiológicas, las neuronas sensoriales conocidas como nociceptores son activadas
por estímulos agudos de tipo doloroso, y en los casos de daño de las propias fibras nerviosas o
de inflamación, la sensibilización de las neuronas sensoriales primarias deriva respectivamente
en un persistente dolor neurogénico o inflamatorio (Hunt et al, 2001; Boucher et al, 2001).
Durante las últimas décadas cada vez se ha estudiado más profundamente todo el proceso de
regulación del dolor y muchos resultados convergen en la idea de que en estos estados de
dolor neurogénico e inflamatorio existe una importante contribución de las células colindantes
tanto gliales como inmunes (Scholz et al, 2007). Por lo tanto es fundamental conocer como se

20
 Introducción

establece la relación entre estos dos sistemas, proceso en el que tiene que darse una
remodelación de la matriz extracelular mediada por la proteólisis de sus componentes, para
permitir así la aproximación, tanto de las células neurales como de las células inmunes
(crecimiento del cono axónico o de expansiones citoplasmáticas) y el establecimiento de una
interacción ya sea física o mediante moléculas difusibles entre ambos sistemas. Como veremos
a continuación en todos estos procesos, toman gran relevancia la familia de las
metaloproteasas, tanto en procesos de degradación de la matriz extracelular en la proteólisis
de moléculas de adhesión, como fragmentos bioactivos liberados y factores tróficos o
citoquinas retenidos por moléculas de la matriz.

3.1. Matriz extracelular y su remodelación proteolítica.

Muchas de las células en los tejidos de los organismos multicelulares están incrustadas en
una matriz extracelular compuesta de proteínas secretadas y de polisacáridos (Figuara 6). La
matriz extracelular llena los espacios entre las células y establece la unión entre células y
tejidos. Un ejemplo de matriz extracelular es la laminar o membrana basal, en la que se apoyan
las capas de células epiteliales y que también rodea a las células musculares, las células
adiposas y los nervios periféricos. La matriz extracelular, sin embargo, es más abundante en
los tejidos conectivos. Por ejemplo, el tejido conectivo que está bajo las capas de células
epiteliales consiste fundamentalmente en una matriz en la que se distribuyen los fibroblastos, o
los huesos, tendones y cartílagos, donde la matriz extracelular es la principal responsable de
su estructura y función.

Las matrices extracelulares están compuestas por complejas proteínas fibrosas integradas
en una sustancia fundamental de tipo gelatinoso, constituida por polisacáridos. Además de las
proteínas estructurales fibrosas y los polisacáridos, la matriz extracelular contiene proteínas de
adhesión que unen los componentes de la matriz unos con otros para anclar las células.

Las diferencias entre los distintos tipos de matriz extracelular son el resultado de
variaciones sobre la forma y la composición de este entramado general. Por ejemplo, los
tendones contienen una alta proporción de las proteínas fibrosas, mientras que el cartílago
contiene una alta concentración de polisacáridos que forman un gel firme resistente a la
compresión.

En los huesos, la matriz extracelular se endurece por el depósito de cristales de fosfato de

calcio. La estructura laminar de la lámina basal también se deriva de la utilización de los
componentes de la matriz que difieren de las que se encuentran en los tejidos conectivos.

21
Introducción

Figura 6. Esquema general de la estructura y composición de la ECM de la piel.

a) Los componentes de la ECM son producidos, secretados y orientados por los fibroblastos del tejido conectivo, que a
su vez, quedan englobados por la propia matriz que ellos producen. La ECM del tejido conectivo contiene una
sustancia fundamental, amorfa, en la cual se ubican componentes fibrosos: un gel de proteoglicanos, macromoléculas
formadas por heteropolisacáridos (también llamados GAG: glucosa-amino-glicanos) y proteínas que suponen un
excelente medio para la difusión de nutrientes y de otras moléculas que actúan como mensajeros químicos. Alberts
2008 b) Embebidos en la matriz de proteoglicanos se encuentran las fibras elásticas y las fibras de colágeno. Las
primeras están constituidas por la proteína elastina, que se dispone en forma de láminas y redes, mantenidas por
enlaces cruzados. Las fibras de colágeno son rígidas y se oponen a las fuerzas de tracción. En la matriz extracelular
están presentes otras proteínas que cumplen función de adhesión, por ejemplo, la laminina y la fibronectina. Estas
proteínas interactúan, por un lado, con receptores integrinas de la membrana celular y por otro, con los componentes
de la matriz. Las proteínas de adhesión, participan en las uniones célula-matriz y célula-célula. Otros componentes de
la ECM también poseen dominios de adhesión para unirse a receptores de la superficie celular como integrinas,
selectinas, CD44 y sindecán. Modificado de Zhu y Marchant, 2012. c) Las integrinas enlazar el citoesqueleto de actina
de una célula a varias estructuras externas. La porción citoplasmática se une a un adaptador de proteínas que a su vez
está conectado a los filamentos intracelulares de actina. Por otro lado, la porción extracelular se une a las moléculas en
la matriz extracelular o a moléculas ubicadas en la superficie de otras células y estas uniones se pueden romper y
recomponer a medida que las células se mueven. Modificado de O'Connor, C. M. & Adams 2010.

Composición de la matriz extracelular:

Colágeno.

Esta es la principal proteína estructural de la matriz extracelular y la más abundante en los

tejidos animales. Todos los tipos de colágenos componen una familia de proteínas, que
contienen al menos 19 miembros diferentes. Se caracterizan por la formación de triples hélices
en las que tres cadenas de polipéptidos se enrollan firmemente una alrededor de la otra en
forma de triple hélice cuyos dominios consisten en repeticiones de la secuencia de
aminoácidos Gly-X-Y.

De los colágenos, el tipo I es el más abundante, tiene forma fibrilar y constituye el

componente estructural básico de todos los tejidos conectivos. Después de ser secretada por la
célula, estos colágenos se ensamblan para formar las fibrillas en las que las moléculas de triple
hélice forman un empaquetamiento escalonado y periódico. Estas fibrillas no se forman dentro

22
 Introducción

de la célula, ya que durante la formación del colágeno fibrilar se sintetizan precursores solubles
(pro-colágenos) que contienen segmentos no-helicoidales en ambos extremos de la cadena
polipeptídica. El pro-colágeno es degradado por proteasas después de su secreción, por lo que
el ensamblaje del colágeno en fibrillas tiene lugar sólo fuera de la célula.

Otros tipos de colágeno no forman fibrillas, sino que desempeñan funciones distintas en
diferentes tipos de matrices extracelulares, como el colágeno tipo IV que forma las láminas
basales o colágenos que forman fibrillas de anclaje que unen algunas láminas basales a los
tejidos conectivos subyacentes.

Fibras elásticas.

Los tejidos conectivos también contienen fibras elásticas, particularmente abundantes en

los órganos, que regularmente se expanden y luego vuelven a su forma original. Los pulmones,
por ejemplo, se expanden cada vez que se inhala y vuelven a su forma original con cada
exhalación. Las fibras elásticas están compuestas principalmente de una proteína llamada
elastina, que se entrecruza en una red de enlaces covalentes y se forman entre las cadenas
laterales de residuos de lisina (similares a los encontrados en el colágeno). Esta red de
cadenas de elastina entrecruzada se comporta como una banda de goma, que se extiende bajo
tensión y reacciona contrayéndose cuando la tensión se libera.

Proteínas fibrosas.

Son proteínas estructurales de la matriz extracelular y están incrustadas en geles formados

a partir de polisacáridos llamados glicosaminoglicanos o GAG, que consisten en unidades
repetidas de disacáridos. Al igual que las pectinas de las paredes celulares vegetales, los GAG
unen iones con carga positiva y atrapan las moléculas de acumulación de agua para formar
geles hidratados, lo que proporciona un soporte mecánico a la matriz extracelular. Se han
descrito múltiples GAG como el acido hialurónico, el condroitín sulfato-4, el condroitín sulfato-6,
el dermatán sulfato, el heparán sulfato, la heparina, el queratán sulfato, el agrecán, etc.

Ácido hialurónico es el único GAG que se presenta como una larga cadena de
polisacáridos individuales. Todos los demás GAGs están ligados a proteínas para formar
proteoglicanos que pueden consistir hasta en un 95% de polisacáridos en peso molecular. Los
proteoglicanos pueden contener desde tan sólo uno a más de un centenar de cadenas de GAG
unidos a los residuos de serina de la proteína. Se han identificado una gran variedad de
proteínas esenciales (desde 10 a > 500 Kd), por lo que los proteoglicanos constituyen un grupo
muy diverso de macromoléculas. Además, aún siendo componentes de la matriz extracelular,
algunos proteoglicanos son proteínas de la membrana celular que trabajan en la adhesión
intercelular. Por ejemplo, el perlecan (principal proteoglicano heparán sulfato de las láminas
basales) se une a la del colágeno tipo IV y a la proteína de adhesión laminina, que describimos
a continuación.

23
Introducción

Proteínas de adhesión.

Son los constituyentes de la matriz extracelular responsables de la unión entre los

componentes que la conforman así como con las superficies de las células.

El prototipo de estas moléculas es la fibronectina, que es la proteína principal de la

adhesión de los tejidos conectivos. La fibronectina es una glicoproteína dimérica compuesta
por dos cadenas de polipéptidos, cada uno con cerca de 2.500 aminoácidos. En la matriz
extracelular, la fibronectina se encuentra muy reticulada entre las fibrillas por puentes disulfuro.
La fibronectina tiene puntos de unión de colágeno y GAG, por lo que se encarga de entrelazar
estos componentes de la matriz. Además la molécula posee un sitio de unión distinto que es
reconocido por los receptores de superficie celular y que es responsable de la unión de las
células a la matriz extracelular. Otras proteínas de adhesión son la laminina, la entactina, la
tenascina, la condronectina y la osteonectina. Las proteínas de adhesión suelen fijarse a las
integrinas de la membrana celular y establecer un entramado, uniéndose a su vez con las
fibras de colágeno y los proteoglicanos.

Las láminas basales contienen una proteína de adhesión distinta llamada laminina. Al igual
que el colágeno tipo IV, la laminina puede auto-ensamblarse para formar polímeros con forma
de malla. Esta proteína genera lugares de unión a receptores de superficie celular del colágeno
tipo IV y del perlecan y además, está estrechamente asociada con otra proteína de adhesión,
llamada entactina o nidógeno, que también se une al colágeno tipo IV. Como resultado de
estas interacciones múltiples, la laminina, la entactina, el colágeno tipo IV y el perlecan forman
grandes redes entrecruzadas en la lámina basal.

Los receptores más importantes de la superficie celular, responsables de la unión de las

células a la matriz extracelular, son las integrinas. Estas son una familia de proteínas
transmembrana compuestas por dos subunidades, designadas α y β. Se han identificado más
de 20 integrinas diferentes, formadas a partir de combinaciones de 18 subunidades α y 8
subunidades β conocidas. Las integrinas se unen a secuencias cortas de aminoácidos
presentes en varios componentes de la matriz extracelular, como el colágeno, la fibronectina y
la laminina. No obstante, los proteoglicanos transmembrana de la superficie de una gran
variedad de células, también se unen a los componentes de la matriz extracelular y modulan
las interacciones célula-matriz.

Además de fijar las células a la matriz extracelular, las integrinas sirven para anclar el
citoesqueleto. El anclaje del citoesqueleto a la matriz extracelular es responsable de la
estabilidad de las uniones célula-matriz. Se han identificado dos tipos diferentes de
interacciones célula-matriz entre las integrinas y el citoesqueleto: adhesiones focales y
hemidesmosomas.

Las adhesiones focales conectan una gran variedad de células a la matriz extracelular y
los dominios citoplásmicos de las subunidades β de las integrinas en estas uniones célula-

24
 Introducción

matriz, anclan el citoesqueleto de actina mediante la asociación con haces de filamentos de

actina. Los hemidesmosomas son los sitios especializados de anclaje de las células epiteliales
donde una determinada integrina (designada α6β4) interactúa con los filamentos intermedios
en lugar de con la actina. La integrina α6β4 se une a la laminina, por lo que los
hemidesmosomas unen las células epiteliales a la lámina basal.

Como hemos descrito la ECM está compuesta por una mezcla compleja de moléculas
insolubles y todo este entramado no solo genera un sólido soporte físico para las células sino
que actúa como una reserva de citoquinas y factores tróficos que se encuentran integrados en
él. Estas moléculas así como las que componen la propia red de la ECM son capaces de unirse
a receptores de la membrana citoplasmática de las células colindantes, proporcionando
señales externas que contienen información de su micro entorno y que provocaran una
reacción en ellas según el estímulo (Miranti et al, 2002; Michele et al, 2003; Yoneda et al, 2003;
Hynes et al, 2002).

Como describiremos posteriormente, la matriz extracelular (ECM) conlleva una extensa

remodelación tanto en condiciones fisiológicas como en condiciones patológicas (Chambers et
al, 1997; Birkedal-Hansen et al, 1993; Werb et al, 1997). El crecimiento embrionario o la
morfogénesis tisular son procesos fisiológicos esenciales que requieren la regulación de la
matriz extracelular para su desarrollo. También existen numerosos estudios acerca de la
remodelación proteolítica de la ECM en el campo de algunas patologías como el cáncer donde
las células neoplásicas necesitan liberarse de esta barrera molecular para que el tumor crezca,
para poder adquirir capacidad invasiva o para favorecer la angiogénesis.

En el ámbito del desarrollo neuronal, la remodelación proteolítica de la matriz extracelular

(ECM) es un evento esencial en el desarrollo de los sistemas nerviosos periférico y central
(Page-McCaw et al., 2007) ya que es necesario un programa regulado de proteólisis pericelular
para permitir que tengan lugar procesos como la proliferación, la migración y la diferenciación
celular, el crecimiento, la guía axónica y la mielinización.

3.2. Moléculas de adhesión célula-célula.

Los sistemas de adhesión célula-célula están implicados en muchos aspectos del
desarrollo neuronal, incluida la migración de las células neuronales, la formación de los haces
axónicos, la formación de uniones sinápticas y la formación de complejos de redes gliales que
rodean a estos axones y sinapsis. También son muy importantes para la morfología del cerebro
y para funciones cerebrales altamente coordinadas, como la memoria y el aprendizaje. Las
uniones célula-célula en el sistema nervioso están formadas por una gran variedad de
proteínas transmembrana, elementos del citoesqueleto y complejos de señalización. Se han
identificado y caracterizado varias proteínas de superficie celular como importantes reguladoras
de la orientación de axón y la formación de sinapsis. Estas moléculas son capaces de
interactuar entre sí, desde distintas células, de manera que activan diferentes vías de

25
Introducción

señalización y consiguen así el contacto físico de las membranas celulares en las que se
encuentran adosadas.

Los cambios morfológicos que acompañan al desarrollo de las ramificaciones axónicas en

la neuritogénesis, implican una reorganización muy dinámica del citoesqueleto y en parte están
reguladas a través de las interacciones entre los receptores de la superficie celular de las
neuronas y la matriz extracelular que los rodea (Revisado en Powell and Rivas; 1998; Faivre-
Sarrailh et al., 1999; Sakurai et al., 2001). De hecho recientemente se han realizado
comparaciones estructurales en poblaciones neuronales mantenidas en presencia de
diferentes moléculas de adhesión, solubles o integradas, como sustrato en la matriz
extracelular (ECM) y los resultados han implicado la adhesión diferencial como un mecanismo
precoz subyacente al crecimiento y a la arborización de las neuritas (Burmeister et al., 1991;
Prochiantz et al., 1995; Chamak et al., 1989; Lafont et al., 1992; Edelman et al., 1982; Edelman
et al., 1998; Flanagan et al., 1998; Flanagan et al., 2002; Luckenbill-Edds et al, 1997). Dentro
de un cono de crecimiento activo, los filamentos de actina son capaces de responder a una
gran variedad de sustratos secretados que forman parte de la ECM, a través de su interacción
directa con moléculas de adhesión localizadas en la superficie celular (Burmeister et al., 1991;
Powell et al., 1998; Bixby et al., 1996; Bixby el al., 1994; Powell et al., 1997; Sanes et al, 1989).
Como consecuencia, el crecimiento axónico, su orientación y el establecimiento de las
conexiones neuronales adecuadas, dependen en gran medida de la distribución espacial de
las señales de la ECM en el medio extracelular. De hecho, la activación de receptores de
membrana a través de una exposición local o global de los componentes de la ECM, pueden
producir efectos muy diferentes en la regulación de la extensión de las neuritas y su
ramificación. Por ejemplo, una fuente local de colágeno IV promueve el crecimiento de árboles
dendríticos muy complejos en las células del ganglio cervical superior en ratas, mientras que un
sustrato como el matrigel, compuesto por la compleja combinación de moléculas procedentes
de un extracto de proteína de la ECM de la membrana basal (laminina), estimula la formación
del axón y aumenta la producción de dendritas (Craig et al., 1994; Powell et al., 1998; Ruoslahti
et al., 1997; Lein et al., 1992; Esch et al., 1999; Esch et al., 2000).

Los receptores de adhesión de la superficie celular se dividen en cuatro familias diferentes:

las integrinas, la superfamilia de genes de inmunoglobulinas y las cadherinas, todos los cuales
influyen en la morfogénesis de las ramificaciones, y por otro lado las selectinas que no están
implicadas en estos procesos (Figura 7). A pesar de que las familias de CAMs y SAMs están
unidas por funciones similares en la regulación de la adhesión celular durante el
establecimiento de la morfología neuronal, las acciones específicas mediadas por cada
molécula de adhesión durante el desarrollo, son muy distintas y dependientes del contexto
celular.

26
 Introducción

Figura 7. Diagrama esquemático de diversas estructuras de dominios de las diferentes superfamilias de CAMs.
A. Proteínas IgSF CAM. B. Cadherinas. C. Integrinas. D. Selectinas. Modificado de Bian, 2013.

Integrinas.

Las integrinas constituyen heterodímeros transmembrana formados por enlaces no

covalentes, que facilitan uniones transmembrana puntuales entre la ECM y las estructuras que
subyacen en el citoesqueleto, tal como se generan en los complejos de adhesión focal. Las
subunidades de las integrinas se pueden expresar de forma individual y se compartimentan
selectivamente en un espacio subcelular específico, como por ejemplo, la concentración de la
integrina α5 dentro de las dendritas apicales de las principales neuronas piramidales del
hipocampo, y su exclusión de los arboles dendríticos basales (Yanagida et al., 1999; Bi et al.,
2001; Pinkstaff et al., 1998). Así, los cambios morfogenéticos también se pueden
compartimentar selectivamente en determinados dominios axónicos o dendríticos. Por ejemplo,
los árboles dendríticos apicales y basales de las neuronas del hipocampo, generan morfologías
muy diferentes en respuesta a señales adhesivas locales, debido a la distribución diferencial de
los distintos tipos de receptores integrinas.

Superfamilia de las inmunoglobulinas.

Las moléculas responsables de la adhesión celular independiente de Ca2+ pertenecen

principalmente a la gran y muy conservada superfamilia de proteínas de inmunoglobulinas (Ig).
Estas proteínas contienen uno o más dominios tipo Ig, que son característicos de las moléculas
de los anticuerpos. Uno de los ejemplos mejor estudiados es la molécula de adhesión celular
neural (N-CAM), que se expresa en una variedad de tipos celulares, incluyendo la mayoría de
las células nerviosas. N-CAM es la molécula de adhesión célula-célula independiente de Ca2+
más frecuente en los vertebrados y, al igual que las cadherinas, se cree que unen las células
entre sí mediante un mecanismo homófilo (entre las moléculas N-CAM localizadas en las
células adyacentes). Sin embargo, algunas proteínas de adhesión célula-célula tipo Ig, utilizan

27
Introducción

un mecanismo heterófilo, como las moléculas de adhesión intercelular (ICAMs) de las células
endoteliales, que se unen a las integrinas en las células sanguíneas cuando estas migran fuera
del torrente sanguíneo mediante este tipo de unión heterófila.

Existen, al menos, 20 formas de N-CAM y en todas ellas hay una larga cadena extracelular
del polipéptido que se pliega en cinco dominios tipo Ig. Algunas formas de N-CAM llevan una
cantidad inusualmente grande de ácido siálico. Cada vez hay más evidencias de que la carga
negativa que proporcionan estas largas cadenas sirve para prevenir la adhesión en lugar de
favorecerla. Por ejemplo, la presencia de N-CAM normalmente promueve la fasciculación los
axones corticoespinales, pero se ha demostrado que en respuesta a la modificación de N-CAM
por incorporación de ácido polisiálico (PSA) estos axones son capaces de elaborar ramas
intersticiales (Daston et al., 1996).

La importancia de las proteínas de adhesión celular tipo Ig en la conexión de las neuronas

del sistema nervioso en desarrollo ha sido claramente demostrada en Drosophila. Una proteína
del tipo N-CAM llamada fasciclina III (FAS3) se expresa de forma transitoria tanto en algunas
neuronas motoras como en algunas de las células musculares que normalmente inervan. Si se
elimina genéticamente FAS3 de estas neuronas, no son capaces de reconocer sus dianas
musculares y no llegan a realizar sinapsis con ellas, lo que parece indicar que FAS3 media
estas conexiones sinápticas mediante un mecanismo de “emparejamiento” homófilo.

A pesar de que las cadherinas y los miembros de la familia de las Ig con frecuencia se
expresan en las mismas células, las adhesiones mediadas por estas son mucho más fuertes y
en gran parte son las responsables de mantener las células unidas, así como de la separación
de colectivos celulares en tejidos discretos y posteriormente del propio mantenimiento de la
integridad del tejido. En cambio, las N-CAM y otros miembros de la familia de las Ig,
contribuyen más en la puesta a punto de estas interacciones célula-célula, en procesos de
desarrollo y la regeneración. Por ejemplo, mientras que los ratones mutantes que carecen de la
proteína N-cadherina mueren temprano durante el desarrollo, los ratones mutantes que
carecen de N-CAM se desarrollan con relativa normalidad a pesar de que tienen algunos
defectos en el desarrollo neural. Sin embargo, al producirse algunas mutaciones en otros
genes que codifican proteínas de adhesión celular tipo Ig, como en el gen L1 en los seres
humanos, la consecuencia puede ser retraso mental y otros defectos neurológicos provocados
por anormalidades en la migración de las células nerviosas y la elongación de sus axones.

Selectinas.

Los glóbulos blancos llevan una vida nómada, moviéndose de aquí para allá entre la
sangre y los tejidos lo que requiere propiedades adhesivas especiales, y estas dependen de
unas proteínas de unión a carbohidratos de superficie celular (lectinas) llamadas selectinas.
Las selectinas median una serie de interacciones transitorias célula-célula dependiente de Ca2+
y que tienen lugar sobre todo en el torrente sanguíneo. Se han descrito al menos tres tipos de

28
 Introducción

selectinas: la L-selectina presente en los leucocitos de la sangre, la P-selectina en las

plaquetas de la sangre y en células endoteliales que han sido localmente activadas por una
respuesta inflamatoria y la E-selectina en las células endoteliales activadas. Cada selectina
constituye una proteína transmembrana con dominio para lectinas altamente conservado que
se une a un oligosacárido específico en otra célula, estableciendo así la interacción célula-
célula.

Las selectinas y las integrinas actúan secuencialmente para permitir que los leucocitos
salgan del torrente sanguíneo y entren en los tejidos en cuando se les necesite. Las selectinas
establecen una adhesión débil mediante la unión de su dominio lectina a los carbohidratos que
son ligandos de baja afinidad. Esto permite que los glóbulos blancos se adhieran débilmente y
de forma reversible al endotelio, de manera que quedan rodando por la superficie de los vasos
sanguíneos impulsados por el flujo de estos, hasta que se produce la activación de la
expresión de integrinas en los linfocitos y es entonces cuando se unen fuertemente a las
células endoteliales de la superficie y es esta unión, fuerte y específica, la que finalmente
desencadena la extravasación de los glóbulos blancos entre las células endoteliales.

Cadherinas.

Las cadherinas son moléculas de adhesión la célula dependiente de Ca2+, que constituyen
una superfamilia integrada por más de 100 miembros en vertebrados, incluyendo las
cadherinas clásicas, las desmogleínas, las desmocolinas, las protocadherinas, las cadherinas
asociadas a receptores neuronales, las FATS, las cadherinas de siete cruces transmembrana,
y la tirosina kinasa Ret (Yagi et al., 2000; Utton et al., 2001; Bahjaoui-Bouhaddi et al., 1997).
(Figura 8).

Están ampliamente distribuidas en el SNC de adultos, pero también caracterizadas por sus
distintos patrones de expresión región-específicos de las diferentes isoformas según ciertos
momentos del desarrollo del sistema nervioso (Powell et al., 1998; Yagi et al., 2000). De hecho,
la expresión combinatoria y la localización de miembros de la superfamilia cadherina permite
una gran variación en las afinidades adhesivas de desarrollo las neuronas durante la
morfogénesis de ramificación y el establecimiento de la conectividad funcional. En el cerebelo
en desarrollo, por ejemplo, la N-cadherina indiscriminadamente estimula la adhesión celular
dependiente de Ca2+ y el crecimiento de las neuritas entre las distintas poblaciones neuronales.
Sin embargo la M-cadherina, por el contrario, produce cambios en la afinidad adhesiva
neuronal que media selectivamente la formación de glomérulos sinápticos entre las dendritas
de la neurona del gránulo y las fibras musgosas de los terminales axonales.
(Kollins and Davenport., 2005).

Las cadherinas se expresan tanto en invertebrados como en vertebrados y en el caso de

estos últimos, prácticamente todas las células parecen expresar una o más cadherinas, en
función del tipo celular

29
Introducción

Figura 8. Representación esquemática de los miembros de la familia de las cadherinas, que todos comparten
un motivo estructural común: “el dominio cadherina extracelular (CE)”.

(a) Representación en 3D del plegamiento típico del dominio CE. (b) Representación esquemática de la organización
general del dominio CE de seleccionados miembros de la familia de las cadherinas. Todas las cadherinas tienen dos o
más dominios CE en sus dominios extracelulares (óvalos azules, enumerados de dominio distal a proximal de la
membrana), que también pueden contener dominios no comunitarios, tales como repeticiones-EGF (rectángulos
verdes), dominios AG-laminina (diamantes cian) y Flamingo-boxes (ovalados de color rosa). Algunas cadherinas tienen,
además del péptido señal, un prodominio (óvalos grises) que se elimina por acción de una proteasa furina en la
superficie celular. Asterisco: Primer dominio EC de Drosophila E (DE) y N (DN) cadherina, determinado a partir de
análisis secuencial. Modificado de Brasch el al., 2012.

. Estas proteínas son las principales moléculas de adhesión celular que mantienen unidas
las células de los tejidos embrionarios más tempranos, de tal manera, que se ha demostrado
que si se elimina el Ca2+ extracelular o si se realiza un pre-tratamiento con anticuerpos anti-
cadherina se produce una fuerte alteración de los tejidos embrionarios y si la adhesión mediada
por cadherinas se deja intacta, el tratamiento con anticuerpos contra otras moléculas de
adhesión, tiene poco efecto. Además, las mutaciones que inactivan la función de la E-
cadherina producen que los embriones de ratón no puedan mantener su integridad, se
desmoronen y mueran temprano en el desarrollo.

30
 Introducción

Las cadherinas clásicas son proteínas monoméricas transmembrana y tienen cinco cadherinas
extracelulares (CE) con dominios de repetición (EC1 a EC5). Todas ellas son moléculas
homófilas de adhesión que funcionan mediante su unión a moléculas asociadas del citoplasma
(CP), las cateninas. Estas últimas están vinculadas a las cadherinas y se encargan de
conectarlas al citoesqueleto de actina conformado por α-catenina, β-catenina y p120 catenina.
Se sabe que los complejos cadherina-catenina regulan la polimerización de la actina, una
propiedad importante para el mantenimiento de la adhesión célula-célula y, a nivel
ultraestructural, estas proteínas se encuentran en las uniones sinápticas de regiones del
sistema nervioso, formando una adhesión de tipo “unión adherente”, de estructura simétrica
(PAJs) (Peters et al, 1976). Durante el desarrollo, los complejos cadherina-catenina se
acumulan en los primeros contactos de los filopodios dendríticos que permanecen como
agregados artefactuales y posteriormente se conservan en muchas de las sinapsis adultas.

Las cadherinas son las principales moléculas de adhesión celular (CAM) responsables de
la adhesión célula-célula y dependientes de Ca2+, presentes en las células de los tejidos de los
vertebrados. Las tres primeras cadherinas que se descubrieron fueron nombradas de acuerdo
con los tejidos principales en las que se encontraron: la E-cadherina se expresa en muchos
tipos de células epiteliales; la N-cadherina en los nervios, los músculos y las células del
cristalino; y la P-cadherina en las células de la placenta y en la epidermis. Sin embargo a
medida que se ha ido estudiando esta familia de proteínas se ha descrito que todas ellas
también se encuentran en otros tejidos: la N-cadherina, por ejemplo, se expresa en los
fibroblastos mientras que la E-cadherina se expresa en diversas partes del cerebro. Estas y
otras cadherinas clásicas están relacionadas entre sí por las secuencias conservadas de sus
dominios extracelulares e intracelulares. También hay un gran número de cadherinas “no-
clásicas”, con más de 50 expresadas tan solo en el cerebro. Las cadherinas “no-clásicas” son
proteínas con una conocida función de adhesión, como es el caso de las cadherinas
desmosómicas y las diversas protocadherinas localizadas en el cerebro. En este grupo también
se incluyen proteínas que parecen tener funciones no adhesivas tales como T-cadherina, que
carece de dominio transmembrana y se une a la membrana plasmática de las células nerviosas
y musculares mediante el glicosilfosfatidilinositol (GPI) y la proteína Fat, que fue la primera
identificada como el producto de la expresión de un gen supresor de tumores en la mosca
Drosophila.

La mayoría de las cadherinas, incluyendo todas las clásicas y algunas no clásicas,

funcionan como proteínas de adhesión transmembrana que se anclan indirectamente al
citoesqueleto de actina de las células que unen. El fragmento citoplasmático de las cadherinas
está altamente conservado e interactúa indirectamente con los filamentos de actina a través de
un complejo de proteínas de anclaje intracelular llamadas cateninas. Esta interacción es
esencial para la eficiencia de la adhesión celular, de hecho si las cadherinas clásicas pierden el
dominio citoplasmático son incapaces de mantener a las células muy juntas. En el caso de la

31
Introducción

cadherinas no-clásicas que forman los desmosomas, estas interactúan con los filamentos
intermedios en lugar de con los filamentos de actina y su dominio citoplasmático también se
une a un complejo proteico diferente, de anclaje intracelular, en vez de a las cateninas.

En el sistema nervioso, especialmente, hay muchos tipos diferentes de cadherinas, cada

una con un patrón de expresión distinto pero a su vez muchas de ellas con superposición. Ya
que se concentran en las sinapsis, se piensa que tienen un papel fundamental en su formación
y estabilización. Algunas de las cadherinas no clásicas, como las protocadherinas, son muy
estudiadas para ayudar a determinar la especificidad de las conexiones sinápticas. Al igual que
los anticuerpos, las cadherinas difieren en sus regiones N-terminal pero son idénticas en sus
regiones C-terminal.

La N-cadherina participa en una gran variedad de procesos en el sistema nervioso central

de los vertebrados. Los fragmentos de N-cadherina que carecen de su región extracelular
sirven como mutantes dominantes negativos de las cadherinas e inhiben su actividad de
adhesión célula-célula. La expresión del fenotipo de este mutante se manifiesta en la aparición
de neuronas que presentan filopodios con morfología de espina, consistente en un aumento de
la longitud de la columna vertebral y una disminución del ancho de la cabeza de la columna
vertebral. Además afecta a la organización de las sinapsis de las neuronas hipocampales en
cultivo. A pesar de las evidencias de que las cadherinas están implicadas en la formación de
las sinapsis, estas no son suficientes para que se puedan formar in vitro, ya que la ausencia de
expresión de la N-cadherina en células neuronales impide la inducción de la diferenciación de
pre-sinapsis en los sitios de contacto con los axones. Algunos estudios recientes también
implican a las cateninas en el control de la estructura de la columna vertebral y de la
organización sináptica del hipocampo en los cultivos de las neuronas. La supresión de la β-
catenina afecta a la localización de las vesículas sinápticas a lo largo del axón y la pérdida de
la catenina p120 afecta a Rho, perteneciente a una pequeña familia de proteínas G de
señalización, que se traduce en una reducción de la densidad de la columna vertebral. La
característica notable de las cadherinas clásicas es su especificidad de unión y distribución
específica de la región. En el cerebro, muchos subtipos de cadherinas clásicas están
expresados por grupos restringidos, vinculando funcionalmente núcleos y láminas. Por lo tanto
podemos afirmar que la adhesión mediada por cadherinas contribuye a la formación selectiva
de conexiones entre neuronas durante la formación de redes neuronales, aunque por ahora se
desconoce el proceso.

3.3. Neuritogénesis, elongación y guía axónica.

Los conos de crecimiento son estructuras móviles localizadas en la extremidad distal de los
axones y son los responsables de la extensión y la búsqueda de caminos durante el desarrollo
del sistema nervioso y su reparación. Impulsar el crecimiento del cono depende de dos
procesos relacionados. En primer lugar, se requiere una dinámica interna del citoesqueleto: 1)
mediante la polimerización de la actina que ocurre en el extremo distal, 2) la actividad de la

32
 Introducción

despolimerización de la región central y 3) la actividad de la miosina estirando en los filamentos

de actina de los lamelipodios. Estos mecanismos integrados por completo dan lugar a un flujo
continuo retrógrado de actina. Este flujo proporciona la tensión mecánica necesaria que
impulsa la extensión axonal, a través de una conexión dinámica de los microtúbulos presentes
en el axón y que invaden el dominio central del cono de crecimiento (Thoumine et al, 2008).

En segundo lugar, se produce una constante formación y disociación de los repetidos contactos
de transición entre los conos de crecimiento y la matriz extracelular o las células adyacentes.
Estos contactos están mediados por moléculas de adhesión celular (CAM) de tipo
transmembrana, como por ejemplo, las integrinas (IgCAMs) y cadherinas, cuyas estructuras
específicas de tipo ligando/receptor poseen una unión de vida media variable. Una pregunta
que sigue abierta es cómo estos dos procesos, es decir, el flujo de actina y la dinámica de
adhesión, se coordinan en el cono de crecimiento y como contribuyen a fijar la velocidad de la
migración. Se requiere una comprensión profunda de estos dos mecanismos desde una
perspectiva fundamental, para el diseño de nuevos compuestos y para fomentar la
regeneración axonal después de una lesión.

33
Introducción

Figura 9. Guía axónica y el papel de las cadherinas en los procesos crecimiento axónico.
a) El extremo distal del cono axónico está formado por filopodios “tipo-dedo”, muy dinámicos, que se encargan de
explorar el entorno molecular, separados entre ellos por láminas de membrana llamadas velos tipo-lamelipodio. El
cono de crecimiento se puede dividir en tres dominios fundamentales: El dominio periférico (P), con largos filamentos
de actina empaquetados y microtúbulos individuales, "pioneros” y dinámicos (MTs), que exploran esta región. El
dominio central (C) contiene paquetes estables de MTs que entran en el cono de crecimiento desde el eje del axón,
junto con numerosos orgánulos, vesículas y haces de actina centrales. Por último, la zona de transición (T) se
encuentra en la interfaz entre el dominio P y el C, donde las estructuras de actomiosina contráctiles (denominadas,
arcos de actina) se situan perpendiculares a los haces de F-actina y forman un anillo. b) El cono de crecimiento se
encuentra con muchos tipos diferentes de señales durante su recorrido, que vienen determinadas por moléculas
adhesivas situadas en la membrana de células vecinas (por ejemplo, las moléculas de adhesión celular
transmembrana (CAMs) o las cadherinas) o insertadas en la ECM (la laminina y la fibronectina). Por otro lado, las
moléculas anti-adhesivas unidas a la superficie (como Slits, efrinas y proteoglicanos condroitín sulfato) pueden
impedir el avance del cono de crecimiento delimitando así su camino. Finalmente, las señales quimiotrópicas
difusibles son los "semáforos” que presentan más instrucciones de dirección para el cono de crecimiento, e incluyen
diversas moléculas solubles (como netrinas y semaforinas), morfógenos (tales como Wnt, sonic hedgehog (SHH) y la
proteína morfogenética ósea (BMP)), factores de crecimiento o neurotróficos (tales como el factor neurotrófico
derivado del cerebro (BDNF)), factores de transcripción secretados y neurotransmisores. Sin ambargo, la respuesta
de atracción o repulsión no es debida a la propiedad intrínseca de la señal en particular, sino más bien a los
receptores específicos y a la señalización interna del cono de crecimiento. Los círculos verdes y rojos se interpretan
como señales de atracción y repulsión, respectivamente. Modificado de Hirano y Takeichi, 2011. c) La figura muestra
los tres estados potenciales del acoplamiento y la función de moléculas de adhesión, como las cadherinas, en el
movimiento de los extremos de los conos axónicos. 1) Vista lateral de un lamelipodio en movimiento sobre un
sustrato rígido o flexible revestido con moléculas de matriz extracelular (rojo). El reconocimiento específico de
ligando-receptor permite la formación de los complejos de adhesión en la superficie ventral. Los filamentos de actina
están fluyendo hacia atrás, debido a una combinación de polimerización en la punta (signo +), despolimerización en la
parte trasera (signo -) y de la acción de tracción de los motores de miosina (cabezas verdes). La conexión dinámica
entre F-actina y los complejos de adhesión es proporcionada por un módulo de acoplamiento compuesto de proteínas
adaptadoras (círculos naranja), específicas para cada tipo de adherencia. La fuerza ejercida en los sitios de adhesión
se traduce en una deformación de la matriz (arrugas). (a) Acoplamiento desengachado, no hay acoplamiento entre F-
actina y los complejos ligando/receptor. (b) acoplamiento deslizante, donde se forman las conexiones débiles
transitorias entre el flujo F-actina y los complejos ligando/receptor mediante proteínas de acoplamiento. (c)
acoplamiento enganchado, donde un fuerte acoplamiento entre la F-actina y los complejos ligando/receptor,
ralentizan el flujo de F-actina y permiten que avance la polimerización. Modificado de Giannone, 2009
.

34
 Introducción

3.4. El papel de la N-cadherina en la neuritogénesis.

Las cadherinas forman una gran familia de moléculas de adhesión implicadas en el
reconocimiento célula-célula y la morfogénesis de tejidos (Yap et al., 1997). Estos procesos
incluyen la orientación de la célula (Kadowaki et al., 2007), el crecimiento del axón (Riehl et al.
1996; Nakai y Kamiguchi, 2002), la fasciculación y ramificación dendrítica (Yu y Malenka, 2003;
Bekirov et al, 2007), la sinaptogénesis (Benson y Tanaka, 1998) y la plasticidad sináptica
(Bozdagi et al, 2000; Togashi et al, 2002, Okamura et al, 2004).

La N-cadherina es capaz de inducir el crecimiento axónico y este efecto puede ser

reproducido o imitado en un modelo in vitro (Matsunaga et al, 1988; Lemmon et al, 1992; Saffell
et al, 1997; Kamiguchi y Yoshihara, 2001). Se ha demostrado que el acoplamiento mecánico
entre los receptores de N-cadherina y el flujo de actina generado a través de las cateninas es
un factor determinante para la motilidad del cono de crecimiento y extensión de las neuritas
(Bard et al., 2008). Sin embargo, aún no se ha dilucidado todo el mecanismo molecular del
proceso. Más adelante en el desarrollo, la N-cadherina se localiza en las sinapsis (Beesley et
al, 1995; Uchida et al, 1996), donde no sólo juega un papel adhesivo, sino que también
participa en la regulación de la función sináptica y la plasticidad (Bozdagi et al, 2000; Tanaka et
al, 2000; Murase et al, 2002; Togashi et al, 2002; Okamura et al, 2004).

En diversos estudios se ha demostrado que los ectodominios de las cadherinas también

son capaces de formar oligómeros laterales (Iino et al., 2001; Troianovski et al, 2003), dando
lugar a complejas estructuras adhesivas (He et al., 2003). En la región intracelular, el dominio
citoplasmático de la cadherina se puede acoplar a la actina a través de la β-catenina (Yap et
al., 1998). Este acoplamiento mecánico podría representar la base molecular para el
fortalecimiento de los contactos intercelulares (Adams et al, 1998; Vasioukhin et al, 2000;.. Chu
et al, 2004). Estudios recientes indican que, además de su papel como molécula de adhesión,
las cadherinas también se comportan como receptores de señalización (Yap y Kovacs, 2003).
En particular, se concluye que la unión de la cadherina activa la familia de las Rho-GTPasas, la
cual participa en el ensamblaje de la actina del citoesqueleto (Noren et al, 2001; Kovacs et al.,
2002). Y a su vez, estas enzimas, junto con el complejo catenina, participan en la regulación de
la capacidad adhesiva de la cadherina. Por ejemplo, una forma dominante negativa de Rac
inhibe la extensión de las zonas de contacto dependientes de cadherinas (Ehrlich et al, 2002;
Gavard et al, 2004.), así como la rápida vinculación de la N-cadherina en la red de actina que
se encuentra en constante movimiento localizada en los lamelipodios (Lambert et al., 2002).
Por lo tanto, se ha propuesto que la N-cadherina interactúa con el citoesqueleto, como
resultado de una unión ligando-receptor (Hirano et al, 1987; Hynes y Lander, 1992; Davis et al,
1993.; Gumbiner et al., 1993; Davis y Bennett et al., 1994).

35
Introducción

4. Metaloproteasas.
4.1. La familia de las metaloproteasas (MMPs y ADAMs).
La remodelación proteolítica de la matriz extracelular (ECM) es un suceso esencial en el
desarrollo, tanto del sistema nervioso periférico como central (Page-McCaw et al, 2007). Las
metaloproteinasas de matriz extracelular (MMPs) y las desintegrinas y metaloproteasas
(ADAMs) tienen la habilidad de cortar la mayoría de los componentes proteicos de la ECM en
condiciones fisiológicas (Page-McCaw et al, 2007; Overall et al, 2002). Por ello, la acción
concertada de diferentes proteasas puede ser muy importante para la construcción y la
fisiología de los circuitos neurales (Kaczmarek et al, 2002; Yong et al., 2005).

Además, las metaloproteasas tienen un papel importante en la activación y procesamiento de

citoquinas o factores de crecimiento (Suzuki M Iino et al., 1997), en la exposición de receptores
de membrana (Preece G et al., 1996), en la liberación del ligando Fas (Kayagaki N et al., 1996)
o en la inactivación del TNF-α (Black RA et al., 1997). La degradación de la matriz extracelular
es por lo tanto un proceso necesario para permitir la migración celular y la remodelación de los
tejidos. Todo ello juega un papel crucial en muchos procesos tanto fisiológicos como
patológicos.

4.1.1. Miembros y estructura de las metaloproteasas.

Numerosos estudios han implicado ADAMs en la formación de de conexiones neurales en el

sistema nervioso en desarrollo (Fambrough et al, 1996; Galko et al, 2000; Hattori et al, 2000;
McFarlane et al, 2003). En contraste con esto, el papel potencial de MMPs en la elongación y
guía axónica, mediada por la proteólisis de los ligandos y/o receptores involucrados en estos
procesos, aún no se ha conseguido demostrar (Yong et al., 2005; McFarlane et al, 2003;
Gonthier et al, 2007; Miller et al, 2008).

Inicialmente, las proteasas se caracterizaron como un grupo degradativo de enzimas,

implicados en el catabolismo de proteínas procedentes de la dieta. Sin embargo, en los últimos
años se ha demostrado que además de estos procesos de hidrólisis inespecífica, las proteasas
son capaces de desempeñar funciones mucho más precisas. De esta forma hoy se sabe que
los enzimas proteolíticos afectan a prácticamente todos los procesos fundamentales de la vida.
El procesamiento selectivo de las proteínas condiciona su localización y su degradación,
modula sus interacciones, genera nuevas moléculas bioactivas o inactiva otras contribuyendo a
la regulación de numerosas rutas de señalización celular. Todas estas acciones específicas
desempeñadas por las proteasas influyen en el desarrollo de procesos biológicos tan
importantes como la replicación del DNA, el control del ciclo celular, la proliferación y migración
celulares, la morfogénesis y remodelación tisulares, el crecimiento neuronal, la cicatrización de
tejidos, la ovulación y fertilización, la inmunidad, la hemostasis, la angiogénesis o la apoptosis
(López-Otín y Bond, 2008).

Hasta la fecha, se han identificado 24 metaloendopeptidasas zinc2+ dependientes de calcio

(MMPs), que poseen actividad catalítica sobre componentes de la matriz extracelular (Nelson
AR et al., 2000; Nagase y Woessner., 1999; Massova et al., 1998; Birkedal-Hansen et al.,
1995) y todas se pueden englobar en uno de los siguientes subgrupos: MMPs solubles y MT-
MMPs.

36
Introducción

37
Introducción

Figura 10. Estructura y sustratos específicos de las metaloproteinasas.

Las metaloproteinasas (MPs) pertenecen a la familia de enzimas metzincinas, que incluye metaloproteinasas de la
matriz (MMPs), adamalisinas (que incluye Adams (una desintegrina y metaloproteinasas) y ADAMTS (Adams con un
motivo de trombospondina)) y astacinas (incluyendo meprinas). Son enzimas multidominio que contienen un motivo
altamente conservado con propiedades quelantes para un ion de zinc en el sitio catalítico. Se producen
metaloproteinasas solubles o ancladas a la membrana para escindir componentes de la matriz extracelular (ECM).
Todas ellas están compuestas por varios dominios funcionales compartidos: un péptido señal, un propéptido, un
dominio catalítico y uno tipo hemopexina (excepto en MMP7, MMP23 y MMP26). El dominio amino-terminal que
contiene el péptido señal, es necesario para la secreción de las MMPs. El dominio propéptido contiene el motivo Cys-
switch. El dominio catalítico con actividad proteolítica, contiene el motivo de unión a zinc; el residuo Cys de este motivo,
interactúa con el ión zinc que mantiene las pro-MMPs inactivas, hasta que se elimina el dominio propéptido. El dominio
carboxi-terminal tipo hemopexina, que está presente en casi todos los MMPs, está implicado en la especificidad por el
sustrato y en las funciones no proteolíticas de las MMPs. Las MMPs de tipo membrana (MT-MMPs) están ancladas a la
superficie celular por un dominio transmembrana seguido por una cola citoplásmica corta o por una secuencia
glicosilfosfatidilinositol (GPI). Algunos MMPs, incluyendo los MT-MMPs, MMP11, MMP17, MMP21, MMP23, MMP25 y
MMP28, pueden ser activados por la convertasa furina, que escinde el propéptido de los precursores inactivos en el
aparato de Golgi, para liberar proteínas funcionales. Las ADAMs son proteínas transmembrana estructuralmente
similares a MT-MMPs, excepto por que carecen del dominio hemopexina y en su lugar tienen otros tres dominios: un
dominio rico en Cys, un dominio de repetición tipo EGF (factor de crecimiento epidérmico) (excepto ADAM10 y
ADAM17) y un dominio desintegrina. En la figura sólo se muestran ADAM9, ADAM10, ADAM12 y ADAM15 ya que no
se conocen sutratos protéico de la ECM en el resto de ADAMs. Las ADAMTSs son proteinansas secretadas y tienen
repeticiones similares a la trombospondina de tipo I en su secuencia C-terminal. Además de los dominios
metaloproteinasa, las meprinas también tienen un dominio catalítico de tipo astacina (Ast-like Cat), un dominio MAM
(proteína meprina A5 Tyr fosfatasa), un dominio TRAF (factor asociado a TNFR) de dominio TRAF y una cola citosólica
C-terminal. La meprina-α también contiene un dominio de corte por furina, escisión que resulta en la pérdida del
dominio transmembrana de tipo EGF y del dominio citosólico, y por tanto, la liberación de la enzima en el espacio
extracelular. MMP23 contiene un dominio inmunoglobulina (Ig) que es único entre las MMPs. Este dominio Ig facilita las
interacciones proteína-proteína o lípido-proteína de forma similar al dominio de hemopexina de otras MMPs. Modificado
de Bonnans, 2014.

Las MT-MMPs están ancladas a la membrana plasmática a través del dominio

transmembrana (Seiki et al., 1999) o de la porción de glicosilfosfatidilinositol en el terminal
COOH (Itoh et al., 1999; Kojima et al., 2000) y seis MMPs han sido asignadas a este grupo.
MT1-, MT2-, MT3- y MT5-MMP (MMP 14, -15, -16 y -24 respectivamente) están estrechamente
relacionadas entre ellas y muestran alrededor de un 70% de identidad de secuencia de
aminoácidos en sus dominios catalíticos. La MT4-MMP (MMP-17) es única en tanto que
muestra un 40% de conservación de secuencia en la misma región (Puente et al., 1996; Kajita
et al., 1999). El miembro de este grupo que se ha identificado más recientemente es MT6-MMP
(MMP-25), es el más homólogo a MT4-MMP y está expresado en leucocitos (Pei et al., 1999;
Velasco et al., 2000). Mientras que las MMPs solubles son presumiblemente responsables de
la degradación de la ECM en grandes áreas de tejido, es probable que las MT-MMPs participen
en la degradación pericelular de la ECM asociada a funciones celulares como la proliferación,
la migración y la capacidad de invasión. Por ejemplo, MT1-MMP, que es la molécula MT-MMP
más estudiada, ha sido detectada en células tumorales malignas durante la progresión de
cánceres (Seiki et al., 1999), en células endoteliales durante la angiogénesis (Hiraoka et al.,
1998; Haas et al., 1998; Zhou et al., 2000), en células mesenquimales durante la
embriogénesis (Kinoh et al., 1996; Apte et al., 1997), en tejidos óseos (Zhou et al., 2000;
Holmbeck et al., 1999) y en tejidos de cicatrización de heridas (Okada et al., 1997). Como
podemos observar en conjunto juegan un papel muy importante en los sucesos fisiológicos y
patológicos que dan lugar a la degradación de la matriz extracelular. Todas la demás MMPs
son solubles y son secretadas como zimógenos, a excepción de la MMP-11.

38
 Introducción

La familia de enzimas MMPs comparten una estructura similar en sus dominios. Todos los
enzimas de esta familia poseen en común los siguientes:

1- Péptido señal: es la secuencia “leader”, responsable de la secreción de la molécula, no está

presente en la forma inactiva del enzima.

2- Dominio proteolítico o catalítico: contiene 2 iones de zinc y al menos un ion de calcio. Uno
de los iones de zinc está presente en el centro activo e implicado en el proceso catalítico de las
MMPs. Este ion de zinc catalítico está conservado en todas las MMPs.

3- Dominio propéptido: este dominio consiste en 80-90 aminoácidos que contienen un residuo
de cisteína el cual interactúa con el átomo de zinc del dominio catalítico a través de un grupo
tiol. En este dominio hay una secuencia altamente conservada (… PRCGXPD…). La proteolisis
de este propéptido da como resultado la activación del zimógeno, y la misma puede darse por
la acción de enzimas proteolíticos, agentes mercuriales o el calor (Okada Y et al., 1989;
Nagase H et al., 1990; Koklitis PA et al., 1991).

4- Dominio hemopexina/vitronectina: está altamente conservado y muestra una secuencia

similar a la proteína plasmática hemopexina. Se ha demostrado que este dominio juega un
papel funcional en la unión al sustrato y/o en las interacciones con los TIMPs. Además de estos
dominios básicos, la familia de las MMPs se despliega en diferentes subgrupos por la
incorporación y/o delección de dominios estructurales y funcionales.

Las MMP-2 y MMP-9 contienen uno o dos dominios adicionales con secuencias similares a las
de la fibronectina para la unión del colágeno y de la “α2 collagen like” (Wilhelm SM et al., 1989).
El miembro más simple de la familia es la MMP-7, con un peso molecular de 28 kD, contiene
solo el dominio propeptídico y el dominio catalítico. Los otros miembros de la familia mantienen
la unidad básica y además tienen un número de dominios estructurales añadidos.

En el caso de la familia descrita recientemente como MMPs de tipo membrana (“membrane-

type MMPs”, MT-MMPs), como ya hemos descrito anteriormente, esta se encuentra anclada a
la membrana celular por un dominio transmembrana y uno intracitoplasmático (Massova I et al.,
1998).

4.1.2. Regulación, activación e inhibición de las MMPs.

En la actualidad, se sabe que las MMPs tienen diferentes sitios de regulación: a) a nivel
transcripcional, a través de factores de crecimiento y citoquinas (Birkedal-Hansen H et al,
1993), b) a nivel postranscripcional, por cambios en la estabilidad del ARNm (Schontal A et al,
1988), y c) a nivel post traduccional, a través de la activación de la forma latente secretada. La
regulación transcripcional es el punto de control más importante para determinar la expresión
de la metaloproteasa latente. Sin embargo, los mecanismos reguladores extracelulares pueden
finalmente controlar el nivel de actividad en términos de degradación de ECM. Con frecuencia,
la activación de la enzima se lleva a cabo por una activación autocatalítica que da lugar a la

39
Introducción

pérdida de un péptido amino terminal (Browner MF et al., Smith WW, Castelahno AL., 1995).
Las MMPs pueden ser activadas in vitro por diversos agentes entre ellos los detergentes, los
compuestos organomercuriales y las enzimas proteolíticas como plasmina, tripsina, calicreína y
estromelisina. Independientemente de cuál sea el agente activador, éste debe ser capaz de
inducir un cambio conformacional en la molécula de la proenzima para que puedan interactuar
con la molécula de zinc. Esta interacción finalmente activa a la proenzima (Liotta LA, Goldfard
RH, Brundage R., 1981).

Asimismo, la actividad de las MMPs puede ser inhibida por sustancias endógenas
conocidas como inhibidores tisulares de las metaloproteasas (TIMPs) (Brown PD, Kleiner DE,
Unsworth EJ., 1993). Se han caracterizado cuatro miembros de la familia llamados TIMP-1,
TIMP-2, TIMP-3 y TIMP-4. La expresión de los TIMPs en los tejidos también está altamente
regulada durante la remodelación en condiciones fisiológicas para mantener el balance en el
metabolismo de la matriz extracelular. La falta de este equilibrio induce un descontrol en el
“turn over” de la matriz produciendo patologías como la artritis, cáncer, enfermedades
cardiovasculares, nefritis, desordenes neurológicos, ulceración y fibrosis en los tejidos
(Woessner et al., 1998).

Otro inhibidor de las MMPs es la α2-macroglobulina, su acción es más lenta y no es específica,

sino que es un inhibidor irreversible de proteasas activas que incluye las MMPs. Se cree que el
control que ejercen los TIMPs sobre la actividad de la MMPs se localiza en el área pericelular
mientras que la α2-macroglobulina actúa en los fluidos, especialmente en zonas que presentan
inflamación (Nagase et al., 1994).

4.2. Papel de las MMPs y ADAMs en el sistema nervioso: regulación de la

neuritogénesis.
Todas las características descritas previamente, confieren importantes funciones a las
MMPs durante la neurogénesis del sistema nervioso. Sin embargo, las MMPs también pueden
jugar papeles distintos y opuestos en una serie de patologías del sistema nervioso central
como la esclerosis múltiple, lesiones de la médula espinal, fractura o hemorragia intracerebral
(Vu et al., 2000; Yong et al., 2001). De este modo, las MMPs contribuyen a la ruptura de la
barrera hematoencefálica, a la modulación de la neuroinflamación a través del procesamiento
de los precursores pro- o anti-inflamatorios, a la regulación de la supervivencia de las células
neurales o mediante la transformación proteolítica de las pro-neurotrofinas en sus formas
activas (Yong et al., 2001; Lee et al., 2001).

Las más expresadas en el sistema nervioso son MMP-9 o gelatinasa B y MMP-2 o gelatinasa A
que tienen como sustrato principal la lámina basal, MMP-3 cuyo sustrato principal es la mielina
y la metaloproteasa de membrana MT5-MMP que participa en procesos de degradación de la
matriz y la red pericelular para permitir el crecimiento axónico, la migración y la plasticidad
sináptica.

40
 Introducción

La rápida transformación que se produce en la matriz extracelular desde su fase

embriónica y postnatal temprana, hasta su forma madura, en el NSC adulto (Rauch et al.,
2004), la rápida desaparición de los CSPGs de las rutas axónicas predestinadas, tal y como se
observa en las áreas periféricas en desarrollo (Landolt et al. 1995; Oakley y Tosney 1991), así
como los cambios reactivos a consecuencia de lesiones del sistema nervioso (Galtrey y
Fawcett 2007, Zurn y Bandtlow 2006) no pueden ser atribuidos exclusivamente a los ajustes en
los patrones de expresión del ECM, sino que también dependen de procesos proteolíticos
altamente activos (Agrawal et al. 2008; Ethell y Ethell 2007; Flannery et al. 2006; Gottschall et
al. 2005; Milward et al. 2007; Porter et al. 2005). Este contexto, las metaloendopeptidasas de la
familia ADAMTS parecen ser las responsables en primer grado del catabolismo de los CSPGs
(ADAMTS: una desintegrina y metaloproteinasa con actividad trombospondina) y por lo tanto
esenciales en la alteración de la migración celular y en las características del crecimiento del
axón en muchos tejidos nerviosos. Del mismo modo, las metaloproteasas de la matriz (MMPs)
podrían jugar únicamente un papel subordinado en la degradación de los proteoglicanos, pero
podrían, de forma preferente, interactuar con las proteínas de unión y las tenascinas del
sistema nervioso central.

Los ADAMTS segregados son parientes cercanos de las metaloproteasas ADAMs

relacionadas con la membrana celular. Tanto las ADAM como ADAMTS se expresan como
zimógenos, conteniendo un predominio y un elemento catalítico que los une al zinc,
relacionado con un dominio similar a la desintegrina. Los ADAMT-zimógenos se encuentran en
la región trans-Golgi o en la superficie de la célula activados mediante el corte N-terminal del
propéptido por convertasas como furina o similares. La extracción adicional de una porción C-
terminal de forma proteolítica o autocatalítica ha demostrado poder modular la actividad
enzimática de algunas de estas metaloproteasas (Gao et al. 2002; Rodriguez-Manzaneque et
al. 2000; Zeng et al. 2006). Por ejemplo, se han caracterizado cinco lugares de unión para la
proteína agrecán (Caterson et al. 2000; Lemons et al. 2001) y una en brevicán (Matthews et al.
2000; Yamada et al. 1995). En neurocán, que está ampliamente expresado en el tejido
nervioso adulto presentando dos fragmentos terminales bien definidos (N- y C-terminal), se ha
demostrado que estos pueden ser cortados tanto por proteasas de tipo ADAMTS o de tipo
MMP. En concreto, basándose en comparaciones de sustratos conocidos, se han descrito
lugares específicos de procesamiento para MMP-2 y de ADAMTS. Sin embargo, mientras
MMP-2 se ha demostrado que corta a neurocán in vitro, la susceptibilidad a la digestión de
ADAMTS tiene que ser todavía confirmada con un modelo experimental (Sandy et al. 2001;
Turk et al. 2001).

Inhibición del crecimiento del axón.

Los conos de crecimiento son estructuras móviles que se encuentran en la punta de los
axones en desarrollo, interpretan las señales en el medio ambiente con el fin de ampliar y
alcanzar sus objetivos. La presentación y la transducción de estas señales dependen de

41
Introducción

moléculas adicionales, tanto intrínsecas como extrínsecas al cono de crecimiento (Dickson et

al., 2002). En particular, los datos recientes indican que existen dos familias de
metaloproteasas capaces de activar o inhibir, mediante proteólisis de ligandos o receptores, la
acción de señales producidas en los conos de crecimiento.

Todos los lecticanos del sistema nervioso central inhiben en su forma intacta el crecimiento
axonal in vitro (Bandtlow and Zimmermann 2000; Yamaguchi et al., 2000). La inhibición del
crecimiento axonal es altamente dependiente de la presencia de una capa pericelular
hialurónica que cubre muchos tipos de células y a menudo incluye cantidades variables de
lecticanos, proteínas conectoras y tenascinas (Evanko et al., 2007). La síntesis aislada de
acido hialurónico o hialuronán promueve la formación de profusiones en la membrana
citoplasmática de varios tipos celulares (Kultti et al. 2006; Rilla et al. 2008). La visión clásica era
que las metaloproteasas degradan la ECM, de forma que allanaba un pasaje para los axones
que se extienden a través del medio ambiente (Muir et al., 1994), sin embargo ahora se sabe
que la regulación de las metaloproteasas en la extensión axón y su orientación es mucho más
compleja.

Las metaloproteasas se expresan en los conos de crecimiento de numerosas neuronas de

vertebrados (Muir et al., 1994; Webber et al, 2002; Zuo et al, 1998). Los primeros estudios
sugirieron que las metaloproteasas participaban en la elongación de los axones (Muir et al.,
1994; Webber et al, 2002), apoyados por la observación de que los mutantes de kuzbanian, la
Drosophila ortóloga de ADAM10, presenta defectos en la extensión del axón del sistema
nervioso central (Fambrough et al., 1996). Varios estudios recientes también han planteado la
posibilidad de que las metaloproteasas regulan la orientación del crecimiento de los axones.
Existen datos in vitro que indican que las metaloproteasas son capaces de regular el
comportamiento de los axones durante su extensión mediante la proteolisis de ectodominios de
señales de orientación y/o de sus receptores (Galko y Tessier-Lavigne, 2000; Hattori et al,
2000). Por ejemplo, algunas ADAMs como ADAM10 están implicadas en completar la
interacción de alta afinidad entre las efrinas y sus receptores Eph (Hattori et al., 2000).

El apoyo a la idea de que las metaloproteasas regulan la guía de los axones de

vertebrados proviene de dos trabajos recientes. En primer lugar, un miembro de la familia
ADAMs, ADAM23, fue identificado en un experimento de screening genético en ratón para
genes que controlan la conectividad neuronal (Leighton et al., 2001). Sin embargo, en la
actualidad, se sabe que la función de orientación de ADAM23 está restringida, ya que se
expresa únicamente en los axones en el SNC de ratón en desarrollo y que los mutantes de
ADAM23 son atáxicos (Leighton et al., 2001). El segundo estudio se pregunta si las
metaloproteasas regulan el crecimiento y la orientación de los axones del GRC en el desarrollo
del sistema visual de Xenopus laevis, donde una preparación de cerebro expuesto permitió
realizar ensayos in vivo para testar el papel de las moléculas candidatas en crecimiento del
axón del GRC (Webber et al., 2002).

42
 Introducción

4.3. Expresión y función de MT5-MMP en el SN.

La familia de MMPs humanas está compuesta de 24 miembros que comparten muchas
características estructurales (Overall and Lopez-Otín, 2002). Sin embargo, y a pesar de que la
mayoría de las enzimas son secretadas, hay un grupo de seis MMPs de membrana (MT-MMP)
que se localizan en la superficie celular a través de un dominio transmembrana C-terminal
(MT1, MT2, MT3 y MT5-MMP) o por una unión mediante glicosilfosfatidilinositol (MT4 y MT6-
MMP) [(Zucker et al., 2003). MT5-MMP (MMP-24) es la quinta metaloproteinasa de membrana
de la matriz identificada en tejidos humanos (Llano et al., 1999; Pei et al., 1999)

MT5-MMP se encuentra ampliamente expresada en todo el sistema nervioso: en los

filopodios de las neuronas hipocampales participando en la regulación del crecimiento del cono
axónico y la migración neuronal (Ross et al., 2007; Willem et al., 2015) y además se ha
demostrado que también es capaz de degradar las cadherinas. Asimismo, se ha descrito que
regula la guía axónica y la plasticidad sináptica mediante la proteólisis de cadherinas, otras
moléculas de adhesión celular o moléculas de la matriz extracelular (Ref)

MT5-MMP destaca sobre el resto de MT-MMPs por el hecho de que está presente en un
conjunto limitado de tejidos que incluyen el cerebro (Pei et al., 1999; Llano et al., 1999) y en
algunas líneas celulares de tumores cerebrales (Llano et al., 1999); varios estudios describen
que la expresión de MT5-MMP durante el desarrollo en ratas, se concentra mayoritariamente
en el sistema nervioso (Sekine-Aizawa et al., 2001, Jaworski et al., 2000), por consiguiente,
MT5-MMP puede jugar un papel específico en el desarrollo y en el mantenimiento del sistema
nervioso.

MT5-MMP (Mmp24) se expresa principalmente en las células neuronales tanto del sistema
nervioso central como del periférico, además también se ha detectado su expresión en células
inflamatorias (Llano et al, 1999; Hayashita- Kinoh t et al, 2001; Bar-Or et al, 2003; Jaworski et
al, 2000). MT5-MMP es capaz de degradar algunos componentes de la matriz extracelular
como por ejemplo el proteoglicano condroitín sulfato que juega un papel inhibitorio en la
neurogénesis y su proteólisis, promueve el crecimiento neurítico in vitro pero no puede
degradar la laminina, cuyo efecto es el opuesto sobre el crecimiento axónico (Hayashita- Kinoh
et al, 2001; Wang et al, 1999). Por otra parte, también se ha demostrado que es capaz de
mediar el corte de la molécula de adhesión célula-célula, N-cadherina, células heterólogas
(Monea et al, 2006). Partiendo de todas estas afirmaciones junto con la ausencia de
ramificaciones tras lesionar el nervio ciático en una cepa de ratones que carecen de la proteína
MT5-MMP, se ha sugerido la posibilidad de que esta metaloproteinasa de membrana pueda
contribuir a la degradación de la matriz extracelular asociada a la plasticidad neuronal (Komori
et al, 2004). Sin embargo todavía disponemos de muy poca información acerca de la
importancia de la función in vivo de esta metaloproteinasa.

En contraste con la mayoría de las MMP, la expresión MT5-MMP esta principalmente

circunscrita a las células neuronales de los dos sistemas nerviosos central y periférico, aunque

43
Introducción

su presencia también se ha detectado en las células inflamatorias (Hayashita-Kinoh et al.,

2001; Bar- Or et al., 2003). Curiosamente, la expresión de MMP-MT5 en los tejidos neuronales
se encuentra espacial y temporalmente regulada en roedores, tanto a lo largo del desarrollo
embrionario como del postnatal (Jaworski et al., 2000; Sekine-Aizawa et al., 2001) y como
miembro de la familia de las MMPs, MT5-MMP puede degradar varios componentes presentes
en el ECM, tales como los proteoglicanos condroitín sulfato (de función inhibitoria),
promoviendo así el crecimiento de las neuritas (Wang et al., 1999). Teniendo en cuenta estos
datos, junto con los estudios que demuestran la ausencia de crecimiento de las fibras- Aß,
después de lesionar el nervio ciático, en una cepa de ratones que carecen del enzima MT5-
MMP, se ha sugerido que esta metaloproteinasa pueden contribuir a la degradación de la ECM
asociada con la plasticidad neuronal y la migración (Komori et al., 2004). Sin embargo, en la
actualidad, todavía hay muy poca información disponible acerca de la auténtica relevancia
funcional de MT5-MMP, tanto en los procesos normales como patológicos.

Contrariamente al patrón de expresión de otras MMPs, la expresión de MT5-MMP está

principalmente circunscrita a las células neuronales de los dos sistemas nerviosos central y
periférico, aunque su presencia también se ha detectado en células inflamatorias como los
mastocitos (Bar-Or et al., 2003; Hayashita-Kinoh et al., 2001)

5. Sistema neuro-inmune.
Existen cuatro tipos celulares derivados de progenitores hematopoyéticos (neutrófilos,
eosinófilos, basófilos y mastocitos) que tienen un papel fundamental en la inmunidad natural y
la inflamación. Todos ellos tienen un citoplasma rico en gránulos, cuyo contenido liberan al
exterior cuando son activados, y son estimulados por citocinas segregadas por linfocitos T y
antígenos opsonizados.

Las células inmunes y la glía interaccionan con las neuronas para modular la
sensibilización ante el dolor y para mediar la transición del dolor agudo al dolor crónico. En
respuesta a una lesión, se produce una activación inmediata de las células inmunes locales y
un reclutamiento hacia la zona lesionada de nuevas células inmunes procedentes del torrente
sanguíneo. Las células inmunes no sólo contribuyen a la protección inmune sino que también
participan en el inicio de la sensibilización de los nociceptores periféricos. A través de la
síntesis y liberación de mediadores del proceso inflamatorio y de las interacciones con
neurotransmisores y otros receptores, las células inmunes, la glía y las neuronas forman una
red integrada que coordina las respuestas inmunes y modula la excitabilidad de de las vías del
dolor.

5.1. Mastocitos.
Durante los 100 años posteriores a que Paul Ehrlich los descubriera, los mastocitos o
células cebadas eran considerados un componente del tejido conectivo derivado de células
mesenquimáticas indiferenciadas (Kitamura et al., 2005). Sin embargo Kitamura y sus
colaboradores (Kitamura et al., 1981) demostraron que los mastocitos proceden de

44
 Introducción

progenitores hematopoyéticos multipotentes de la médula ósea. Los mastocitos normalmente

no maduran antes de abandonar la médula ósea sino que circulan por el sistema vascular
como progenitores inmaduros y después completan su diferenciación una vez integrados
dentro de los tejidos conectivos o mucosos de la periferia. Se identificó una población celular
en la sangre fetal murina que cumplía los criterios de un progenitor mastocitario: las células se
definieron por un fenotipo de superficie Thy-1loKithi, presencia de gránulos citoplasmáticos y la
expresión de RNAs codificantes para proteasas asociadas a los mastocitos, pero ausencia de
expresión de FcεRI. Sin embargo, más recientemente Chen et al., en el año 2005 describieron
el fenotipo de progenitores de mastocitos (MCPs) procedentes de la médula ósea adulta de
ratones, capaces de regenerar la población mastocitaria en ratones deficientes a partir de
mastocitos diferenciados en cultivo a partir de MCPs. Este estudio también sugería que estos
precursores derivaban directamente de progenitores multipotentes (MPPs) y no de progenitores
mieloides comunes (CMPs) o progenitores de granulocitos/macrófagos (GMPs). Si bien otros
grupos como el de Arinobu describió el fenotipo de una población de progenitores bipotentes
capaces de derivar tanto en un linaje mastocitario como en un linaje basófilo, y que procedía
principalmente de GMPs de la médula ósea, el trabajo de Chen et al., refutó estos datos y
actualmente es su hipótesis la que es mayormente aceptada.

Los mastocitos son una población de células heterogéneas que derivan de células de la
médula ósea y migran a tejidos periféricos como células inmaduras diferenciándose in situ.
Históricamente se clasificaron según diferencias fenotípicas, básicamente en propiedades de
tinción (Enerback et al., 1966a; Enerback et al., 1966b). Pero además de las diferencias
morfológicas e histoquímicas, también se diferencian en su desarrollo, perfiles de activación y
bioquímica, en su contenido en mediadores y en sus respuestas a secretagogos mastocitarios
y a agentes estabilizadores (Lorentz et al., 2000; Metcalfe et al., 1997; Pearce et al., 1982;
Pearce et al., 1982b; Shanahan et al., 1985; Theoharides et al., 1982).

Los mastocitos actúan como células proinflamatorias en procesos patológicos como la

alergia, la inflamación crónica, las parasitosis por helmintos y los tumores, pero también tienen
funciones fisiológicas múltiples, como la cicatrización de heridas (Artuc et al., 1999; Iba et al.,
2003) y la regulación de la respuesta inmune del organismo, especialmente frente a bacterias y
parásitos (Malaviya et al., 1996). Los mastocitos, tras la activación inducida por mecanismos
dependientes o independientes de IgE, liberan gran cantidad de mediadores pre-formados
proinflamatorios, inmunorreguladores y reguladores del tejido. Son capaces de degranularse en
cuestión de minutos durante un proceso inflamatorio resultando en la liberación de histamina,
bradiquinina y otros mediadores que contribuyen la vasodilatación (Lawrence T et al., 2002).

Origen, maduración y localización de los MC.

Los mastocitos son células inmunes locales que se encuentran siempre cercanas a los
capilares que irrigan estos tejidos. Las células precursoras de los mastocitos llegan a través de
la circulación hasta los tejidos periféricos, donde maduran. La localización final de los

45
Introducción

mastocitos depende de receptores específicos como por ejemplo la integrina β-7, que es crítica
para la localización de las células precursoras de mastocitos en el intestino delgado (Gurish et
al., 2001).

Los mastocitos maduros son abundantes en los tejidos mucosos (principalmente cerca de
vasos sanguíneos y nervios) que están en contacto con el medio externo, como el tracto
respiratorio, el tracto intestinal y la piel (Schwartz et al., 1994). También se localizan en
órganos linfoides. Una vez han madurado, más del 40% del volumen total del mastocito está
ocupado por las membranas de los gránulos de secreción. Estos gránulos se originan en el
aparato de Golgi, que es el responsable de la síntesis y organización de los mediadores
preformados (Caulfield et al., 1980).

En los roedores los mastocitos maduros son de dos tipos:

- Mastocitos de mucosa (MMC) (intestino, bronquios, timo, hígado y submucosa

gástrica): contienen condroitín sulfato como proteoglicano en los gránulos
citoplasmáticos y son dependientes de citoquinas producidas por linfocitos T.

- Mastocitos de tejido conjuntivo (CTMC) (piel, pulmón y superficies serosas): contienen

heparina como proteoglicano.

Activación de los MC.

Los mastocitos se sitúan cerca de las proyecciones de las neuronas nociceptivas primarias
y contribuyen a la sensibilización de los nociceptores en numerosos contextos. La inyección
del compuesto secretagogo 48/80 provoca la degranulación de los mastocitos en la duramadre
y desencadena la excitación de los nociceptores presentes en las meninges (Levy et al., 2007).
La degranulación de las células cebadas también contribuye a la rápida activación de la
hiperalgesia termal inducida por NGF (Lewin et al., 1994). Aunque todos estos datos indican
que los mastocitos residentes en los tejidos son responsables de la sensibilización de los
nociceptores periféricos, no se ha demostrado cuales son los mediadores químicos derivados
de los mastocitos que son esenciales para estos efectos. Se sabe que la histamina juega un
papel muy importante como mediador de la activación de los nociceptores mediado por
mastocitos, pero sorprendentemente el factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-alfa) parece no ser
tan necesario (Rudick et al., 2008), aunque los principales mediadores químicos de los
mastocitos son los neuropéptidos como por ejemplo la sustancia P, VIP y el neuropéptido Y
que se pueden unir y activar los mastocitos provocando su degranulación y la liberación de
histamina (Cross et al., 1996; Ebertz et al., 1987; Stewart et al., 1996).

5.2. Papel de los MC en el dolor inflamatorio.

Se ha reconocido desde la primera parte del siglo que la estimulación de las fibras
nerviosas aferentes se asocia con respuestas inflamatorias periféricas como la vasodilatación y
la extravasación del plasma sanguíneo (Bruce et al., 1910). Esta observación ha llevado a la
idea de que no sólo las neuronas aferentes cumplen una función sensorial, sino que también

46
 Introducción

participan en sistemas efectores locales que están involucrados en la respuesta inflamatoria,

consecuencia de irritación y lesiones tisulares (Holzer et al., 1988). La hipótesis de que los
neuropéptidos actúan como un vínculo entre los sistemas inmune y nervioso ha sido apoyada
por la demostración de (1) una inervación peptidérgica directa de órganos linfoides primarios y
secundarios, (2) una gran proximidad entre las terminaciones nerviosas sensoriales y células
del sistema inmune, y (3) receptores específicos neuropeptidérgicos localizados en las células
inmunes efectoras (Payan et al., 1989; Felten et al., 1985). Múltiples estudios han demostrado
que los neuropéptidos son capaces de interactuar con prácticamente todos los componentes
del sistema inmunológico (Guirao et al., 1996). Es necesaria una amplia respuesta inflamatoria
para orquestar la reparación de los tejidos después de una lesión (Figura11).

Figura 11. La proximidad entre mastocitos y fibras nerviosas en los tejidos, facilita la comunicación neuro-
inmune implicada en la modulación del dolor.
Las interacciones entre las células nerviosas y los mastocitos están facilitadas por moléculas de adhesión como E-
cadherina, CADM-1 y N-cadherina (Taiwo et al, 2005; Chen et al., 2011). Tanto las células cebadas como las neuronas
tienen la capacidad de secretar el factor de crecimiento nervioso (NGF) y la sustancia P (SP) que se unen a TrkA y a
receptores NK-1, respectivamente (Forsythe y Bienenstock, 2012). NGF y SP participan en la señalización nociceptiva.
NGF y el factor de necrosis tumoral (TNF), secretados por los mastocitos, inducen el crecimiento neuronal y reducen el
posterior umbral de activación neuronal a través de la unión con TrkA y TNFR, respectivamente (Norman et al., 2008;
Vincent et al., 2013; Cunha et al., 1992; Verri et al., 2006). La triptasa liberada por los mastocitos se une al receptor de
proteinasa activada 2 (PAR2) en las neuronas e inicia una cascada que implica la activación de TRPV1/4 a través de
PLC y la liberación de CGRP (Hagiyama et al., 2013; Folgueras et al., 2009). CGRP a su vez se une al receptor
acoplado a proteína G (GPCR-CGRP) en los mastocitos y promueve la liberación de histamina (Leon et al., 1994;
Woolf et al., 1996). Modificado de Chatterjea y Martinov, 2015.

En los últimos años, ha quedado suficientemente acreditado que el sistema nervioso y el

inmune no son dos entidades separadas (Ottaway et al., 1991; McKay et al., 1994; Straub et
al., 1998; Eskandari et al., 2002; Pedotti et al., 2003; Eskandari et al., 2003; Straub et al., 2004;
Brogden et al., 2005; Engelhardt et al., 2005). El sistema nervioso, incluyendo el cerebro y las
neuronas periféricas, es capaz de estimular o inhibir actividades del sistema inmune innato y

47
Introducción

adaptativo a través de vías hormonales o neuronales. Pero a su vez, el sistema inmune

también puede influir en la actividad del sistema nervioso mediante la liberación de mediadores
inmunes o citoquinas.

Los mastocitos son conocidos principalmente por su papel en las reacciones de

hipersensibilidad dependiente de la inmunoglobulina E (IgE), y aumenta la aceptación sobre su
implicación en un amplio número de funciones fisiológicas entre las que destaca la interacción
neuro-inmune (Galli et al., 2008). La activación de los mastocitos desencadena la
degranulación de los mismos, liberando moléculas mediadoras entre las que destacan la
histamina y quimioquinas.

Los mastocitos poseen receptores TrkA que provocan su degranulación ante la presencia
de NGF (Mazurek et al, 1986.; Pearce y Thompson, 1986; Horigome et al, 1993), y la
consecuente liberación de aminas, citoquinas o enzimas (Harvima et al., 1994; Marshall y
Bienenstock, 1994) puede causar un aumento agudo de la sensibilidad actuando en los
terminales de los nociceptores (Lewin et al., 1994). Por otra parte, NGF también puede unirse
directamente a los receptores TrkA de los terminales periféricos de las neuronas sensoriales
primarias y mediante la señalización intracelular mediada por tirosina kinasas (Kaplan et al.,
1991b), puede fosforilar proteínas clave relacionadas con la transducción o con la activación de
los canales iónicos de la membrana citoplasmática, produciendo la sensibilización del terminal
periférico. Finalmente, NGF podría también actuar a nivel local a través de la sensibilización del
sistema nervioso simpático. Las neuronas simpáticas postganglionares expresan TrkA
(Smeyne et al, 1994) e interactúan con las neuronas sensoriales primarias para producir el
componente neurogénico de la inflamación (Levine et al., 1985; Coderre et al., 1991; Green et
al., 1993).

5.3. Bases moleculares de la interacción neuroinmune.

Como ya sabemos, los mediadores neuronales que se liberan en los terminales nerviosos
se unen a los receptores de las células inmunes. Las neuronas simpáticas, por ejemplo,
pueden estimular las células B y las células colaboradoras T (Th1) a través de la activación de
receptores β-adrenérgicos y mantener así una respuesta inmune de células Th2 (Kohm y
Sanders, 2000; Elenkov et al., 2000). La noradrenalina parece inhibir la actividad de las células
en la inmunidad innata, tales como los macrófagos, neutrófilos o células “natural killers” (NK) a
través de receptores β2-adrenérgicos, y a su vez estimular la inmunidad adaptativa relacionada
con las células B y T. Además, el sistema nervioso también puede modular la respuesta
inflamatoria y la reacción alérgica. El SNC regula respuestas inflamatorias sistémicas a
endotoxina a través de las vías humorales (Hu et al., 1991; Lipton et al., 1997; Woiciechowsky
et al., 1998).

Por otro lado, la estimulación de neuronas sensoriales sensibles a la capsaicina induce la

inflamación neurogénica produciendo síntomas inflamatorios tales como la vasodilatación,
extravasación de plasma e hipersensibilidad (Jancso et al., 1967). La evidencia experimental

48
 Introducción

apoya que algunos neuropéptidos, como la sustancia P y el péptido relacionado con el gen de
la calcitonina (CGRP), son capaces de provocar la inflamación neurogénica mediante la
interacción con el receptor de la neuroquinina-1 (NK-1) y el receptor de CGRP1,
respectivamente, localizados en las células endoteliales, mastocitos, células del sistema
inmune y en las arteriolas (Brain et al., 1988; Bowden et al., 1994; Maggi et al., 1995). La
destrucción de las fibras nerviosas sensibles a la capsaicina con esta sustancia, durante el
periodo neonatal, reduce el contenido de estos neuropéptidos y la inflamación neurogénica.

Además, las neuronas sensoriales no participan únicamente en la inflamación neurogénica

sino que se ha demostrado también su mediación en la nocicepción y el dolor. Muchos agentes
inflamatorios pueden estimular las neuronas aferentes primarias. Especialmente, la tripsina y
triptasa secretada por los mastocitos escinden el receptor proteinasa activado (PAR) 2 en las
neuronas aferentes espinales principales y estimulan la liberación de estos neuropéptidos
(Steinhoff et al., 2000). Además, los mastocitos que contienen triptasa están muy próximos a
las fibras nerviosas que contienen la sustancia P y CGRP (Stead et al., 1987; Naukkarinen et
al., 1994; Metcalfe et al., 1997), por lo que el grupo de Bunnett sostiene que la activación de los
mastocitos mediada por la IgE provoca la liberación de triptasa de los gránulos secretores
intracelulares y esta triptasa activa PAR-2 en las neuronas sensoriales para estimular la
liberación de la sustancia P y CGRP (Steinhoff et al., 2000).

Esta asociación mutua entre los nervios y las células inmunes se ha observado en
condiciones normales y patológicas y es ampliamente aceptada, sin embargo su base
molecular exacta no ha sido aclarada todavía aunque algunos trabajos han sido capaces de
dilucidar una parte de la base molecular de comunicación entre los nervios y mastocitos
mediante una imagen molecular de CADM1 y N-cadherina.

Las interacciones entre las neuronas y los mastocitos están implicadas tanto en la
homeostasis como en regulaciones patológicas y en la estrecha aposición que ambos estados
conlleva. Mediante imágenes obtenidas con el microscopio atómico de fuerzas (AFM), se ha
podido observar que se producen asociaciones físicas entre neuritas y mastocitos en co-cultivo,
mostrando un cono de crecimiento de más de 7 micras, que cubre la superficie de los
mastocitos (Suzuki et al., 2001; Suzuki et al., 2007). Para investigar las moléculas de adhesión
implicadas en la interacción, en primer lugar se observó la distribución de las cadherinas en los
co-cultivos de neuritas y mastocitos (Goda et al., 2002; Tanaka et al., 2000), que son una
familia de proteínas de adhesión celular dependientes de Ca2+, de unión homófila, que juegan
un papel importante en la formación de la plasticidad sináptica. Analizando diversas
inmunotinciones en estos co-cultivos se demostró que tanto las neuronas sensoriales del
ganglio cervical superior (SCG) como los mastocitos derivados de la médula ósea (BMMCs)
expresan la N-cadherina y la E-cadherina y que ambas están presentes sobre todo en el
citoplasma de los BMMCs en ausencia de las neuritas de los SCGs (Tegoshi et al., 2000;
Suzuki et al., 2004). Sin embargo, cuando se establece la asociación con las neuritas, la N-

49
Introducción

cadherina se localiza en la membrana plasmática de BMMCs, pero no la E-cadherina (Suzuki

et al., 2004). También se ha observado un acumulo de β-catenina, que es una proteína que se
encuentra íntimamente asociada con las cadherinas, en la periferia de la membrana plasmática
en los BMMCs unidos a neuritas. Sin embargo, en cultivos sin neuronas, la β-catenina se
distribuye por el citoplasma. Estos resultados sugirieren que la N-cadherina está involucrada en
la formación de contactos entre los nervios y mastocitos.

Por otro lado, Biederer et al. demostraron que la molécula de adhesión celular sináptica
SynCAM se localiza preferentemente en ambos lados de la mayoría de las sinapsis en el
cerebro y funciona como una molécula de adhesión de unión homófila que abarca toda la
hendidura sináptica en el sistema nervioso. Ito et al. establecieron que SgIGSF media la
adhesión entre los fibroblastos y los BMMCs (Biederer et al., 2002; Ito et al., 2003). Aunque
esta molécula de adhesión también se ha descrito con otros nombres diferentes, actualmente
su nombre se ha aprobado por el Comité de Nomenclatura Génica de HUGO como la molécula
de adhesión celular-1 (CADM1). En los co-cultivos de neuronas del SCG y BMMCs, CADM1 se
expresa intensamente en el lugar de contacto entre los mastocitos y las neuritas. Los
mastocitos que carecen de CADM1 no contactan bien con los axones, mientras que la
expresión ectópica de esta molécula de adhesión, mejora significativamente su acoplamiento.
El grado de adhesión de los mastocitos que expresan CADM1 se reduce de una forma dosis-
dependiente cuando se cultivan en presencia de un anticuerpo bloqueante anti-CADM1. Estos
resultados sugieren que CADM1 es la principal molécula de adhesión que media la unión in
vitro entre mastocitos y neuritas (Furuno et al., 2003).

También se ha demostrado la participación de CADM1 en la comunicación entre los

mastocitos y las neuronas sensoriales. Existe una diferencia significativa entre la proporción de
mastocitos con y sin CADM1 que son capaces de responder a la activación neuronal. Sólo una
cuarta parte de los mastocitos sin CADM1 responden a la activación de las neuritas, mientras
que con su participación se eleva a más de la mitad. Esta tasa de respuesta de las células
cebadas CADM1+ ante la activación neuronal, disminuye de forma dosis-dependiente en
presencia de un anticuerpo bloqueante anti-CADM1. Además, el receptor antagonista NK-1,
bloquea la tasa de respuesta de los mastocitos CADM1- a la activación de las neuritas en
concentraciones mucho menores que en mastocitos CADM1+. Así CADM1 es probable que no
sólo funcione como simple molécula de adhesión en la interacción entre nervios y mastocitos,
sino que también sirva para promover el desarrollo de un microambiente donde las células
cebadas tengan una mayor susceptibilidad a la activación por parte del sistema nervioso.

50
 Objetivos

OBJETIVOS

51
 Objetivos

OBJETIVOS

El objetivo general del presente trabajo de tesis doctoral consiste en el estudio de los diferentes
factores que regulan las neuronas sensoriales periféricas que están implicadas en la detección
del dolor, así como su participación en el desarrollo postnatal del sistema neuroinmune. Con
este fin, propusimos estudiar la contribución de neurotrofinas y de metaloproteasas al
desarrollo y mantenimiento de esta población sensorial, además de las interacciones que se
producen en este periodo entre los terminales nociceptivos y las células inmunes que
intervienen en los procesos inflamatorios.

Para lograr el objetivo general nuestros objetivos específicos fueron:

1- Estudio del papel de BDNF como factor neurotrófico clave en el desarrollo postnatal de
las diferentes modalidades sensoriales cutáneas.

2- Estudio de los cambios en los requerimientos neurotróficos postnatales de las neuronas

nociceptivas cutáneas que dan lugar a la diversificación de poblaciones nociceptivas.

3- Estudio de la regulación de la inervación nociceptiva cutánea por la metaloproteasa

MT5-MMP.

4- Estudio de las interacciones moleculares de los mastocitos con las neuronas

nociceptivas cutáneas y su relación con el dolor inflamatorio.o.

53
 Materiales y métodos

MATERIALES Y MÉTODOS

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 Materiales y métodos

1. Animales.
1.1. Cepas de ratones.
En este estudio se han usado diferentes cepas de ratones modificados genéticamente cuya
generación y genotipado han sido descritas con anterioridad. Los animales fueron estabulados
según la legislación vigente en el Servicio de Producción Animal del Campus de Burjassot bajo
la supervisión de la veterinaria jefe de la Universidad de Valencia. Las cepas de ratones
utilizadas, su procedencia y características son las descritas a continuación:

- Cepa Bdnf -/-: Esta cepa porta una delección del exón único del gen Bdnf y, aunque fue
generada sobre un fondo genético mixto Sv129 y C57Bl6 (Jones et al., 1994), ha sido
retrocruzada sobre fondo genético puro ICR/CD1 durante más de 20 generaciones. La
mutación es letal en homocigosis poco después del nacimiento y sólo un 5% de los animales
sobreviven hasta p20-25. Por este motivo la colonia se mantuvo en heterocigosis y se
realizaron cruces entre padres heterocigotos para la obtención de ratones homocigotos
mutantes nulos para BDNF de distintos estadios prenatales y postnatales tempranos.

- Cepa Mmp24-/- : Esta cepa de ratones ha sido generado en el laboratorio del Dr. Carlos
Lopez-Otín (Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Instituto
Universitario de Oncología, Universidad de Oviedo, Oviedo) y en ella se ha eliminado un
fragmento genómico de 6 kb que contiene los exones 5, 6 y 7 del gen endógeno Mmp 24. Esta
delección produce la pérdida del dominio catalítico y parte del dominio hemopexina de la
proteína. La cepa fue generada y mantenida sobre fondo genético puro C57Bl6.

1.2 Genotipado de los animales.

El genotipo de cada animal se determinó mediante el análisis por PCR del DNA genómico
extraído a partir de fragmentos de cola de ratones fetales, postnatales o adultos. Los protocolos
utilizados se indican a continuación.

Aislamiento de DNA

Fragmentos de cola de ratón de aproximadamente 0,5 cm fueron sumergidos en 400 µl de

tampón de lisis (0,5% SDS, 0,1 M NaCl, 0,05 M Tris pH 8,0 y 3 mM EDTA) con proteinasa K
(200 µm/ml) y se incubaron a 60º C toda la noche a fin de conseguir una buena digestión
celular. Tras la digestión se centrifugaron los lisados celulares a 14.000 rpm., durante 10 min.,
y los sobrenadantes se transfirieron a tubos limpios. A continuación se añadieron 500 µl de
cloroformo (Sigma) y 75 µl de acetato potásico 8 M, se agitaron y se guardaron a –80 ºC
durante al menos una hora. Una vez descongelados se centrifugaron a 2800 g., durante 15
min., para facilitar la separación entre las fases acuosa y orgánica. Se transfirieron 200 µl de la
fase acuosa a un tubo Eppendorf limpio y se precipitó el DNA genómico con 1 ml de etanol
absoluto. A continuación se centrifugaron las muestras a 2800 g., durante 10 min. y los
precipitados de DNA generados se lavaron con etanol al 70%, se dejaron secar y se
resuspendieron en 100 µl de agua destilada.

57
Materiales y métodos

Detección de los alelos WT y mutante mediante PCR

Las condiciones de la PCR para cada cepa se detallan a continuación. El tamaño de cada
producto de amplificación se resolvió mediante electroforesis en geles de agarosa al 0,8%
preparado en tampón Tris-borato-EDTA (TBE: Tris a 89 mM, pH 8,0, ácido bórico a 89 mM y
EDTA a 2 mM) con 10 µg/ml de bromuro de etidio. Como tampón de carga 6x, se utilizó glicerol
al 50%, azul de bromofenol (Sigma) al 0,05%, cianol de xileno (Sigma) al 0,05% y EDTA a 100
mM.

- Cepa BDNF -/- : El genotipo se determinó mediante amplificación por PCR de DNA genómico
utilizando como cebadores:

- “MBDSA7”: cebador directo (5’ GTG GAG TTC TGC TAA TGA GAA GCT GAG 3’) común
para ambos alelos.

- “MBSUP2”: cebador inverso (5’ CTG GTC CTC ATC CAG CAG CTC TTC G 3’) para el alelo
salvaje.

- “PGK2”: cebador inverso (5’ GTG CCA GCG GGG CTG CTA AAG CGC 3’) para el alelo
mutante.

Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: desnaturalización a 94 ºC durante 1

min., anillamiento a 65 ºC durante 2 min. y extensión a 72 ºC 2 min. Después de una reacción
de 40 ciclos el producto del alelo salvaje era de 1400 bp. y el del alelo mutante de 1400 bp.

- Cepa TrkB-/- : El genotipo de los ratones se determinó mediante amplificación por PCR de
DNA genómico utilizando los siguientes cebadores:

- “TrkB fwr gen”: cebador directo (5’ TCG CGT AAA GAC GGA ACA TGA TCC 3’) común para
ambos alelos.

- “TrkB rew wt gen”: cebador inverso (5’ AGA CCA TGA TGA GTG GGT CGC C 3’) para el alelo
salvaje.

- “TrkB rew ko gen”: cebador inverso (5’ GAT GTG GAA TGT GTG CGA GGC C) para el alelo
mutante.

Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: desnaturalización a 94 ºC durante 1

min., anillamiento a 65 ºC durante 30 seg. y extensión a 72 ºC durante 1 min. Después de una
reacción de 35 ciclos el producto de amplificación del alelo salvaje era de 900 y 1000 bp. para
la banda correspondiente al alelo mutante.

58
 Materiales y métodos

- Cepa Mmp24-/-: El genotipo se determinó mediante amplificación por PCR de DNA genómico
utilizando como cebadores:

- “mt5-mmp fwr gen”: cebador directo (5' CGC CAT CTG AGA GGA AGC ACG AG 3') y

- “mt5-mmp rew gen”: cebador inverso (5' CAC TGT GTT GAA GTT GCC ATC GC 3'), para el
alelo salvaje

- “Neo fwr gen”: (5' AGG ATC TCC TGT CAT CTC ACC TTG CTC CTG 3') y

- “Neo rew gen”: (5' AAG AAC TCG TCA AGA AGG CGA TAG AAG GCG 3') correspondiente a
la secuencia neo.

Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: desnaturalización a 94 ºC durante 30

seg., anillamiento a 61 ºC durante 1 min. y extensión a 72 ºC 45 seg. Después de una reacción
de 30 ciclos el producto del alelo salvaje era de 117 bp. y el del alelo mutante de 492 bp.

2. Técnicas histológicas.
2.1. Procesamiento histológico.
Los animales adultos y postnatales (P), de 5 días (P5) a P25, fueron profundamente
anestesiados mediante una inyección intraperitoneal de 70 µg de pentobarbital sódico por cada
gramo de peso del animal y fijados mediante perfusión intracardiaca con paraformaldehido
(PFA) al 4% en tampón fosfato 0,1M a pH 7,4 (PB). En algunos animales se empleó el fijador
Karnovsky (PFA al 2% y glutaraldehido al 2,5% en PB) con el objetivo de preservar mejor la
ultraestructura para su subsiguiente análisis por microscopía electrónica de transmisión (TEM).
Los cuerpos se colocaron en la misma solución fijadora durante 1 hora y después se lavaron
abundantemente con PB. Las extremidades posteriores, y dorsales tronco fueron utilizados
para la disección de la piel glabra y pilosa, de la médula espinal, de los diferentes DRGs y de
los nervios periféricos que fueron posteriormente procesados para histoquímica,
inmunohistoquímica, tinción argéntica y TEM. Embriones completos de estadios gestacionales
(E) 11, 12, 13 y 15 (se consideró estadio 0 la mañana del tapón vaginal) y la región torácico-
lumbar y las patas traseras de animales neonatos (postnatal P0) fueron fijados por inmersión
en solución de Carnoy (60% etanol absoluto, 30% cloroformo, 10% ácido acético glacial) e
incluidos en parafina junto con algunos de los DRGs y fragmentos de piel postnatales o adultos
fijados con PFA 4%. Para la inclusión en parafina, las muestras se deshidrataron previamente
por inmersión en una batería de alcoholes de graduación creciente (etanol 70%, 96% 100%),
se aclararon con tolueno y se sumergieron en parafina a 60ºC toda la noche y en parafina
nueva varias horas antes de confeccionar los bloques. Las muestras incluidas se cortaron con
un microtomo de parafina Leica RM2135 (Leica microsystems) y se obtuvieron series de cortes
de 7 µm de grosor, excepto en la piel, donde se obtuvieron secciones de 10 µm con un plano
de corte perpendicular a la superficie. El resto de tejidos diseccionados de los animales
perfundidos se crioprotegieron con sacarosa al 30% en dH2O, toda la noche a 4 ºC, y se
obtuvieron secciones de 10 µm mediante un criostato Microm HM 505 N. En ambos

59
Materiales y métodos

procedimientos los cortes fueron montados en portaobjetos tratados con gelatina-alumbre de

cromo (alumbre de cromo al 0,2%, gelatina al 0,5% y azida sódica al 1%), para favorecer su
adhesión. Para las distintas tinciones y aplicación de las técnicas inmunohistoquímicas (ver
más adelante), los cortes de parafina fueron desparafinados con xileno durante 15 min. y
rehidratados en una batería de alcoholes de concentración decreciente (100%, 70% y 96%)
hasta llegar al agua destilada.

2.2. Técnicas inmunohistoquímicas, histoquímicas e impregnación argéntica.

Para las técnicas histoquímicas con lectinas o la técnica inmunohistoquímica empleadas en
este estudio se utilizaron tanto las técnicas de detección basadas en la peroxidasa como
técnicas inmunofluorescentes. Se emplearon distintos anticuerpos primarios que se encuentran
recogidos en la Tabla 1 del Anexo.

El tratamiento de los cortes previo a la incubación con el anticuerpo primario fue variable
dependiendo del anticuerpo y la técnica de detección. El bloqueo de la peroxidasa endógena,
en los casos en los que se utilizó peroxidasa como marcador de los anticuerpos, se realizó
mediante el tratamiento de las muestras con peróxido de hidrógeno al 3% durante 30 min. La
fijación con aldehidos forma uniones cruzadas que enmascaran los sitios antigénicos del tejido,
proporcionando tinciones inmunohistoquímicas flojas. Para romper estas uniones y
desenmascarar los epitopos, se trató el tejido, en algunas ocasiones, con una solución de
citrato sódico a 10 mM y pH 6,5, precalentada a 95-100 ºC durante 20 min. El bloqueo de
uniones inespecíficas en todos los casos se llevó a cabo incubando los cortes con un tampón
de bloqueo (Triton X-100 al 0,2% y suero de cabra [NGS] al 10% en PB) durante 1 hora a
temperatura ambiente. Los cortes se incubaron con el anticuerpo primario, durante toda la
noche y a temperatura ambiente, en el mismo tampón de bloqueo (Tabla 1, Anexo).

Para las detecciones con peroxidasa se utilizó el método del ABC. Tras la incubación con el
anticuerpo primario, se incubaron los cortes con anticuerpos secundarios acoplados a biotina
apropiados para detectar la especie del anticuerpo primario seguido del complejo avidina-
biotina-peroxidasa (Vector) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
Tras varios lavados en PB los cortes se incubaron en diaminobenzidina (DAB) (Sigma) al
0,02% y H2O2 (Panreac) al 0,001% en PB, hasta que se observó el marcaje deseado. La tinción
argéntica de las terminaciones nerviosas presentes en la piel se realizó mediante una
modificación del protocolo original descrito en Tolivia et al., 1997. Este método es aplicable a
secciones del sistema nervioso central incluidas en parafina y fijadas con paraformaldehido.
Los cortes de piel se desparafinaron, se incubaron en la solución mordiente, tartrato de sodio
(C4H4O6Na2.2H2O), durante 5 min y posteriormente se lavaron con agua destilada 3 veces
durante 5 min. A continuación se incubaron en la solución de nitrato de plata al 20% en agua
destilada durante 1min. Una vez teñidos los cortes, se eliminaron los restos de plata lavando
primero durante 5-10 s. con acetona a temperatura ambiente y a continuación durante 20s.
con una solución reductora entre 70 y 75ºC en agitación (pirogalol). Por último se lavaron con
agua destilada y se procedió a su contratinción, deshidratación y montaje con Eukitt.

60
 Materiales y métodos

La histoquímica realizada con la lectina de Griffonia simplicifolia (IB4) acoplada a biotina (10
µg/ml; Sigma) se realizó bajo las mismas condiciones que las inmunodetecciones. Finalmente
se procedió a la deshidratación de las muestras en alcoholes de concentración
progresivamente creciente, aclarado con xilol y montaje con Eukitt (Panreac) de las
preparaciones.

Para las detecciones fluorescentes se utilizaron anticuerpos secundarios apropiados

conjugados con distintos fluoróforos (ver Tabla 3). En estos casos, los cortes fueron teñidos
además con DAPI (4´,6-diamidino-2-fenolindol dihidrocloruro; Sigma) a 2 µg/ml o TOPRO-3
(Molecular Probes) y montados con el medio de montaje para fluorescencia Prolong Gold
(Molecular Probes). La fluorescencia convencional fue visualizada con un microscopio vertical
Nikon E600 (Nikon, Japón) o un invertido Nikon TS2000 y se capturaron imágenes con una
cámara digital Nikon DM1200. Para los estudios de colocalización las muestras fueron
analizadas en un microscopio confocal espectral Leica TCSSL, equipado con láseres de argón.

2.3. Preparación de muestras para microscopía electrónica de transmisión.

Las piezas extraídas se postfijaron con tetróxido de osmio al 1% (Sigma) en PB, se
deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol (30%, 50%, 70%), se contrastaron con
acetato de uranilo al 2% en etanol de 70º, se completó la deshidratación hasta 200% etanol
puro (70%, 96%, 100% y 200% etanol), se aclararon en óxido de propileno (Panreac) y se
incluyeron en araldita (Durcupan-Fluka). Para los recuentos de fibras mielínicas se obtuvieron
secciones transversales al nervio de 1µm de grosor mediante un ultramicrotomo Reichert
Ultracut E, se tiñeron con azul de toluidina al 1% y se determinó el número total de axones
utilizando el programa CAST-GRID software package (Olympus, Denmark) adaptado a un
microscopio Olympus BX51. Para los recuentos de las fibras amielínicas se utilizaron secciones
de 60 nm de grosor que se contrastaron con citrato de plomo y se visualizaron en un
microscopio electrónico de transmisión Jeol JEM-1010F.

La piel de las almohadillas plantares de animales de ambos genotipos, se incluyó en resina

como se describe anteriormente y se obtuvieron cortes semifinos seriados de 2 µm de grosor
que se tiñeron con azul de toluidina-bórax al 1% para su observación al microscopio óptico. Se
fotografiaron las regiones de interés y estos semifinos se arrancaron del portaobjetos mediante
un choque térmico, usando una plancha metálica enfriada previamente con nitrógeno líquido,
después de pegar un bloque de araldita polimerizada sobre el corte. Una vez separado el
semifino del portaobjetos se retalló la región de interés y se obtuvieron cortes ultrafinos de 60
nm de grosor que fueron contrastados con plomo, observados y fotografiados a diferentes
magnificaciones con el microscopio electrónico de transmisión Jeol JEM-1010F.

3. Preparación del mesenterio para el análisis de mastocitos in vivo.

Los ratones adultos fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de 70 µg
de pentobarbital sódico por cada gramo de peso del animal. Después de abrir la cavidad
ventral de los animales, los mesenterios fueron expuestos sobre un portaobjetos de vidrio y
sobre ellos se colocó un fragmento de gasa estéril para facilitar la incubación con la solución

61
Materiales y métodos

experimental. Las muestras fueron expuestas durante 30 minutos a una solución de capsaicina
5 µM en suero salino y con 50% de glucosa o a la misma solución basal pero sin capsaicina.
Transcurrido este tiempo se lavó el tejido con suero salino, se fijó por inmersión con un fijador
orgánico durante 30 minutos (solución de Carnoy) y finalmente se diseccionó el mesenterio.
Los animales fueron sacrificados por decapitación inmediatamente antes de aplicar el fijador.
Una vez fijados los mesenterios, se lavaron primero 3 veces en etanol de 70%, a continuación
3 más en agua destilada y por último se extendieron cuidadosamente sobre los cubreobjetos.
Para determinar el número total de mastocitos y el número total de mastocitos degranulados se
tiñeron las preparaciones con violeta de cresilo al 1% durante 5 minutos, para detectar los
gránulos por metacromasia, y se montaron con glicerol al 50% en PBS.

4. Cultivos celulares.
Todos los protocolos de cultivos celulares se llevaron a cabo en condiciones de máxima
asepsia. Antes de cada disección el área de trabajo y todo el material no estéril fue
desinfectado con alcohol al 70%. Para las disecciones se utilizó el siguiente material de
microcirugía de acero inoxidable: una pinzas finas, unas pinzas ultrafinas 55 (Dumont
Dumostar), dos bisturíes finos, unas microtijeras, unas tijeras pequeñas.

4.1. Cultivos primarios de neuronas sensoriales.

4.1.1. Preparación de las placas para cultivos de neuronas sensoriales.

Para cada tipo de ensayo de cultivo celular se trataron las placas con diferentes sustratos de
adhesión. Opcionalmente colocamos cubreobjetos de cristal de 12 mm de diámetro o insertos
con membranas de 0,4 µm de diámetro de poro en los pocillos de las placas p-24 y tratamos
directamente el cristal o la membrana en lugar del plástico. A continuación se detallan los
tratamientos con los diferentes sustratos:

Laminina

Incubamos las placas durante toda la noche con poli-DL-ornitina a 0,5 mg/ml (Sigma), en
tampón borato a pH 8,4, a temperatura ambiente. A continuación lavamos las placas tres veces
con ddH2O y las dejamos secar. Cubrimos las placas con una solución de laminina (20 µg/ml
en HBSS [Gibco), stock 1 mg/ml; Sigma) que mantuvimos como mínimo 3 horas y cómo
máximo 48, en el incubador de CO2 a 37 ºC. La laminina la lavamos con medio F12 (Gibco) sin
dejar secar en ningún momento y las placas se reservaron hasta el momento de la siembra
celular en el medio F12 en el incubador de CO2 (nunca más de 24 horas).

Matrigel

Incubamos las placas con una solución de Growth factor reduced - Matrigel® (0,2 µg/ml en
medio Hams F12; BD) durante al menos 2 horas en el incubador de CO2 a 37 ºC. A
continuación lavamos 3 veces con medio F12 sin dejar secar en ningún momento y las placas
se reservaron hasta el momento de la siembra celular en el medio F12 en el incubador de CO2
(nunca más de 24 horas).

62
 Materiales y métodos

Colágeno tipo I, gelatina y poli-D-lisina

Incubamos las placas con una solución de colágeno tipo I a 1,5 mg/ml (Vitrogen), gelatina al
0,1% (Sigma) o poli-D-lisina a 0,1 mg/ml (Sigma) en PBS durante al menos 2 horas en el
incubador de CO2 a 37 ºC. A continuación lavamos 3 veces con PBS y dejamos secar las
placas hasta el momento de la siembra celular.

4.1.2. Recolección y siembra de las células.

Protocolo de disección y recolección del tejido

Para el cultivo primario de neuronal sensoriales de los DRGs (Davis y cols., 1993), se
sacrificaron por dislocación cervical animales postnatales entre 0 y 20 días de edad de ambos
genotipos. Tras la decapitación, se diseccionaron los animales, se extrajeron y limpiaron las
columnas vertebrales en medio L15 atemperado y se abrieron desde la zona rostro-dorsal para
exponer así los ganglios sensoriales que se sitúan en las raíces dorsales formando nódulos
pares a ambos lados de la médula espinal, justo a la altura de los discos intervertebrales pero
separados de ellos por las meninges espinales. Para la extracción de los DRGs se utilizó una
lupa de disección Leica MZ6 (aumento 25x), unas tijeras finas para abrir la columna y unas
pinzas ultrafinas que permitieran la sujeción de los ganglios por la raíz para preservar de esta
manera su estructura encapsulada. Los DRGs se fueron depositando uno a uno en una placa
con medio L15 y una vez finalizada la extracción (alrededor de 50 ganglios por animal) se
utilizaron micro bisturíes para eliminar los restos de raíces dorsales y ventrales así como de
nervio raquídeo, para minimizar la fracción glial y los restos de mielina procedentes de los
axones.

Preparación de la suspensión celular

Una vez limpios, se transfirieron los ganglios a un tubo de 10 ml mediante una pipeta de vidrio
con la punta pulida a la llama y pre-tratada con Sigmacote (Sigma) para evitar la adhesión del
tejido. A continuación se lavaron con medio Hams F12 (Gibco) atemperado y se procedió a la
disociación enzimática. Los tiempos de incubación en cada una de las soluciones enzimáticas
variaron en función del la edad del animal: en primer lugar se incubó durante 30 minutos a 4 ºC
con colagenasa (Worthington) a 2 mg/ml en medio Hams F12 seguido de 15 (P0-P7) ó 60
minutos (≥P20) a 37 ºC; en segundo lugar, tras lavar con medio Hams F12, se incubó con
tripsina (Worthington) al 0,05% en HBSS-CMF (Hanks balanced SALT solution Ca/Mg-free,
Gibco) durante 10 (P0-P7) ó 15 minutos (≥P20) a 37 ºC ; a continuación se bloqueó la actividad
enzimática con HIHS (Gibco), se lavó con medio Hams F12 y por último se incubó 5 minutos
con DNAsa al 0,1% en F12. A continuación se lavaron los ganglios con medio Hams F12
(Gibco) atemperado y se procedió a la disociación mecánica, que se realizó disgregando
cuidadosamente el tejido al deslizarlo por una pipeta de vidrio pre-tratada con la punta pulida a
la llama y ligeramente cerrada. Una vez conseguida una suspensión celular homogénea se
sembraron las células en medio Hams F12 suplementado con SATO (SATO: 2 mM
glutamina, 0.35% albúmina de suero bovino (BSA) (Pathocyte-4, ICN, Irvine, CA), 60 ng/ml

63
Materiales y métodos

progesterona, 16 µg/ml putrescina, 400 ng/ml L-tiroxina, 38 ng/ml selenito sódico, 340 ng/ml tri-
iodo-tironina, 60 µg/ml penicilina y 100 µg/ml streptomicina) y se incubaron a 37 ºC en una
atmósfera de CO2 al 5%. La densidad celular empleada para la mayoría de los cultivos
primarios de neuronas de los DRGs y en concreto para aquellos en los que se estudiaba la
supervivencia neuronal o esta afectaba al resultado del ensayo, fue aproximadamente 2000
células por pocillo, ya que a densidades superiores las neuronas secretan factores
neurotróficos suficientes como para camuflar el efecto de los tratamientos.

4.1.3. Estudio de la supervivencia neuronal.

Los ensayos de supervivencia de las neuronas sensoriales se realizaron en cultivos de

diferentes edades postnatales (P0, P2, P5, P7 y P15). Los factores neurotróficos NGF, BDNF y
GDNF (10 ng/ml; PeProtech) se añadieron al medio Hams F12-SATO, de forma individual o en
combinaciones entre ellos, justo en el momento de la siembra celular y como control de su
efecto, se sembraron neuronas en ausencia de factores de crecimiento. Para trazar la curva
dosis-respuesta de supervivencia neuronal en presencia de NGF, las neuronas se sembraron
en presencia de diferentes concentraciones de la neurotrofina (0, 0,1, 1 y 10 ng/ml). En la
determinación de la tasa de supervivencia en cada condición, se consideró como el número
inicial de neuronas sembradas el total de neuronas adheridas al sustrato 4 horas después de la
siembra. Para estimar el número total de neuronas se realizó, en todos los casos, un muestreo
usando un microscopio invertido con contraste de fases Nikon TS2000, contabilizando todas
aquellas células con morfología claramente neuronal y que habían comenzado a expandir
neuritas, presentes en campos no-solapantes (20x), a lo largo de dos líneas perpendiculares
imaginarias trazadas a través del cubreobjetos. Los cultivos se mantuvieron durante 48 ó 96
horas en el incubador de CO2 y tras este periodo se estimó el número total de neuronas
supervivientes como se describe anteriormente.

4.1.4. Ensayos de bloqueo de supervivencia in vitro.

Los ensayos de bloqueo de función para estudiar la supervivencia neuronal dependiente de

BDNF, se realizaron cultivando neuronas sensoriales disociadas de los DRGs, de animales
neonatales. Las neuronas se sembraron a una concentración de 2000 ó 10000 células/ml sobre
ornitina/laminina y se incubaron en medio Hams F12-SATO con 1 ó 10 ng/ml de NGF
(PeProtech) en presencia de anticuerpos IgG anti-BDNF generados en conejo (6 µg/ml; Santa
Cruz Labs.) o anticuerpos IgG anti-ratón (6 µg/ml; Sigma), como control de las posibles uniones
inespecíficas de los anticuerpos. La tasa de supervivencia neuronal se determinó a los 5 y 10
días respectivamente, tal como se describe con anterioridad.

4.2. Cultivos y co-cultivos organotípicos.

Los cultivos de explantes organotípicos se establecieron a partir de animales postnatales de 20
días (P20) de ambos genotipos ya que las neuronas sensoriales de los DRGs a esta edad
pueden sobrevivir sin necesidad de adición exógena de factores neurotróficos. Los DRGs se
diseccionaron de la región lumbar como se ha explicado con anterioridad y los fragmentos piel
se obtuvieron de las almohadillas plantares de las extremidades traseras del ratón. Todos los

64
 Materiales y métodos

tejidos fueron diseccionados en medio L15 (GIBCO, Grand Island, NY) y posteriormente
lavados en medio Hams F12. Utilizando unas pinzas ultrafinas estériles los DRGs y los
fragmentos de piel fueron colocados individualmente uno junto al otro sobre una membrana
porosa situada en el compartimento superior de insertos (0,4 µm poro, 12-mm diámetro;
Millipore) que habían sido pre-tratados con Matrigel (Growth Factor Reduced; BD) y
suspendidos sobre las placas de 24 pocillos. Para permitir la adhesión de los explantes sobre
el sustrato, dada la naturaleza impermeable de la piel, se pipeteó cuidadosamente en el pocillo
un volumen de medio F12-SATO suficiente para mantener el tejido húmedo pero sin
sumergirlo, durante 1 hora de incubación a 37 ºC en una atmósfera húmeda con CO2 al 5%.
Pasado este tiempo se añadió una pequeña cantidad más de medio para cubrir los explantes y
favorecer así su supervivencia. El co-cultivo se mantuvo durante 6 días en el incubador en
ausencia de factores tróficos exógenos.

4.3. Cultivo de mastocitos derivados de la médula ósea (BMMCs).

Para establecer los cultivos de mastocitos derivados de la médula ósea (BMMCs) se
sacrificaron por dislocación cervical animales adultos de ambos genotipos. La médula ósea se
extrajo del fémur y la tibia del animal tras eliminar las epífisis, mediante la inyección de medio
atemperado con una jeringuilla a través del interior del hueso hasta vaciar por completo la
cavidad medular sobre la placa de cultivo. Para la disección y el cultivo de las células
hematopoyéticas empleamos medio RPMI 1640 suplementado (RPMIS: RPMI 1640, 10% suero
bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina, 100 µg/ml streptomicina (Gibco), 50
µM β-mercaptoetanol y 1% HEPES, pH 7,5). Una vez extraída la médula ósea se transfirió el
tejido a un falcon de 10 ml, se lavó con medio RPMIS, se disgregó cuidadosamente con una
pipeta de vidrio con la punta pulida a la llama y ligeramente cerrada hasta obtener una solución
celular homogénea. A continuación se sembraron las células en ausencia de sustrato de
adhesión a una densidad de aproximadamente 4 x 105 células/ml, se añadió al medio RPMIS10
ng/ml de interleukina-3 (IL-3; PeProtech), a fin de favorecer la diferenciación de las células
madre hematopoyéticas hacia el linaje mieloide, y se incubaron a 37 ºC en una atmósfera
húmeda con CO2 al 5%. Algunas de las células aisladas se mantuvieron en suspensión
mientras que una fracción de ellas de adhirió de forma espontánea al frasco de cultivo. Ambas
fracciones proliferaron pero únicamente la población en suspensión se utilizó para el sub-
cultivo (o pase, cada 3-4 días) ya que estudios previos demuestran que es ésta la población
que permite la obtención de un cultivo enriquecido en mastocitos en un 98%, tras un periodo de
4 semanas de diferenciación in vitro (Jeffrey y cols., 2006). Transcurrido este periodo y una vez
establecido el cultivo de BMMCs se mantuvo como máximo hasta las 9 semanas in vitro
pasando las células cada 3 días. La identidad de las células se determinó mediante criterios
morfológicos y para ello se recogió una muestra de células de cada cultivo en un tubo
Eppendorf y se fijaron con glutaraldehido al 3,5% en PB, durante 30 min. a 37 ºC. Tras diversos
lavados en PB se dispensaron gotas de agar (Panreac) al 1,5% sobre las muestras para darles
consistencia y se procedió a su inclusión en araldita. Como hemos descrito anteriormente se
realizó la postfijación de las células en tetraóxido de osmio al 1% en PB durante 45 min. a

65
Materiales y métodos

temperatura ambiente, se lavaron y se incubaron en acetato de uranilo (Aname) al 2% en

alcohol del 70%, durante 1 hora. Posteriormente se deshidrataron en baños de alcoholes de
graduación creciente muy cortos (5 min.), se aclararon con óxido de propileno y se incluyeron
en araldita. Se obtuvieron cortes semifinos de 1 µm de grosor mediante un ultramicrotomo
Reichert Ultracut E, se tiñeron con azul de toluidina al 1% y se analizaron con un microscopio
vertical Nikon E600.

4.4. Co-cultivos de neuronas sensoriales de los DRGs y BMMCs.

El estudio de la interacción entre las neuronas sensoriales de los DRGs y los mastocitos se
realizo mediante co-cultivos con BMMCs. En primer lugar, se establecieron los cultivos
primarios de neuronas disociadas o explantes de DRGs de animales adultos de ambos
genotipos, conforme a lo descrito previamente, y se sembraron en placas de 24 pocillos en las
que se habían introducido cubreobjetos o insertos pre-tratados con Matrigel (growth factor
reduced; BD). Cuando los cultivos primarios alcanzaron los 5 DIV, se lavaron los cultivos con
medio Hams F12, se sembraron 1x104 BMMCs por pocillo y se incubaron las células en medio
Hams F12 suplementado con SATO y con 10 ng/ml de IL-3. Como control del ensayo se
cultivaron BMMCs solas y en las mismas condiciones experimentales.

4.5. Ensayos de bloqueo de adhesión in vitro.

En los ensayos de bloqueo de función para analizar la tasa de degranulación de los mastocitos
mediada por una interacción física neuro-inmune, se utilizaron los co-cultivos de neuronas
sensoriales disociadas de los DRGs y BMMCs, descritos previamente. Los BMMCs se pre-
incubaron con un anticuerpo IgG monoclonal contra el dominio extracelular de la N-cadherina
(mAb GC-4, 40 µg/ml, Sigma) o con IgGs anti-ratón (40 µg/ml; Sigma), durante 1 hora a 37 ºC
en un incubador de CO2. El co-cultivo se mantuvo durante 72 horas in vitro sin eliminar los
anticuerpos bloqueantes y a continuación se estimuló la degranulación de las BMMCs
incubándolo con capsaicina 1 µM durante 1 hora a 37 ºC en el incubador de CO2, o únicamente
con una solución de DMSO vehículo. Como control se aplicaron los mismos tratamientos a
BMMCs sembradas en ausencia de neuronas pero bajo las mismas condiciones
experimentales (medio de cultivo y sustrato) que los co-cultivos.

5. Técnicas inmunocitoquímicas.
Para la realización de las distintas tinciones de los estudios in vitro, las neuronas disociadas,
BMMCs, explantes y co-cultivos en general, sembrados sobre cubreobjetos o insertos en
placas, se fijaron con PFA al 4% durante 20 min. a temperatura ambiente y a continuación se
lavaron varias veces las muestras con PB. En el caso de la inmunodetección de la N-cadherina
donde una menor permeabilización nos permitía detectar únicamente la proteína presente en la
membrana citoplasmática, se utilizó PFA al 2%. Para determinar el número total de mastocitos
y el número total de mastocitos degranulados se tiñeron las células con violeta de cresilo al 1%
durante 5 minutos, para detectar los gránulos por metacromasia, y se montaron con glicerol al
50% en PBS.

66
 Materiales y métodos

Para la detección de antígenos por inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa y para la

histoquímica con la lectina IB4, el bloqueo de uniones inespecíficas se realizó mediante la
incubación en tampón bloqueo (suero de cabra al 10% [NGS), Triton X-100 al 0,2% y glicina al
0,5% en PB, excepto en el caso de detección mediante peroxidasa) durante 30 min. A
continuación, los cubres o los insertos con las muestras se incubaron con el anticuerpo
primario de interés (Tabla 1; Anexo) y/o la lectina IB4 acoplada a biotina (10µg/ml; Sigma),
preparado en tampón bloqueo, durante toda la noche. En el caso de la inmunodetección de la
N-cadherina, se incubaron las muestras 5 min. en tampón bloqueo con Triton-X-100 al 0,3% y
durante el resto del protocolo no se utilizaron detergentes. Para el análisis de los co-cultivos de
neuronas disociadas y las BMMCs, las inmunodetecciones se realizaron con peroxidasa
utilizando el método del ABC. Tras la incubación con el anticuerpo primario, se incubaron los
cortes con anticuerpos secundarios apropiados acoplados a biotina (Tabla 2; Anexo) seguido
del complejo avidina-biotina-peroxidasa (Vector) como se ha explicado anteriormente. Tras
varios lavados en PB los cortes se incubaron en diaminobenzidina (DAB) (Sigma) al 0,02% y
H2O2 (Panreac) al 0,01% en PB, hasta que se observó el marcaje deseado. Posteriormente se
tiñeron las células con violeta de cresilo al 1% durante 5 minutos y se lavaron, se deshidrataron
con alcoholes de concentración creciente y se montaron con Eukitt. Para las
inmunofluorescencias, después de la incubación con el anticuerpo primario y tras varios
lavados, las muestras se incubaron 45 min. con el anticuerpo secundario apropiado en tampón
bloqueo (Tabla 2; Anexo). Dado que la heparina que expresan los mastocitos posee una alta
afinidad por la avidina y la estreptavidina (Bussolati y Gugliota, 1983) las BMMCs se marcaron
directamente con estreptavidina acoplada al fluoróforo Cy3 (1:200; Jackson Inmunochemicals).
Finalmente los cubreobjetos y los insertos se lavaron varias veces en PB, se tiñeron con DAPI
o TOPRO-3 y se montaron con Prolong-Gold (Molecular Probes). Para montar las muestras
sembradas sobre insertos, se recortó la membrana porosa con un bisturí, se colocó
cuidadosamente sobre un portaobjetos y, tras aplicar una gota del medio de montaje, se cubrió
con un cubreobjetos de cristal. Los marcajes fueron analizados mediante microscopía de
fluorescencia convencional o mediante microscopía confocal, tal como se ha explicado
previamente.

6. Análisis morfométrico y estereología.

6.1. Recuentos neuronales.
El número total de neuronas se determinó en tres DRGs diferentes: torácico (T) 1, lumbar (L) 1
y L4. Para ello se realizaron series de cortes de 7 µm consecutivos a partir de bloques de
parafina conteniendo embriones completos o las regiones lumbares de animales neonatos y
postnatales y se tiñeron con la tinción de Nissl usando violeta de cresilo. Después de mapear
de forma completa cada uno de los ganglios en todos los cortes en los que se encontraba
contenido se contaron las neuronas presentes en una de cada cuatro secciones para estimar el
número total presente en el ganglio. En los estadios E15, P0 y P15 las neuronas se
identificaron usando criterios morfológicos, de forma que, para no sobreestimar su número,
únicamente se tuvieron en cuenta aquellas que presentaban nucleolos claramente visibles. En

67
Materiales y métodos

el estadio E12, las neuronas no pueden ser identificadas basándose únicamente en su

morfología por lo que se realizaron inmunotinciones (tal como se ha indicado antes) con
anticuerpos anti-neurofilamento (subunidad 150 kDa, NF 150), que en estas estructuras
funciona como un marcador muy temprano de diferenciación neuronal. Para calcular el
volumen total del ganglio se midieron las áreas de las secciones contadas y se estimó el
volumen aplicando la fórmula de Cavalieri.

6.2. Recuentos de fibras nerviosas al microscopio óptico.

Para los recuentos de fibras mielínicas y amielínicas se utilizaron la raíz dorsal de los ganglios
L3 y L5 así como los correspondientes nervios raquídeos, además del nervio ciático, el nervio
sáfeno y los nervios digitales de animales P15 las muestras fueron procesadas para
microscopía electrónica. Para los recuentos de fibras mielínicas se obtuvieron secciones
transversales al nervio de 1µm de grosor mediante un ultramicrotomo Reichert Ultracut E, se
tiñeron con azul de toluidina al 1% y se determinó el número total de axones utilizando el
programa CAST-GRID software package (Olympus, Denmark) adaptado a un microscopio
Olympus BX51.

6.3. Recuentos de fibras nerviosas al microscopio electrónico.

Para los recuentos de las fibras amielínicas se utilizaron secciones de 60 nm de grosor que se
contrastaron con citrato de plomo y se visualizaron en un microscopio electrónico de
transmisión Jeol JEM-1010F. Para estimar el número total de fibras amielínicas en cada nervio,
se obtuvieron microfotografías a 5200X al azar hasta cubrir una superficie igual para cada
muestra y luego se refirió el número obtenido en cada caso a la superficie total del nervio en
cuestión. Para calcular el área de los axones amielínicos se dibujaron las secciones
transversales de los axones en papel de acetato. Estos dibujos fueron analizados mediante las
aplicaciones IPTK4 de análisis de imagen del programa Adobe Photoshop 7.0, obteniéndose
los valores de las áreas.

La piel de las almohadillas plantares de animales de ambos genotipos, se incluyó en resina

como se describe anteriormente y se obtuvieron cortes semifinos seriados de 2 µm de grosor
que se tiñeron con azul de toluidina-bórax al 1% para su observación al microscopio óptico. Se
fotografiaron las regiones de interés y estos semifinos se arrancaron del portaobjetos mediante
un choque térmico, usando una plancha metálica enfriada previamente con nitrógeno líquido,
después de pegar un bloque de araldita polimerizada sobre el corte. Una vez separado el
semifino del portaobjetos se retalló la región de interés y se obtuvieron cortes ultrafinos de 60
nm de grosor que fueron contrastados con plomo, observados y fotografiados a diferentes
magnificaciones con el microscopio electrónico de transmisión Jeol JEM-1010F.

6.4. Análisis morfométrico de estructuras.

El análisis morfométrico de las áreas y fracción de áreas se realizó en cortes de criostato de 10
µm de médulas de ratones postnatales fijados en PFA al 4% en PB. Mediante
inmunofluorescencia se marcaron las medulas espinales con anticuerpos anti-Tuj1, un
marcador del citoesqueleto neuronal tal y como se describe anteriormente. La fluorescencia

68
 Materiales y métodos

convencional fue visualizada con un microscopio vertical Nikon E600 (Nikon, Japón), se
capturaron imágenes con una cámara digital Nikon DM1200 y el estudio fue realizado mediante
las aplicaciones IPTK4 de análisis de imagen del programa Adobe Photoshop 7.0. Las
imágenes fueron capturadas con objetivo de 10x en formato 512 x 512, con 8 bits de resolución
por pixel.

6.5. Análisis morfométrico de neuritas.

Los análisis de arborización neurítica se realizaron a partir de cultivos de neuronas sensoriales
disociadas sembradas sobre colágeno y fijadas a las 48 horas in vitro con PFA al 4% en PB.
Mediante inmunofluorescencia se marcaron las neuronas con anticuerpos anti-Tuj1, un
marcador del citoesqueleto neuronal. Se tomaron imágenes de neuronas a 20x y se dibujaron
en papel de acetato las neuritas y las ramificaciones de, al menos, 100 neuronas por condición.
Estos dibujos fueron analizados mediante las aplicaciones IPTK4 de análisis de imagen del
programa Adobe Photoshop 7.0, obteniéndose los valores del número medio de neuritas y
ramificaciones por neurona.

7. Medida del flujo intracelular de Ca2+.

El flujo intracelular de Ca2+ se determinó usando la sonda fluorescente fura-2 acetoximetil ester
(AM) (Molecular Probes) siguiendo la metodología descrita por (McNaughton y Preece, 1986).
Las neuronas sensoriales se sembraron en cubreobjetos pre-tratados con ornitina/laminina,
como se describe previamente, y se mantuvieron durante 5 DIV. Transcurrido este tiempo se
incubaron con Fura-2 AM 5 µM en pH 7,4 (NaCl 140 mM, KCl 4 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2
1mM, HEPES 10 mM y glucosa 5 mM) suplementado con 0,025% ácido plurónico (Molecular
Probes) durante 1 hora a 37 ºC en el incubador de CO2. A continuación las células se lavaron 3
veces con tampón Tyrode/Hepes y los cubreobjetos se transfirieron a una cámara de perfusión
instalada en la platina de un microscopio invertido de epifluorescencia Nikon Diaphot, equipado
con una cámara digital. Mediante un sistema de perfusión constante por gravedad, las
muestras se perfundieron con tampón Tyrode/Hepes, se les administró una solución de
capsaicina (300 nM) durante 30 segundos y se lavaron otra vez con el mismo tampón. Dado
que la solución stock de capsaicina se prepara en DMSO, se añadió la misma concentración
final de DMSO al tampón Tyrode/Hepes que usamos para la perfusión sin tratamiento. Al final
de cada experimento se perfundieron las neuronas con una solución de KCl 100mM como
control positivo del flujo del Ca2+ tras la despolarización de la membrana celular. Los datos de
emisión de fluorescencia a 520 nm se registraron mediante el sistema de monitorización de
fluorescencia Aquacosmos software, en respuesta a una excitación a 340 nm (Ca2+ marcado) y
a 380 nm (Ca2+ libre). La relación F340/F380 se adquirió antes, durante y después de los
tratamientos a intervalos de tiempo de 1 segundo. Estas determinaciones se realizaron en el
laboratorio de la Dra. Rosa Panells en el Centro de Investigación Principe Felipe de Valencia.

69
Materiales y métodos

8. Inmunodetección de proteínas mediante western blot.

8.1. Extracción de proteína total.
Para las determinaciones proteicas se sembraron explantes de DRGs y BMMCs en placas, se
cultivaron durante 6 y 3 DIV respectivamente su medio estándar y se recogieron tras varios
lavados con PBS frío. A continuación se incubaron las muestras en tampón de lisis (50 mM Tris
pH 8, SDS 1% y EDTA 10 mM) suplementado con inhibidores de fosfatasas y proteasas
(ortovanadato sódico a 1 mM, fluoruro sódico a 1 mM, PMSF a 1 mM, aprotinina a 10 µg/ml y
leupeptina a 10 µg/ml) a 4 ºC durante 30 minutos, para asegurar la lisis total de las células. Los
lisados de las muestras se sometieron a ultrasonidos 10 veces durante 30 segundos en un
Bioruptor (Cosmo Bio Co.) para reducir la viscosidad de la muestra debida al DNA. La
concentración de proteína de determinó por el método de Bradford modificado (BCA Protein
Assay Kit; Pierce) usando albúmina de suero bovino (BSA) como estándar. A la misma
cantidad de proteína (30 µg) por muestra se le añadió un volumen adecuado de tampón de
carga 4x (Tris-HCl a 625 mM, pH 6,8, con glicerol al 10 %, SDS al 2%, β-mercaptoetanol al 4%
y azul de bromofenol al 0,025%), desnaturalizada por ebullición durante 5 minutos.

8.2. Electroforesis y transferencia a membrana.

Las proteínas se separaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (Pronadisa) al
8-10% en docecilsulfato sódico (SDS), utilizando el sistema Mini-Protean 3 (Bio-Rad) bajo
condiciones desnaturalizantes y reductoras, a un amperaje constante de 25 mA/gel. El tampón
de electroforesis utilizado constó de glicina (Sigma) a 0,2 M, Trizma base (Sigma) a 25 mM y
SDS al 1% (Sigma). Se utilizó un marcador pre-teñido de pesos moleculares en el rango
adecuado (13-220 kDa; Bio-Rad). Los geles se electrotransfirieron a una membrana de
nitrocelulosa (Hybond-ECL, Amersham Biosciences), utilizando tampón de transferencia (Tris-
HCl a 25 mM, pH 8.3, metanol al 20% y glicina a 192 mM) en un sistema Mini Trans-Blot (Bio-
Rad). La eficiencia de la transferencia se analizó mediante tinción de la membrana con rojo
Ponceau (al 0,5% en ácido acético glacial al 1%).

8.3. Bloqueo de membranas e incubación con anticuerpos.

Las membranas fueron bloqueadas en leche desnatada en polvo al 5% en Tris-base salino
(TBS: Tris-base a 0,1 M, pH 7,5, con NaCl al 0,9%) con detergente Tween-20 (Sigma) al 0,1%
(TBS-T) durante 1 hora a temperatura ambiente y en agitación. Posteriormente se incubaron
las membranas con los anticuerpos primarios a las diluciones adecuadas (ver Tabla) en TBS-T,
durante toda la noche a 4 ºC y en agitación. Finalmente, las membranas se lavaron tres veces
en TBS-T y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con los anticuerpos
secundarios adecuados acoplados a peroxidasa (ver Tabla). Tras varios lavados en TBS-T se
detectaron las bandas de proteína mediante quimioluminiscencia, incubando las membranas
durante 5 minutos con Lumigen TMA-6 (Amersham Pharmacia) y capturando la luminiscencia
en un documentador de geles Kodak EL LOGIG 440 Imaging System (Kodak; Japón) hasta la
detección óptima de la señal. Las intensidades de las bandas individuales se cuantificaron
mediante el programa Molecular Imaging (Kodak). Los niveles de expresión de las proteínas

70
 Materiales y métodos

analizadas en nuestros estudios se normalizaron con respecto a los de la β-actina de las

mismas muestras.

9. Análisis de la expresión de ARNs mensajeros.

9.1. Extracción de RNA total y retro-transcripción.
Para el análisis de la expresión de ARNs mensajeros en tejido se recogieron cantidades
equivalentes de piel y DRGs de animales postnatales de diferentes edades (P0, P7 y P15) y se
aisló el RNA mediante la técnica del fenol/cloroformo usando Trizol (Life Technologies,
Gaithersburg, MD) para la extracción seguido de isopropanol para la precipitación del mismo.
El RNA resultante se resuspendió en 100 µl de ddH2O libre de ARNasas. Los ARNs totales de
los explantes y los BMMCs se extrajeron mediante el kit de extracción Rneasy Mini Kit
(Qiagen; Alemania) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para ello se recolectaron
6
aproximadamente 1 x 10 BMMCs y unos 20 explantes de DRGs cultivados durante 6DIV y el
RNA obtenido se resuspendió en 15 µl de ddH2O libre de ARNasas. En ambos procedimientos
se cuantificó el RNA total mediante espectrofotometría, y únicamente aquellas muestras con
una relación de absorbancia 260/280 > 1,6 se emplearon para el análisis. Los ARNs totales se
guardaron a –80 ºC hasta su uso.

Para la retro-transcripción a ADNc se partió de 1-2 µg de RNA total, 3 µg/µl de hexanucleótidos

al azar (Invitrogen; USA) y 200 U de la transcriptasa reversa SuperScript II RT (Invitrogen), en
un volumen de reacción de 20-30 µl y en presencia de tampón first strand (Tris-HCl a 50 mM,
KCl a 75 mM, Mg2Cl a 3 mM) con DTT a 5 mM y 0,25 mM de cada dNTP (Amersham
Pharmacia). La reacción se llevó a cabo a 42 ºC durante 50 min. seguido de 15 min. a 70 ºC.
En todos los casos se incluyeron duplicados de las muestras sin transcriptasa reversa (RT-)
para usar posteriormente como control de la amplificación del DNA.

9.2. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Los análisis por PCR para determinar la expresión de distintos genes se realizaron en un
termociclador Mastercycler (Eppendorf, Alemania). Se usó 1 µl de ADNc en un volumen de
reacción de 20 µl conteniendo Tris-HCl a 4 mM, KCl a 20 mM, EDTA a 20 µM, DTT a 200 µM,
dNTPs 0,25 mM (Amersham Pharmacia), cebadores a 0,25 µM (Sigma-Genosys; Anexo II) y 1
U de Taq polimerasa (Promega). Los pares de oligonucleótidos específicos utilizados como
cebadores se diseñaron usando los programas Gene Runner y Primer Express 2.0 y su
secuencia es la siguiente:

Ngf
cebador directo: 5´-GATCGGCGTACAGG CAGAAC
cebador inverso: 5´-CAGTGGGCTTCAGGGACAGA

TrkB
cebador directo: 5´- GCGAACCTGCAGATACCCAAT
cebador inverso: 5´- CCAAATTCCCAACGTCCCA

71
Materiales y métodos

Mmp24
cebador directo: 5´-TGATTCAGATGAACCCTGGA
cebador inverso: 5´-AAGGGAGCCATGATAGCACT

β-actin 59 ºC
cebador directo: 5´-CCGGGACCTGACAG ACTACCT
cebador inverso: 5´-GCCATCTCCTGCTCGAAGTCTA

Después de una desnaturalización inicial, se efectuaron los ciclos de amplificación

correspondientes a cada pareja de cebadores: Ngf, 59 ºC - 34 ciclos; Mmp24, 57 ºC - 40 ciclos;
TrkB, 56ºC - 35 ciclos; β-actina, 59 ºC - 20 ciclos. El tamaño de cada producto de amplificación
se resolvió mediante agarosa al 2% preparado en tampón Tris-borato-EDTA (TBE: Tris a 89
mM, PH 8,0 ácido bórico a 89 mM y EDTA a 2mM) con 10 µg/ml de bromuro de etidio. Como
tampón de carga, se utilizó glicerol al 50%, azul de bromofenol al 0,05%, cianol de xileno al
0,05% y EDTA a 100 mM. Los transcritos de Ngf fueron cuantificados mediante análisis
densitométrico en un documentador de geles Kodak EL LOGIG 440 Imaging System (Kodak;
Japón) hasta la detección óptima de la señal. Las intensidades de las bandas individuales se
cuantificaron mediante el programa Molecular Imaging (Kodak). Los niveles de expresión de las
proteínas analizadas en nuestros estudios se normalizaron con respecto a los de la β-actina de
las mismas muestras.

9.3. PCR en tiempo real o cuantitativa (RT- PCR).

Los niveles de expresión de los RNA mensajeros se evaluaron utilizando reacciones en cadena
de la polimerasa en tiempo real desde DNA complementario generado por transcripción en
reverso (RT-PCR) a partir de RNA total extraído de los distintos tejidos o células. Para estos
estudios, los distintos RNA celulares fueron extraídos con Trizol como se ha explicado
anteriormente. Las muestras se trataron con ADNasa-I siguiendo las indicaciones de la casa
comercial. Se comprobó la integridad y se determinó la concentración del RNA por
espectrofotometría y electroforesis en minigeles de agarosa al 1%. El ADNc se sintetizó a partir
de 3 µg de RNA total como ya se ha explicado. La especificidad de los oligonucleótidos
cebadores se comprobó en un termociclador estándar (Perkin Elmer). Para las PCRs
cuantitativas se utilizó una solución 1/5 de ADNc en un volumen final de 26 µl de mezcla de
reacción consistente en 12,5 µl de QuantiTect SYBR Green PCR master mix (Molecular
Probes), 0,3 µM de la correspondiente pareja de oligonucleótidos cebadores (Invitrogen), 11 µl
de ddH2O y 1µl de la muestra de ADNc. Las reacciones se llevaron a cabo por triplicado,
incluyendo siempre controles negativos de la reacción y se cuantificó simultáneamente la
expresión del ARNm de la beta-actina de cada muestra como control interno. Los pares de
oligonucleótidos específicos utilizados como cebadores se diseñaron usando los programas
Gene Runner y Primer Express 2.0 y su secuencia es la siguiente:

Ngf
cebador directo: 5´-GATCGGCGTACAGGCAGAAC

72
 Materiales y métodos

cebador inverso: 5´-CAGTGGGCTTCAGGGACAGA

Gdnf
cebador directo: 5´- AGCCACCATTAAAAGACTGAAAAGG
cebador inverso: 5´-CCTGCCGATTCCTCTCTCTTC

Bdnf
cebador directo: 5´- CCAAAGGCCAACTGAAGCAGTA
cebador inverso: 5´- GCAGCCTTCCTTGGTGTAACC

β-actina 60 °C
cebador directo: 5´-CGGGACCTGACAGACTACCTCAT
cebador inverso: 5´-GCCATCTCCTGCTCGAAGTCTAG

β-actin 59 °C
cebador directo: 5´-CCGGGACCTGACAGACTACCT
cebador inverso: 5´-GCCATCTCCTGCTCGAAGTCTA

Para todas las parejas de cebadores se utilizaron las mismas condiciones de PCR, que son las
siguientes: un paso inicial de desnaturalización a 50 ºC durante 2 min. y a 95 ºC durante 10
min. seguido de 35 ciclos de: desnaturalización a 95 ºC 30 s, hibridación a 60 ºC (BDNF) o
59ºC (NGF y GDNF) durante 45 s y una primera elongación de 1 min. a 72 ºC. Al finalizar los
35 ciclos, 15 s a 85 ºC con adquisición de la fluorescencia del SYBR Green en este paso y una
elongación final de 2 min. a 72 ºC. La especificidad y ausencia de contaminaciones se verificó
tanto por las curvas de desnaturalización como por electroforesis en geles de agarosa al 1.5%.
En todos los experimentos se incluyó un control negativo de reacción y para determinar la
concentración relativa del tránscrito, en todas las reacciones se estableció una curva estándar
con duplicados de diluciones seriadas de DNA genómico purificado de tejido de ratón. Todas
las muestras, los controles negativos, la curva estándar y los controles internos fueron
analizados por triplicado y simultáneamente para cada pareja de cebadores. La
reproducibilidad de los resultados se confirmó analizando dos reacciones PCR por cada
experimento. La cuantificación de los productos se basó en el registro de la fluorescencia del
SYBR Green durante la fase exponencial de amplificación en un termociclador ABI PRISM
7700 sequence detection system (Applied Biosystems) para PCR en tiempo real, y la
subsiguiente determinación del ciclo de PCR en el cual el producto amplificado sobrepasó un
umbral determinado (llamado Ct o crossing threshold). El análisis del nivel de expresión de
cada factor neurotrófico se realizó con el programa ABI Prism 7000 SDS Software y se
normalizó con las cuantificaciones de la β-actina. Los datos así estandarizados se usaron para
calcular diferencias en la expresión de los distintos genes estudiados.

73
Materiales y métodos

10. Análisis estadísticos.

Los análisis estadísticos se han realizado con el programa informático SPSS versión 12.0 para
Windows (Statistical Product and Service Solutions, SPSS Inc., USA). Para poder aplicar un
test de tipo paramétrico a los valores absolutos, se determinó primero si se distribuían de forma
normal mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov (Sokal y Rohlf, 1995) y se testó la
homogeneidad de varianzas mediante el Test de Levene. Para determinar la significación de
las diferencias entre las medias de los grupos se usó la prueba de la t de Student. En el caso
de las comparaciones entre valores relativos se llevó a cabo la transformación arcsen (raíz
(valor)) antes de aplicar el test de la t (Sokal y Rohlf, 1995). En el conjunto de los análisis los
valores P < 0.05 se han considerado estadísticamente significativos. Todos los valores
obtenidos se han expresado como la media ± error estándar de la media (SEM), en los
diferentes grupos descritos. Se ha representado P < 0.05 como *, P < 0.01 como **, y P < 0.001
como ***.

11. Anexo.

Tabla 1. Anticuerpos primarios utilizados para inmunohistoquímica o inmunocitoquímica.

Antígeno Tipo(*) Dilución IH/IC Procedencia

β-catenina prAc 1:100 Cell Signaling
Calbindina prAc 1:2000 Swant
Calretinina prAc 1:250 Swant
CGRP prAc 1:500 Amersham
CGRP pgAc 1:500 Abcam
MMP-MT5 prAc 1:15 R&D systems
MMP-MT5 pgAc 1:25 Santa Cruz
N-cadherin mAc 1:200 BD Traduction
NeuN mAc 1:500 Chemicon
NF-150 mAc 1:100 Hybridoma Bank
PGP 9.5 prAc 1:500 Ultraclone
S100-β prAc 1:1000 Sigma
TH prAc 1:300 Pel-Freez
TrkB pckAc 1:10 Promega
Tuj1 mAc 1:300 Covance
Tuj1 prAc 1:300/1:500 Sigma
VR1 C-ter prAc 1:1000 Neuromics

(*) Abreviaturas:
mAc: Anticuerpo monoclonal generado en ratón (IgG)
pckAc: Anticuerpo policlonal generado en pollo (IgY)
pgAc: Anticuerpo policlonal generado en cabra (IgG)
prAc: Anticuerpo policlonal generado en conejo (IgG)

74
 Materiales y métodos

Tabla 2. Anticuerpos primarios utilizados para inmunodetección de proteínas por Western-blot.

Antígeno Tipo(*) Dilución IH/IC Procedencia

β-actina mAc 1:5000 Sigma

β-catenina prAc 1:1000 Cell Signaling
N-cadherin mAc 1:1000 BD Traduction
VR1 C-ter prAc 1:1000 Neuromics

Tabla 3. Anticuerpos secundarios.

Antígeno Tipo(*) Dilución IH/IC/IB Procedencia

Alexa Fluor 488 anti-IgG Ratón 1:700 Molecular Probes

Alexa Fluor 488 anti-IgG Conejo 1:700 Molecular Probes

Alexa Fluor 488 anti-IgG Cabra 1:700 Molecular Probes

HRP-anti-IgG Ratón 1:300/1:5000 Chemicon

HRP-anti-IgG Conejo 1:1000 Amersham

Biotinilado anti-IgG Ratón 1:300 Vector

Biotinilado anti-IgG Conejo 1:300 Vector

Biotinilado anti-IgY Chicken 1:300 Promega

CyTM3 anti-IgG Ratón 1:1500 Jackson IR Labs

CyTM3 anti-IgG Conejo 1:1500 Jackson IR Labs

CyTM3 Streptoavidina - 1:200 Jackson IR Labs

CyTM2 Streptoavidina - 1:200 Jackson IR Labs

75
 Resultados

RESULTADOS

77
 Resultados

1. El BDNF es un factor neurotrófico esencial para la supervivencia de las

neuronas nociceptivas y la regulación de su heterogeneidad
1.1. Caracterización de las poblaciones de neuronas sensoriales que dependen
de BDNF in vivo
Establecimiento del periodo de dependencia trófica del BDNF de las neuronas sensoriales de
los DRGs

El recuento de neuronas presentes en los ganglios lumbares L1 y L4/5 de los animales

Bdnf+/+ y Bdnf-/- durante el desarrollo embrionario y postnatal (Tabla 2) muestran que en esta
cepa de ratones mutantes para Bdnf no existe pérdida aparente en el número de neuronas en
ninguno de los estadios analizados hasta el momento del nacimiento. Sin embargo, la pérdida
es evidente en el día postnatal (P) 15 momento en el que se observa una disminución del 38%
de las neuronas en el mutante nulo de BDNF (Bdnf+/+ 8215 1246, n = 3; Bdnf-/- 5071 + 301, n =
4; p < 0,05). Por lo tanto, podemos concluir que la pérdida neuronal en los ratones mutantes de
BDNF es postnatal. Dada la escasa viabilidad de los ratones deficientes en BDNF que
sobreviven, en el mejor de los casos, sólo hasta los 20-25 días tras el nacimiento, no ha sido
posible analizar un número suficiente de animales mutantes de más de 15 días. Es por ello que
no podemos concluir si el déficit que describimos es completo o si más neuronas se perderían
en animales deficientes para BDNF de más edad. Para realizar estudios en animales adultos
será necesaria la generación de mutantes nulos condicionales en los cuales se elimine el gen
de manera específica en los ganglios sin comprometer la viabilidad del organismo.

E12 E15 P0 P15

L1 DRG BDNF +/+ 2510 ± 227 (6) 5642 ± 457 (4) 6379 ± 460 (5)
BDNF -/- 2470 ± 266 (2) 5432 ± 557 (3) 5814 ± 90 (5)

L4 DRG BDNF +/+ 10099 ± 137 (3) 8215 ± 1246 (3)

-/-
BDNF 10234 ± 1311 (3) 5077 ± 301 (4)

% reduction n.s. n.s. n.s. 38*

Tabla 2. Recuentos neuronales en los DRGs de ratones BDNF +/+ y BDNF -/- .
Recuentos neuronales en series de secciones de los DRSs L1 y L4, de ratones de genotipo salvaje (BDNF +/+) y
mutante (BDNF -/-). En E12, los números totales de neuronas, se calcularon mediante el recuento de las células
marcadas positivamente con el anticuerpo anti-neurofilamento. En el resto de estadios, se contaron las neuronas
identificadas con violeta de cresilo (ver Fariñas et al., 1996). El número de animales individuales analizados en cada
caso está indicado en paréntesis. Datos representados como media ± s.e.m. * p<0.05; n.s. no significativo.

79
Resultados

Caracterización de las neuronas perdidas en ausencia de BDNF

Las neuronas de los DRGs son de tipo pseudounipolar con una neurita que se bifurca muy
cerca del soma en dos ramas, la periférica y la central. La fibra periférica proyecta a distintas
zonas del organismo (músculo, piel, vísceras), en las que termina bien como terminación libre
no encapsulada o bien como terminación que forma parte de receptores sensoriales
especializados, estructuras encapsuladas más o menos complejas que transducen estímulos
sensoriales específicos. La fibra central termina en capas concretas de la médula espinal y
transmite la información sensorial periférica al sistema nervioso central. Las neuronas
sensoriales maduras de los DRGs constituyen una población heterogénea en cuanto al tamaño
de sus somas y al diámetro de sus fibras y consiguiente grado de mielinización, fenotipo
neuroquímico, propiedades fisiológicas como la velocidad de conducción o la modalidad
sensorial, receptor sensorial que inervan en la periferia, área de proyección en el sistema
nervioso central, etc. (ver revisiones en Scott, 1992). Es posible utilizar estos criterios de
clasificación para averiguar qué poblaciones concretas de neuronas se pierden en ausencia de
un determinado factor trófico, aunque la dificultad estriba en que existe un considerable grado
de solapamiento entre las distintas poblaciones.

a Neuronas con fibras mielínicas

La presencia de una vaina de mielina alrededor de las fibras de muchas de las neuronas
sensoriales hace posible su recuento a nivel de microscopía óptica, en cortes transversales de
1-2 µm obtenidos a partir de nervios incluidos en resinas epoxi y teñidos con azul de toluidina
(ver Figura 12).

Figura 12. Pérdida de fibras mielínicas y

amielínicas en las raíces dorsales y nervios
safenos.
Secciones transversales de los nervios periféricos de
BDNF+ / + (A, C, E) y BDNF- / - (B, D, F) fotografiadas en
en el microscopio óptico (AD) y electrónico (E, F). (A, B)
Secciones transversales de las raíces dorsales L5 de
ratones BDNF + / + y BDNF - / -. Se pueden distinguir
fácilmente los contornos de las fibras mielínicas al
microscopio óptico, debido a la intensa tinción de la
vaina de mielina. Se puede observar una clara
reducción en el área en la raíz del mutante. (C, D)
Secciones transversales de los nervios sáfenos de
ratones BDNF + / + y BDNF - / -. El nervio safeno es un
nervio puramente cutáneo que inerva la piel pilosa de
mitad de la pantorrilla. Se puede observar una
reducción en el área de la sección transversal similar a
la encontrada en raíces dorsales. (E, F) Micrografías
electrónicas de las secciones transversales de las
raíces dorsales L5 de ratones BDNF + / + y BDNF - / -.Las
fibras amielínicas se encuentran en paquetes (flechas)
entremezcladas con fibras mielinizadas de diferente
calibre. Se puede destacar que los paquetes incluyen
un menor número de fibras en el animal mutante. Las
pérdidas de axones mielínicos y no mielínicos (ver
Tabla 2), contribuyen a la reducción de tamaño
observadas en las secciones transversales de las raíces
dorsales de los ratones mutantes para BDNF. Barras de
escala: A-D 25µm, E y F ampliacion x 5.200.

80
 Resultados

Estos recuentos sólo pueden realizarse una vez finalizado el periodo de mielinización en el
sistema nervioso periférico que, en el ratón, es de unos diez días (observaciones propias no
publicadas).

En concreto, realizamos recuentos de fibras mielínicas correspondientes a los ganglios L3

y L5 en animales de P15, tanto en la raíz dorsal, que contiene las fibras centrales que se
dirigen hacia el asta dorsal de la médula espinal, como en el nervio raquídeo, que contiene las
fibras periféricas. Los recuentos en los animales Bdnf-/- muestran una reducción del 32-36% en
las raíces dorsales (Tabla 2; Figura 12A y B) y del 32% en los nervios sáfenos con respecto a
los animales Bdnf+/+ (Tabla 2; Figura 12C y D).

Una deficiencia en fibras mielínicas puede resultar de la pérdida de diversos tipos de

neuronas sensoriales. Los músculos y la piel son las áreas periféricas más inervadas por las
neuronas de los DRGs. Algunas neuronas sensoriales que tienen fibras mielínicas y que
proyectan a los músculos y a los tendones, son propioceptores. Estas neuronas son algunas de
las de mayor calibre y poseen fibras de tipo Aα con una gruesa vaina de mielina. Estas
neuronas son las responsables de inervar los husos neuromusculares y los órganos tendinosos
de Golgi y dependen de la señalización de NT-3 a través de TrkC (Fariñas et al., 1994; Enfors
et al, 1994; Klein et al, 1994; Tojo et al, 1995; Tessarollo et al, 1994, 1997). En estudios previos
de la cepa de mutantes para BDNF utilizada aquí ya se había comprobado que el número de
husos neuromusculares en los músculos de las patas en los mutantes no difería del encontrado
en los animales de genotipo salvaje (Jones et al., 1994). Dado que el desarrollo y
diferenciación de estos receptores sensoriales musculares es absolutamente dependiente de la
inervación sensorial, la presencia de un número normal de ellos en animales que carecen de
BDNF es una demostración de que las neuronas propioceptivas, con fibras Aα no se pierden en
ausencia de esta neurotrofina.

Si excluimos la población de neuronas propioceptivas, la mayoría de neuronas con fibras

mielínicas restantes pertenecen a un gran grupo heterogéneo de neuronas sensoriales que
inervan la piel y que poseen fibras Aβ o Aδ. La mayoría de las neuronas con fibras mielínicas
son de tamaño intermedio (fibras Aß). Se cree que estas neuronas inervan mecanorreceptores
cutáneos, como los corpúsculos de Meissner, de Paccini, folículos pilosos y las células de
Merkel, especializados en proporcionar información al sistema nervioso central acerca del
tacto, presión, vibración y tensión en la piel (ver, por ejemplo, Koltzenburg et al., 1997). Por otro
lado, las de menor calibre entre las mielínicas (fibras Aδ), correspondientes, entre otros, a
nociceptores polimodales, especialmente termorreceptores, que terminan de forma libre en los
territorios que inervan (ver revisiones en Scott, 1992). Los datos previos y nuestras
determinaciones de la distribución por tamaños de fibras mielínicas parecen indicar que la
deficiencia observada en animales mutantes para BDNF afecta probablemente a neuronas
sensoriales de proyección cutánea de tamaño medio a medio-pequeño. En este sentido, ya se
había descrito que una subpoblación de neuronas sensoriales de tamaño medio expresaban el

81
Resultados

receptor TrkB (Enfors et al., 1992; Schecterson et al., 1992; Mu et al., 1993) mediante técnicas
de hibridación in situ.

b Neuronas con fibras amielínicas

Nuestros recuentos a nivel de microscopía óptica no tienen en cuenta posibles efectos

sobre una fracción importante de las neuronas los DRGs, aquellas cuyas fibras son de muy
pequeño calibre y no están mielinizadas (fibras C) y que, por tanto, sólo son visibles a nivel de
microscopía electrónica. Estas neuronas, en su mayoría nociceptivas, constituyen,
aproximadamente, el 60% de las neuronas en el ganglio. Por tanto, dado que la reducción en el
número de fibras mielínicas observada en los nervios mutantes coincide con la reducción en el
número de cuerpos celulares perdidos en los ganglios de ratones mutantes para BDNF, es
lógico suponer que en los mutantes se produce también una pérdida de neuronas con fibras
amielínicas. Por este motivo estudiamos las raíces dorsales del ganglio L5 de animales de P15
con microscopía electrónica (Figura 12E y F).

BDNF +/+ BDNF -/- % pérdida

Fibras mielínicas

Raíz dorsal L3 1473 ± 42 987 ± 89 32*

Raíz dorsal L5 2490 ± 108 1600 ± 39 36*

Nervio sáfeno (piel pilosa) 545 ± 29 386 ± 27 29*

Nervio digital (piel pilosa) 40 ± 2 32 ± 2 18*

Nervio digital (piel glabra) 63 ± 4 44 ± 8 29*

Fibras amielínicas

Raíz dorsal L5 6516 ± 830 3313 ± 339 49*

Nervio sáfeno 5787 ± 624 2791 ± 329 48*

Tabla 3. Recuentos de fibras mielínicas y amielínicas en los DRGs y en diferentes nervios perféricos de ratones
P15 BDNF +/+ and BDNF -/-. Recuentos de fibras mielínicas en cortes transversales del nervio, de 1 µm de grosor,
teñidos con azul de toluidina. Las fibras amielínicas se cuantificaron en micrografías electrónicas. En cada caso se
analizaron tres animales independientes. Datos presentados como media ± s.e.m. * p<0.05

Cualitativamente, el aspecto de las fibras amielínicas observadas en cortes ultrafinos

obtenidos a partir de nervios de animales Bdnf-/- era diferente al de los nervios control.
Observamos que los paquetes de fibras amielínicas se ven reducidos en su tamaño mientras
que el área media de cada fibra no presenta ninguna diferencia (Figura 12E, F)) si se comparan
control y mutante nulo (Bdnf+/+: 0.130 + 0.025; Bdnf-/-: 0.140 + 0.014 µm2). Los recuentos de
fibras amielínicas muestran que en la misma raíz dorsal donde faltaba el 36% de las fibras

82
 Resultados

mielínicas, se producía además una pérdida (49%) de fibras amielínicas (Tabla 3, Figura 12E,
F).

Estas observaciones demuestran que en animales mutantes nulos para BDNF se pierden
tanto neuronas sensoriales con fibras mielínicas como con fibras amielínicas de tipo C.

Neuronas sensoriales cutáneas de proyección a la piel glabra y a la piel pilosa

Los ganglios analizados en este estudio (L3-L5) son especialmente favorables para el
estudio de neuronas sensoriales cutáneas porque inervan las extremidades posteriores, donde
se encuentran tanto territorios de piel pilosa, a lo largo de la extremidad, como territorios de piel
glabra, sin pelo, en las almohadillas plantares. Dado que los diferentes tipos de piel poseen
diferentes combinaciones de receptores cutáneos, quisimos averiguar si existían diferencias en
el número de fibras mielínicas que inervaban la piel glabra y la pilosa. Para resolver esta
cuestión decidimos estudiar las proyecciones a la piel en dos nervios diferentes de la
extremidad trasera, el nervio sáfeno, puramente cutáneo piloso, y ramas específicas del nervio
ciático que inervan selectivamente la piel pilosa o la glabra. Debido a la ausencia de un atlas
anatómico de ratón suficientemente exhaustivo como para incluir en detalle los patrones de
inervación, realizamos disecciones finas de todo el árbol nervioso desde los ganglios lumbares
L3-L6 hasta el extremo de la pata, identificando todas las ramas por comparación con las
identificadas en otras especies, como la rata (Hebel y Stromberg, 1976) y el humano (Figura
13).

El nervio ciático, compuesto por fibras procedentes de los ganglios L4, L5 y L6 (ver Figura
13), recorre la parte dorsal interna de la extremidad posterior y da lugar tanto a nervios
musculares como a nervios cutáneos a la piel glabra y a la piel pilosa de la pata. Hemos
estudiado cual sería la pérdida de los axones si nos acercamos a las ramas más distales, como
son las del nervio digital. En la pata trasera del ratón existen dos nervios digitales que recorren
el empeine e inervan la piel pilosa y dos nervios digitales que recorren la planta e inervan la piel
glabra de las almohadillas plantares.

Los recuentos de fibras mielínicas en cortes transversales a nivel de estos nervios revelan
que los nervios digitales que inervan la piel pilosa de los mutantes de BDNF poseen un déficit
de, aproximadamente, el 30% (Tabla 2; Figura 13). Por lo tanto, podemos concluir que la
pérdida original en el número de fibras mielínicas que observábamos en los nervios raquídeos
de los ganglios L3 y L5 se mantiene a lo largo de los principales nervios cutáneos y de sus
correspondientes ramificaciones terminales, ya se dirijan a la piel pilosa o no pilosa.

Especialmente interesante es el nervio sáfeno (ver Figura 13) que recibe sus aferencias de
neuronas de los ganglios L2, L3 y L4 e inerva exclusivamente un área de la piel pilosa a una
altura media de la pantorrilla.

83
Resultados

Figura 13. Esquema de la inervación lumbar del ratón y el porcentaje de pérdida de fibras
mielínicas en los ratones deficientes en BDNF.

Como mostramos anteriormente, los recuentos de axones mielínicos en los nervios

raquídeos de los ganglios de L3, antes de que se ramifiquen sus correspondientes nervios
sáfenos, demuestran una pérdida del 32% en los mutantes (Tabla 3; Figura 13). De acuerdo
con estos resultados, los recuentos de fibras mielínicas del nervio sáfeno de animales control y
mutantes nulos de BDNF, indican una reducción estadísticamente significativa (alrededor de
29%, p<0.05) de fibras mielínicas del mutante (Tabla 3; Figura 13). En el caso del nervio sáfeno
realizamos, además, un recuento de fibras amielínicas al microscopio electrónico que nos
permitió comprobar que el déficit observado en los nervios raquídeos se mantenía en los
nervios puramente cutáneos (20-30%; Figura 13). Así, todos los nervios cutáneos estudiados
en ratones mutantes para BDNF parecen presentar un déficit en el número de fibras mielínicas
y amielínicas.

84
 Resultados

1.2. Caracterización de los diferentes grupos de receptores cutáneos que

dependen de BDNF in vivo.
Inervación sensorial de la piel glabra y pilosa

Tanto la piel glabra como la pilosa están inervadas por fibras nerviosas somáticas que
reciben información de las diversas modalidades sensoriales. Para medir la densidad de la
inervación somática general en los diferentes tipos de piel de los ratones mutantes para BDNF,
se utilizó un anticuerpo contra PGP 9.5 (protein gene product 9.5) que reconoce
específicamente una ubicuitina hidrolasa (UCHL-1) presente en todo tipo de fibras nerviosas,
tanto mielínicas como amielínicas. En cuanto a los receptores sensoriales presentes en la piel
pilosa, se analizaron muestras de piel de la zona medial de la pantorrilla, inervadas por el
sáfeno y para el análisis de la piel glabra, se seleccionaron muestras de las almohadillas
plantares, inervadas por el nervio ciático, en ambos casos localizadas en las extremidades
posteriores. Con el marcador general de inervación PGP 9.5 observamos que la densidad de
fibras y terminaciones nerviosas marcadas se encontraba sustancialmente reducida tanto en la
piel pilosa como en la glabra del mutante nulo de BDNF coincidiendo con la disminución de
fibras en el nervio (Figura 14 A-D).

Ambos tipos de piel reciben también la inervación del sistema nervioso simpático y para
comprobar si la reducción en la densidad de las fibras nerviosas estaba restringida a los
aferentes sensoriales se marcaron las proyecciones simpáticas, que también terminan en
forma de terminaciones libres no encapsuladas, usando un anticuerpo contra la TH (tirosina
hidroxilasa), un enzima que participa de la ruta biosintética de las catecolaminas y que se
expresa en las fibras nerviosas simpáticas pero no en las sensoriales. Este análisis lo
realizamos en muestras de piel glabra de las almohadillas plantares del ratón y los resultados
de la inmunohistoquímica mostraron que en la piel glabra de los ratones Bdnf-/- no había
diferencias significativas en la densidad de las fibras nerviosas positivas para TH (datos no
mostrados).

Todos estos datos demuestran que se produce una pérdida de proyección nerviosa
cutánea en los ratones Bdnf-/-, coherente con el déficit de neuronas sensoriales de los DRGs y
de las fibras mielínicas y amielínicas en los nervios, y que esta pérdida afecta de forma
exclusiva a las fibras nerviosas sensoriales y no a las simpáticas.

Mecanorreceptores cutáneos en la piel glabra y pilosa: fibras Aß

Las neuronas sensoriales de proyección cutánea con fibras mielínicas Aß inervan a

mecanorreceptores especializados. La fisiología de estas neuronas puede ser de dos tipos: a)
los aferentes de adaptación rápida que inervan a los corpúsculos de Meissner y Pacini, en la
piel glabra y a los pelos de protección o de cobertura (comunes o tilotricos), en la piel pilosa; b)
los aferentes de adaptación lenta que inervan a las células de Merkel en los dos tipos de piel
(ver Koltzenburg et al., 1997). Al igual que los receptores propioceptivos del músculo, el
desarrollo normal de muchos de estos mecanorreceptores cutáneos es absolutamente
dependiente de la llegada y mantenimiento de su inervación sensorial. Esto hace que sea

85
Resultados

posible analizar el déficit en neuronas de los DRGs que inervan a receptores específicos
concretos mediante el análisis de si estos están presentes.

Figura 14: Efecto de la falta de señalización de BDNF en

la inervación general y sobre los diferentes receptores
de la piel pilosa y glabra de ratón.
(A,D) Inervación general de la piel glabra de la almohadilla
plantar (A, B) y de la piel pilosa del empeine (C, D), en
ratones BDNF + / + y BDNF - / - de 15 días de edad. La
densidad de inervación se evaluó mediante el estudio de
secciones transversales de la piel glabra de la almohadilla
plantar y de la piel del lado piloso, marcadas con un
anticuerpo contra PGP9.5, un marcador general para fibras
periféricas. La tinción de los anticuerpos (verde), mostró un
patrón de tinción menor tanto en la piel glabra de la
almohadilla plantar como en la piel peluda de las patas
traseras de ratones de BDNF-/- (B, C). Además, la falta de
una alimentación postnatal aproppiada en los ratones
mutantes para BDNF, hace que su tamaño sea más pequeño
que sus hermanos de camada de tipo salvaje y, en
consecuencia, la densidad del pelo es mayor
(aproximadamente 1,5 veces, D). (E, F) Mediante el método
de tinción de plata de "tipo Cajal" se observa una ausencia
total de corpúsculos de Meissner en la piel glabra de la
almohadilla plantar de ratones BDNF - / -. Tengase en cuenta
que en ratones BDNF - / - las diferentes capas de la piel
glabra son más delgadas que en ratones normales (B, F). (G,
H). Según la evaluación realizada por la tinción de PGP9.5
en la piel del dorso piloso, las terminaciones lanceoladas
longitudinales de la mayoria de los folículos pilosos faltaban
en ratones mutantes de BDNF, mientras que las
terminaciones lanceoladas transversales no se vieron
afectadas. (G-J) El número de células de Merkel (flechas) ,
incluyendo las asociadas a los folículos del pelo y sus fibras
innervantes, también se redujeron en ratones BDNF - / - .

En el caso de la piel glabra, los corpúsculos de Meissner responden a deformaciones leves

de la piel y son especialmente abundantes en las almohadillas plantares, donde se sitúan justo
debajo de la epidermis entre las papilas dérmicas (ver Figura 14E). Se encuentran inervados
por una o más fibras nerviosas Aß de adaptación rápida que discurren de forma sinuosa en el
interior de una cápsula formada por células de Schwann modificadas a partir de las que rodean
a las fibras sensoriales (Perl et al, 1992). El desarrollo de este tipo de corpúsculos sensoriales
se ha estudiado en diferentes especies de mamíferos mediante impregnaciones metálicas con
oro o plata, técnicas inmunohistoquímicas y análisis ultraestructural (Renehanand Munger et al,
1990; Zelená et al, 1994; Saxod et al, 1996). Se ha visto que su desarrollo en el ratón comienza
dos días después del nacimiento y que alcanzan la conformación adulta sobre P20-P25 y, por
lo tanto, decidimos realizar el estudio de los corpúsculos de Meissner en la piel glabra de las
extremidades posteriores de animales P15 deficientes para BDNF, usando la técnica de tinción
argéntica de Cajal o un anticuerpo contra PGP 9.5. Encontramos que, mientras en los animales
controles existía un número elevado de corpúsculos de Meissner situados entre las papilas
dérmicas, los mutantes carecían totalmente de estas estructuras (ver Figura 14E y F;
Gonzalez-Martín et al., 2005). Además se había demostrado en estudios previos que ratones

86
 Resultados

de dos o tres semanas de edad, deficientes para el receptor de alta afinidad del BDNF, TrkB,
también carecen de corpúsculos de Meissner en la piel glabra de las extremidades posteriores
(Gonzalez-Martín et al, 2004). Ya que la diferenciación de estos receptores depende de su
inervación (ver revisión en Zelená et al., 1994), podemos concluir que la ausencia de
corpúsculos en los animales TrkB-/- y Bdnf-/- es debida a la pérdida de las neuronas sensoriales
aferentes a estos receptores.

Quisimos averiguar en nuestros mutantes nulos de BDNF, si se veía afectada la inervación

de los folículos pilosos de la piel. Ya que se conoce que la estructura de la piel y la inervación
de los folículos pilosos se completa antes del día 17 de vida postnatal (Peters et al., 2002),
realizamos comparaciones entre la inervación de los folículos pilosos de ratones Bdnf+/+ y Bdnf-
/- en P15 utilizando la inmunotinción para PGP 9.5 en cortes transversales de piel. Como se
puede observar en la Figura 14G, los folículos pilosos de los controles se encuentran rodeados
por una empalizada de terminales lanceolados orientados de forma longitudinal dentro del
complejo piloneural y por terminales nerviosos circunferenciales que rodean el pelo. Sin
embargo, como mostramos en la Figura 14H, en los pelos de protección de los mutantes se
observa una desorganización de los terminales circunferenciales y una fuerte pérdida en el
número de folículos pilosos que desarrollan terminales lanceolados. Estos datos demuestran
claramente que las neuronas sensoriales que dan lugar a los terminales lanceolados de la piel
pilosa dependen de BDNF.

Las neuronas con fibras de adaptación lenta están asociadas a complejos de células de
Merkel que se denominan touch dome. Los touch dome están considerados unidades
sensoriales que se localizan tanto en el estrato basal de la epidermis de la piel glabra como en
la base de los folículos pilosos de la piel pilosa y estudios previos indican que el número final
de estos receptores ya está determinado en el momento del nacimiento. Sin embargo, parece
ser que el número de células de Merkel que componen cada unidad aumenta hasta que el
animal alcanza la edad adulta (Nurse & Diamond et al, 1984). Por este motivo, es difícil
observar touch domes formados por más de tres o cuatro células de Merkel durante los
primeros 15 días postnatales y lo más frecuente es encontrar células únicas. Además se ha
descrito que, en el momento del nacimiento, prácticamente todas las células de Merkel están
ya inervadas por sus aferentes sensoriales (Pasche et al, 1990). Basándonos en estos datos
quisimos comparar los touch domes presentes en la piel de los ratones P15 Bdnf+/+ y Bdnf-/- y,
para ello, realizamos una doble inmunotinción con anticuerpos para PGP 9.5 y S100β en cortes
de criostato, de 10 µm de grosor, de manera que pudiéramos teñir las fibras inervantes con el
doble marcaje y las células de Merkel únicamente con PGP 9.5 (Fundin et al, 1997; LeMaster
et al, 1999). Cómo podemos observar en la Figura 14J, en la piel glabra de la extremidad
posterior de los ratones Bdnf-/- el número de touch dome por mm2 está reducido alrededor de
un 35-40% en relación a los controles (Figura 14I). El número de células de Merkel por unidad
sensorial también se reduce, de tal manera que si la proporción de agrupaciones de dos o más
células vs células únicas en los animales salvajes es de 1:3, en los animales deficientes para
BDNF llega a ser 1:9 (Figura 14). Y, por último, en la piel glabra también observamos una
reducción de la inervación de las células de Merkel: en los animales control, alrededor del 90%

87
Resultados

de los touch dome están inervados mientras que en los animales Bdnf-/- sólo lo están un 50%
(Figura 14I y J). En cuanto a la piel pilosa, se sabe que las células de Merkel están asociadas a
los complejos piloneurales de los folículos pilosos y lo que observamos fue que
aproximadamente el 50% de los folículos de cada sección presentaban células de Merkel
asociadas en los animales control mientras que sólo el 20% los presentaban en los animales
deficientes para BDNF (Figura 14G y H). Todos estos datos que muestran que los animales
Bdnf-/- tienen menos touch domes, menos células de Merkel y menos fibras de adaptación
lenta, implican que existe una subpoblación de neuronas sensoriales en los DRGs,
responsables de la percepción mecánica de adaptación lenta, que dependen de BDNF para su
supervivencia durante su desarrollo postnatal.

En resumen, todos estos resultados indican que el BDNF es necesario para la

supervivencia durante el desarrollo postnatal de diferentes mecanorreceptores cutáneos, con
inervación por aferentes mielínicos, tales como los corpúsculos de Meissner, los complejos
piloneurales o los complejos de células de Merkel denominados touch domes.

Neuronas sensoriales con fibras Aδ y C: nociceptores

Los aferentes amielínicos con fibras de tipo C inervan la epidermis en forma de

terminaciones libres (Lynn y Carpenter, 1982; Willis y Coggeshall, 1991) y, en los marcajes con
PGP 9.5 para medir la densidad de inervación general de la piel, observamos que el número de
fibras nerviosas libres, tanto en la piel glabra como en la piel pilosa, estaba reducido en los
animales Bdnf-/-. Además, los recuentos en los nervios de los animales Bdnf-/- indicaban una
pérdida significativa de fibras amielínicas. Con respecto a las fibras Aδ, existía la posibilidad de
que también estuvieran reducidas en número, dado el déficit en fibras mielínicas de los nervios
principales. Es difícil determinar con precisión una pérdida de fibras Aδ y C a nivel de la
epidermis ya que ambos tipos de fibras acaban en forma de terminaciones libres, por lo que su
posible cuantificación ya sea con impregnaciones argénticas o con tinciones
inmunocitoquímicas es dudosa. Sin embargo, las neuronas sensoriales que dan lugar a estas
fibras son las de menor tamaño en el ganglio y expresan algunos marcadores específicos que
permiten su análisis con facilidad. Dentro del conjunto de neuronas sensoriales pequeñas, se
pueden distinguir dos poblaciones de neuronas nociceptivas durante las dos primeras semanas
de desarrollo postnatal: 1) una población de neuronas que expresan TrkA, CGRP y SP, que
tienen fibras C o Aδ; 2) una población de neuronas que no contienen TrkA pero sí c-ret, que
tienen fibras C y son positivas cuando se marcan con la lectina IB4 (Averill et al., 1995; Silos-
Santiago et al., 1995; Bennett et al., 1998).

A fin de determinar con más precisión el efecto de la carencia de BDNF sobre neuronas de
los DRG con terminaciones libres en la piel analizamos el número de neuronas positivas para
CGRP o para IB4 en cortes a través del ganglio L5 en animales Bdnf+/+ y Bdnf-/- de P15. A esta
edad las dos poblaciones se encuentran bien definidas y la co-localización es muy baja, tal
como se muestra en la Figura 15G y H donde las neuronas CGRP positivas (rojo) y las IB4
positivas (verde) están presentes en ambos fenotipos. Sin embargo, la cuantificación de ambas
poblaciones prueba que existe una pérdida de aproximadamente el 40% de las neuronas
CGRP positivas y del 50% de las IB4 positivas en los animales mutantes, indicando así que
ambas poblaciones contienen una fracción de neuronas dependientes de BDNF para su

88
 Resultados

supervivencia (ver Figura 15). Estas dos poblaciones proyectan sus axones hacia el asta dorsal
de la médula espinal formando patrones diferentes de inervación en las láminas espinales: las
neuronas CGRP positivas proyectan hacia la lámina I y la zona exterior de la lámina II (lamina
IIo), mientras que las neuronas IB4 positivas proyectan principalmente hacia el interior de la
lámina II (lamina IIi) (Averill et al., 1995; Silos-Santiago et al., 1995; Mollivier et al., 1997; Zylka
et al., 2005). En cortes de criostato de 20 µm teñidos con anticuerpos para detectar CGRP y
con la lectina IB4 marcada, observamos que en los animales deficientes para BDNF, el patrón
de expresión de CGRP de las láminas I y IIo está reducido en área, las fibras presentan una
distribución desorganizada en relación con los animales control y, en particular, se produce una
pérdida de las fibras CGRP positivas presentes en el fasciculus gracile (Figura 15C y D), que
contiene las fibras colaterales ascendentes de las neuronas peptidérgicas (Kubota et al., 1988).
Del mismo modo, observamos que el área que ocupan las fibras marcadas con IB4 en la
lámina IIi, es más estrecha en los mutantes (Figura 15E y F).

Figura 15: Efecto de la falta de señalización de BDNF en la

inervación cutánea y en diferentes nociceptores.
(A, B) Inervación general de la piel glabra de la almohadilla
plantar en ratones de 15 días de edad, BDNF+/+ y BDNF-/-,
detectada por inmunomarcaje con anticuerpos frente a PGP9.5.
Podemos observar que llegan menos nervios y menos
terminaciones nerviosas libres (cabezas de flecha) a la
epidermis en los ratones BDNF-/-. (C, F) Secciones
transversales del asta dorsal de la médula espinal de los
ratones tipo salvaje y los animales mutantes de BDNF,
marcados con anticuerpos contra CGRP (C, D) o con la lectina
IB4 (E, F). Las zonas ocupadas por las fibras CGRP+ o IB4+ se
reducen en animales mutantes y los colaterales CGRP+ que
forman el fasciculus gracile, están ausentes en los ratones
mutantes de BDNF (flecha). (G, H) Secciones de DRGs que
muestran neuronas CGRP + (rojo) e IB4 + (verde). Las pocas
células con doble marcaje (amarillo, indicadas por las flechas)
están presentes en ambos genotipos. (I) El número de neuronas
CGRP+ o IB4+ disminuyen en los animales mutantes para
BDNF (n = 4). (** p <0,005, *** p <0,001). Barras de escala: A,
B, 10 µm; C-F, 100 µm; G, H, 40 µm.

Todos estos datos indican que una fracción de cada población se pierde en ausencia de la
neurotrofina BDNF y que, por lo tanto, BDNF es necesario para la regulación in vivo del número
de neuronas sensoriales nociceptivas durante el periodo postnatal, independientemente de su
modalidad funcional.

89
Resultados

1.3. Caracterización in vitro de la población de neuronas sensoriales nociceptivas

que depende de BDNF
Determinación del periodo de máxima dependencia trófica de las neuronas nociceptivas y
termoceptivas in vitro

Para determinar los requerimientos neurotróficos in vitro de los nociceptores durante el

periodo postnatal, cultivamos neuronas sensoriales de los DRGs obtenidos a partir de animales
de diferentes edades (P0, P2, P5, P8 y P15) en presencia de NGF, BDNF, GDNF o sus
diferentes combinaciones, siempre a concentraciones bajas de factores (10 ng/ml). Las
neuronas fueron extraídas del ganglio mediante disociación enzimática y mecánica y
posteriormente sembradas a baja densidad para evitar efectos paracrinos. Además, siempre se
detecta un cierto grado de supervivencia neuronal independiente de factores neurotróficos
exógenos que aumenta con la edad del animal hasta alcanzar su nivel máximo en P8, cuando
el número de neuronas que sobreviven en cultivo en ausencia de neurotrofinas es el mismo
que en cualquiera de las condiciones experimentales probadas (Figura 16A). De todas formas,
la morfología que desarrollan las células en presencia de cada factor neurotrófico es muy
diferente; por ejemplo, cuando las neuronas crecen en presencia de GDNF alcanzan un mayor
tamaño que cuando crecen en presencia de NGF o BDNF (Figura 16B).

Figura 16: Supervivencia in vitro de neuronas DRG postnatales tempranas en presencia de diferentes
factores de crecimiento.
(A) Supervivencia de las neuronas sensoriales disociadas de DRGs de tipo salvaje, en diferentes días después
de su nacimiento (P) y cultivadas durante 48 horas en presencia de 10 ng/ml de NGF, BDNF o GDNF, o en
ausencia de cualquier factor añadido ( 0 NT) (expresado como el porcentaje del número de neuronas adheridas
4 h después de la siembra). Obsérvese que la supervivencia independiente de factores neurotróficos, se
desarrolla progresivamente después del nacimiento. En todas las etapas, se obtiene la supervivencia máxima
en presencia de NGF. BDNF o GDNF solo permiten la supervivencia de una población relativamente pequeña
de neuronas sensoriales neonatales, pero en P2 y P5 el porcentaje de neuronas dependientes BDNF y GDNF
aumenta. P0, n = 3; P2, n = 12; P5, n = 3; P 8, n = 4 Los asteriscos indican significatividad ( * p <0.05, ** p
<0,005, *** p <0,001, **** p <0,0001). (B) Neuronas sensoriales de ratones P2 cultivadas en 10 ng / ml de NGF,
BDNFo GDNF y marcadas con anticuerpos anti-IIIb tubulina (verde). Barra de escala: 25 µm

90
 Resultados

Por lo tanto, decidimos centrar nuestro estudio en la primera semana después del
nacimiento del ratón. De forma coherente con estudios anteriores, el mayor porcentaje de
supervivencia cuantificada a las 48 horas in vitro (HIV), que fue de alrededor del 80% lo
obtuvimos cuando cultivábamos las neuronas de cualquier edad en presencia de NGF (Figura
17B y C). En neuronas obtenidas de ratones de P0 únicamente un pequeño porcentaje de
neuronas sobreviven en presencia de BDNF o GDNF pero, como podemos observar en la
Figura, el porcentaje aumenta progresivamente entre P2 y P5 con ambos factores tróficos lo
que indica que durante este corto periodo de tiempo, BDNF y GDNF adquieren in vivo la misma
relevancia para la supervivencia de neuronas sensoriales que, en el momento del nacimiento,
dependían exclusivamente de NGF. Estos resultados indican que entre P0 y P5 existe una
fracción de neuronas dependientes de NGF que únicamente expresan TrkA y otra fracción de
neuronas TrkA+ que aumenta progresivamente con la edad, desde aproximadamente el 10%
en P0 hasta el 40% en P5, que también expresan tanto componentes del complejo de GDNF,
como el receptor TrkB. Por tanto, las neuronas dependientes de NGF en el nacimiento se
hacen sensibles a BDNF y GDNF sin perder su respuesta a NGF en el periodo P0-P5. Además,
BDNF y GDNF parecen actuar sobre la misma población, dado que no se produce un efecto
aditivo en supervivencia cuando se combinan ambos factores (Figura 17A y ver también
Baudet, 2000).

Figura 17: Supervivencia in vitro de

neuronas DRG postnatales tempranas en
presencia de diferentes factores de
crecimiento.
(A-C) Supervivencia de las neuronas
sensoriales disociadas de DRGs de tipo salvaje
en P0, P2 yP5 y cultivadas durante 48 horas en
presencia de 10 ng / ml de NGF, BDNF o
GDNF, y en combinaciones de dos factores
tróficos (expresado como el porcentaje del
número de neuronas adheridas 4 H después de
la siembra). . P0, n = 3; P2, n = 12; P5, n = 3.
A) Las neuronas responden equitativamente
bien en presencia de GDNF y BDNF y sus
efectos no son aditivos, lo que sugiere que
estos dos factores actúan sobre la misma
población de neuronas, indicando que una
fracción de neuronas IB4+ pueden ser
rescatadas por BDNF. B) GDNF provoca un
aumento en la respuesta a supervivencia en ua
fracción de la población dependiente de NGF.
C) BDNF, igualmente, provoca un aumento en
la respuesta a supervivencia en ua fracción de
la población dependiente de NGF. * p <0.05, **
p <0,005, *** p <0,001, **** p <0,0001).

91
Resultados

Dado que nuestros cultivos indicaban que BDNF podía promover la supervivencia de una
fracción de neuronas sensoriales que eran, además, sensibles a NGF decidimos analizar la
expresión del receptor TrkB en nuestros cultivos. Cuando se cultivan las neuronas de animales
P2 durante 48 o 96 HIV en presencia de NGF, las marcamos con anticuerpos que detectan el
receptor TrkB de BDNF y analizamos cuál es la proporción de neuronas que expresan el
receptor frente al total de neuronas que sobreviven, se observa que aproximadamente el 50%
de las neuronas del cultivo son TrkB+ tras 48 HIV y que este porcentaje está incluso
aumentado a las 96 HIV (Figura 18A).

El hecho de que la proporción de neuronas sensoriales que responden a BDNF aumente

con el tiempo en los cultivos tratados con NGF sugiere la posibilidad de que la regulación de la
expresión TrkB esté controlada por NGF. Para comprobarlo, preparamos cultivos primarios de
neuronas neonatales de los DRGs y los mantuvimos 24 HIV en presencia de NGF para
asegurar la supervivencia neuronal durante el establecimiento y crecimiento inicial del cultivo.
Pasado este tiempo la neurotrofina fue eliminada mediante varios lavados con medio de cultivo
para asegurar la ausencia de trazas de la misma.

A continuación mantuvimos los cultivos en estado de deprivación trófica durante 12 horas,

seguidamente volvimos a lavar e inmediatamente procedimos a la estimulación de las
neuronas sensoriales con10 ng/ml de NGF durante diferentes períodos de tiempo (4, 8, 12 y 24
h; en dos cultivos independientes). Los niveles de ARNm de TrkB, según lo determinado por
RT-PCR, aumentaron progresivamente a medida que aumentaba la exposición a NGF (Figura
18B).

Figura 18: Expresión in vitro del receptor

TrkB.
(A) Porcentaje de neuronas que expresan
TrkB en cultivos de ratones postnatales de 2
días de edad, mantenidos durante 48 o 96
horas en presencia de 10 ng / ml de NGF. Un
porcentaje sustancial de neuronas cultivadas
en NGF expresó el receptor TrkB (n = 4). (B)
Estudio en el tiempo de la expresión del
mRNA de TrkB inducida por el tratamiento
de los cultivos con NGF, durante diferentes
periodos de tiempo y determinado por RT-
PCR. Control interno: β actina. * p<0.05.

92
 Resultados

Aunque en principio no serían descartables posibles efectos producidos por los cambios en
la supervivencia neuronal promovida por NGF en el incremento del ARNm de TrkB, hay que
resaltar que el aumento en los niveles de expresión de TrkB en relación a la situación control
sin NGF se observa tan solo 4 horas después de la estimulación con NGF, lo que sugiere que
la expresión de TrkB sí es modulada por la señalización de NGF.

Identificación de las subpoblaciones de neuronas nociceptivas y termorreceptivas que

dependen de BDNF

Para poder estudiar con más detalle cuales son las subpoblaciones que responden ante
cada factor neurotrófico, fijamos los cultivos que habíamos mantenido durante 48 HIV y los
procesamos para inmunofluorescencia utilizando anticuerpos para la proteína CGRP para
marcar la población TrkA+ y la lectina IB4 para identificar la población de neuronas no-
peptidérgicas, c-ret/FRAP+ (Averill et al., 1995; Silos-Santiago et al., 1995; Bennett et al.,
1998). En presencia de NGF la mayoría de neuronas que sobreviven en P0 son CGRP+ (75 ±
7%; n = 3 cultivos independientes) y sólo una fracción de ellas son IB4+ (39 ± 7%; n = 3
cultivos independientes). En P15 las poblaciones de neuronas CGRP+ e IB4+ están bien
separadas y el índice de co-localización es muy bajo (datos no mostrados), tal como sucede in
vivo (Figura 15G y H).

Como se puede observar en la figura, la presencia de NGF durante este periodo es

suficiente para la supervivencia de todas las neuronas cultivadas. Sin embargo, la comparación
de la contribución de los tres factores neurotróficos a la supervivencia entre P0 y P5 indica que
también BDNF y GDNF son capaces de mantener ambas poblaciones de nociceptores (Figura
19A) y que, por lo tanto, los DRGs durante este periodo perinatal contienen neuronas
peptidérgicas y no-peptidérgicas que expresan los tres receptores: TrkA, TrkB y Ret.

Figura 19: Supervivencia in vitro de

las neuronas de los DRGs de pequeño
diámetro, en presencia de diferentes
factores de crecimiento.
(A) Supervivencia de neuronas CGRP+ e
IB4+ aisladas de DRGs de ratones P0, P2
y P5 y cultivadas durante 48 horas en
presencia de 10 ng / ml de NGF, BDNF o
GDNF (expresado como el porcentaje del
número de neuronas adheridas a las 4 h
después de la siembra), n = 5. (B-D)
Doble tinción con anticuerpos CGRP
(rojo) y lectina IB4 (verde) en neuronas
cultivadas a partir de DRGs de ratones
P5, en diferentes condiciones de
factores de crecimiento. Barras de
escala: 50 µm.

93
Resultados

Por otro lado, la activación que provoca la presencia de cada neurotrofina tiene un efecto
muy diferente en el fenotipo de las neuronas, más allá de los cambios morfológicos descritos
en la Figura 16B. Las neuronas con doble marcaje CGRP/IB4 presentan una mayor expresión
del neuropéptido cuando crecen en presencia de NGF que en BDNF o GDNF (Figura 19B-D) y,
a pesar de que nuestros datos respaldan que BDNF y GDNF mantienen in vitro a las mismas
neuronas nociceptivas, las neuronas IB4+ que crecen en presencia de GDNF parecen tener un
tamaño mayor que las cultivadas en BDNF sugiriendo que el GDNF produce un efecto directo
sobre el tamaño neuronal (Moore et al., 1996; Luo et al., 2007).

P2 P5
Receptores IB4 CGRP Receptores IB4 CGRP
TrkA + + TrkA + -
TrkA/trkB - + TrkA/trkB - +
TrkA/c-ret + -
TrkA/trkB/c-ret + + TrkA/trkB/c-ret + +
c-ret + -

Tabla 4. Combinaciones de receptores en las neuronas sensoriales de tamaño pequeño.

Propuesta de combinación de receptores de factores tróficos, presentes en las neuronas IB4 o CGRP+ de los DRGs,
extraídos de animales P2 o P5, para justificar la supervivencia en cultivo con NGF, BDNF o GDNF.

Para justificar la supervivencia de neuronas IB4 o CGRP+, extraídos de DRGs de animales

P2 o P5 y crecidas en cultivo con NGF, BDNF o GDNF proponemos la siguiente combinación
de receptores de factores tróficos (Tabla 4).

1.4. Papel paracrino/autocrino de BDNF en el desarrollo postnatal de las

neuronas nociceptoras.
Los factores neurotróficos se expresan generalmente en los tejidos diana de las
neuronas sensoriales. Sin embargo, estudios previos han demostrado que también pueden
expresarse en los propios ganglios donde pueden ejercer efectos paracrinos y autocrinos
(Acheson et al., 1995). Ya que nuestros resultados in vitro demuestran que las neuronas
nociceptivas son capaces de sobrevivir en presencia de cualquiera de los tres factores,
examinamos mediante RT-PCR cuantitativa los niveles de expresión de NGF, BDNF y GDNF,
tanto en la piel pilosa de las extremidades posteriores como en los DRGs, en animales
neonatos, P8 y P15 (Figura 20A y B).

Los niveles de expresión de los factores son más bajos en la piel que en los DRG,
probablemente debido a que, tras completar la inervación periférica durante el desarrollo, la
expresión de los factores neurotróficos se reduce a células específicas de los receptores
sensoriales y no a todas las células epiteliales. Como cabría esperar, basándonos en los
estudios previos, en la piel, los niveles de ARNm de NGF son más altos en P0 y van
decayendo con la edad. En cambio, los ARNms de BDNF y GDNF también están presentes en
P0 pero en menor cantidad (Figura 20A y B), también decrecen durante el desarrollo postnatal

94
 Resultados

hasta alcanzar P15 donde GDNF aumenta de forma significativa respecto a BDNF y NGF. Sin
embargo, el nivel de expresión de los ARNms de BDNF en los DRG son marcadamente altos
en relación con sus propios niveles en la piel. Además, su expresión es mucho más elevada en
el momento del nacimiento y decrece progresivamente a lo largo del tiempo, aunque siempre
con niveles superiores a los otros dos factores neurotróficos.

Figura 20: Expresión del mRNA de NGF, BDNF y

GDNF en la piel y los DRGs y sus efectos
autocrinos / paracrinos.
(A) Se utilizó PCR en tiempo real para cuantificar la
expresión de NGF, BDNF y GDNF en muestras de
piel y DRGs de ratones recién nacidos (P0), de 8
días de edad (P8) y de 15 días de edad (P15). Los
gráficos muestran que en la piel se expresan
cantidades muy pequeñas de mRNA de cada
neurotrofina (A), mientras que se observan unas
cantidades especialmente altas en la expresión de
mRNA de BDNF en los DRGs de animales P0, que
van decreciendo progresivamente en P8 y P15 (B)
(n = 4). * p <0.05, ** p <0,005, *** p <0,001).

Esta expresión podría sugerir que algunas neuronas sensoriales dependen de BDNF producido
en el propio ganglio durante el desarrollo postnatal temprano. Para comprobar esta hipótesis
establecimos cultivos de DRGs de animales neonatos en presencia de NGF en
concentraciones de máxima supervivencia (10 ng/ml) y los mantuvimos durante 10 DIV
añadiendo PBS sólo, anticuerpos anti-BDNF para bloquear su función o una IgG irrelevante
como control. A continuación fijamos los cultivos y los procesamos para analizar la
supervivencia de las dos subpoblaciones de neuronas nociceptivas. Cómo podemos observar
en la Figura 21A y B, los anticuerpos bloqueantes reducen la supervivencia tanto de las
neuronas peptidérgicas (CGRP+) como la de las no-peptidérgicas (IB4+) y lo hacen en
proporciones similares a las obtenidas en los recuentos in vivo de los animales Bdnf-/-. Para
confirmar estos datos realizamos un segundo tipo de experimentos, en los que cultivamos
neuronas de DRGs de ratones Bdnf+ /+ y Bdnf-/ - neonatos y los mantuvimos en presencia de
NGF, BDNF o GDNF (10 ng/ml cada una) durante 48 HIV. Tras fijar los cultivos, analizamos los
resultados de supervivencia neuronal total y concluimos que, en presencia de BDNF, no se
observa ninguna diferencia significativa en la tasa de supervivencia entre ambos genotipos,
hecho coherente con que la administración exógena de la neurotrofina reemplaza la que las

95
Resultados

neuronas mutantes no poseen. Sin embargo, en presencia de NGF o GDNF, en los cultivos
mutantes se pierde una fracción de las neuronas que normalmente sobreviven en los cultivos
procedentes de animales de tipo salvaje (Figura 21C). Estos resultados indican que las
neuronas de los DRGs producen BDNF durante su crecimiento in vitro y que éste es necesario
para la supervivencia de las neuronas nociceptivas TrkA+/TrkB+/Ret+. Los datos también
sugieren que la ausencia in vivo de BDNF, que probablemente debía ser producido en los
propios ganglios, afecta directamente a la supervivencia de una fracción de las dos poblaciones
de nociceptores (peptidérgicos y no-peptidérgicos). Todo esto indica que existen neuronas que
dependen de NGF en el momento del nacimiento y que expresan BDNF necesario para la
supervivencia de las neuronas nociceptivas TrkA+.

Figura 21: Efectos autocrinos/paracrinos de BDNF.

(A) Histograma que muestra el porcentaje de supervivencia neuronal en experimentos independientes de neuronas
sensoriales de los DRGs, cultivadas en presencia de 10 ng/ml de NGF y tratadas simultáneamente con anticuerpos
anti-BDNF o con un IgG no relevante. Se puede observar que el bloqueo de BDNF reduce la supervivencia en NGF lo
que sugiere efectos autocrinos/paracrinos de esta neurotrofina NGF sobre neuronas-dependientes (n = 5). (B) Doble
tinción de los cultivos, con anticuerpos anti-CGRP (rojo) y lectina IB4 (verde), en las diferentes condiciones de
tratamiento. C) Histograma que muestra el porcentaje de nueronas que sobreviven en tres cultivos independientes en
los cuales neuronas sensoriales de los DRGs neonatales de animales Bdnf +/+ y Bdnf -/-, fueron cultivados en presencia
de 10 ng/ml de NGF, BDNF o GDNF, durante 48h. * p <0.05, ** p <0,005, *** p <0,001

96
 Resultados

2. La metaloproteasa MT5-MMP está implicada en la regulación de la inervación

cutánea nociceptiva neuro-inmune
2.1. MT5-MMP modula la inervación cutánea nociceptiva in vivo
Diversos estudios previos han demostrado que la metaloproteasa de membrana MT5-MMP se
expresa ampliamente en el sistema nervioso central y participa en procesos de guía axónica y
establecimiento de sinapsis durante el desarrollo embrionario y postnatal de mamíferos. Se ha
descrito también su implicación en la regulación del crecimiento neurítico de las neuronas de
los DRGs permitiendo a los axones la invasión de tejidos nuevos para poder alcanzar sus
dianas.

Figura 22. Modificación genética dirigida del gen MMP-MT5.

(A) Mapas de restricción de la región de interés del gen MT5-MMP (Mmp24) (arriba) y del constructo genético (abajo).
B, BamHI; RV, EcoRV; X, XhoI; X con X superpuesta, XhoI eliminado. (B) Análisis por Southern blot de los ratones
Mmp24 + / +, Mmp24+/-, y Mmp24 - / -. (C) Detección de ARNm de Mmp24 en el cerebelo por análisis Northern blot. El
tejido hepático se cargó como un control negativo. (D) Análisis de la activación de proMMP-2 mediante transfecciones
transitorias de los cDNA completos de Mmp24 de tipo salvaje y de la forma truncada ∆MT5-MMP, obtenida a partir de
cerebelo del ratón mutante nulo.

En este trabajo de tesis doctoral hemos querido profundizar en este segundo punto y, para
ello, inicialmente realizamos un estudio histológico de la expresión de la metaloproteasa MT5-
MMP en los ganglios L4 y L5 de la raíz dorsal de ratones postnatales y adultos, en cortes de
criostato de 20 µm de grosor y usando anticuerpos específicos anti-MT5-MMP. Nuestros
inmunomarcajes indicaban la presencia de un número significativo de neuronas en los DRGs
que expresan esta metaloproteasa de membrana (Figura 23A). Para examinar con más detalle
su expresión en la población de neuronas sensoriales nociceptivas realizamos dobles marcajes
con anticuerpos anti-CGRP o con la lectina IB4 y observamos que la expresión de MT5-MMP
estaba restringida a la población peptidérgica dependiente de NGF, ya que no observamos
niveles detectables de proteína en la población no-peptidérgica (Figura 23B-C). Por tanto, los
nociceptores peeptidérgicos expresan la metaloproteasa.

97
Resultados

Figura 23. Expresión MT5-MMP e hiperinervación de la piel en las almohadillas plantares y en la lengua de los
ratones de tipo salvaje y deficientes en Mmp24.
(A, B, C) Secciones de DRGs lumbares, inmuno-teñidas
para detectar MT5-MMP (rojo), sólo (A) o en combinación
con anticuerpos para CGRP (B) o con la lectina IB4 (C)
(verde). Obsérvese que las neuronas MT5-MMP+ son
CGRP+ pero no IB4+. (D, E) Micrografías confocales que
muestran la inervación de la epidermis y la dermis superior,
en lugares comparables de las almohadillas plantares de
ratones adultos Mmp24 + / + y Mmp24- / -, tal como se muestra
por doble inmunofluorescencia con anti-CGRP (verde) y anti-
PGP9.5 (rojo). La estructura del tejido es revelada por el
marcador histoquímico fluorescente de DNA, TOPRO-3
(azul). Las líneas discontinuas indican el límite entre la
dermis superior (d) y la epidermis (e), y la superficie de la
piel. Las puntas de flecha indican ejemplos de terminaciones
nerviosas libres (FNEs) en la epidermis, que sólo están
marcadas con anticuerpos anti-PGP9.5. Las flechas señalan
las FNEs finas que también están marcados con anticuerpos
anti-CGRP. Obsérvese que la densidad global de inervación
aparece aumentada en la piel mutante y que la epidermis de
los ratones mutantes contiene más terminaciones nerviosas
libres CGRP+. (F) Cuantificación de la inervación en la
epidermis de las almohadillas plantares de ratones Mmp24
+/+
y Mmp24 - / -. Debido a que la piel de ambos genotipos no
difiere en el espesor de la epidermis (véase el texto), los
análisis cuantitativos se llevaron a cabo en tres cuadrículas,
de ancho fijo por sección, en cuatro secciones por animal y
se obtuvo la media de cada parámetro. Se muestra la media
de FNEs / mm ± SEM de tres ratones de cada genotipo. Los
parámetros analizados fueron el número de PGP9.5 + y
CGRP + FNE. Nótese que la densidad de inervación general
epidérmica y de fibras CGRP +, en particular, aumentan. (G,
H) Secciones representativas de la piel de la almohadilla
plantar de ratones Mmp24 + / + y Mmp24 - / -, marcados para la
detección de PGP9.5 usando inmunoperoxidasa, que
muestran la extensión lateral que pueden alcanzar algunas
fibras de la epidermis de mutantes (H), algo que nunca se ha
observado en la piel de los animales de tipo salvaje (G). La
línea discontinua indica la superficie de la piel. (I, J)
Micrografías confocales que muestran la inervación de la epidermis lingual en ratones adultos Mmp24 + / + y Mmp24 - /
- mediante inmunofluorescencia con anticuerpos anti-PGP9.5 (verde). La estructura del tejido es revelada por el
marcador histoquímico fluorescente de DNA, TOPRO (azul). Se puede observar que la epidermis lingual también está
hiperinervada por las FNEs en el mutante. Barras de escala: A, 50 µm; B, C, 25 µm; D, E, 40 µm; G, H, 10 µm; I, J, 30
µm.

Se decidió entonces comprobar qué papel juega MT5-MMP en el desarrollo de las vías
nociceptivas. Para ello, caracterizamos una cepa de ratones mutantes nulos en los que se
había delecionado el dominio catalítico y parte del dominio hemopexina del gen que codifica
para la proteína MT5-MMP (Figura 22); cepa generada en el laboratorio de Dr. Carlos Lopez-
Otin). El estudio inicial de esta cepa de ratones mostró que la MT5-MMP no era esencial para
el desarrollo embrionario ni para la viabilidad de los ratones. Sin embargo, los estudios de
comportamiento realizados en el laboratorio del Dr. Lopez-Otín indicaban que los animales
mutantes Mmp24 mostraban una mayor respuesta ante un estímulo nociceptivo térmico de tipo
agudo pero no ante estímulos nociceptivos mecánicos o en ensayos de control de la actividad
motora. Más aún los animales deficientes en MT5-MMP mostraban un comportamiento
anómalo en paradigmas de dolor inflamatorio (ver más adelante; Folgueras et al., 2009).

98
 Resultados

A fin de analizar la hiperalgesia térmica basal de los mutantes Mmp24 realizamos un

estudio histológico de la piel de las patas traseras de los ratones adultos para caracterizar la
inervación de las neuronas nociceptivas. A pesar de que la piel de los mutantes parecía
histológicamente normal (grosor epidérmico: 45.6 ± 1.3 µm en Mmp24+/+ y 45.8 ± 3.1 µm en
Mmp24-/- ; n = 3 animales por genotipo), el análisis inmunohistoquímico de la inervación general
de la piel determinado con anticuerpos que detectan la proteína neuronal general PGP 9.5 o
CGRP, como proteína específica de fibras nociceptivas peptidérgicas, mostró en ambos casos
que la densidad de los terminales libres de la epidermis está significativamente aumentada en
los mutantes de Mmp24 (Figura 23D y E). Mediante un análisis más exhaustivo de los
terminales libres observamos que, en los animales mutantes, las fibras PGP 9.5+ o CGRP+, no
sólo son más numerosas sino que individualmente están más ramificadas y que muchas de sus
ramificaciones secundarias se extienden paralelas a la superficie de la piel a diferencia de los
animales salvajes que jamás muestran este fenotipo (Figura 23G y H).

Para discernir entre las dos principales poblaciones de nociceptores realizamos dobles
marcajes para PGP 9.5 y CGRP, ya que la marca de las fibras IB4 no se distingue con claridad
en la epidermis por cuestiones técnicas (Rice et al., 1993). Los resultados indican que es la
población PGP 9.5+/CGRP+ y no la PGP 9.5+/CGRP-, la que incrementa su densidad en la
epidermis y esto es coherente con la ausencia de expresión de la proteína MT5-MMP en las
neuronas IB4+ de los DRGs (Figura 23F). Para comprobar si el fenotipo era exclusivo de los
ganglios espinales o si por el contrario era un fenotipo periférico general decidimos analizar
otros ganglios sensoriales. Como ejemplo representativo de la inervación nociceptiva de un
ganglio craneal estudiamos los terminales libres de las neuronas del ganglio trigémino que
inervan la epidermis de la lengua con anticuerpos anti-PGP 9.5 y observamos que también
presentan hiperinervación en los animales mutantes de Mmp24 (Figura 23I y J), sugiriendo que
la proteína MT5-MMP es esencial para determinar el tamaño del campo receptivo de las
neuronas nociceptivas cutáneas.

2.2. MT5-MMP no está implicada en la supervivencia de las neuronas

nociceptivas
La sobre-expresión en la piel de NGF o de otros factores neurotróficos miembros de la
familia de GDNF, produce un aumento en el número de neuronas nociceptivas de los DRGs así
como de la hipertrofia de las fibras nociceptivas de la epidermis o aumento en la respuesta al
dolor térmico (Malin et al., 2006; Stucky et al. 1999). Para comprobar si nuestro fenotipo de
hiperalgesia térmica o de hipertrofia en las fibras nociceptivas en los mutantes para Mmp24 era
consecuencia de una alteración en el tamaño de la población de neuronas nociceptivas,
analizamos los ganglios lumbares de la raíz dorsal L4 y L5 de animales adultos ya que son los
principales responsables de la inervación de la piel de las extremidades posteriores del ratón.

El estudio histológico de los ganglios se hizo sobre cortes de criostato de 10 µm de grosor

que posteriormente se tiñeron con anticuerpos anti-CGRP o con la lectina IB4 para detectar las
principales poblaciones de nociceptores y determinamos que cualitativamente no se
apreciaban diferencias en el número de neuronas nociceptivas CGRP+ o IB4+, así como en el

99
Resultados

tamaño total del ganglio en los animales mutantes para Mmp24 comparado con los animales
de la cepa salvaje. Para realizar un análisis más exhaustivo y cuantificar de forma precisa el
número de neuronas, realizamos cortes semifinos y ultrafinos en las raíces dorsales (DR) de
ganglios L4 de animales adultos Mmp24+/+ y Mmp24-/- y calculamos el número total de fibras
mielínicas y amielínicas (Figura 24 A-D). Concluimos que no existían diferencias entre los
genotipos (Mmp24+/+: 1605 ± 100 y Mmp24-/-: 1762 ± 99 en fibras mielínicas (Figuras A y B);
Mmp24+/+: 7276 ± 1285 y Mmp24-/-: 6430 ± 1191 en fibras amielínicas (Figuras C y D); n = 3
animales por genotipo). Estos datos indican que MT5-MMP no está implicada en la
supervivencia in vivo de las neuronas sensoriales de los DRGs, incluyendo a las poblaciones
de neuronas nociceptivas CGRP+ e IB4+ que poseen fibras amielínicas y que inervan la piel.

Figura 24. Análisis de fibras mielínicas y amielínicas en L4 raíces dorsales de ratones adultos Mmp24 - / -.
(A, B) Secciones transversales de 1 micras de espesor en resina, de la raíz dorsal L4 de ratones adultos Mmp24+ / + y
Mmp24 - / -, teñidas con azul de toluidina, que muestran las fibras sensoriales mielinizadas. Micrografías electrónicas (C,
D) de las mismas raíces que ilustran la apariencia de las fibras C no mielinizadas. Barras de escala: A, B, 10 µm; C, D,
1 µm.

Otra explicación para el fenotipo de hiperalgesia e hipertrofia en las fibras nociceptivas de

los ratones mutantes Mmp24-/-, podría ser la existencia de una mayor ramificación de las
neuronas sensoriales de los DRGs en la médula espinal, que pudiera aumentar sensibilidad del
animal a estímulos nociceptivos térmicos, a nivel del sistema nervioso central. Para ello
comprobamos si las fibras sensoriales CGRP+ de proyección central abarcaban un área mayor
en las láminas I y II del asta dorsal mediante la inmunotinción de cortes coronales de la médula
espinal de ratones Mmp24+/+ y Mmp24-/- con anticuerpos que reconocían las proteínas CGRP y
neurofilamento 160 kDa (Figura 25 A-D). A continuación medimos el área que ocupaban las
fibras nerviosas CGRP+ que además eran negativas para neurofilamento 160 kDa y
normalizamos con el área total de la sección coronal de la médula. Los resultados indicaron

100
 Resultados

que, a pesar del hecho de que las fibras sensoriales CGRP+ son capaces de hiperinervar la
piel en los ratones mutantes, su patrón de proyección central a la médula espinal es normal y
cuantitativamente similar a la proyección de las fibras de ratones de cepa salvaje (Figura 25 A -
E).

Figura 25. El crecimiento normal del CGRP mutante + fibras centrales en la médula espinal.
(A-D) Micrografías fluorescentes que muestran las astas dorsales en secciones coronales de la médula espinal de
ratones adultos Mmp24 + / + y Mmp24 - / - inmunotieñidos para el neurofilamento 160 kDa (NF-160) y CGRP. Obsérvese
que en general, el área ocupada por las fibras nerviosas finas CGRP+, procedentes de neuronas sensoriales
nociceptivas MT5-MMP +, están prácticamente desprovistas de fibras gruesas NF160 +. No se observan diferencias en
la presencia o en el área ocupada por las fibras peptidérgicas. (E) Histograma que muestra la cuantificación del área
(en mm2) ocupada por las terminaciones nerviosas CGRP+, medido en tres animales adultos independientes por
genotipo. Nótese que las fibras deficientes Mmp24 CGRP+, no hiperinervan la médula espinal, a pesar de ser capaces
de tener un crecimiento más extenso en los territorios de la piel. Barras de escala: A-D, 50 µm.

Una vez estudiado el fenotipo de proyección central, también quisimos contrastar la

posibilidad de que la hipertrofia de las fibras CGRP+ en la epidermis pudiera ser consecuencia
de una mayor señalización de NGF a través de su receptor de alta afinidad TrkA. En primer
lugar comparamos la cantidad de ARNm de Ngf que se producía en la piel de animales
postnatales y comprobamos por RT-PCR que no existían diferencias significativas entre
genotipos (Ngf/β-actin ratio: 1.49 ± 0.11 en ratones Mmp24+/+ y 1.27 ± 0.13 en ratones Mmp24-/-
; n = 3 por genotipo). Además, los ensayos in vitro realizados con animales neonatales, donde
la mayoría de las neuronas sensoriales de los DRGs responden a NGF (Molliver et al., 1997;
Baudet et al., 2000), demuestran que tras 48 HIV no se aprecian diferencias significativas en la
supervivencia de las neuronas sensoriales cultivadas en diferentes concentraciones de NGF,
ya sean submáximas (0, 0.1, 1 ng/ml) o máximas (10 ng/ml) (el porcentaje de supervivencia
neuronal en 10 ng/ml de NGF a las 48 horas, relativo al número total de neuronas presentes en
el mismo pocillo 6 horas después de la siembra celular: Mmp24+/+, 61.0 ± 3.3 %, n = 7; Mmp24-
/-
, 58.0 ± 7.1 %, n = 6 cultivos independientes). Este resultado indicaba que la viabilidad de esta
población de nociceptores en respuesta a NGF no está afectada por la ausencia de la
metaloproteasa y, dado que in vivo la mutación tampoco altera el número de neuronas

101
Resultados

sensoriales nociceptivas, podríamos concluir que la carencia de MT5-MMP en la piel produce

una mayor ramificación de las fibras termonociceptivas de tipo C.

2.3. MT5-MMP modula el crecimiento neurítico in vitro

Para evaluar si la hiperinervación de la piel en los animales mutantes de Mmp24 era
consecuencia de la ausencia de la actividad proteasa en las neuronas sensoriales, realizamos
co-cultivos de explantes de piel normal, extraída de las almohadillas plantares de las
extremidades traseras del ratón, junto con DRGs Mmp24+/+ o Mmp24-/- aislados de ratones de
tres semanas de edad. Los co-cultivos se realizaron en membranas de 0.4 µm de diámetro de
poro pre-tratadas con Matrigel, para favorecer la adhesión de ambos tejidos, insertos en
pocillos de cultivo de tal forma que el explante de piel permaneciera en contacto con el medio
pero sin sumergirlo en profundidad, ya que el carácter impermeable del tejido epidérmico
dificulta su inmersión en el medio. Los co-cultivos se mantuvieron durante 6 días in vitro (DIV),
para asegurar que las neuritas sensoriales llegaran a contactar con el tejido cutáneo.
Transcurrido este tiempo se fijaron los co-cultivos y se empleó la tinción con anticuerpos anti-
beta-III-tubulina como marcador neuronal específico. En los co-cultivos en los que ambos
tejidos eran de genotipo silvestre observamos que las neuritas de los DRGs se aproximan al
explante de piel pero en ningún caso se produce la invasión del tejido dérmico (Figura 26A).
Sin embargo, las neuritas procedentes de ganglios Mmp24-/- invaden el tejido dérmico y son
capaces de ramificarse extensamente por todo el tejido cutáneo (Figura 26B). Estos resultados
sugieren que la pérdida de MT5-MMP en las neuronas sensoriales de los DRGs altera el
crecimiento de sus neuritas en la piel.

Figura 26. Fenotipo de las neuritas de las neuronas sensoriales de ratones mutantes de Mmp24 en co-cultivo
de explantes de DRGs y piel.
(A, B) Co-cultivos de explantes de DRGs aislados de ratones Mmp24 + / + y Mmp24 - / - de tres semanas de edad con
fragmentos aislados de piel de tipo salvaje, después de seis días in vitro. Las neuritas están marcadas con una
inmunotinción para tubulina neuronal β-III (verde) y el tejido se tiñó con marcador nuclear DAPI. Barras de escala: a, b,
200 µm.
.

102
 Resultados

A continuación intentamos determinar si el fenotipo de hiperinervación epidérmica de los

animales Mmp24-/- era la consecuencia de un mayor crecimiento neurítico en sus neuronas
nociceptivas. Para ello realizamos cultivos primarios de neuronas sensoriales disociadas a
partir de los DRGs de animales neonatales Mmp24+/+ o Mmp24-/- (Figura 27). Cultivamos las
neuronas sobre diferentes sustratos de adhesión (laminina, poli-D-lisina, colágeno tipo IV,
Matrigel o gelatina) y en presencia de 10 ng/ml de NGF durante 48 HIV. Tras este periodo de
tiempo fijamos las neuronas y las marcamos con anti-beta–III-tubulina para poder identificar
con claridad su citoesqueleto. En todas las condiciones observamos que las neuronas de los
animales mutantes mostraban una mayor ramificación de sus neuritas (Figura 27A). Para
cuantificar la complejidad de la ramificación de las células, seleccionamos las neuronas
sembradas sobre colágeno y analizamos 100-150 neuronas por cada cultivo independiente.
Cuantificamos, mediante análisis de imagen, el número de neuritas primarias y secundarias y
determinamos que los cultivos obtenidos a partir de los animales mutantes MMp24-/-
presentaban un incremento significativo del numero de neuronas NGF-dependientes que tenían
más neuritas secundarias y, por lo tanto, una mayor arborización (Figura 27A-D y 28A). En
general, esta mayor arborización estaba asociada a un incremento en el número de
varicosidades a lo largo de las neuritas.

Figura 27. Fenotipo de las neuritas de las neuronas sensoriales mutantes de Mmp24.
(A, B) Neuronas de DRGs neonatales aisladas de ratones Mmp24 + / + y Mmp24 - / - sembradas en placas con
colágeno, se cultivaron durante 2 días en presencia de 10 ng / ml de NGF, fijadas e inmunoteñidas con anticuerpos
frente a la tubulina neuronal. Se observa que las neuronas Mmp24 - / - están más profusamente ramificadas. (C, D)
Dibujos de varios ejemplos de neuronas Mmp24 + / + y Mmp24 - / - para ilustrar los cambios en la morfología

Las varicosidades de las neuritas están asociadas a los procesos de elongación o

retracción del cono de crecimiento como consecuencia de la despolimerización de los

103
 Resultados

microtúbulos del citoesqueleto durante la neuritogénesis (Jacobs et al., 1986; Ahmad et al.,
2000); además, se había descrito previamente la presencia de la proteína MT5-MMP en el
cono de crecimiento axónico de neuronas en cultivo (Hayashita- Kinoh et al., 2001; Monea et
al., 2006), datos que sugieren la implicación de esta metaloproteasa en la regulación del
comportamiento del cono axónico. También acorde con estos resultados, observamos que
nuestros cultivos Mmp24-/- presentaban mayores proporciones de conos de crecimiento con
múltiples filopodios que, a su vez mostraban abundantes expansiones finas a modo de nuevos
crecimientos axónicos, cuando se los comparaba con los cultivos Mmp24+/+ (12.8 ± 2.2% conos
de crecimiento complejos en Mmp24+/+ vs 35.7 ± 4.3% en Mmp24-/-; n = 3 cultivos
independientes por genotipo, P < 0.05; Figura 28B y C). Cuando marcamos las neuronas
nociceptivas con anticuerpos anti-CGRP o con la lectina IB4, para distinguir entre las dos
poblaciones principales de nociceptores térmicos, observamos que los cambios en el patrón de
ramificación que acabamos de describir se producían en la población CGRP+ pero no en la
IB4+ (Figura 28D y E). Todo esto sugería que la hipertrofia de las fibras nerviosas CRGP+ que
se observaba en la piel intacta de los animales mutantes es consecuencia de un proceso
autónomo celular de mayor actividad neuritogénica.

Figura 28. Medida del crecimiento neurítico en las neuronas sensoriales Mmp24.
(A) Cuantificación de los números relativos de neuronas por neuronas inmunoteñidas con el marcador neuronal
tubulina en función de su producción de neuritas secundarias, en cultivos Mmp24+ / + y Mmp24- / -.Las neuronas
mutantes están más ramificadas, como se refleja por
el aumento significativo de los porcentajes de
neuronas mutantes Mmp24- / - que entran dentro del
rango de “más de 40 neuritas secundarias”,
comparado los tipos silvestres (n = 3 cultivos
independientes por genotipo; 100-150 neuronas
registradas por cultivo; ***, P <0,001). (B) Los
ejemplos representativos de la alteración en la
morfología de las neuritas Mmp24-/- en crecimiento, en
el punto de bifurcación, caracterizado por extensiones
de membrana. (C) Neuronas de los DRGs neonatales,
aisladas de ratones Mmp24 + / + y Mmp24 - / - ,
sembradas en placas con colágeno y cultivadas
durante 2 días en presencia de 10 ng / ml de NGF,
fijadas e inmunoteñidas con anticuerpos frente a
CGRP. Las neuronas nociceptivas peptidérgicas en
cultivos de mutantes estaban ramificadas más
profusamente y sus conos de crecimiento
presentaban morfologías anormales caracterizadas
por filopodios supernumerarios (inserciones). Barra de
escala (B-C,): 25 µm

104
 Resultados

2.4. MT5-MMP está implicada en la respuesta al dolor térmico agudo

Basándonos en los resultados previos del laboratorio del Dr. López-Otín en colaboración
con el laboratorio de farmacología del Dr. Luis Menéndez, que indicaban que los animales
mutantes mostraban una mayor respuesta ante un estímulo nociceptivo térmico de tipo agudo
(Anexo: Folgueras et al., 2009), quisimos comprobar si esta respuesta era un mecanismo
autónomo celular.

El receptor vaniloide TRPV1 o VR1, es un canal de cationes no selectivo que participa en

la señalización del dolor térmico. VR1 es capaz de detectar señales físicas o químicas que
desencadenan la apertura del canal y, de esa manera, la afluencia de iones Ca2+ al interior de
la célula. VR1 se activa a 43 ºC de temperatura pero también mediante la unión a capsaicina,
una molécula extraída de la guindilla que pertenece a la familia de los capsaicinoides (Caterina
et al., 1997). Para analizar la respuesta de las neuronas sensoriales al dolor agudo realizamos
ensayos de movilización del Ca2+ intracelular a tiempo real, mediante pulsos cortos de
capsaicina en cultivos de neuronas sensoriales disociadas de DRGs neonatales. Los registros
de flujo de Ca2+ mostraron que tras un único estímulo de 20” con capsaicina 300 nM, en los
cultivos Mmp24-/- respondían un 40% más de neuronas que en los normales (37.8 ± 5.0 % de
neuronas en Mmp24+/+, n = 5, vs 66.2 ± 1.4 % en Mmp24-/-; n = 3; P < 0.01). Ya que una
posible explicación podría ser que MT5-MMP regulara el receptor de capsaicina, comparamos
los niveles de TRPV1 en DRGs y en BMMCs (ver apartado Mmp24-/- y Mmp24+/+ sin detectar
ningún cambio aparente ni en la cantidad ni en procesamiento de la proteína (Figura 29A y B).

Figura 29. Los niveles normales de TRPV1 en neuronas sensoriales y mastocitos deficientes en Mmp24.
(A) Llisados de los DRGs aislados de ratones adultos Mmp24 + / + y Mmp24 - / - analizados por SDS-PAGE y Western
blot con anticuerpos contra el dominio intracelular N-terminal del receptor de la capsaicina, TRPV1, y para β-actina que
se usa como control de carga. (B) Lisados de BMMCs adultos, Mmp24 + / + y Mmp24 - / -, analizados por SDS-PAGE y
Western blot con anticuerpos contra el dominio intracelular N-terminal del receptor de la capsaicina TRPV1 y para β-
actina que se usa como control de carga. Se observa que no hay cambios aparentes en los niveles del receptor de la
capsaicina.

2.5. MT5-MMP modula el procesamiento de la N-cadherina

Nuestros datos indican que las neuronas sensoriales mutantes de Mmp24 tienen alteraciones
en el crecimiento neurítico caracterizado por una mayor ramificación en la piel y que su fenotipo
se mantiene in vitro indicando que se trata de un mecanismo autónomo celular. Estudios
previos muestran que la actividad enzimática de MT5-MMP es capaz de procesar a la molécula
de adhesión N-cadherina cuando ambas son sobre-expresadas en células heterólogas,

105
Resultados

generando un fragmento C-terminal de bajo peso molecular (≈35 kDa) (Monea et al., 2006). Así
mismo, se ha demostrado que la N-cadherina juega un papel importante en la estabilización de
las ramificaciones de las neuritas y que el aumento de la β-catenina que interacciona con ella
en el citoplasma desencadena la formación de árboles neuríticos hipertróficos en neuronas
hipocampales en cultivo (Yu y Malenka et al., 2003; Ye y Jan et al., 2005). Estos resultados
sugerían una posible interacción de ambas moléculas en nuestro sistema para regular la
neuritogénesis.

Figura 30. Aumento de los niveles de N-cadherina en ausencia de MT5-MMP.

(A, C) Neuronas de los DRGs aisladas de ratones Mmp24 + / + (A) y Mmp24 - / - (C) sembradas sobre colágeno en placas
y cultivadas durante 2 días en presencia de 10 ng/ml de NGF, fijadas y marcadas con anticuerpos para tubulina
neuronal (rojo) y N-cadherina (verde). Se observa que los focos de expresión N-cadherina son más abundantes en las
neuritas de neuronas mutantes. El recuadro muestra un tramo de una neurita marcada a mayor aumento. (B, D)
Neuronas neonatales de los DRGs aisladas de ratones Mmp24 + / + (B) y Mmp24 - / - (D) sembradas sobre colágeno en
placas y cultivadas durante 2 días en presencia de 10 ng/ml de NGF, fijadas y marcadas con anticuerpos para N-
cadherina (verde) y de β-catenina (rojo). Se observa que los axones de las neuronas mutantes exhiben una mayor
inmunorreactividad. En el recuadro se observa un tramo de una de las neuritas marcada con un mayor aumento, que
muestra co-localización en varicosidades. Barras de escala: A-D 20 µm.

Para comprobarlo, realizamos, en primer lugar, un análisis inmunocitoquímico en cultivos

de ambos genotipos y observamos que las neuronas Mmp24-/- exhibían más agregados de N-
cadherina a lo largo de sus neuritas que las neuronas de genotipo silvestre (Figura 30A y C).
Ya que esta diferencia podía ser una consecuencia de la mayor ramificación de las neuritas de
las neuronas mutantes, realizamos un análisis del procesamiento de la N-cadherina mediante
western blot en homogenados obtenidos a partir de explantes de DRGs adultos de ambos
genotipos, cultivados durante 6 días para favorecer una elevada neuritogénesis. Los resultados
mostraban una reducción significativa en los niveles de varios fragmentos intracelulares C-
terminales en las muestras procedentes de ratones Mmp24-/- y un aumento en la forma
completa de la N-cadherina (Figura 31A). Además, observamos un aumento en los niveles de
la proteína β-catenina en las neuronas mutantes tanto por western blot como por
inmunocitoquímica (Figuras 30B, D y 31A), consecuente con los datos previos ya que una
mayor presencia de forma completa de N-cadherina en la membrana citoplasmática impediría
su degradación.

106
 Resultados

Figura 31. Reducción en el procesamiento de N-cadherina y aumento de los niveles de β-catenina en neuronas
sensoriales y mastocitos deficientes en Mmp24.
(A) Lisados de explantes de DRG adultos analizados por SDS-PAGE y Western blot con un anticuerpo para el dominio
intracelular de N-cadherina. (A) Se puede observar en ambos genotipos tanto la proteína completa (135 kDa) como
varios de los fragmentos intracelulares de N-cadherina, pero los niveles de los fragmentos intracelulares escindidos,
CTF2 y CTF50 kDa, se reducen significativamente (en relación con β-actina) en células aisladas a partir de ratones
mutantes comparados con los de los animales de tipo salvaje, mientras que los niveles de la forma completa se
incrementa en las muestras mutantes (n = 4-7 experimentos independientes). Los niveles de catenina se
incrementan significativamente en las neuronas mutantes en relación con tipos salvajes (n = 4). (B) Lisados de
BMMCs cultivadas analizados por SDS-PAGE y Western blot con un anticuerpo para el dominio intracelular de N-
cadherina. Al igual que en las neuronas de los DRG,) los niveles de N-cadherina completa (135 kD) se incrementan
significativamente (en relación con -actina) en las células de los ratones de mutantes en comparación con los de los
animales de tipo salvaje, mientras el nivel de varias formas escindidas se incrementan en las muestras salvajes (n = 3
experimentos independientes). Los niveles de -catenina también se incrementan significativamente en las BMMCs de
mutantes en relación con tipos silvestres

3. La metaloproteasa MT5-MMP está relacionada con la interacción entre los

mastocitos y las fibras nerviosas nociceptivas.

Las neuronas sensoriales peptidérgicas CGRP+ participan en la potenciación de la

respuesta nociceptiva durante los procesos inflamatorios de la piel. Los estudios de
comportamiento realizados en el laboratorio del Dr. Lopez-Otín indicaban que los animales
mutantes de Mmp24 no solo mostraban una mayor respuesta ante un estímulo nociceptivo
térmico de tipo agudo sino que, sorprendentemente, tras la inducción de un proceso
inflamatorio mediante la inyección intraplantar de carragenina, los animales mutantes carecían
de respuesta hiperalgésica a estímulos térmicos.

Basándonos en estos resultados decidimos analizar los mecanismos celulares que regulan
la sensibilización periférica durante los procesos inflamatorios. Se ha descrito que, a pesar de
que la propia neurotrofina NGF es capaz de sensibilizar a los nociceptores de una forma
autónoma celular, este efecto hiperalgésico se reduce en gran medida evitando la
desgranulación de los mastocitos presentes en este entorno inflamatorio, mediante la
aplicación de un compuesto específico denominado 48/80. Esto sugiere que los mastocitos son
necesarios para permitir que el NGF tenga un efecto completo sobre los terminales
nociceptivos (Lewin et al., 1994; Rueff y Mendell, 1996). Por lo tanto, decidimos analizar las
características y la dinámica de los mastocitos presentes en muestras de piel de animales
Mmp24-/- y Mmp24+/+ y su interacción con los terminales nerviosos nociceptivos.

107
Resultados

3.1. MT5-MMP está implicada en la regulación del proceso de “de-granulación” de

los mastocitos
Para determinar un posible fenotipo histológico en los animales mutantes, comparamos la
piel de las almohadillas plantares de animales Mmp24-/- y Mmp24+/+ mediante observación de
cortes de 2 µm de tejido previamente incluido en resina epoxi y posteriormente teñido con azul
de toluidina (Figura 32A y B); de esta manera, la metacromasia propia de los mastocitos nos
permitió observar en el microscopio óptico que, aparentemente, no existían diferencias en el
número de células cebadas teñidas con el colorante entre las muestras de ratones de cepa
salvaje y las de ratones mutantes a pesar de la presencia de un mayor número de fibras
nerviosas peptidérgicas (Figura 32 A y B). A continuación seleccionamos cortes y regiones
equivalentes entre ambos genotipos y obtuvimos cortes ultrafinos de 60 nm a partir de los
cortes semifinos de 2 µm de grosor para poder observar la ultraestructura de la piel en el
microscopio electrónico de transmisión (Figura 32C y D). Esto nos reveló que, en realidad,
existía una mayor cantidad de mastocitos en la piel mutante que no podríamos haber
observado en el microscopio óptico mediante la tinción metacromática ya que las células
habían iniciado o culminado su proceso de “de-granulación” (Figura 32C y D). Por lo tanto
podemos concluir que la dermis de los ratones Mmp24-/- posee una superpoblación de
mastocitos mutantes que se encuentran irregularmente “de-granulados”.

Ya que la degranulación de los mastocitos puede ser inducida de forma experimental

mediante la aplicación tópica de capsaicina sobre preparaciones de mesenterio in vivo, tal
como se describe en el trabajo de Ito et al. en el año 2007, decidimos emplear esta
aproximación para analizar la capacidad de degranulación de los mastocitos en ratones
Mmp24-/- , de forma funcional y fisiológica (Figura 32E y F). Este experimento fue realizado
aplicando capsaicina a 5 µM o suero salino sobre los mesenterios expuestos de animales
adultos Mmp24-/- y Mmp24+/+ anestesiados. A continuación los animales fueron sacrificados
para proceder a la extracción, fijación y tinción metacromática de los mesenterios con violeta
de cresilo, y finalmente se analizó el número total de mastocitos y el de mastocitos “de-
granulados” con y sin tratamiento con capsaicina en ambos genotipos. En condiciones basales,
observamos que el número total de mastocitos era similar en los ratones Mmp24-/- y Mmp24+/+
pero, sorprendentemente, el porcentaje de células cebadas “de-granuladas” era muy superior
en los ratones mutantes en comparación con los ratones de la cepa salvaje (62.1 ± 4.0 % vs
17.4 ± 0.7 %, respectivamente, n = 3 animales por genotipo, P < 0.001; (figura 32E y F). Tras la
administración exógena de capsaicina, los mastocitos de los animales Mmp24+/+ respondieron
de la manera esperada ya que, tal y como se había descrito previamente (Ito et al., 2007), el
porcentaje de “de-granulación” aumentó aproximadamente en un 50% (27.2 ± 2.6, n = 3; P <
0.05; Figura 33). Sin embargo, en los animales Mmp24-/- no observamos ningún incremento en
el porcentaje de “de-granulación” de las células cebadas tras el tratamiento con capsaicina
(52.5 ± 1.7, n = 3; P < 0.07; datos no mostrados en la figura 32). Estos datos sugirieren que las
alteraciones en la “de-granunación” basal de los mastocitos mutantes podrían ser la causa que

108
 Resultados

impide la acción exógena de la capsaicina sobre los mismos, ya que los niveles de “de-
granulación” basal de los ratones mutantes son per se muy superiores a los observados en los
ratones Mmp24+/+ tratados con capsaicina.

Figura 32. Alteración de las respuestas a capsaicina y degranulación de mastocitos en ratones deficientes en
Mmp24.
A, B) Secciones de resina de 1 micra de grosor de la dermis de ratones adultos Mmp24 + / + y Mmp24 -/-, teñidas con
azul de toluidina en las que se pueden distinguir varios mastocitos por su tinción metacromática granular de color
púrpura (flechas). Micrografías electrónicas (C, D) de mastocitos en la dermis de ratones adultos Mmp24 + / + y Mmp24 -
/-
. Nótese la presencia normal de los gránulos característicos en el citoplasma del mastocito del tipo salvaje, frente a
los gránulos vacíos en las células mutantes. Estos mastocitos degranulados se observaron frecuentemente en las
muestras mutantes. (E, F) Preparaciones de mesenterio completo de ratones adultos Mmp24 + / + y Mmp24 - / -, teñido
con azul de toluidina, en el que varios mastocitos normales (flechas) y mastocitos degranulados (flecha vacía) se
pueden diferenciar por su tinción granular púrpura metacromática (flechas). En campos de mayor aumento (E, F) se
pueden observar en las inserciones de los mastocitos desgranulados, más frecuentes en los ratones mutantes.

109
Resultados

3.2. Obtención de mastocitos maduros a partir de cultivos de médula ósea

(BMMCs)
Para estudiar la interacción entre las neuronas sensoriales y los mastocitos de animales
Mmp24-/- y Mmp24+/+, decidimos diseñar un método experimental que nos permitiera aislar y
cultivar in vitro estos dos tipos celulares; de esta forma podríamos observar e interferir en el
mecanismo mediante el cual se regula su relación célula-célula y estudiar el efecto de la
mutación en los propios mastocitos. Para ello, establecimos cultivos de mastocitos maduros
derivados de cultivos de células inmaduras procedentes de la médula ósea. El objetivo era
seleccionar y permitir la maduración in vitro del linaje mieloide de la progenie hematopoyética.

Tras extraer y limpiar el fémur de los ratones procedimos al vaciado de la cavidad medular
mediante la inyección a presión de medio de cultivo atemperado a través de la misma; de esta
forma se consigue la extracción casi total de las células de la médula ósea. A continuación, las
cultivamos a una densidad de 4 x 105 células/ml sin necesidad de usar ningún tipo de sustrato
de adhesión ya que una fracción de las células es capaz de adherirse espontáneamente al
frasco de cultivo mientras que otra fracción se mantiene en suspensión. Ambas fracciones
tienen capacidad proliferativa pero es esta última fracción la que se sub-cultiva cada 3-4 días
en presencia de IL-3, ya que estudios previos demuestran que es ésta la población que permite
la obtención de un cultivo de mastocitos enriquecido en un 98%, tras un periodo de 4 semanas
de diferenciación in vitro (Jeffrey et al., 2006). Transcurrido este periodo, y una vez establecido
el cultivo de BMMCs (mastocitos derivados de la médula ósea; del inglés bone marrow mast
cell), se mantuvo como máximo hasta las 9 semanas in vitro pasando las células cada 3 días
para renovar su medio de cultivo. La identidad de las células se caracterizó mediante criterios
morfológicos, citoquímicos y ultraestructurales. Su morfología general se observó mediante
tinciones de violeta de cresilo que permitían detectar, a su vez, la metacromasia propia de
estos tipos celulares. Además, realizamos comprobaciones citoquímicas para la detección y
evaluación del grado de maduración de los BMMCs mediante complejos de avidina marcada
como la Cy3-streptoavidina (ver Figura 33B), ya que se ha demostrado que las células cebadas
se pueden detectar gracias a que sus gránulos contienen biotina. Por último, recogimos las
células cultivadas y las procesamos para su análisis en microscopía electrónica, lo que nos
permitió el estudio de su ultraestructura y la confirmación de que prácticamente la totalidad de
las células del cultivo poseían todas las características propias de los mastocitos maduros.

3.3. Estudio de las interacciones celulares entre mastocitos y neuronas

sensoriales
Nuestros resultados sugerían que las interacciones entre las neuritas y las células inmunes
son funcionalmente anormales en la piel de los ratones mutantes Mmp24-/-. Para estudiar las
posibles interacciones de los mastocitos y las neuronas sensoriales, así como analizar los
efectos de la mutación en Mmp24 en las propias células cebadas, empleamos los cultivos de
BMMCs de ambos genotipos para compararlos y observar las diferencias en su fenotipo. En
primer lugar comprobamos que los BMMCs maduros expresaban la proteína MT5-MMP y para

110
 Resultados

ello realizamos una doble tinción fluorescente con anticuerpos anti-MT5-MMP que fueron
detectados con inmunofluorescencia y con estreptoavidina conjugada con un fluoróforo distinto.
Observamos que los BMMCs son inmunopositivos para MT5-MMP pero que no todos ellos
presentan el mismo nivel de expresión (Figura 33A). En cultivos aislados de BMMCs
comprobamos, mediante la tinción metacromática de los orgánulos de los mastocitos, que el
porcentaje de “de-granulación” era similar en cultivos salvajes (16.3 ± 2.5 %, n = 3 cultivos a
partir de animales independientes) y en cultivos mutantes (19.5 ± 3.5 %, n = 2), lo que indicaba
que la falta de MT5-MMP no afecta de forma directa la “de-granulación” basal de los
mastocitos. Por lo tanto, y a pesar de la presencia de MT5-MMP en las células cebadas, todos
estos resultados juntos sugieren que el fenotipo de “de-granulación” observado en los animales
mutantes es debido a alteraciones en las interacciones entre los mastocitos y las neuronas
sensoriales y no a un proceso autónomo-celular de los propios mastocitos.

Figura 33. Expresión in vitro de MT5-MMP en DRGs y BMMCs.

(A) BMMCs diferenciado in vitro muestra inmunoreactividad para la tinción MT5-MMP (rojo). (B) Los co-cultivos de
neuronas aisladas de DRGs y BMMCs de ratones adultos, de tipo salvaje, marcadas con anticuerpos contra el
marcador neuronal tubulina (rojo) y con estreptavidina (azul) que une específicamente gránulos de los mastocitos,
utilizando técnicas fluorescentes. (C) Los co-cultivos de neuronas aisladas de DRGs y BMMCs de ratones adultos de
tipo salvaje inmunoteñida para tubulina, utilizando peroxidasa (marrón) y contrastados con violeta de cresilo que
permite la distinción metacromática de los gránulos de los mastocitos y su degranulación. Cabe destacar las neuritas
tubulina + (cabeza de flecha) que entran en estrecho contacto con los mastocitos. Los puntos con flecha negra en un
mastocito no-desgranulado, homogéneamente púrpura, mientras que la flecha vacía indica un mastocito degranulado
con los gránulos blancos característicos, próximos a la superficie celular. Barras de escala: A, C, 10 µm; B, 20 µm

Llegados a estas conclusiones decidimos analizar en profundidad estas interacciones neuro-

inmunes mediante el co-cultivo de ambos tipos celulares procedentes de animales Mmp24-/- y
Mmp24+/+ (Figura 34). Para ello, desarrollamos dos tipos de experimentos in vitro. En el
primero, números equivalentes de BMMCs diferenciados y maduros de cada genotipo fueron
añadidos a cultivos de explantes de DRGs procedentes de ratones Mmp24-/- y Mmp24+/+
adultos, que habían sido mantenidos in vitro durante 5 días para permitir la suficiente
elongación y ramificación de sus neuritas. Cuatro co-cultivos independientes de cada
combinación de genotipos fueron fijados para su posterior análisis tras tres días de interacción
entre los diferentes tipos celulares. Los mastocitos fueron detectados mediante su marcaje con
streptoavidina conjugada con Cy3 y las neuronas sensoriales mediante anticuerpos específicos
que reconocían la tubulina neuronal, lo que nos permitía observar todo el árbol neurítico de
cada explante en fluorescencia (datos no mostrados). Los resultados mostraron que muchos
más mastocitos de ambos genotipos se encontraban más adyacentes a las neuritas mutantes

111
Resultados

que a las de la cepa salvaje. Sorprendentemente, aquellos co- cultivos formados por BMMCs y
explantes de DRGs ambos Mmp24-/-, presentaban densidades de células marcadas con
streptoavidina mucho mayores que aquellos co-cultivos en los que interaccionaban BMMCs
salvajes con DRGs mutantes. Esta observación, que evidencia que el fenotipo mutante neuro-
inmune es mucho más intenso cuando la interacción se produce entre mastocitos y neuronas
sensoriales que carecen ambas de la proteína MT5-MMP, sugiere que la metaloproteasa es
responsable de la regulación de este proceso.

Figura 34. Contactos físicos alterados entre los

mastocitos mutantes de Mmp24.

Micrografías representativas de cocultivos de BMMCs y

neuronas disociadas de DRGs adultos, en combinaciones
Mmp24+/+/Mmp24-/- (A) y Mmp24-/-/Mmp24-/- (B). Las fibras
sensoriales se marcaron con anticuerpos para la tubulina
neuronal usando métodos de detección a base de
peroxidasa, y los mastocitos se tiñeron con violeta de
cresilo. Se puede observar que las fibras mutantes tienen
varicosidades más grandes y están más estrechamente
unidas a los mastocitos. En los co-cultivos en los que
ambos elementos son de tipo salvaje, estos están
generalmente más separados y los mastocitos extienden
procesos que parecen acercarse a las fibras (flechas). Los
paneles de la derecha representan BMMCs maduros no
degranulados y los paneles de la izquierda, muestran
BMMCs maduros degranulados (las puntas de flecha
apuntan a gránulos vacíos). Barra de escala: 10µm.

En el segundo tipo de experimentos cultivamos BMMCs sobre neuronas sensoriales

disociadas procedentes de DRGs adultos, que habían sido previamente mantenidas in vitro
durante 5 días para permitir, al igual que en los experimentos de los explantes, la elongación y
ramificación de su árbol neurítico (Figura 34). Los co-cultivos se fijaron tras 3 días de
incubación, fueron marcados mediante inmunocitoquímica con anticuerpos contra la proteína
neuronal tubulina, usando un método de detección basado en la reacción enzimática de la
peroxidasa, y posteriormente teñidos con violeta de cresilo para poder así identificar los
BMMCs y su grado de “de-granulación”. Tras el análisis, los resultados mostraban que, en los
co-cultivos donde interaccionaban BMMCs Mmp24+/+ y neuronas Mmp24+/+ (Figura 34A), las
células inmunes parecían extender procesos hacia las fibras sensoriales, aparentemente
buscando un contacto, pero la mayoría de las fibras se encontraban alejadas de los mastocitos.
Sin embargo, en el caso de los co-cultivos en los que interaccionaban mastocitos y neuronas
sensoriales mutantes, las fibras siempre se aproximaban más y parecían entrar en contacto
con las células cebadas (Figura 34B).

112
 Resultados

Tras observar este comportamiento en las fibras mutantes nos propusimos evaluar si estos
cambios morfológicos eran funcionalmente relevantes o no. Para ello, estudiamos la “de-
granulación” de los BMMCs co-cultivándolos con las neuronas sensoriales disociadas en todas
las combinaciones posibles de genotipos y en diferentes condiciones (Figura 34; Tabla 5). En
los co-cultivos de neuronas y BMMCs Mmp24+/+ el porcentaje de mastocitos “de-granulados”
era muy bajo (Tabla 5) y prácticamente idéntico al que obtuvimos en los cultivos
independientes de BMMCs de cepa salvaje o mutante (ver datos previos) pero, al tratar los co-
cultivos 1 hora con capsaicina 1 µM, la mayoría de los mastocitos se “de-granularon”. Sin
embargo, en el caso de los co-cultivos de BMMCs y neuronas Mmp24-/-, el porcentaje de
mastocitos “de-granulados” alcanzaba directamente el 70% en ausencia de capsaicina
exógena (Tabla 5) y, tras el tratamiento con capsaicina, no obteníamos ningún aumento en la
tasa de “de-granulación” de los mismos. Estos resultados son similares a los que obtenidos en
el estudio in vivo de los mesenterios de los ratones mutantes y, por lo tanto, indican que las
interacciones neuro-inmunes que se producen en los ratones Mmp24-/- dan lugar a respuestas
irregulares en la “de-granulación” de los mastocitos. Una posible explicación para justificar
estos resultados también podría ser que MT5-MMP fuera capaz de regular de forma directa o
indirecta al receptor vaniloide de la capsaicina TRPV1 pero tal como hemos descrito
anteriormente (Figura 29), estudiamos los niveles de expresión del mismo en las neuronas
sensoriales de los DRGs y en los BMMCs de ambos genotipos y no observamos ninguna
diferencia significativa. Curiosamente, en los co-cultivos en los que cualquiera de los dos, bien
los BMMCs o bien las neuronas sensoriales, eran mutantes, la interacción provocaba un
fenotipo intermedio (Tabla 5), lo que sugería que la mutación afecta a la interacción entre
ambos tipos celulares. Además en estos casos intermedios, el tratamiento con capsaicina
aumentaba al 70% el porcentaje de mastocitos degranulados igual que en el caso de los co-
cultivos Mmp24+/+/Mmp24+/+.

Co-cultivo Tratamiento

Neuronas
BMMC vehiculo capsaicina NGF
DRG

Mmp24+/+ Mmp24+/+ 15.8 ± 1.0 56.5 ± 7.3 61.1 ± 8.9

Mmp24+/+ Mmp24-/- 31.3 ± 2.7 47.9 ± 6.2 50.9 ± 13.4

Mmp24-/- Mmp24+/+ 44.7 ± 4.9 68.2 ± 1.7 65.2 ± 5.1

Mmp24-/- Mmp24-/- 76.0 ± 3.7 80.1 ± 5.0 60.7 ± 3.1

n 4 4 3

Tabla 5 Porcentaje de mastocitos degranulados (BMMCs) en co-cultivos de neuronas disociadas de DRGs

adultos y BMMCs, de diferentes genotipos y con diferenetes tratamientos.
Capsaicina: 1 µM. NGF: 100 ng/ml. “n”: number de experimentos independientes (cultivos de animales diferentes) por
genotipo.

113
Resultados

Todos los resultados obtenidos en los experimentos de los co-cultivos neuro-inmunes

demuestran que, tanto las interacciones morfológicas como las interacciones funcionales que
tienen lugar de forma espontánea entre mastocitos y fibras sensoriales de los DRGs in vitro, se
encuentran alteradas en ausencia de la proteína MT5-MMP, un hecho que podemos
correlacionar con los datos obtenidos en el estudio in vivo de los mesenterios intactos.

Basándonos en los resultados previos del laboratorio del Dr. López-Otín, en colaboración
con el laboratorio de farmacología del Dr. Luis Menéndez, que demostraban mediante ensayos
de comportamiento que la ausencia de MT5-MMP también alteraba la respuesta hiperalgésica
térmica mediada por NGF (Lewin et al., 1994; Rueff y Mendell, 1996), intentamos analizar si
existía una relación entre este fenotipo comportamental de los ratones Mmp24-/- ante la
presencia de moléculas mediadoras en el proceso hiperalgésico y el fenotipo neuro-inmune in
vitro. Para ello procedimos a tratar los co-cultivos con NGF y, al igual que con el tratamiento
con capsaicina, observamos que el NGF era capaz de incrementar el porcentaje de mastocitos
“de-granulados” en el caso de los co-cultivos de cepa salvaje pero no en el caso de los
mutantes (Tabla 5). Esto indica que la perdida de respuesta hiperalgésica postinflamatoria in
vivo en los ratones Mmp24-/-, puede explicarse por una posible incapacidad de los mastocitos
de liberar moléculas mediadoras necesarias para la sensibilización de las fibras nerviosas.

A continuación quisimos comprobar si realmente los cambios en el fenotipo de “de-

granulación” de los ratones mutantes se debían a la aparente alteración en los contactos físicos
entre neuronas sensoriales y mastocitos. Para ello, llevamos a cabo experimentos en los que
co-cultivamos en un mismo pocillo neuronas sensoriales de los DRGs Mmp24-/- y mastocitos
Mmp24-/- pero separados físicamente mediante el inserto en el pocillo de una cámara dispuesta
de una membrana porosa (transwell) que permitía el cultivo de las neuronas en la cámara y de
los mastocitos en el pocillo de la placa, de manera que era posible el intercambio de moléculas
secretadas al medio pero no la interacción física entre las células de los dos compartimientos.
En estas condiciones, no se observaron diferencias en el porcentaje de mastocitos “de-
granulados” entre co-cultivos Mmp24-/-/Mmp24-/- y co-cultivos Mmp24+/+/ Mmp24+/+ o sus
combinaciones (70 células degranuladas de 182 células totales en co-cultivos de neuronas
Mmp24+/+/BMMCs Mmp24+/+; 79 de 177 células totales en co-cultivos de neuronas Mmp24-/-
/BMMCs Mmp24-/-; 70 de 171 células totales en co-cultivos de neuronas Mmp24-/-/BMMCs
Mmp24+/+; 80 de 198 células totales en co-cultivos de neuronas Mmp24+/+/BMMCs Mmp24-/-) ,
indicativo de que la alteración del contacto físico neuro-inmune en los ratones mutantes, es la
causa de la respuesta ectópica de los mastocitos. Todos estos resultados demuestran que las
interacciones morfológicas entre mastocitos y fibras sensoriales están alteradas en ausencia de
la proteína MT5-MMP, dando lugar a respuestas fisiológicas irregulares

3.4. Implicación de la N-cadherina en la interacción mastocito-neurona sensorial

Nuestros datos previos mostraban que las neuronas sensoriales que carecen de MT5-
MMP presentan alteraciones en su crecimiento neurítico caracterizadas por una mayor

114
 Resultados

ramificación en la piel y una interacción irregular con los mastocitos cutáneos. Para poder
profundizar en el mecanismo mediante el cual MT5-MMP regula la interacción entre las células
inmunes y las neuronas sensoriales y, por lo tanto, el dolor inflamatorio, nos propusimos
estudiar las posibles acciones de esta metaloproteasa en la regulación de la adhesión celular.
Ya habíamos mostrado como las neuronas mutantes parecían tener muchos más focos en los
que la N-cadherina parecía acumularse, niveles más altos de la forma completa de N-cadherina
en la membrana citoplasmática y niveles de β-catenina aumentados (ver datos anteriores en el
apartado 2.5). Por otra parte, la N-cadherina se expresa también en los mastocitos y su tráfico
a los sitios de la membrana en interacción con las neuritas parece ser inducido por las propias
neuritas (Suzuki et al., 2004), lo que sugiere una implicación de esta molécula de adhesión en
el establecimiento de la denominada “sinapsis neuro-inmune”

En el caso de los mastocitos, comprobamos aquellos que expresaban MT5-MMP

también expresaban N-cadherina y, en el análisis de co-localización inmunocitoquímica, ambas
moléculas mostraron tener distribuciones similares. Y esta observación fue similar en los dos
tipos celulares, tanto neuronas como BMMCs (Figura 35A). La marca visible de MT5-MMP
resultó ser especialmente punteada sobre todo en los BMMCs lo que sugiería una posible
distribución vesicular que coincidía con las descripciones anteriores de la distribución de N-
cadherina en los mastocitos (Suzuki et al., 2004). Curiosamente, pudimos observar que, en los
sitios de contacto entre neuritas y BMMCs, los marcajes para N-cadherina y MT5 MMP eran
aparentemente mucho más intensos y homogéneos en los mutantes (Figura 35A). Al igual que
en las neuronas, la falta de MT5-MMP en BMMCs también dio lugar a un procesamiento
anormal de la N-cadherina y en consecuencia en un aumento de los niveles de beta-catenina,
como se muestra por western blot (Figura 31B).

Figura 35.Papel de N-cadherina y MT5-MMP en la interacción funcional entre neuronas de los DRGs y los
BMMCs.
(A) Co-cultivo de BMMCs y neuronas de los DRGs de tipo salvaje, marcadas con anticuerpos para MT5-MMP (rojo) y
de N-cadherina (verde). Téngase en cuenta que tanto neuronas (n) como mastocitos (BMMC) expresan ambas
moléculas. Co-cultivos de neuronas de los DRGs de tipo salvaje (B y C) y BMMCs de tipo salvaje (B) y mutante (C)
marcados con anticuerpos para tubulina neuronal (rojo), N-cadherina (verde) y con estreptavidina conjugada con Cy3
(azul). Obsérvese que la N-cadherina se acumula en los sitios de contacto entre neuritas y células inmunes y que estas
interacciones aparecen más frecuentemente en co-cultivos mutantes. Barras de escala: A-C 15 µm.

Para comprobar si la N-cadherina y MT5-MMP desempeñaban un papel en la interacción

funcional entre neuronas y células cebadas tratamos co-cultivos de neuronas y BMMCs de
diferentes genotipos con anticuerpos anti-N-cadherina con el objetivo de bloquear su función, o

115
Resultados

con IgGs no relevantes como control, y a continuación analizamos los fenotipos de tasa de “de-
granulación” de los BMMCs usando una tinción de violeta de cresilo. De acuerdo con los
experimentos anteriores que muestran que la “de-granulación” requiere el contacto directo
entre las células nerviosas e inmunes (Suzuki et al., 2004), nuestros resultados indicaron que la
“de-granulación” normal requiere la interacción célula-célula mediada por la N-cadherina, entre
los mastocitos y las neuritas, ya que no era posible provocar la “de-granulación” inducida por la
capsaicina en los co-cultivos Mmp24+/+/Mmp24+/+ tratados con anticuerpos bloqueantes anti-N-
cadherina (Tabla 6). Sin embargo, y de forma sorprendente, en los co-cultivos Mmp24-/-
/Mmp24-/- la adición de anticuerpos anti-N-cadherina, pero no de una IgG control, fue capaz de
rescatar el fenotipo mutante de “de-granulación” en los mastocitos (Tabla 6). Por lo tanto, de
estos datos podemos concluir que la N-cadherina modula la sinapsis neuro-inmune y que la
regulación de esta molécula de adhesión celular por MT5-MMP resulta esencial para el
funcionamiento normal de esta interacción y de las respuestas al dolor inflamatorio.

Co-cultivos Tratamiento

Neuronas anti-N-Cdh
IgGs IgGs + caps. anti-N-Cdh
DRG BMMC + caps.

Mmp24+/+ Mmp24+/+ 24.4 ± 0.9 57.7 ± 2.4 16.7 ± 3.4 22.2 ± 4.9
-/- -/-
Mmp24 Mmp24 59.8 ± 7.3 68.9 ± 9.8 22.8 ± 4.7 24.7 ± 0.2

n 2 2 2 2

Tabla 6 Porcentaje de mastocitos degranulados (BMMCs) en experimentos de bloqueo de función de N-

cadherin en co-cultivos de neuronas disociadas de DRGs adultos y BMMCs de diferentes genotipos.

Capsaicina (caps.): 1 µM. IgGs no-relevantes de ratón (Sigma): 40 µg/ml. IgGs de ratón anti-N-Cdh (anti-N-cadherina,
clon GC4; Sigma): 40 µg/ml. “n”: numero de experimentos independientes (cultivos a partir de diferentes animales) por
genotipo.

116
 Discusión

DISCUSIÓN

117
 Discusión

Discusión

En el presente trabajo de tesis doctoral hemos querido investigar aspectos de la regulación de

las neuronas sensoriales periféricas que participan en la detección del dolor y, para ello, hemos
estudiado la contribución de la neurotrofina BDNF y de la metaloproteasa MT-5 al desarrollo y
mantenimiento de esta población sensorial de indudable inetrés biomédico. Los aspectos más
destacables de los hallazgos pueden resumirse en: 1) hemos identificado por primera vez la
dependencia trófica postnatal de neuronas nociceptivas de la neurotrofina BDNF, 2) la
implicación de una metaloproteasa en la fisiología del dolor a través de acciones específicas en
el crecimiento de las fibras nociceptivas y en su interacción con mastocitos de la piel. Ambos
resultados son novedosos y contribuyen a una mejor comprensión de la percepción del dolor a
nivel periférico.

Las neurotrofinas son moléculas cuya función canónica es su implicación en la

supervivencia neuronal durante el desarrollo del sistema nervioso, aunque esta familia de
factores tróficos regula otros muchos aspectos del desarrollo y de la función neuronal, como la
diferenciación, el crecimiento axónico o la plasticidad sináptica (Reichardt y Fariñas, 1997).
Estas proteínas han sido ampliamente estudiadas a lo largo de los últimos 50 años utilizando
modelos genéticos de ganancia y pérdida de función, de manera que muchos de sus aspectos
biológicos y de su modo de acción se conocen en profundidad. Particularmente, las cepas de
ratones mutantes nulos para las diferentes neurotrofinas y sus receptores tirosina kinasa han
permitido describir y caracterizar con exhaustividad su implicación en la supervivencia de las
neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico. Sin embargo, caracterizaciones de estas
cepas en distintos laboratorios han dado lugar, en algunas ocasiones, a resultados
discrepantes. Esto ha conducido a que, por ejemplo, en el caso de BDNF o su receptor tirosina
kinasa TrkB, que se expresan ampliamente durante el desarrollo embrionario y postnatal, no se
conozcan bien las poblaciones de neuronas sensoriales que dependen de esta vía de
señalización para su supervivencia.

La investigación bibliográfica de las descripciones previas que existen sobre otras

cepas de ratones mutantes nulos de BDNF o su receptor TrkB, generadas en diferentes
laboratorios, muestran que los trabajos son relativamente confusos y variables en cuanto a sus
resultados. Sí parece claro que la supervivencia de las neuronas sensoriales de los ganglios
exclusivamente viscerales, como el nodoso y el petroso, depende de la señalización de BDNF
y de la neurotrofina 4/5 a través de su receptor TrkB. En los ratones mutantes nulos que
carecen de la forma catalítica del receptor TrkB y en los dobles mutantes nulos de BDNF y NT-
4/5, las neuronas del complejo ganglionar nodoso-petroso no sobreviven (Connover et al.,
1995; Erickson et al., 1996; Silos-Santiago et al., 1997; Brady et al., 1999; Erickson et al.,
2001). Sin embargo, estudios similares realizados en los DRGs, ofrecen resultados
contradictorios. Los estudios iniciales indicaron una reducción del 30-35% de las neuronas
sensoriales de los DRGs en animales mutantes nulos tanto para TrkB como para BDNF a los

119
Discusión

15 días de edad (Klein et al., 1993; Jones et al., 1994; Ernfors et al., 1994), y ninguna pérdida
neuronal en los DRGs de animales perinatales mutantes nulos para NT-4/5 (Liu et al., 1995;
Conmover et al., 1995). Sin embargo, un estudio posterior en otra cepa generada
independientemente sugería que BDNF el participaría en la regulación de la sensibilidad pero
no de la supervivencia de los aferentes a la piel pilosa, ya que los autores no observaban
deficiencias en el número de fibras a la piel en animales nulos para BDNF postnatales (Carroll
et al., 1998). El posible momento en el que se producirían los déficits también fue objeto de
controversia. El déficit neuronal en animales mutantes nulos de TrkB parecía producirse
durante el periodo postnatal (Silos-Santiago et al., 1997), pero se describieron déficits en el
periodo prenatal (Minichello et al., 1995, Liebl et al., 2000).

Curiosamente, análisis más recientes de la inervación periférica muestran pérdidas

parciales de los aferentes sensoriales cutáneos en ausencia de la señalización de BDNF
mediada por TrkB. Los animales postnatales mutantes nulos de BDNF y de TrkB carecen de
corpúsculos de Meisner (González-Martínez et al, 2004; 2005) y de una fracción de
corpúsculos de Paccini (Sedy et al., 2004). El análisis de los receptores en el ligamento
periodontal, el paladar, o las vibrisas del ratón también ha indicado que las los corpúsculos de
Ruffini y los de Meissner no se diferencian en ausencia de BDNF o TrkB (Fundin et al., 1997;
Ichikawa et al., 2000; Alkhamrah et al., 2003). Debido a que los receptores sensoriales
periféricos parecen depender de la inervación aferente sensorial para su diferenciación (véase
Zelená, 1994, para una revisión) estos estudios sugieren que la falta de BDNF puede dar lugar
a déficit en el número de neuronas sensoriales mecanoceptivas. Sin embargo, a pesar de esta
situación, la cuestión de la dependencia sensorial de neuronas sensoriales de los DRG de
BDNF ha quedado sin revisar.

En el presente trabajo de tesis doctoral hemos identificado a BDNF como una molécula
esencial para la supervivencia de las neuronas nociceptivas cutáneas y hemos demostrado que
el requerimiento de BDNF aparece inmediatamente después del nacimiento del animal y se
mantiene durante su primera semana de vida, un periodo durante el cual se produce la
regulación a la baja de la expresión del receptor TrkA. Neuronas que expresan el neuropéptido
CGRP y/o que presentan sitios de unión para la lectina IB4, sobreviven in vitro en presencia de
BDNF. La carencia de BDNF in vivo, produce la pérdida de aferentes sensoriales con fibras tipo
C, una reducción general de la densidad de terminales libres que inervan tanto la piel glabra
como la pilosa, una reducción de la inervación en el asta dorsal de la médula espinal y también
la pérdida de neuronas CGRP+ e IB4+ en los ganglios lumbares de la raíz dorsal. Además,
nuestros resultados sugieren que el BDNF requerido para la supervivencia de las neuronas
sensoriales nociceptivas, es producido por los propios ganglios de la raíz dorsal de forma
autocrina/paracrina.

En nuestro estudio de los animales mutantes nulos de BDNF observamos que la

pérdida de neuronas sensoriales de los DRG se produce exclusivamente durante el periodo
postnatal, a pesar de la expresión del receptor TrkB en las neuronas de los DRGs durante el

120
 Discusión

desarrollo embrionario (Ernfors et al., 1992; Schecterson et al., 1992; Mu et al., 1993; Fariñas
et al., 1998). Los resultados son más consistentes con la dependencia trófica de las neuronas
observada en cultivo. La supervivencia in vitro de las neuronas sensoriales neonatales
depende muy poco de BDNF; sin embargo, esta dependencia aumenta progresivamente con la
edad postnatal (ver también Baudet et al., 2000). Todo esto nos indica que es muy probable
que la ventana temporal en la que BDNF afecta a la supervivencia de los aferentes nerviosos
de las poblaciones de nociceptores y mecanorreceptores se limite al desarrollo postnatal. La
expresión de TrkB durante el desarrollo de los ganglios podría estar relacionada con la
señalización por NT-3 (Fariñas et al., 1998).

Debido a que los ratones mutantes BDNF generalmente mueren durante las
primeras horas de vida postnatal, y sólo unos pocos sobreviven hasta P15-P21, no pudimos
analizar si se pierden más neuronas en ausencia sostenida de BDNF hasta la edad adulta. El
fenotipo de los ratones mutantes nulos heterocigotos para BDNF mostró una reducción del
25% en el número de neuronas nociceptivas, un déficit que en los ensayos de comportamiento
dio lugar a alteraciones en la respuesta fisiológica a estímulos dolorosos. Pérdidas parciales de
neuronas sensoriales en ratones heterocigotos mutantes nulos para ciertas neurotrofinas ya
han sido descritas previamente. Los ratones mutantes nulos para NT-3 muestran una ausencia
total de husos neuromusculares, que no se desarrollan en ausencia de las neuronas
proprioceptivas que los inervan y que dependen de NT-3 para su supervivencia prenatal,
mientras que los heterocigotos para esta mutación tienen tan sólo el 50% del complemento
normal de husos neuromusculares (Fariñas et al., 1994; Ernfors et al., 1994b; Tessarollo et al.,
1994; Tojo et al., 1995). Estos fenotipos parciales han sido interpretados como una
demostración de que las neurotrofinas son factores limitantes en condiciones normales
(Fariñas y Reichardt, 1997). El fenotipo nociceptivo de los ratones mutantes heterocigotos para
BDNF, consistente en una reducción del 25%, sugiere que efectivamente sólo el 50% de las
neuronas nociceptivas, que es la pérdida observada en los mutantes nulos, son dependientes
de BDNF. Esto también sugeriría que BDNF no es necesario para la supervivencia de los
nociceptores después de las dos primeras semanas de vida, cuando ya se observa la pérdida
del 50%.

Algunas neuronas dependen exclusivamente de una sola neurotrofina, como por

ejemplo, las neuronas propioceptivas de gran diámetro que parecen expresar exclusivamente
el receptor TrkC durante el desarrollo (Mu, et al., 1993) y que sólo requieren NT-3 para
sobrevivir (Klein et al., 1994; Fariñas et al., 1994; Ernfors et al., 1994; Tessarollo et al., 1994;
Tojo et al., 1995). En cambio, los nociceptores parecen depender de la acción secuencial de
más de un factor neurotrófico. Durante la embriogénesis del ratón, todas las neuronas de
tamaño pequeño de los DRGs expresan el receptor para NGF, TrkA, y requieren de esta
neurotrofina para su supervivencia; de hecho, los ratones recién nacidos con deficiencia en
cualquiera de las dos moléculas pierden por completo esta población neuronal, que representa
alrededor del 80% de todas las neuronas de los DRGs (Ruit et al, 1992; Crowley , et al., 1994;
Smeyne et al., 1994; Silos-Santiago et al., 1995; White et al., 1996; Rice et al., 1998). Es

121
Discusión

probable que estas neuronas dependientes de NGF también dependan inicialmente de NT-3,
ya que en los ratones deficientes en NT-3 manifiestan una pérdida de alrededor del 70% de la
población total de neuronas sensoriales en estadios muy tempranos de formación de los
ganglios, lo que incluye necesariamente a neuronas del dolor (Fariñas et al., 1996). El
requerimiento de NT-3 parece estar mediado también por TrkA, porque los ratones mutantes
nulos de TrkC únicamente pierden la población de las neuronas propioceptivas que constituyen
menos del 20% de todas las neuronas en los DRGs (Klein et al., 1994; Fariñas et al. 1994,
1996).

Después del nacimiento, TrkA todavía está presente en las neuronas sensoriales
peptidérgicas que expresan CGRP y SP y, por lo tanto, estas neuronas siguen siendo
dependientes de NGF después del nacimiento. Sin embargo, en las neuronas IB4-positivas
TrkA se regula a la baja después del nacimiento y se comienza a expresar el receptor de
GDNF, c-ret (Silos-Santiago et al., 1995; Molliver et al., 1997; Bennett et al., 1998). Este patrón
de expresión condujo a la idea de que los nociceptores IB4 positivos cambian su dependencia
trófica del NGF al GDNF de forma progresiva durante el periodo postnatal (Silos-Santiago et
al., 1995; Molliver et al, 1997; Bennett et al., 1998). Se ha demostrado que la expresión de c-ret
y la supervivencia neuronal producida en respuesta a GDNF aumentan después del nacimiento
y que, en P15, más del 50% de las neuronas de los DRG puede mantenerse in vitro
únicamente en presencia de GDNF (Molliver et al., 1997). Otros estudios posteriores mostraron
que GDNF, sin embargo, no es muy eficaz como factor de supervivencia para las neuronas
sensoriales de los DRGs embrionarias y/o neonatales (Matheson et al., 1997; Baudet et al.,
2000) y que los ratones deficientes en GDNF pierden menos del 25% de todas las neuronas
de DRG prenatalmente (Moore et al., 1996), un déficit que parece incluir preferentemente a
neuronas pequeño tamaño, como se muestra mediante el análisis de la distribución de los
tamaños de las células (Baudet et al., 2000). Más recientemente, la caracterización de una
cepa de ratones en la que se había inactivado c-Ret de forma condicional, demostró que el
GDNF no es esencial para la supervivencia de las neuronas IB4 positivas (Fundin et al., 1999,
Luo et al., 2007). Estos últimos datos indican que, aunque las neuronas nociceptivas expresan
receptor c-ret y pueden responder a GDNF, este factor neurotrófico no es esencial para la
supervivencia de estos aferentes sensoriales. En la piel de ratones neonatales la expresión de
GDNF es baja o parece limitarse a estructuras muy específicas (Golden et al., 1999; Fundin et
al., 1999; Botchkareva et al., 2000) pero esta expresión adquiere más relevancia, incluso que la
de BDNF o NGF, durante el desarrollo postnatal. En estudios previos se ha demostrado que
GDNF también regula la fisiología de los nociceptores y los patrones de inervación en los
animales adultos (Amaya et al., 2004; Malin et al., 2006; Albers et al., 2006). Además, se ha
comprobado que la administración exógena de GDNF puede prevenir los cambios en la
velocidad de conducción de las fibras IB4 positivas inducidos por axotomía y así como
promover el crecimiento de las neuritas in vitro en cultivo de explantes de DRGs (Bennett et al.,
1998; Leclere et al., 1998). Por lo tanto, el GDNF desempeña un papel importante en la
fisiología de los nociceptores c-ret positivos pero no es esencial para su supervivencia. Por el

122
 Discusión

contrario, nuestros resultados demuestran que BDNF sí juega un papel esencial en la

supervivencia de los nociceptores inmediatamente después del nacimiento e implican
directamente a BDNF como una molécula importante en el desarrollo nociceptivo.

La dependencia temporal de BDNF coincide con un periodo en el cual los nociceptores

están cambiando la expresión de sus receptores para factores neurotróficos y cuando en los
territorios diana se están produciendo cambios en la expresión de los factores para dichos
receptores. Nuestros datos obtenidos a partir de los cultivos celulares indican que muchas
neuronas sensoriales de los DRGs que dependen de NGF durante este periodo, expresan TrkB
y c-Ret y, por consiguiente, pueden también mantenerse in vitro en presencia de los factores
tróficos BDNF o GDNF. El déficit neuronal que hemos encontrado en los ratones mutantes
nulos para BDNF indica que el factor relevante para la supervivencia in vivo realmente es
BDNF. Por lo tanto, ya que BDNF mantiene a una población de células que también pueden
sobrevivir en presencia de NGF y GDNF, podemos deducir que la pérdida de neuronas
observada in vivo probablemente es debida a la expresión diferencial de estos factores tróficos
durante el período inicial del desarrollo postnatal. De esta manera, la dinámica de expresión de
los diferentes factores neurotróficos durante el desarrollo postnatal de la piel podría explicar las
pérdidas específicas en poblaciones neuronales sensoriales a pesar de la presencia del
receptor correspondiente, tal como ocurre durante el desarrollo del oído interno (Fariñas et al.,
2001).

Analizando los DRGs por PCR cuantitativa, se observa una fuerte expresión de BDNF
durante primeros días después del parto. En trabajos previos se ha demostrado que la
expresión de BDNF en las neuronas nociceptoras TrkA-positivos está regulada mediante la
acción del NGF producido en los tejidos periféricos, como sucede en los casos de inflamación
(Wetmore y Olson, 1995; Barakat-Walter et al., 1996; Apfel et al., 1996; Michael et al., 1997).
Por otra parte, también se ha demostrado que el BDNF producido y liberado por las propias
neuronas en los DRG adultos parece mantener la supervivencia de las neuronas sensoriales
mediante un mecanismo autocrino (Wright et al., 1992; Acheson et al., 1995). Todos nuestros
datos son coherentes con un modelo en el que el NGF puede regular la expresión de BDNF y
TrkB, de forma que el BDNF derivado del ganglio sensorial garantiza la supervivencia de las
neuronas nociceptivas. Curiosamente, los resultados obtenidos de la sobre-expresión de BDNF
en la piel muestran un aumento en la inervación de los folículos pilosos, los corpúsculos de
Meissner y las células de Merkel sin cambios en el número de neuronas sensoriales en los
DRG (LeMaster et al., 1999), lo que sugiere que la sobreexpresión cutánea de BDNF no
produce en el rescate de las neuronas de los DRG después del nacimiento. Las neurotrofinas
han demostrado ejercer acciones diferentes cuando actúan sobre las terminaciones nerviosas
o sobre los cuerpos celulares (Howe y Mobley et al., 2005). Estudios adicionales serán
necesarios para determinar si el BDNF promueve la supervivencia y regula el crecimiento de
las neuritas actuando en compartimentos celulares diferentes.

123
Discusión

La administración exógena de BDNF en el cerebro ha demostrado tener un efecto anti-

nociceptivo, tanto después de tratamientos crónicos (Siuciak et al, 1994; Siuciak et al, 1995)
como en agudos (Cirulli et al., 2000). Se ha propuesto que esta reducción de la sensibilidad al
dolor es una respuesta del sistema nervioso central, provocada por una modulación de las
acciones de la serotonina y varios neuropéptidos, como la SP y el neuropéptido Y, por el BDNF
(Siuciak et al., 1994; 1995). El efecto anti-nociceptivo de BDNF puede ser antagonizado por la
naloxona, sugiriendo la participación adicional de los sistemas vinculados a opioides, en la
analgesia producida por infusiones de BDNF en el mesencéfalo (Siuciak et al., 1994). Sin
embargo, en contraste con el efecto anti-nociceptivo observado tras la administración exógena
de BDNF, tanto nuestros experimentos como otros previos (MacQueen et al., 2001) han
demostrado que los ratones heterocigotos mutantes nulos para BDNF presentan hipoalgesia
térmica en la prueba de placa caliente en condiciones basales.

El hecho de que tanto los niveles bajos de BDNF en el desarrollo como los niveles altos
durante la edad adulta puedan resultar en un efecto hipoalgésico debe ser estudiado con más
detalle. Además de las diferencias existentes entre especies (en los experimentos de respuesta
a la placa térmica con animales heterocigotos deficientes en BDNF se emplearon ratones como
modelo experimental, mientras que en los experimentos de infusión de BDNF en adultos de
emplearon ratas) y de la posibilidad de que en los citados experimentos intervinieran variables
no controladas que puedan modular la analgesia inducida por estrés (Wilson y Mogil, 2001), es
indudable que el hecho de que exista una pérdida postnatal de aferentes cutáneos nociceptivos
también podría explicar el aumento de la latencia en la percepción de la nocicepción térmica en
ratones deficientes en BDNF.

La dependencia neurotrófica en las poblaciones de neuronas periféricas ha sido

investigada exhaustivamente. Sorprendentemente, el fenotipo nociceptivo de la cepa de
ratones deficientes en BDNF había sido difícil de describir y demostrar a pesar de los análisis
previos. Aquí se demuestra que BDNF es esencial para la supervivencia de una fracción de
nociceptores durante el periodo perinatal, justo cuando éstos están perdiendo su dependencia
de NGF. Estos resultados deben tenerse en cuenta al interpretar las consecuencias de los
reducidos niveles de BDNF en la fisiología del dolor.

Durante las últimas décadas se han llevado a cabo numerosos estudios que han
demostrado de forma cada vez más evidente, que las MMPs cumplen un papel fundamental en
los procesos de remodelación fisiológica que tienen lugar durante el desarrollo del sistema
nervioso y en los procesos de remodelación tras lesión neural (Yong et al., 2005). Estos nuevos
datos hacen hincapié sobre todo, en lo distintas y opuestas que pueden ser las actividades que
desempeñan los diferentes miembros de la familia de las MMPs en estos procesos y también
en la importancia de determinar las funciones in vivo más esenciales de cada enzima. En el
trabajo desarrollado en esta tesis doctoral demostramos que los ratones deficientes en MT5-
MMP exhiben un fenotipo nociceptivo complejo caracterizado por una mayor sensibilidad a
estímulos nociceptivos térmicos acompañados de una pérdida profunda de la hiperalgesia

124
 Discusión

inflamatoria térmica después de la inyección de carragenina en la pata. En los ratones Mmp24-/-

las neuronas de los DRGs que expresan el neuropéptido CGRP muestran conos de
crecimiento complejos, con múltiples filopodios y sus axones son más ramificados in vitro e
hiperinervan el tejido cutáneo cuando son co-cultivadas con explantes de piel o in vivo. Todos
estos resultados demuestran que la ausencia de MT5-MMP en las neuronas sensoriales
nociceptivas peptidérgicas altera el crecimiento neurítico como consecuencia de un proceso
autónomo-celular. Además, la MT5-MMP también juega un papel en las interacciones célula-
célula entre neuritas nociceptivas y mastocitos. Hemos observado un aumento en el contacto
físico entre neuritas sensoriales Mmp24-/- y los mastocitos y esta interacción anormal se
correlaciona con una mayor proporción de mastocitos prematuramente degranulados tanto in
vivo como in vitro. Nuestros estudios bioquímicos en ambos tipos celulares demuestran que en
ausencia de MT-5-MMP se produce una distribución y procesamiento anormales de la N-
cadherina que tiene consecuencias en el comportamiento de los mastocitos, lo que sugiere que
los cambios en este sustrato de MT5-MMP es capaz de mediar las interacciones entre los
aferentes primarios sensoriales y los mastocitos de la piel, dando lugar a respuestas
comportamentales específicas del dolor.

Los resultados obtenidos de los estudios de comportamiento demuestran que la

ausencia de MT5-MMP produce una mayor sensibilidad a estímulos nociceptivos térmicos. Ya
que cada neurona sensorial inerva un área cutánea mucho mayor que las de fenotipo salvaje,
podemos especular que una mayor arborización en los terminales axónicos de las neuronas
sensoriales de ratones Mmp24-/- podría desencadenar más despolarizaciones individuales
originadas en las múltiples ramas del axón principal, en comparación con la cepa salvaje, que
llegarían finalmente a generar una mayor propagación de los impulsos nerviosos (Weidner et
al., 2003). Sin embargo, los registros de fibra única en las fibras nerviosas sensoriales de
ratones Mmp24-/- no mostraron diferencias significativas en las respuestas a estímulos
nociceptivos térmicos de calor de forma repetida (experimentos realizados por el laboratorio del
Dr. Carlos Belmonte en el INA-UMH; ver Rodríguez-Folgueras et al., 2009). Una interpretación
alternativa podría ser que existiera un mayor número de neuronas sensoriales en los ratones
mutantes que aumentara la afluencia sensorial final que llega a las neuronas de segundo orden
en el sistema nervioso central. Sin embargo, los recuentos del número de neuronas sensoriales
no revelaron diferencias entre genotipos ni in vivo ni in vitro en presencia de NGF. Por tanto, la
explicación más plausible para la percepción incrementada del dolor es que se estimulen más
neuronas sensoriales con cada estímulo al existir una mayor profusión de fibras nociceptivas
en la piel.

Una cepa similar ya había sido generada con anterioridad y en ella se habían descrito
alteraciones en dolor neuropático (Komori et al., 2004). Sin embargo, nosotros no hemos
podido demostrar en nuestra cepa Mmp24-/- la ausencia de la alodinia mecánica causada por
una lesión del nervio ciático (datos no mostrados) como se había publicado anteriormente en la
cepa de ratones deficientes en MT5-MMP (Komori et al., 2004). En dicho trabajo se sugiere
que la ausencia de la alodinia mecánica en esta cepa mutante es consecuencia de la

125
Discusión

incapacidad de las propias fibras mecánicas Aβ de expandirse por las capas superficiales del
asta dorsal de la médula espinal. En nuestra cepa tampoco hemos observado este defecto en
las fibras mecánicas. Estas diferencias pueden deberse a las diferentes estrategias empleadas
para la delección de Mmp24 o a las características y el fondo genético de los ratones
empleados en ambos estudios.

Hemos demostrado que prácticamente todas las neuronas que expresan MT5-MMP en
los DRGs son CGRP + y que, por el contrario, MT5-MMP no se expresa en las neuronas IB4+.
Curiosamente, no todos las neuronas CGRP+ de los DRGs expresan la proteína MT5-MMP y,
por tanto, esta metaloproteinasa podría considerarse un posible marcador de una subpoblación
específica de nociceptores peptidérgicos. Las poblaciones de nociceptores CGRP+ e IB4+
difieren en sus dependencias tróficas, en las moléculas neuroactivas que liberan o en sus
patrones de proyección central. Por otra parte, es generalmente aceptado que tanto las
neuronas peptidérgicas como las no peptidérgicas responden a diferentes estímulos
nociceptivos, siendo la población de neuronas peptidérgicas la que se encuentra
principalmente implicada en el incremento fisiológico de la capacidad de respuesta al dolor
consecuente a los procesos inflamatorios (Hunt y Mantyh, 2001). De acuerdo con la expresión
de la proteína MT5-MMP en las neuronas peptidérgicas, nuestro análisis del comportamiento
de los ratones mutantes se centró en el estudio de la respuesta dolorosa inflamatoria.

Curiosamente, cuando realizamos experimentos en los que se inyectó carragenina en

la pata trasera del ratón observamos que se producía una pérdida de respuesta al dolor térmico
en los animales mutantes, dato que resultó bastante sorprendente teniendo en cuenta nuestros
estudios previos de percepción dolorosa basal. Para explorar si el fenotipo de hiperalgesia en
esta cepa de ratones mutantes era debida a la ausencia en particular de alguno de los
mediadores conocidos de dolor inflamatorio, se evaluó el efecto hiperalgésico de una serie de
factores que se liberan durante el proceso de inflamación (Cunha et al., 2005; Marchand et al.,
2005). Nuestros resultados demostraron que sólo la administración de IL-6 o PGE2 produce
hiperalgesia en Mmp24-/- ratones, mientras que TNF-α, IL-1β y NGF no tienen ningún efecto, lo
que sugiere que estas proteínas actúan a través de una vía inflamatoria que se altera en los
ratones mutantes carentes de MT5-MMP. Ya que la acción de estos factores durante el
proceso inflamatorio puede estar organizada como una cascada de amplificación en la que
NGF sería la última de proteínas efectoras (Woolf et al., 1997), hemos centrado nuestra
investigación en algunas de las características particulares de la hiperalgesia inflamatoria
inducida por NGF. Los niveles del factor neurotrófico NGF aumentan en la piel durante el
proceso inflamatorio en respuesta a la presencia y acción del TNFα y a la IL-1β (Weskamp y
Otten, 1987; Woolf et al., 1997) y desempeñan un papel importante en la hiperalgesia
inflamatoria aguda mediante mecanismos periféricos (Shu y Mendell, 1999). Aunque el NGF es
capaz de sensibilizar las fibras nociceptivas directamente, los enfoques farmacológicos han
indicado que los mastocitos son mediadores necesarios en la hiperalgesia producida por NGF,
mediante la liberación de varias moléculas neuroactivas (como la serotonina, histamina y el
propio NGF), en respuesta a la estimulación con NGF (León et al., 1994; Lewin et al., 1994; Tal
y Liberman, 1997; Woolf et al., 1996). En nuestro trabajo hemos observado un aumento

126
 Discusión

anormal de mastocitos degranulados en condiciones basales, en muestras de ratones Mmp24-/-

. Mediante nuestro estudio demostramos que esta degranulación basal anormal impide una
degranulación inducida, ya sea por capsaicina o por NGF, y estos resultados correlacionan con
la falta de hiperalgesia tras la administración de NGF en vivo. Por lo tanto, nuestros resultados
están de acuerdo con la idea de que la liberación de moléculas neuroactivas por los mastocitos
es algo esencial para el proceso de sensibilización de la fibra nerviosa que desencadena la
hiperalgesia inflamatoria (Shu y Mendell, 1999).

De acuerdo con los resultados descritos por Suzuki & col. en el 2004, nuestros
resultados muestran como la degranulación de los mastocitos requiere de una interacción física
de las células inmunes con axones de las neuronas sensoriales. También hemos demostrado
que la proteína MT5-MMP regula esta interacción mediante un mecanismo que implica a la N-
cadherina, una molécula de adhesión célula-célula. Muchos trabajos han descrito como las
cadherinas median procesos de reconocimiento y adhesión celular en muchos tipos celulares y
en particular, se ha estudiado que la distribución subcelular de la N-cadherina en los mastocitos
cambia en respuesta al contacto con neuritas y que la N-cadherina se concentra en los puntos
de contacto celular regulando las interacciones sinápticas entre el nervio y el mastocito (Suzuki
et al., 2004). Por otro lado, se había demostrado en células heterólogas que la N-cadherina es
sustrato de la actividad proteolítica de MT5-MMP y que esta actividad libera el dominio
extracelular de interacción homofílica y genera diversos fragmentos intracelulares (Monea et
al., 2006). En este trabajo de tesis hemos probado que la N-cadherina es un sustrato de MT5-
MMP en células implicadas en la percepción y fisiología del dolor, neuronas sensoriales y
mastocitos de la piel. Por otra parte, la constatación de que el bloqueo de la N-cadherina
mediante anticuerpos específicos rescata la interacción anormal entre mastocitos y neuronas
mutantes apoya la hipótesis de que el fenotipo del ratón Mmp24-/- es consecuencia de una
actividad alterada de la N-cadherina en ambos tipos de células.

Es posible que los cambios en la adhesión celular sean también responsables del fenotipo
de hiperinervación cutánea. A pesar de que se ha demostrado que un aumento en la expresión
de factores tróficos son capaces de producir un incremento en el número de neuronas
sensoriales y sus ramificaciones en los territorios de destino, como se observa en los ratones
transgénicos que sobre expresan NGF bajo el promotor de la queratina 14 (Stucky et al., 1999),
no hemos detectado diferencias en los niveles de expresión de NGF en muestras de piel entre
genotipos. La neuritogénesis es un proceso muy dinámico que conlleva constantes extensiones
y retracciones del cono axónico de las neuronas y se sabe que la N-cadherina juega un papel
muy importante en la estabilización de las ramificaciones de las neuritas (Ye y Jan, 2005). Se
ha demostrado que la sobreexpresión de la N-cadherina y β-catenina en las neuronas del
hipocampo aumenta su arborización dendrítica (Yu y Malenka, 2003) y las neuronas
sensoriales de los DRGs mutantes para Mmp24 presentan niveles muy altos de beta-catenina.
Nuestros resultados también indican que la proteína MT5-MMP actúa de manera autónoma-
celular para regular el crecimiento la ramificación neurítica de neuronas aisladas cultivadas
sobre diferentes moléculas de la matriz extracelular. Aunque la N-cadherina es una molécula
homofílica de adhesión célula-célula, se ha mostrado que en otros tipos celulares la unión del
colágeno a integrinas puede regular el procesamiento de ectodominios de cadherinas mediante
metaloproteinasas y facilitar migración (Lee et al., 2007; Symowicz et al., 2007). Por lo tanto,

127
Discusión

los cambios en el procesamiento y distribución de la N-cadherina así como el aumento en los

niveles de β-catenina, observados en los cultivos mutantes de DRGs y BMMCs, pueden ser
mecanismos que justifiquen tanto el fenotipo de crecimiento neurítico como el de la interacción
neural-mastocitaria.

En conclusión, nuestros resultados proporcionan la primera evidencia causal de que la

ausencia de una metaloproteinasa en particular produce un fenotipo de hiperinervación cutánea
y una alteración morfológica y funcional de las interacciones neuro-inmune que tienen
consecuencias complejas en las respuestas nociceptivas, tanto en condiciones fisiológicas
como patológicas. Muchos trabajos han aportado evidencias acerca de la importancia de la
familia de enzimas proteolíticas MMP en la patología del sistema nervioso central y periférico.
Asimismo, el incremento en la expresión y la contribución de estas enzimas en detrimento de
una serie de patologías como la disfunción de la barrera sangre-cerebro, desmielinización,
neuroinflamación, lesión de la médula espinal, la esclerosis múltiple o accidente cerebro-
vascular hemorrágico ha sugerido el uso de inhibidores de metaloproteasas para el tratamiento
de enfermedades neurológicas (Hu et al., 2007; Yong et al., 2005). Más allá de estas
propuestas anteriores, y en base a los resultados presentados aquí, llegamos a la conclusión
de que algunas metaloproteinasas específicas también pueden constituir nuevas dianas
relevantes para el control del dolor. Los datos además destacan la relevancia de la interacción
neuro-inmune en el análisis de la fisiología del dolor (Scholz y Wolf, 2007). Por último, también
proponemos que los ratones deficientes en Mmp24 puede representar un modelo genético útil
para el análisis de los mecanismos subyacentes al desarrollo de estados crónicos de dolor
clínico.

Nuestros resultados sugieren que los mecanismos periféricos son muy relevantes en la
fisiología del dolor y que alteraciones en las vías nociceptivas pueden ser debidas a problemas
en el desarrollo de las neuronas sensoriales implicadas o a sus interacciones con elementos de
los territorios diana que inervan.

128
 Conclusiones

CONCLUSIONES

129
 Conclusiones

1. La expresión de BDNF es necesaria para la supervivencia durante el desarrollo postnatal de

los diferentes mecanorreceptores cutáneos inervados por aferentes mielínicos, tales como los
corpúsculos de Meissner, los complejos piloneurales o los complejos de células de Merkel.

2. La ausencia de BDNF produce la pérdida de aferentes sensoriales con fibras tipo C, una
reducción general de la densidad de terminales libres que inervan tanto la piel glabra como la
pilosa, una reducción de la inervación en el asta dorsal de la médula espinal y también la
pérdida de neuronas CGRP+ e IB4+ en los ganglios lumbares de la raíz dorsal.

3. La ventana temporal en la que BDNF afecta a la supervivencia de los aferentes nerviosos

de las poblaciones de nociceptores y mecanorreceptores se limita al periodo postnatal.

4. BDNF es una molécula esencial para la supervivencia de las neuronas nociceptivas

cutáneas durante su primera semana de vida, justo cuando éstos están perdiendo su
dependencia neurotrófica de NGF. Durante este periodo se reduce la expresión del receptor
TrkA y las neuronas que expresan el neuropéptido CGRP y/o que presentan sitios de unión
para la lectina IB4, sobreviven in vitro en presencia de BDNF.

5. BDNF mantiene a una población de células que también pueden sobrevivir en presencia de
NGF y GDNF, mediante la expresión diferencial de factores tróficos en una ventana
espacio/temporal. El BDNF requerido para la supervivencia de las neuronas sensoriales
nociceptivas, es producido por los propios ganglios de la raíz dorsal de forma
autocrina/paracrina.

6. La proteína MT5-MMP es esencial para determinar el tamaño del campo receptivo de las
neuronas nociceptivas cutáneas y la ausencia de la proteína en las neuronas sensoriales
nociceptivas peptidérgicas altera el crecimiento neurítico como consecuencia de un proceso
autónomo-celular.

7. MT5-MMP juega un papel fundamental en las interacciones célula-célula entre neuritas

nociceptivas y mastocitos. En ausencia de MT-5-MMP se produce una distribución y
procesamiento anormales de la N-cadherina alterando el comportamiento de los mastocitos.

8. MT5-MMP es capaz de mediar las interacciones entre los aferentes primarios sensoriales y
los mastocitos de la piel, dando lugar a respuestas comportamentales específicas del dolor.

131
 Bibliografía

BIBLIOGRAFÍA

133
 Bibliografía

Acheson, A., Conover, J. C., Fandl, J. P., DeChiara, T. M., Russell, M., Thadani, A. et al. (1995) A
BDNF autocrine loop in adult sensory neurons prevents cell death. Nature 374: 450-453.

Agrawal, A. K., Jelen, M., Grzebieniak, Z., Zukrowski, P., Rudnicki, J., and Nienartowicz, E. (2008)
Androgen receptors as a prognostic and predictive factor in breast cancer. Folia Histochem
Cytobiol 46: 269-276.

Agrawal, A. K., Jelen, M., Rudnicki, J., Grzebieniak, Z., Zukrowski, P., and Nienartowicz, E. (2008)
Molecular markers (c-erbB-2, p53) in breast cancer. Folia Histochem Cytobiol 46: 449-455.

Altar, C. A. and DiStefano, P. S. (1998) Neurotrophin trafficking by anterograde transport. Trends

Neurosci 21: 433-437.

Apte, S. S., Fukai, N., Beier, D. R., and Olsen, B. R. (1997) The matrix metalloproteinase-14
(MMP-14) gene is structurally distinct from other MMP genes and is co-expressed with the
TIMP-2 gene during mouse embryogenesis. J Biol Chem 272: 25511-25517.

Artuc, M., Grutzkau, A., Luger, T., and Henz, B. M. (1999) Expression of MC1- and MC5-receptors
on the human mast cell line HMC-1. Ann N Y Acad Sci 885: 364-367.

Artuc, M., Hermes, B., Steckelings, U. M., Grutzkau, A., and Henz, B. M. (1999) Mast cells and
their mediators in cutaneous wound healing--active participants or innocent bystanders?
Exp Dermatol 8: 1-16.

Bahjaoui-Bouhaddi, M., Padilla, F., Nicolet, M., Cifuentes-Diaz, C., Fellmann, D., and Mege, R. M.
(1997) Localized deposition of M-cadherin in the glomeruli of the granular layer during the
postnatal development of mouse cerebellum. J Comp Neurol 378: 180-195.

Bandtlow, C. E. and Schwab, M. E. (2000) NI-35/250/nogo-a: a neurite growth inhibitor restricting

structural plasticity and regeneration of nerve fibers in the adult vertebrate CNS. Glia 29:
175-181.

Bandtlow, C. E. and Zimmermann, D. R. (2000) Proteoglycans in the developing brain: new

conceptual insights for old proteins. Physiol Rev 80: 1267-1290.

Bao,W., Zheng,J., Wu,X.F., Cao,J.G., Yang,Z.J., Ren,N., Tang,Y., Gao,Y., Huang,J.P., and
Zhou,L.W. (2010). Short axis contact in the chaining of ellipsoidal particles of polar
molecule dominated electrorheological fluid. J. Phys. Condens. Matter 22, 324105.

Barde, Y. A., Edgar, D., and Thoenen, H. (1982) Purification of a new neurotrophic factor from
mammalian brain. EMBO J 1: 549-553.

Bar-Or, A., Nuttall, R. K., Duddy, M., Alter, A., Kim, H. J., Ifergan, I. et al. (2003) Analyses of all
matrix metalloproteinase members in leukocytes emphasize monocytes as major
inflammatory mediators in multiple sclerosis. Brain 126: 2738-2749.

135
 Bibliografía

Beattie, E. C., Carroll, R. C., Yu, X., Morishita, W., Yasuda, H., von, Z. M. et al. (2000) Regulation
of AMPA receptor endocytosis by a signaling mechanism shared with LTD. Nat Neurosci 3:
1291-1300.

Beattie, E. C., Howe, C. L., Wilde, A., Brodsky, F. M., and Mobley, W. C. (2000) NGF signals
through TrkA to increase clathrin at the plasma membrane and enhance clathrin-mediated
membrane trafficking. J Neurosci 20: 7325-7333.

Benedetti, M., Levi, A., and Chao, M. V. (1993) Differential expression of nerve growth factor
receptors leads to altered binding affinity and neurotrophin responsiveness. Proc Natl Acad
Sci U S A 90: 7859-7863.

Bentley, C. A. and Lee, K. F. (2000) p75 is important for axon growth and schwann cell migration
during development. J Neurosci 20: 7706-7715.

Bernik, T. R., Friedman, S. G., Ochani, M., DiRaimo, R., Ulloa, L., Yang, H. et al. (2002)
Pharmacological stimulation of the cholinergic antiinflammatory pathway. J Exp Med 195:
781-788.

Bi, X., Lynch, G., Zhou, J., and Gall, C. M. (2001) Polarized distribution of alpha5 integrin in
dendrites of hippocampal and cortical neurons. J Comp Neurol 435: 184-193.

Bi, X., Yong, A. P., Zhou, J., Ribak, C. E., and Lynch, G. (2001) Rapid induction of intraneuronal
neurofibrillary tangles in apolipoprotein E-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A 98:
8832-8837.

Bibel, M., Hoppe, E., and Barde, Y. A. (1999) Biochemical and functional interactions between the
neurotrophin receptors Trk and p75NTR. EMBO J 18: 616-622.

Biederer, T., Sara, Y., Mozhayeva, M., Atasoy, D., Liu, X., Kavalali, E. T. et al. (2002) SynCAM, a
synaptic adhesion molecule that drives synapse assembly. Science 297: 1525-1531.

Birkedal-Hansen, H. (1993) Role of matrix metalloproteinases in human periodontal diseases. J

Periodontol 64: 474-484.

Birkedal-Hansen, H. (1995) Matrix metalloproteinases. Adv Dent Res 9: 16.

Birkedal-Hansen, H. (1995) Proteolytic remodeling of extracellular matrix. Curr Opin Cell Biol 7:
728-735.

Birkedal-Hansen, H., Moore, W. G., Bodden, M. K., Windsor, L. J., Birkedal-Hansen, B., DeCarlo,
A. et al. (1993) Matrix metalloproteinases: a review. Crit Rev Oral Biol Med 4: 197-250.

Bishop, J. F., Mueller, G. P., and Mouradian, M. M. (1994) Alternate 5' exons in the rat brain-
derived neurotrophic factor gene: differential patterns of expression across brain regions.
Brain Res Mol Brain Res 26: 225-232.

136
 Bibliografía

Bixby, J. L. and Bookman, R. J. (1996) Intracellular mechanisms of axon growth induction by CAMs
and integrins: some unresolved issues. Perspect Dev Neurobiol 4: 147-156.

Bixby, J. L., Grunwald, G. B., and Bookman, R. J. (1994) Ca2+ influx and neurite growth in
response to purified N-cadherin and laminin. J Cell Biol 127: 1461-1475.

Black, R. A., Rauch, C. T., Kozlosky, C. J., Peschon, J. J., Slack, J. L., Wolfson, M. F. et al. (1997)
A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from cells.
Nature 385: 729-733.

Blum, R., Kafitz, K. W., and Konnerth, A. (2002) Neurotrophin-evoked depolarization requires the
sodium channel Na(V)1.9. Nature 419: 687-693.

Bonni, A., Brunet, A., West, A. E., Datta, S. R., Takasu, M. A., and Greenberg, M. E. (1999) Cell
survival promoted by the Ras-MAPK signaling pathway by transcription-dependent and -
independent mechanisms. Science 286: 1358-1362.

Borovikova, L. V., Ivanova, S., Nardi, D., Zhang, M., Yang, H., Ombrellino, M. et al. (2000) Role of
vagus nerve signaling in CNI-1493-mediated suppression of acute inflammation. Auton
Neurosci 85: 141-147.

Borovikova, L. V., Ivanova, S., Zhang, M., Yang, H., Botchkina, G. I., Watkins, L. R. et al. (2000)
Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin.
Nature 405: 458-462.

Bothwell, M. (1995) Functional interactions of neurotrophins and neurotrophin receptors. Annu Rev
Neurosci 18: 223-253.

Boucher, T. J. and McMahon, S. B. (2001) Neurotrophic factors and neuropathic pain. Curr Opin
Pharmacol 1: 66-72.

Bowden, J. J., Garland, A. M., Baluk, P., Lefevre, P., Grady, E. F., Vigna, S. R. et al. (1994) Direct
observation of substance P-induced internalization of neurokinin 1 (NK1) receptors at sites
of inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A 91: 8964-8968.

Brain, S. D. and Williams, T. J. (1988) Neuropharmacology of peptides in skin. Semin Dermatol 7:

278-283.

Brain, S. D. and Williams, T. J. (1988) Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin
gene-related peptide. Nature 335: 73-75.

Brennan, C., Rivas-Plata, K., and Landis, S. C. (1999) The p75 neurotrophin receptor influences
NT-3 responsiveness of sympathetic neurons in vivo. Nat Neurosci 2: 699-705.

Brew, K., Dinakarpandian, D., and Nagase, H. (2000) Tissue inhibitors of metalloproteinases:
evolution, structure and function. Biochim Biophys Acta 1477: 267-283.

Brogden, K. A., Guthmiller, J. M., Salzet, M., and Zasloff, M. (2005) The nervous system and innate
immunity: the neuropeptide connection. Nat Immunol 6: 558-564.

137
 Bibliografía

Brown, P. D., Kleiner, D. E., Unsworth, E. J., and Stetler-Stevenson, W. G. (1993) Cellular
activation of the 72 kDa type IV procollagenase/TIMP-2 complex. Kidney Int 43: 163-170.

Browner, M. F., Smith, W. W., and Castelhano, A. L. (1995) Matrilysin-inhibitor complexes:

common themes among metalloproteases. Biochemistry 34: 6602-6610.

Bruce, A. B. (1910) the mendelian theory of heredity and the augmentation of vigor1. Science 32:
627-628.

Bruce, H. A. (1910) IV. Chloroma of the Jaws 4. Ann Surg 51: 52-64.

Bruce, I. (1910) Discussion on Pericarditis with Effusion, as determined by Operation or Post-

mortem Examination 3. Proc R Soc Med 3: 93-94.

Bruce, L. C. (1910) Remarks on the effect of bacterial vaccines on nutrition 2. Br Med J 1: 430-432.

Brunet, A., Bonni, A., Zigmond, M. J., Lin, M. Z., Juo, P., Hu, L. S. et al. (1999) Akt promotes cell
survival by phosphorylating and inhibiting a Forkhead transcription factor. Cell 96: 857-868.

Buchman, V. L., Sporn, M., and Davies, A. M. (1994) Role of transforming growth factor-beta
isoforms in regulating the expression of nerve growth factor and neurotrophin-3 mRNA
levels in embryonic cutaneous cells at different stages of development. Development 120:
1621-1629.

Buck, S. H. and Burks, T. F. (1986) The neuropharmacology of capsaicin: review of some recent
observations. Pharmacol Rev 38: 179-226.

Burgoyne, R. D. and Cambray-Deakin, M. A. (1988) The cellular neurobiology of neuronal

development: the cerebellar granule cell. Brain Res 472: 77-101.

Burmeister, D. W., Rivas, R. J., and Goldberg, D. J. (1991) Substrate-bound factors stimulate
engorgement of growth cone lamellipodia during neurite elongation. Cell Motil Cytoskeleton
19: 255-268.

Butte, M. J., Hwang, P. K., Mobley, W. C., and Fletterick, R. J. (1998) Crystal structure of
neurotrophin-3 homodimer shows distinct regions are used to bind its receptors.
Biochemistry 37: 16846-16852.

Calverley,D.C., Phang,T.L., Choudhury,Q.G., Gao,B., Oton,A.B., Weyant,M.J., and Geraci,M.W.

(2010). Significant downregulation of platelet gene expression in metastatic lung cancer.
Clin. Transl. Sci. 3, 227-232.

Canossa, M., Gartner, A., Campana, G., Inagaki, N., and Thoenen, H. (2001) Regulated secretion
of neurotrophins by metabotropic glutamate group I (mGluRI) and Trk receptor activation is
mediated via phospholipase C signalling pathways. EMBO J 20: 1640-1650.

Carroll, P., Lewin, G. R., Koltzenburg, M., Toyka, K. V., and Thoenen, H. (1998) A role for BDNF in
mechanosensation. Nat Neurosci 1: 42-46.

138
 Bibliografía

Caterson, B., Flannery, C. R., Hughes, C. E., and Little, C. B. (2000) Mechanisms involved in
cartilage proteoglycan catabolism. Matrix Biol 19: 333-344.

Caulfield, J. P., Lewis, R. A., Hein, A., and Austen, K. F. (1980) Secretion in dissociated human
pulmonary mast cells. Evidence for solubilization of granule contents before discharge. J
Cell Biol 85: 299-312.

Cervero, F. (1995) Visceral pain: mechanisms of peripheral and central sensitization 3. Ann Med
27: 235-239.

Chamak, B. and Prochiantz, A. (1989) [Axons, dendrites and adhesion]. C R Acad Sci III 308: 353-
358.

Chamak, B. and Prochiantz, A. (1989) Influence of extracellular matrix proteins on the expression
of neuronal polarity. Development 106: 483-491.

Chambers, A. F. and Matrisian, L. M. (1997) Changing views of the role of matrix

metalloproteinases in metastasis. J Natl Cancer Inst 89: 1260-1270.

Chang, S. C., Tucker, T., Thorogood, N. P., and Brown, C. J. (2006) Mechanisms of X-
chromosome inactivation 1. Front Biosci 11: 852-866.

Chao, M. V. (2003) Dependence receptors: what is the mechanism? Sci STKE 2003: E38.

Chao, M. V. (2003) Neurotrophins and their receptors: a convergence point for many signalling
pathways. Nat Rev Neurosci 4: 299-309.

Chao, M. V. (2003) Retrograde transport redux. Neuron 39: 1-2.

Chen, C. C., Grimbaldeston, M. A., Tsai, M., Weissman, I. L., and Galli, S. J. (2005) Identification
of mast cell progenitors in adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 11408-11413.

Ching,C.B., Wood,H.M., Ross,J.H., Gao,T., and Angermeier,K.W. (2011). The Cleveland Clinic
experience with adult hypospadias patients undergoing repair: their presentation and a new
classification system. BJU. Int. 107, 1142-1146.

Chun,J.Y., Tummala,R., Nadiminty,N., Lou,W., Liu,C., Yang,J., Evans,C.P., Zhou,Q., and Gao,A.C.
(2010). Andrographolide, an herbal medicine, inhibits interleukin-6 expression and
suppresses prostate cancer cell growth. Genes Cancer 1, 868-876.

Clary, D. O. and Reichardt, L. F. (1994) An alternatively spliced form of the nerve growth factor
receptor TrkA confers an enhanced response to neurotrophin 3. Proc Natl Acad Sci U S A
91: 11133-11137.

Clary, D. O., Weskamp, G., Austin, L. R., and Reichardt, L. F. (1994) TrkA cross-linking mimics
neuronal responses to nerve growth factor. Mol Biol Cell 5: 549-563.

139
 Bibliografía

Coderre, T. J. and Melzack, R. (1991) Central neural mediators of secondary hyperalgesia

following heat injury in rats: neuropeptides and excitatory amino acids. Neurosci Lett 131:
71-74.

Coderre, T. J., Basbaum, A. I., Helms, C., and Levine, J. D. (1991) High-dose epinephrine acts at
alpha 2-adrenoceptors to suppress experimental arthritis. Brain Res 544: 325-328.

Coderre, T. J., Chan, A. K., Helms, C., Basbaum, A. I., and Levine, J. D. (1991) Increasing
sympathetic nerve terminal-dependent plasma extravasation correlates with decreased
arthritic joint injury in rats. Neuroscience 40: 185-189.

Cohen, S. (1960) Purification of a nerve-growth promoting protein from the mouse salivary gland
and its neuro-cytotoxic antiserum 18. Proc Natl Acad Sci U S A 46: 302-311.

Cohen, S. and Levi-Montalcini, R. (1956). A nerve growth-stimulating factor isolated from snake
venom. Proc Natl Acad Sci U S A 42: 571-574.

Coppola, V., Barrick, C. A., Bobisse, S., Rodriguez-Galan, M. C., Pivetta, M., Reynolds, D. et al.
(2006) The scaffold protein Cybr is required for cytokine-modulated trafficking of leukocytes
in vivo 1. Mol Cell Biol 26: 5249-5258.

Coppola, V., Barrick, C. A., Southon, E. A., Celeste, A., Wang, K., Chen, B. et al. (2004) Ablation of
TrkA function in the immune system causes B cell abnormalities 2. Development 131:
5185-5195.

Corbit, K. C., Foster, D. A., and Rosner, M. R. (1999) Protein kinase Cdelta mediates neurogenic
but not mitogenic activation of mitogen-activated protein kinase in neuronal cells. Mol Cell
Biol 19: 4209-4218.

Curtis, R., Adryan, K. M., Stark, J. L., Park, J. S., Compton, D. L., Weskamp, G. et al. (1995)
Differential role of the low affinity neurotrophin receptor (p75) in retrograde axonal transport
of the neurotrophins. Neuron 14: 1201-1211.

Dai,H., Liu,F., Gao,Q., Fu,T., and Kou,X. (2011). A highly selective fluorescent sensor for mercury
ion (II) based on azathia-crown ether possessing a dansyl moiety. Luminescence. 26, 523-
530.

Datta, S. R., Brunet, A., and Greenberg, M. E. (1999) Cellular survival: a play in three Akts. Genes
Dev 13: 2905-2927.

Daumke,O., Gao,S., von der,M.A., Haller,O., and Kochs,G. (2010). Structure of the MxA stalk
elucidates the assembly of ring-like units of an antiviral module. Small GTPases. 1, 62-64.

Davies, A. M. (1993) Promoting motor neuron survival. Curr Biol 3: 879-881.

Davies, A. M., Horton, A., Burton, L. E., Schmelzer, C., Vandlen, R., and Rosenthal, A. (1993)
Neurotrophin-4/5 is a mammalian-specific survival factor for distinct populations of sensory
neurons. J Neurosci 13: 4961-4967.

140
 Bibliografía

Davies, A. M., Lee, K. F., and Jaenisch, R. (1993) p75-deficient trigeminal sensory neurons have
an altered response to NGF but not to other neurotrophins. Neuron 11: 565-574.

Deeb,D., Gao,X., Arbab,A.S., Barton,K., Dulchavsky,S.A., and Gautam,S.C. (2010). CDDO-Me: A

Novel Synthetic Triterpenoid for the Treatment of Pancreatic Cancer. Cancers. (Basel) 2,
1779-1793.

Dickson, B. J. (2002) Molecular mechanisms of axon guidance. Science 298: 1959-1964.

Dickson, B. J. and Senti, K. A. (2002) Axon guidance: growth cones make an unexpected turn.
Curr Biol 12: R218-R220.

Donovan, M. J., Lin, M. I., Wiegn, P., Ringstedt, T., Kraemer, R., Hahn, R. et al. (2000) Brain
derived neurotrophic factor is an endothelial cell survival factor required for intramyocardial
vessel stabilization. Development 127: 4531-4540.

Du, J., Feng, L., Yang, F., and Lu, B. (2000) Activity- and Ca(2+)-dependent modulation of surface
expression of brain-derived neurotrophic factor receptors in hippocampal neurons. J Cell
Biol 150: 1423-1434.

Du,J., Zheng,J., Li,Y., Li,J., Ji,G., Dong,G., Yang,Z., Wang,W., and Gao,Z. (2010). Laparoscopy-
assisted total gastrectomy with extended lymph node resection for advanced gastric
cancer--reports of 82 cases. Hepatogastroenterology 57, 1589-1594.

Edelman, G. M. and Chuong, C. M. (1982) Embryonic to adult conversion of neural cell adhesion
molecules in normal and staggerer mice. Proc Natl Acad Sci U S A 79: 7036-7040.

Edelman, G. M. and Jones, F. S. (1998) Gene regulation of cell adhesion: a key step in neural
morphogenesis. Brain Res Brain Res Rev 26: 337-352.

Eide, F. F., Vining, E. R., Eide, B. L., Zang, K., Wang, X. Y., and Reichardt, L. F. (1996) Naturally
occurring truncated TrkB receptors have dominant inhibitory effects on brain-derived
neurotrophic factor signaling. J Neurosci 16: 3123-3129.

Elenkov, I. J., Chrousos, G. P., and Wilder, R. L. (2000) Neuroendocrine regulation of IL-12 and
TNF-alpha/IL-10 balance. Clinical implications. Ann N Y Acad Sci 917: 94-105.

Elenkov, I. J., Wilder, R. L., Chrousos, G. P., and Vizi, E. S. (2000) The sympathetic nerve--an
integrative interface between two supersystems: the brain and the immune system.
Pharmacol Rev 52: 595-638.

Enerback, L. (1966) Mast cells in rat gastrointestinal mucosa. 2. Dye-binding and metachromatic
properties. Acta Pathol Microbiol Scand 66: 303-312.

Enerback, L. (1966) Mast cells in rat gastrointestinal mucosa. 3. Reactivity towards compound
48/80. Acta Pathol Microbiol Scand 66: 313-322.

Enerback, L. (1966) Mast cells in rat gastrointestinal mucosa. 4. Monoamine storing capacity. Acta
Pathol Microbiol Scand 67: 365-379.

141
 Bibliografía

Enerback, L. (1966) Mast cells in rat gastrointestinal mucosa. I. Effects of fixation. Acta Pathol
Microbiol Scand 66: 289-302.

Engelhardt, J. I., Soos, J., Obal, I., Vigh, L., and Siklos, L. (2005) Subcellular localization of IgG
from the sera of ALS patients in the nervous system. Acta Neurol Scand 112: 126-133.

Ernfors, P., Lee, K. F., Kucera, J., and Jaenisch, R. (1994) Lack of neurotrophin-3 leads to
deficiencies in the peripheral nervous system and loss of limb proprioceptive afferents. Cell
77: 503-512.

Ernfors, P., Wetmore, C., Olson, L., and Persson, H. (1990) Identification of cells in rat brain and
peripheral tissues expressing mRNA for members of the nerve growth factor family.
Neuron 5: 511-526.

Esch, T., Lemmon, V., and Banker, G. (1999) Local presentation of substrate molecules directs
axon specification by cultured hippocampal neurons. J Neurosci 19: 6417-6426.

Esch, T., Lemmon, V., and Banker, G. (2000) Differential effects of NgCAM and N-cadherin on the
development of axons and dendrites by cultured hippocampal neurons. J Neurocytol 29:
215-223.

Eskandari, F. and Sternberg, E. M. (2002) Neural-immune interactions in health and disease. Ann
N Y Acad Sci 966: 20-27.

Eskandari, F., Webster, J. I., and Sternberg, E. M. (2003) Neural immune pathways and their
connection to inflammatory diseases. Arthritis Res Ther 5: 251-265.

Esposito, D., Patel, P., Stephens, R. M., Perez, P., Chao, M. V., Kaplan, D. R. et al. (2001) The
cytoplasmic and transmembrane domains of the p75 and Trk A receptors regulate high
affinity binding to nerve growth factor. J Biol Chem 276: 32687-32695.

Ethell, I. M. and Ethell, D. W. (2007) Matrix metalloproteinases in brain development and

remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res 85: 2813-2823.

Evanko, S. P., Tammi, M. I., Tammi, R. H., and Wight, T. N. (2007) Hyaluronan-dependent
pericellular matrix. Adv Drug Deliv Rev 59: 1351-1365.

Faivre-Sarrailh, C. and Rougon, G. (1993) Are the glypiated adhesion molecules preferentially
targeted to the axonal compartment? Mol Neurobiol 7: 49-60.

Faivre-Sarrailh, C., Falk, J., Pollerberg, E., Schachner, M., and Rougon, G. (1999) NrCAM,
cerebellar granule cell receptor for the neuronal adhesion molecule F3, displays an actin-
dependent mobility in growth cones. J Cell Sci 112 Pt 18: 3015-3027.

Faivre-Sarrailh, C., Lena, J. Y., Had, L., Vignes, M., and Lindberg, U. (1993) Location of profilin at
presynaptic sites in the cerebellar cortex; implication for the regulation of the actin-
polymerization state during axonal elongation and synaptogenesis. J Neurocytol 22: 1060-
1072.

142
 Bibliografía

Fambrough, D. and Goodman, C. S. (1996) The Drosophila beaten path gene encodes a novel
secreted protein that regulates defasciculation at motor axon choice points. Cell 87: 1049-
1058.

Fambrough, D., Pan, D., Rubin, G. M., and Goodman, C. S. (1996) The cell surface
metalloprotease/disintegrin Kuzbanian is required for axonal extension in Drosophila. Proc
Natl Acad Sci U S A 93: 13233-13238.

Fan,Y.J., Ye,Y.B., Gao,W., Zhang,F., and Zhang,Y.X. (2010). [Study on the seasonal variations of
the active components in Acer truncatum leaves and the inhibitory ability on fatty acid
synthase]. Zhong. Yao Cai. 33, 1740-1742.

Fang,P., Gao,Q., Liu,W.J., Qi,X.X., Li,G.B., Zhang,J., Li,Z.H., Sun,J.L., Sun,J.H., and Gao,Y.M.
(2010). Survival and differentiation of neuroepithelial stem cells on chitosan bicomponent
fibers. Chin J. Physiol 53, 208-214.

Farhadi, H. F., Mowla, S. J., Petrecca, K., Morris, S. J., Seidah, N. G., and Murphy, R. A. (2000)
Neurotrophin-3 sorts to the constitutive secretory pathway of hippocampal neurons and is
diverted to the regulated secretory pathway by coexpression with brain-derived
neurotrophic factor. J Neurosci 20: 4059-4068.

Fariñas, I., Jones, K. R., Backus, C., Wang, X. Y., and Reichardt, L. F. (1994) Severe sensory and
sympathetic deficits in mice lacking neurotrophin-3. Nature 369: 658-661.

Fariñas, I., Wilkinson, G. A., Backus, C., Reichardt, L. F., and Patapoutian, A. (1998)
Characterization of neurotrophin and Trk receptor functions in developing sensory ganglia:
direct NT-3 activation of TrkB neurons in vivo. Neuron 21: 325-334.

Fariñas, I., Yoshida, C. K., Backus, C., and Reichardt, L. F. (1996) Lack of neurotrophin-3 results in
death of spinal sensory neurons and premature differentiation of their precursors. Neuron
17: 1065-1078.

Felten, D. L. and Felten, S. Y. (1987) Immune interactions with specific neural structures. Brain
Behav Immun 1: 279-283.

Felten, D. L., Ackerman, K. D., Wiegand, S. J., and Felten, S. Y. (1987) Noradrenergic sympathetic
innervation of the spleen: I. Nerve fibers associate with lymphocytes and macrophages in
specific compartments of the splenic white pulp. J Neurosci Res 18: 28-21.

Felten, D. L., Felten, S. Y., Bellinger, D. L., Carlson, S. L., Ackerman, K. D., Madden, K. S. et al.
(1987) Noradrenergic sympathetic neural interactions with the immune system: structure
and function. Immunol Rev 100: 225-260.

Felten, D. L., Felten, S. Y., Carlson, S. L., Olschowka, J. A., and Livnat, S. (1985) Noradrenergic
and peptidergic innervation of lymphoid tissue. J Immunol 135: 755s-765s.

Fitzgerald, M. (1983) Capsaicin and sensory neurones--a review. Pain 15: 109-130.

Flannery, C. R. (2006) MMPs and ADAMTSs: functional studies. Front Biosci 11: 544-569.

143
 Bibliografía

Flannery, C. R. (2006) Usurped SLRPs: novel arthritis biomarkers exposed by catabolism of small
leucine-rich proteoglycans? Arthritis Res Ther 8: 106.

Frade, J. M. and Barde, Y. A. (1998) Microglia-derived nerve growth factor causes cell death in the
developing retina. Neuron 20: 35-41.

Frade, J. M. and Barde, Y. A. (1998) Nerve growth factor: two receptors, multiple functions.
Bioessays 20: 137-145.

Fritzsch, B., Fariñas, I., and Reichardt, L. F. (1997) Lack of neurotrophin 3 causes losses of both
classes of spiral ganglion neurons in the cochlea in a region-specific fashion 1. J Neurosci
17: 6213-6225.

Galko, M. J. and Tessier-Lavigne, M. (2000) Biochemical characterization of netrin-synergizing

activity. J Biol Chem 275: 7832-7838.

Galko, M. J. and Tessier-Lavigne, M. (2000) Function of an axonal chemoattractant modulated by

metalloprotease activity. Science 289: 1365-1367.

Galli, S. J., Grimbaldeston, M., and Tsai, M. (2008) Immunomodulatory mast cells: negative, as
well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol 8: 478-486.

Galli, S. J., Iemura, A., Garlick, D. S., Gamba-Vitalo, C., Zsebo, K. M., and Andrews, R. G. (1993)
Reversible expansion of primate mast cell populations in vivo by stem cell factor. J Clin
Invest 91: 148-152.

Galli, S. J., Tsai, M., and Wershil, B. K. (1993) The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells.
What each is teaching us about the others. Am J Pathol 142: 965-974.

Galtrey, C. M. and Fawcett, J. W. (2007) Characterization of tests of functional recovery after

median and ulnar nerve injury and repair in the rat forelimb. J Peripher Nerv Syst 12: 11-
27.

Galtrey, C. M. and Fawcett, J. W. (2007) The role of chondroitin sulfate proteoglycans in

regeneration and plasticity in the central nervous system. Brain Res Rev 54: 1-18.

Gao,X., Zhang,H., Steinberg,G., and Zhao,H. (2010). The Akt pathway is involved in rapid ischemic
tolerance in focal ischemia in Rats. Transl. Stroke Res. 1, 202-209.

Garner, A. S., Menegay, H. J., Boeshore, K. L., Xie, X. Y., Voci, J. M., Johnson, J. E. et al. (1996)
Expression of TrkB receptor isoforms in the developing avian visual system. J Neurosci 16:
1740-1752.

Goda, Y. (2002) Cadherins communicate structural plasticity of presynaptic and postsynaptic

terminals. Neuron 35: 1-3.

Goltz, M., Broll, H., Mankertz, A., Weigelt, W., Ludwig, H., Buhk, H. J. et al. (1994) Glycoprotein B
of bovine herpesvirus type 4: its phylogenetic relationship to gB equivalents of the
herpesviruses 1. Virus Genes 9: 53-59.

144
 Bibliografía

Gonthier, B., Nasarre, C., Roth, L., Perraut, M., Thomasset, N., Roussel, G. et al. (2007) Functional
interaction between matrix metalloproteinase-3 and semaphorin-3C during cortical axonal
growth and guidance. Cereb Cortex 17: 1712-1721.

Green, P. G., Luo, J., Hammond, E. R., and Levine, J. D. (1993) Trypsin enhances sympathetic
neuron-dependent plasma extravasation in the rat knee joint. Neurosci Lett 158: 117-119.

Green, P. G., Luo, J., Heller, P. H., and Levine, J. D. (1993) Neurogenic and non-neurogenic
mechanisms of plasma extravasation in the rat. Neuroscience 52: 735-743.

Greene, J., Wang, M., Liu, Y. E., Raymond, L. A., Rosen, C., and Shi, Y. E. (1996) Molecular
cloning and characterization of human tissue inhibitor of metalloproteinase 4. J Biol Chem
271: 30375-30380.

Grewal, J. S., Mukhin, Y. V., Garnovskaya, M. N., Raymond, J. R., and Greene, E. L. (1999)
Serotonin 5-HT2A receptor induces TGF-beta1 expression in mesangial cells via ERK:
proliferative and fibrotic signals. Am J Physiol 276: F922-F930.

Grewal, S. S., York, R. D., and Stork, P. J. (1999) Extracellular-signal-regulated kinase signalling in
neurons. Curr Opin Neurobiol 9: 544-553.

Guiton, M., Gunn-Moore, F. J., and Tavare, J. M. (1995) Critical role for the phosphorylation of
tyrosines 674 and 675 in signalling by the Trk tyrosine kinase. Biochem Soc Trans 23:
176S.

Guiton, M., Gunn-Moore, F. J., Glass, D. J., Geis, D. R., Yancopoulos, G. D., and Tavare, J. M.
(1995) Naturally occurring tyrosine kinase inserts block high affinity binding of
phospholipase C gamma and Shc to TrkC and neurotrophin-3 signaling. J Biol Chem 270:
20384-20390.

Guo,Y., Yue,Q., and Gao,B. (2010). Probing the molecular mechanism of C.I. Acid red 73 binding
to human serum albumin. Environ. Toxicol. Pharmacol. 30, 45-51.

Gurish, M. F., Tao, H., Abonia, J. P., Arya, A., Friend, D. S., Parker, C. M. et al. (2001) Intestinal
mast cell progenitors require CD49dbeta7 (alpha4beta7 integrin) for tissue-specific homing.
J Exp Med 194: 1243-1252.

Haas, T. L., Davis, S. J., and Madri, J. A. (1998) Three-dimensional type I collagen lattices induce
coordinate expression of matrix metalloproteinases MT1-MMP and MMP-2 in
microvascular endothelial cells. J Biol Chem 273: 3604-3610.

Hallbook, F. (1999) Evolution of the vertebrate neurotrophin and Trk receptor gene families. Curr
Opin Neurobiol 9: 616-621.

Hallbook, F., Ibanez, C. F., and Persson, H. (1991) Evolutionary studies of the nerve growth factor
family reveal a novel member abundantly expressed in Xenopus ovary. Neuron 6: 845-
858.

Harvima, I. T., Horsmanheimo, L., Naukkarinen, A., and Horsmanheimo, M. (1994) Mast cell
proteinases and cytokines in skin inflammation. Arch Dermatol Res 287: 61-67.

145
 Bibliografía

Hayashita-Kinoh, H., Kinoh, H., Okada, A., Komori, K., Itoh, Y., Chiba, T. et al. (2001) Membrane-
type 5 matrix metalloproteinase is expressed in differentiated neurons and regulates axonal
growth 1. Cell Growth Differ 12: 573-580.

Heerssen, H. M. and Segal, R. A. (2002) Location, location, location: a spatial view of neurotrophin
signal transduction 1. Trends Neurosci 25: 160-165.

Hetman, M. and Xia, Z. (2000) Signaling pathways mediating anti-apoptotic action of neurotrophins
2. Acta Neurobiol Exp (Wars ) 60: 531-545.

Hetman, M., Cavanaugh, J. E., Kimelman, D., and Xia, Z. (2000) Role of glycogen synthase
kinase-3beta in neuronal apoptosis induced by trophic withdrawal 5. J Neurosci 20: 2567-
2574.

Heymach, J. V., Jr., Kruttgen, A., Suter, U., and Shooter, E. M. (1996) The regulated secretion and
vectorial targeting of neurotrophins in neuroendocrine and epithelial cells 1. J Biol Chem
271: 25430-25437.

Hohn, A., Leibrock, J., Bailey, K., and Barde, Y. A. (1990) Identification and characterization of a
novel member of the nerve growth factor/brain-derived neurotrophic factor family 13.
Nature 344: 339-341.

Holgado-Madruga, M., Moscatello, D. K., Emlet, D. R., Dieterich, R., and Wong, A. J. (1997) Grb2-
associated binder-1 mediates phosphatidylinositol 3-kinase activation and the promotion of
cell survival by nerve growth factor 1. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 12419-12424.

Holmbeck, K., Bianco, P., Caterina, J., Yamada, S., Kromer, M., Kuznetsov, S. A. et al. (1999)
MT1-MMP-deficient mice develop dwarfism, osteopenia, arthritis, and connective tissue
disease due to inadequate collagen turnover 3. Cell 99: 81-92.

Holzer, P. (1988) Local effector functions of capsaicin-sensitive sensory nerve endings:

involvement of tachykinins, calcitonin gene-related peptide and other neuropeptides /21.
Neuroscience 24: 739-768.

Holzer, P. (1991) Capsaicin as a tool for studying sensory neuron functions 28. Adv Exp Med Biol
298: 3-16.

Holzer, P. (1991) Capsaicin: cellular targets, mechanisms of action, and selectivity for thin sensory
neurons 15. Pharmacol Rev 43: 143-201.

Holzer, P. and Lippe, I. T. (1988) Stimulation of afferent nerve endings by intragastric capsaicin
protects against ethanol-induced damage of gastric mucosa 1. Neuroscience 27: 981-987.

Horigome, K., Pryor, J. C., Bullock, E. D., and Johnson, E. M., Jr. (1993) Mediator release from
mast cells by nerve growth factor. Neurotrophin specificity and receptor mediation 4. J Biol
Chem 268: 14881-14887.

Hu, X. X., Goldmuntz, E. A., and Brosnan, C. F. (1991) The effect of norepinephrine on endotoxin-
mediated macrophage activation 1. J Neuroimmunol 31: 35-42.

146
 Bibliografía

Huang, E. J. and Reichardt, L. F. (2001) Neurotrophins: roles in neuronal development and

function 1. Annu Rev Neurosci 24: 677-736.

Huang, E. J. and Reichardt, L. F. (2003) Trk receptors: roles in neuronal signal transduction 2.
Annu Rev Biochem 72: 609-642.

Huang,Q., Gao,S.B., Zhang,Z.M., Lin,H.J., Pan,G.T., Yang,K.C., and Rong,T.Z. (2010).

[Construction of root library by SSH and preliminary analysis of genes responsible for
phosphorus deficiency in maize]. Genetika 46, 1619-1625.

Hunt, S. P. and Mantyh, P. W. (2001) The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci 2:
83-91.

Hynes, R. O. (1992) Integrins: versatility, modulation, and signaling in cell adhesion. Cell 69: 11-25.

Hynes, R. O. (1992) Specificity of cell adhesion in development: the cadherin superfamily. Curr
Opin Genet Dev 2: 621-624.

Hynes, R. O. (2002) A reevaluation of integrins as regulators of angiogenesis 18. Nat Med 8: 918-
921.

Hynes, R. O. (2002) Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines 17. Cell 110: 673-687.

Hynes, R. O. and Lander, A. D. (1992) Contact and adhesive specificities in the associations,
migrations, and targeting of cells and axons. Cell 68: 303-322.

Hynes, R. O., George, E. L., Georges, E. N., Guan, J. L., Rayburn, H., and Yang, J. T. (1992)
Toward a genetic analysis of cell-matrix adhesion. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 57:
249-258.

Hynes, R. O., Lively, J. C., McCarty, J. H., Taverna, D., Francis, S. E., Hodivala-Dilke, K. et al.
(2002) The diverse roles of integrins and their ligands in angiogenesis 3. Cold Spring Harb
Symp Quant Biol 67: 143-153.

Hynes, R. O., Sauer, R. T., and Sharp, P. A. (1992) The whitehead institute and mit. Science 256:
719.

Ip, N. Y., Ibanez, C. F., Nye, S. H., McClain, J., Jones, P. F., Gies, D. R. et al. (1992) Mammalian
neurotrophin-4: structure, chromosomal localization, tissue distribution, and receptor
specificity 2. Proc Natl Acad Sci U S A 89: 3060-3064.

Ito, A., Jippo, T., Wakayama, T., Morii, E., Koma, Y., Onda, H. et al. (2003) SgIGSF: a new mast-
cell adhesion molecule used for attachment to fibroblasts and transcriptionally regulated by
MITF 2. Blood 101: 2601-2608.

Itoh, Y., Kajita, M., Kinoh, H., Mori, H., Okada, A., and Seiki, M. (1999) Membrane type 4 matrix
metalloproteinase (MT4-MMP, MMP-17) is a glycosylphosphatidylinositol-anchored
proteinase 1. J Biol Chem 274: 34260-34266.

147
 Bibliografía

Jancso, N., Jancso-Gabor, A., and Szolcsanyi, J. (1967) Direct evidence for neurogenic
inflammation and its prevention by denervation and by pretreatment with capsaicin 1. Br J
Pharmacol Chemother 31: 138-151.

Jaworski, D. M. (2000) Developmental regulation of membrane type-5 matrix metalloproteinase

(MT5-MMP) expression in the rat nervous system 1. Brain Res 860: 174-177.

Jiang,X., Li,H., Luo,Q., and Gao,J.H. (2011). Modeling MR signal change induced by oxygen effect
in neural tissue preparations of various geometries. Magn Reson. Med. 65, 1358-1364.

Jiang,Y., Gao,F., Xu,X., Ye,K., and Zhou,G. (2011). Changes in the composition of the bacterial
flora on tray-packaged pork during chilled storage analyzed by PCR-DGGE and real-time
PCR. J. Food Sci. 76, M27-M33.

Jones, K. R. and Reichardt, L. F. (1990) Molecular cloning of a human gene that is a member of
the nerve growth factor family 1. Proc Natl Acad Sci U S A 87: 8060-8064.

Jones, K. R., Fariñas, I., Backus, C., and Reichardt, L. F. (1994) Targeted disruption of the BDNF
gene perturbs brain and sensory neuron development but not motor neuron development.
Cell 76: 989-999.

Jonsson-Rylander, A. C., Nilsson, T., Fritsche-Danielson, R., Hammarstrom, A., Behrendt, M.,
Andersson, J. O. et al. (2005) Role of ADAMTS-1 in atherosclerosis: remodeling of carotid
artery, immunohistochemistry, and proteolysis of versican 4. Arterioscler Thromb Vasc Biol
25: 180-185.

Kaczmarek, L., Lapinska-Dzwonek, J., and Szymczak, S. (2002) Matrix metalloproteinases in the
adult brain physiology: a link between c-Fos, AP-1 and remodeling of neuronal
connections? 8. EMBO J 21: 6643-6648.

Kaczmarek, L., Luniewski, W., Zagrodzki, B., Godlewska, J., Osiadacz, J., Wietrzyk, J. et al. (2002)
Synthesis of 6-substituted 6H-indolo[2,3-b]quinolines as novel cytotoxic agents and
topoisomerase II inhibitors. Acta Pol Pharm 59: 199-207.

Kajita, M., Kinoh, H., Ito, N., Takamura, A., Itoh, Y., Okada, A. et al. (1999) Human membrane
type-4 matrix metalloproteinase (MT4-MMP) is encoded by a novel major transcript:
isolation of complementary DNA clones for human and mouse mt4-mmp transcripts 2.
FEBS Lett 457: 353-356.

Kaplan, D. R. and Miller, F. D. (2000) Neurotrophin signal transduction in the nervous system 2.
Curr Opin Neurobiol 10: 381-391.

Kayagaki, N. and Yagita, H. (1996) [Metalloproteinase-mediated release of human fas ligand] 3.

Nihon Rinsho 54: 1747-1752.

Kermani, P., Rafii, D., Jin, D. K., Whitlock, P., Schaffer, W., Chiang, A. et al. (2005) Neurotrophins
promote revascularization by local recruitment of TrkB+ endothelial cells and systemic
mobilization of hematopoietic progenitors 2. J Clin Invest 115: 653-663.

148
 Bibliografía

Khom, S., Baburin, I., Timin, E. N., Hohaus, A., Sieghart, W., and Hering, S. (2006)
Pharmacological properties of GABAA receptors containing gamma1 subunits 9. Mol
Pharmacol 69: 640-649.

Khom, S., Baburin, I., Timin, E., Hohaus, A., Trauner, G., Kopp, B. et al. (2007) Valerenic acid
potentiates and inhibits GABA(A) receptors: molecular mechanism and subunit specificity
8. Neuropharmacology 53: 178-187.

Khom, S., Strommer, B., Ramharter, J., Schwarz, T., Schwarzer, C., Erker, T. et al. (2010)
Valerenic acid derivatives as novel subunit-selective GABAA receptor ligands - in vitro and
in vivo characterization 4. Br J Pharmacol 161: 65-78.

Kinoh, H., Sato, H., Tsunezuka, Y., Takino, T., Kawashima, A., Okada, Y. et al. (1996) MT-MMP,
the cell surface activator of proMMP-2 (pro-gelatinase A), is expressed with its substrate in
mouse tissue during embryogenesis 2. J Cell Sci 109 ( Pt 5): 953-959.

Kirstein, M. and Fariñas, I. (2002) Sensing life: regulation of sensory neuron survival by
neurotrophins 3. Cell Mol Life Sci 59: 1787-1802.

Kitamura, Y. (2005) [Recent progress of mast cell research] 5. Arerugi 54: 45-47.

Kitamura, Y. (2005) MITF and SgIGSF: an essential transcription factor and its target adhesion
molecule for development and survival of mast cells 1. Novartis Found Symp 271: 4-11.

Kitamura, Y. and Ito, A. (2005) Mast cell-committed progenitors 2. Proc Natl Acad Sci U S A 102:
11129-11130.

Kitamura, Y., Yokoyama, M., Matsuda, H., Ohno, T., and Mori, K. J. (1981) Spleen colony-forming
cell as common precursor for tissue mast cells and granulocytes 1. Nature 291: 159-160.

Klein, R. (1994) Role of neurotrophins in mouse neuronal development. FASEB J 8: 738-744.

Klein, R., Silos-Santiago, I., Smeyne, R. J., Lira, S. A., Brambilla, R., Bryant, S. et al. (1994)
Disruption of the neurotrophin-3 receptor gene TrkC eliminates la muscle afferents and
results in abnormal movements. Nature 368: 249-251.

Kohm, A. P., Tang2 Y, Sanders, V. M., and Jones3 SB (2000) Activation of antigen-specific CD4+
Th2 cells and B cells in vivo increases norepinephrine release in the spleen and bone
marrow 1. J Immunol 165: 725-733.

Koibuchi, N., Fukuda, H., and Chin, W. W. (1999) Promoter-specific regulation of the brain-derived
neurotropic factor gene by thyroid hormone in the developing rat cerebellum 1.
Endocrinology 140: 3955-3961.

Koibuchi, N., Liu, Y., Fukuda, H., Takeshita, A., Yen, P. M., and Chin, W. W. (1999) ROR alpha
augments thyroid hormone receptor-mediated transcriptional activation 4. Endocrinology
140: 1356-1364.

Kojima, S., Itoh, Y., Matsumoto, S., Masuho, Y., and Seiki, M. (2000) Membrane-type 6 matrix
metalloproteinase (MT6-MMP, MMP-25) is the second glycosyl-phosphatidyl inositol (GPI)-
anchored MMP 2. FEBS Lett 480: 142-146.

149
 Bibliografía

Kolbeck, R., Jungbluth, S., and Barde, Y. A. (1994) Characterisation of neurotrophin dimers and
monomers 1. Eur J Biochem 225: 995-1003.

Komori, K., Nonaka, T., Okada, A., Kinoh, H., Hayashita-Kinoh, H., Yoshida, N. et al. (2004)
Absence of mechanical allodynia and Abeta-fiber sprouting after sciatic nerve injury in mice
lacking membrane-type 5 matrix metalloproteinase. FEBS Lett 557: 125-128.

Kultti, A., Rilla, K., Tiihonen, R., Spicer, A. P., Tammi, R. H., and Tammi, M. I. (2006) Hyaluronan
synthesis induces microvillus-like cell surface protrusions 1. J Biol Chem 281: 15821-
15828.

Kuo,C.H., Gao,K., Clifford,A., Shannon,K., and Clark,J. (2011). Orbital exenterations: an 18-year
experience from a single head and neck unit. ANZ. J. Surg. 81, 326-330.

Kuramochi, M., Fukuhara, H., Nobukuni, T., Kanbe, T., Maruyama, T., Ghosh, H. P. et al. (2001)
TSLC1 is a tumor-suppressor gene in human non-small-cell lung cancer 21. Nat Genet 27:
427-430.

Lafont, F., Rouget, M., Triller, A., Prochiantz, A., and Rousselet, A. (1992) In vitro control of
neuronal polarity by glycosaminoglycans. Development 114: 17-29.

Lai, K. O., Fu, W. Y., Ip, F. C., and Ip, N. Y. (1998) Cloning and expression of a novel neurotrophin,
NT-7, from carp 1. Mol Cell Neurosci 11: 64-76.

Laird, J. M., de la Rubia, P. G., and Cervero, F. (1995) Excitability changes of somatic and viscero-
somatic nociceptive reflexes in the decerebrate-spinal rabbit: role of NMDA receptors. J
Physiol 489 ( Pt 2): 545-555.

Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., and Zimmermann, D. R. (1995) Versican is
selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration
and axon outgrowth 5. Development 121: 2303-2312.

Lawrence, T., Willoughby, D. A., and Gilroy, D. W. (2002) Anti-inflammatory lipid mediators and
insights into the resolution of inflammation 5. Nat Rev Immunol 2: 787-795.

Lee, R., Kermani, P., Teng, K. K., and Hempstead, B. L. (2001) Regulation of cell survival by
secreted proneurotrophins 1. Science 294: 1945-1948.

Leighton, P. A., Mitchell, K. J., Goodrich, L. V., Lu, X., Pinson, K., Scherz, P. et al. (2001) Defining
brain wiring patterns and mechanisms through gene trapping in mice 1. Nature 410: 174-
179.

Levi-Montalcini, R. (1987) The nerve growth factor: thirty-five years later 2. Biosci Rep 7: 681-699.

Levi-Montalcini, R. and Cohen, S. (1956). In vitro and in vivo effects of a nerve growth-stimulating
agent isolated from snake venom. Proc Natl Acad Sci U S A 42: 695-699.

Levine, J. D., Dardick, S. J., Basbaum, A. I., and Scipio, E. (1985) Reflex neurogenic inflammation.
I. Contribution of the peripheral nervous system to spatially remote inflammatory responses
that follow injury 2. J Neurosci 5: 1380-1386.

150
 Bibliografía

Levy, D., Burstein, R., Kainz, V., Jakubowski, M., and Strassman, A. M. (2007) Mast cell
degranulation activates a pain pathway underlying migraine headache 3. Pain 130: 166-
176.

Lewin, G. R. and Barde, Y. A. (1996) Physiology of the neurotrophins 2. Annu Rev Neurosci 19:
289-317.

Lewin, G. R. and Mendell, L. M. (1994) Regulation of cutaneous C-fiber heat nociceptors by nerve
growth factor in the developing rat 3. J Neurophysiol 71: 941-949.

Lewin, G. R., Rueff, A., and Mendell, L. M. (1994) Peripheral and central mechanisms of NGF-
induced hyperalgesia 1. Eur J Neurosci 6: 1903-1912.

Li,L., He,Q., and Gao,Y.S. (2010). [Phosphodiesterase regulation of cardiovascular functions].

Sheng Li Ke. Xue. Jin. Zhan. 41, 100-106.

Li,L., Yue,Z., Lu,H., Zhang,Y., Liu,C., Gao,S., and Yue,W. (2010). [The expression of EMS1 and
DcR3 protein in laryngeal carcinoma and the relation between EMS1 and DcR3]. Lin.
Chung Er. Bi Yan. Hou Tou. Jing. Wai Ke. Za Zhi. 24, 1126-8, 1141.

Li,S., Cui,L., Zhao,J., Dai,P., Zong,S., Zuo,W., Chen,C., Jin,H., Gao,H., and Liu,Q. (2011).
Seroprevalence of Toxoplasma gondii infection in female sterility patients in China. J.
Parasitol. 97, 529-530.

Li,Z., Ni,J., Fang,G., Gao,Y., and Wei,J. (2010). [Effect of baicalin on pharmacokinetics of
chlorogenic acid in rabbits]. Zhongguo Zhong. Yao Za Zhi. 35, 3291-3293.

Li,Z.C., Li,H.J., Dai,L.L., Gao,Y.Q., Cai,W.P., Li,H.Y., Huang,X.J., Zhang,T., and Wu,H. (2010).
Liver injury in HIV-1-infected patients receiving non-nucleosides reverse transcriptase
inhibitors-based antiretroviral therapy. Chin Med. J. (Engl. ) 123, 3587-3590.

Liebl, D. J., Klesse, L. J., Tessarollo, L., Wohlman, T., and Parada, L. F. (2000) Loss of brain-
derived neurotrophic factor-dependent neural crest-derived sensory neurons in
neurotrophin-4 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 2297-2302.

Liepinsh, E., Ilag, L. L., Otting, G., and Ibanez, C. F. (1997) NMR structure of the death domain of
the p75 neurotrophin receptor 3. EMBO J 16: 4999-5005.

Lin, S., Lian, Q., and Pang, M. (2000) [Exploration on parameters of TCM syndrome in acute
cerebral infarction through investigating active factors of vascular endothelium cells] 3.
Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi 20: 911-914.

Liotta, L. A., Goldfarb, R. H., Brundage, R., Siegal, G. P., Terranova, V., and Garbisa, S. (1981)
Effect of plasminogen activator (urokinase), plasmin, and thrombin on glycoprotein and
collagenous components of basement membrane 2. Cancer Res 41: 4629-4636.

Lipton, J. M. and Catania, A. (1997) Anti-inflammatory actions of the neuroimmunomodulator

alpha-MSH 1. Immunol Today 18: 140-145.

151
 Bibliografía

Liu,W., Huang,D., Liu,K., Hu,S., Yu,J., Gao,G., and Song,S. (2010). Discovery, identification and
comparative analysis of non-specific lipid transfer protein (nsLtp) family in Solanaceae.
Genomics Proteomics. Bioinformatics. 8, 229-237.

Llano, E., Pendas, A. M., Freije, J. P., Nakano, A., Knauper, V., Murphy, G. et al. (1999)
Identification and characterization of human MT5-MMP, a new membrane-bound activator
of progelatinase a overexpressed in brain tumors 1. Cancer Res 59: 2570-2576.

Lopez-Otin, C. and Bond, J. S. (2008) Proteases: multifunctional enzymes in life and disease1. J
Biol Chem 283: 30433-30437.

Lorentz, A., Schwengberg, S., Sellge, G., Manns, M. P., and Bischoff, S. C. (2000) Human
intestinal mast cells are capable of producing different cytokine profiles: role of IgE receptor
cross-linking and IL-4 1. J Immunol 164: 43-48.

Luckenbill-Edds, L. (1997) Laminin and the mechanism of neuronal outgrowth 1. Brain Res Brain
Res Rev 23: 1-27.

Maeda, N. and Noda, M. (1996) 6B4 proteoglycan/phosphacan is a repulsive substratum but

promotes morphological differentiation of cortical neurons. Development 122: 647-658.

Maggi, C. A. (1995) Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as co-transmitters

released from peripheral endings of sensory nerves 20. Prog Neurobiol 45: 1-98.

Maggi, C. A. (1995) The mammalian tachykinin receptors 9. Gen Pharmacol 26: 911-944.

Maggi, C. A., Giachetti, A., Dey, R. D., and Said, S. I. (1995) Neuropeptides as regulators of airway
function: vasoactive intestinal peptide and the tachykinins 15. Physiol Rev 75: 277-322.

Maggi, C. A., Santicioli, P., and Giuliani, S. (1995) Role of cyclic AMP and protein kinase A in K+
channel activation by calcitonin gene-related peptide (CGRP) in the guinea-pig ureter 6. J
Auton Pharmacol 15: 403-419.

Mahadeo, D., Kaplan, L., Chao, M. V., and Hempstead, B. L. (1994) High affinity nerve growth
factor binding displays a faster rate of association than p140Trk binding. Implications for
multi-subunit polypeptide receptors 1. J Biol Chem 269: 6884-6891.

Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., and Abraham, S. N. (1996) Mast cell modulation of neutrophil
influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha 8. Nature 381: 77-80.

Malaviya, R., Morrison, A. R., and Pentland, A. P. (1996) Histamine in human epidermal cells is
induced by ultraviolet light injury 11. J Invest Dermatol 106: 785-789.

Malaviya, R., Twesten, N. J., Ross, E. A., Abraham, S. N., and Pfeifer, J. D. (1996) Mast cells
process bacterial Ags through a phagocytic route for class I MHC presentation to T cells
13. J Immunol 156: 1490-1496.

Margolis, R. K., Rauch, U., Maurel, P., and Margolis, R. U. (1996) Neurocan and phosphacan: two
major nervous tissue-specific chondroitin sulfate proteoglycans 4. Perspect Dev Neurobiol
3: 273-290.

152
 Bibliografía

Marshall, J. S. and Bienenstock, J. (1994) The role of mast cells in inflammatory reactions of the
airways, skin and intestine. Curr Opin Immunol 6: 853-859.

Massaad, C. A., Safieh-Garabedian, B., Poole, S., Atweh, S. F., Jabbur, S. J., and Saade, N. E.
(2004) Involvement of substance P, CGRP and histamine in the hyperalgesia and cytokine
upregulation induced by intraplantar injection of capsaicin in rats 5. J Neuroimmunol 153:
171-182.

Massova, I. and Mobashery, S. (1998) Kinship and diversification of bacterial penicillin-binding

proteins and beta-lactamases 4. Antimicrob Agents Chemother 42: 1-17.

Massova, I., Kotra, L. P., and Mobashery, S. (1998) Structural insight into the binding motifs for the
calcium ion and the non-catalytic zinc in matrix metalloproteases 2. Bioorg Med Chem Lett
8: 853-858.

Massova, I., Kotra, L. P., Fridman, R., and Mobashery, S. (1998) Matrix metalloproteinases:
structures, evolution, and diversification 3. FASEB J 12: 1075-1095.

Massova, I., Martin, P., Bulychev, A., Kocz, R., Doyle, M., Edwards, B. F. et al. (1998) Templates
for design of inhibitors for serine proteases: application of the program DOCK to the
discovery of novel inhibitors for thrombin 1. Bioorg Med Chem Lett 8: 2463-2466.

Matthews, R. T., Gary, S. C., Zerillo, C., Pratta, M., Solomon, K., Arner, E. C. et al. (2000) Brain-
enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated
by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family
member 1. J Biol Chem 275: 22695-22703.

Mazurek, N., Weskamp, G., Erne, P., and Otten, U. (1986) Nerve growth factor induces mast cell
degranulation without changing intracellular calcium levels 1. FEBS Lett 198: 315-320.

McFarlane, S. (2003) Metalloproteases: carving out a role in axon guidance 4. Neuron 37: 559-
562.

McKay, N. G., Hunter, D. J., Haites, N. E., and Power, D. A. (1994) Regulation of alternative
splicing of the fibronectin IIICS domain by cytokines 3. Biochem Biophys Res Commun
199: 1005-1011.

McMahon, S. B., Armanini, M. P., Ling, L. H., and Phillips, H. S. (1994) Expression and
coexpression of Trk receptors in subpopulations of adult primary sensory neurons
projecting to identified peripheral targets 1. Neuron 12: 1161-1171.

Meakin, S. O. and Shooter, E. M. (1992) The nerve growth factor family of receptors 1. Trends
Neurosci 15: 323-331.

Meakin, S. O., Gryz, E. A., and MacDonald, J. I. (1997) A kinase insert isoform of rat TrkA supports
nerve growth factor-dependent cell survival but not neurite outgrowth 1. J Neurochem 69:
954-967.

153
 Bibliografía

Meakin, S. O., Suter, U., Drinkwater, C. C., Welcher, A. A., and Shooter, E. M. (1992) The rat Trk
protooncogene product exhibits properties characteristic of the slow nerve growth factor
receptor 2. Proc Natl Acad Sci U S A 89: 2374-2378.

Merighi, A. (2002) Costorage and coexistence of neuropeptides in the mammalian CNS 1. Prog
Neurobiol 66: 161-190.

Metcalfe, D. D., Baram, D., and Mekori, Y. A. (1997) Mast cells 2. Physiol Rev 77: 1033-1079.

Michele, D. E. and Campbell, K. P. (2003) Dystrophin-glycoprotein complex: post-translational

processing and dystroglycan function 26. J Biol Chem 278: 15457-15460.

Middleton, G., Hamanoue, M., Enokido, Y., Wyatt, S., Pennica, D., Jaffray, E. et al. (2000)
Cytokine-induced nuclear factor kappa B activation promotes the survival of developing
neurons 2. J Cell Biol 148: 325-332.

Minichiello, L., Piehl, F., Vazquez, E., Schimmang, T., Hokfelt, T., Represa, J. et al. (1995)
Differential effects of combined Trk receptor mutations on dorsal root ganglion and inner
ear sensory neurons. Development 121: 4067-4075.

Miranti, C. K. (2002) Application of cell adhesion to study signaling networks 1. Methods Cell Biol
69: 359-383.

Miranti, C. K. and Brugge, J. S. (2002) Sensing the environment: a historical perspective on

integrin signal transduction 2. Nat Cell Biol 4: E83-E90.

Molliver, D. C. and Snider, W. D. (1997) Nerve growth factor receptor TrkA is down-regulated
during postnatal development by a subset of dorsal root ganglion neurons. J Comp Neurol
381: 428-438.

Molliver, D. C., Wright, D. E., Leitner, M. L., Parsadanian, A. S., Doster, K., Wen, D. et al. (1997)
IB4-binding DRG neurons switch from NGF to GDNF dependence in early postnatal life.
Neuron 19: 849-861.

Monea, S., Jordan, B. A., Srivastava, S., DeSouza, S., and Ziff, E. B. (2006) Membrane localization
of membrane type 5 matrix metalloproteinase by AMPA receptor binding protein and
cleavage of cadherins. J Neurosci 26: 2300-2312.

Mowla, S. J., Pareek, S., Farhadi, H. F., Petrecca, K., Fawcett, J. P., Seidah, N. G. et al. (1999)
Differential sorting of nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor in
hippocampal neurons 2. J Neurosci 19: 2069-2080.

Mu, X., Silos-Santiago, I., Carroll, S. L., and Snider, W. D. (1993) Neurotrophin receptor genes are
expressed in distinct patterns in developing dorsal root ganglia. J Neurosci 13: 4029-4041.

Muir, D. (1994) Metalloproteinase-dependent neurite outgrowth within a synthetic extracellular

matrix is induced by nerve growth factor 2. Exp Cell Res 210: 243-252.

Nagase, H. (1994) Matrix metalloproteinases. A mini-review 39. Contrib Nephrol 107: 85-93.

154
 Bibliografía

Nagase, H. and Woessner, J. F., Jr. (1999) Matrix metalloproteinases 5. J Biol Chem 274: 21491-
21494.

Nagase, H., Fields, C. G., and Fields, G. B. (1994) Design and characterization of a fluorogenic
substrate selectively hydrolyzed by stromelysin 1 (matrix metalloproteinase-3) 13. J Biol
Chem 269: 20952-20957.

Nagase, H., Itoh, Y., and Binner, S. (1994) Interaction of alpha 2-macroglobulin with matrix
metalloproteinases and its use for identification of their active forms 8. Ann N Y Acad Sci
732: 294-302.

Naukkarinen, A., Harvima, I. T., Aalto, M. L., and Horsmanheimo, M. (1994) Mast cell tryptase and
chymase are potential regulators of neurogenic inflammation in psoriatic skin 8. Int J
Dermatol 33: 361-366.

Nelson, A. R., Fingleton, B., Rothenberg, M. L., and Matrisian, L. M. (2000) Matrix
metalloproteinases: biologic activity and clinical implications 1. J Clin Oncol 18: 1135-1149.

Niederost, B. P., Zimmermann, D. R., Schwab, M. E., and Bandtlow, C. E. (1999) Bovine CNS
myelin contains neurite growth-inhibitory activity associated with chondroitin sulfate
proteoglycans 1. J Neurosci 19: 8979-8989.

Niu,M., Du,M., Gao,Z., Yang,C., Lu,X., Qiao,R., and Gao,M. (2010). Monodispersed magnetic
polystyrene beads with excellent colloidal stability and strong magnetic response.
Macromol. Rapid Commun. 31, 1805-1810.

Nosaka, Y., Arai, A., Miyasaka, N., and Miura, O. (1999) CrkL mediates Ras-dependent activation
of the Raf/ERK pathway through the guanine nucleotide exchange factor C3G in
hematopoietic cells stimulated with erythropoietin or interleukin-3 8. J Biol Chem 274:
30154-30162.

Nurse,C.A. and Diamond,J. (1984). A fluorescent microscopic study of the development of rat
touch domes and their Merkel cells. Neuroscience 11, 509-520.

Oakley,R.A. and Tosney,K.W. (1991). Peanut agglutinin and chondroitin-6-sulfate are molecular
markers for tissues that act as barriers to axon advance in the avian embryo. Dev. Biol.
147, 187-206.

O'Connor,T.P., Saucier,J.M., Daniluk,D., Stillman,B.A., Krah,R., Rikihisa,Y., Xiong,Q.,

Yabsley,M.J., Adams,D.S., Diniz,P.P., Breitschwerdt,E.B., Gaunt,S.D., and
Chandrashekar,R. (2010). Evaluation of peptide- and recombinant protein-based assays
for detection of anti-Ehrlichia ewingii antibodies in experimentally and naturally infected
dogs. [corrected]. Am. J. Vet. Res. 71, 1195-1200.

Okada, A., Saez, S., Misumi, Y., and Basset, P. (1997) Rat stromelysin 3: cDNA cloning from
healing skin wound, activation by furin and expression in rat tissues 8. Gene 185: 187-
193.

Okada, A., Tomasetto, C., Lutz, Y., Bellocq, J. P., Rio, M. C., and Basset, P. (1997) Expression of
matrix metalloproteinases during rat skin wound healing: evidence that membrane type-1
matrix metalloproteinase is a stromal activator of pro-gelatinase A 6. J Cell Biol 137: 67-77.

155
 Bibliografía

Okamura,A.M., Simone,C., and O'Leary,M.D. (2004). Force modeling for needle insertion into soft
tissue. IEEE Trans. Biomed. Eng 51, 1707-1716.

Ottaway, C. A. (1991) Neuroimmunomodulation in the intestinal mucosa 1. Gastroenterol Clin

North Am 20: 511-529.

Overall, C. M. (2002) Molecular determinants of metalloproteinase substrate specificity: matrix

metalloproteinase substrate binding domains, modules, and exosites 6. Mol Biotechnol 22:
51-86.

Overall, C. M. and Lopez-Otin, C. (2002) Strategies for MMP inhibition in cancer: innovations for
the post-trial era 7. Nat Rev Cancer 2: 657-672.

Overall, C. M., McQuibban, G. A., and Clark-Lewis, I. (2002) Discovery of chemokine substrates for
matrix metalloproteinases by exosite scanning: a new tool for degradomics 3. Biol Chem
383: 1059-1066.

Page-McCaw, A. (2008) Remodeling the model organism: matrix metalloproteinase functions in

invertebrates 2. Semin Cell Dev Biol 19: 14-23.

Page-McCaw, A., Ewald, A. J., and Werb, Z. (2007) Matrix metalloproteinases and the regulation of
tissue remodelling 3. Nat Rev Mol Cell Biol 8: 221-233.

Pang, P. T. and Lu, B. (2004) Regulation of late-phase LTP and long-term memory in normal and
aging hippocampus: role of secreted proteins tPA and BDNF 1. Ageing Res Rev 3: 407-
430.

Pang, P. T., Teng, H. K., Zaitsev, E., Woo, N. T., Sakata, K., Zhen, S. et al. (2004) Cleavage of
proBDNF by tPA/plasmin is essential for long-term hippocampal plasticity 2. Science 306:
487-491.

Pang,M., Gao,C.L., Wu,Z.X., Lv,N., Wang,Z.L., Tang,X.X., and Qu,P. (2010). Apoptosis induced by
yessotoxins in Hela human cervical cancer cells in vitro. Mol. Med. Rep. 3, 629-634.

Pasche,F., Merot,Y., Carraux,P., and Saurat,J.H. (1990). Relationship between Merkel cells and
nerve endings during embryogenesis in the mouse epidermis. J. Invest Dermatol. 95, 247-
251.

Patapoutian, A. and Reichardt, L. F. (2001) Trk receptors: mediators of neurotrophin action 1. Curr
Opin Neurobiol 11: 272-280.

Patapoutian, A., Backus, C., Kispert, A., and Reichardt, L. F. (1999) Regulation of neurotrophin-3
expression by epithelial-mesenchymal interactions: the role of Wnt factors 1. Science 283:
1180-1183.

Patapoutian,A., Peier,A.M., Story,G.M., and Viswanath,V. (2003). ThermoTRP channels and

beyond: mechanisms of temperature sensation. Nat. Rev. Neurosci. 4, 529-539.

Pavloff, N., Rivard, D., Masson, S., Shen, S. H., and Mes-Masson, A. M. (1992) Sequence analysis
of the large and small subunits of human ribonucleotide reductase 2. DNA Seq 2: 227-234.

156
 Bibliografía

Pavloff, N., Staskus, P. W., Kishnani, N. S., and Hawkes, S. P. (1992) A new inhibitor of
metalloproteinases from chicken: ChIMP-3. A third member of the TIMP family 1. J Biol
Chem 267: 17321-17326.

Payan, D. G. (1989) Neuropeptides and inflammation: the role of substance P 26. Annu Rev Med
40: 341-352.

Payan, D. G. (1989) Substance P: a modulator of neuroendocrine-immune function 18. Hosp Pract

(Off Ed) 24: 67-80.

Pearce, F. L. (1982) Calcium and histamine secretion from mast cells 11. Prog Med Chem 19: 59-
109.

Pearce, F. L. (1982) Functional heterogeneity of mast cells from different species and tissues 2.
Klin Wochenschr 60: 954-957.

Pearce, F. L. and Clements, J. (1982) Effect of disodium cromoglycate and cyclic AMP-active
drugs on cytotoxic histamine release from rat mast cells 3. Biochem Pharmacol 31: 2247-
2250.

Pearce, F. L. and Messis, P. D. (1982) Phosphatidic acid induces histamine secretion from rat
peritoneal mast cells 14. Int Arch Allergy Appl Immunol 68: 93-95.

Pearce, F. L. and Thompson, H. L. (1986) Some characteristics of histamine secretion from rat
peritoneal mast cells stimulated with nerve growth factor 1. J Physiol 372: 379-393.

Pearce, F. L., Befus, A. D., and Bienenstock, J. (1982) Isolation and properties of mast cells from
the small bowel lamina propria of the rat 10. Agents Actions 12: 183-185.

Pearce, F. L., Befus, A. D., Gauldie, J., and Bienenstock, J. (1982) Mucosal mast cells. II. ffects of
anti-allergic compounds on histamine secretion by isolated intestinal mast cells 6. J
Immunol 128: 2481-2486.

Pedotti, R., De Voss, J. J., Steinman, L., and Galli, S. J. (2003) Involvement of both 'allergic' and
'autoimmune' mechanisms in EAE, MS and other autoimmune diseases 10. Trends
Immunol 24: 479-484.

Pedotti, R., DeVoss, J. J., Youssef, S., Mitchell, D., Wedemeyer, J., Madanat, R. et al. (2003)
Multiple elements of the allergic arm of the immune response modulate autoimmune
demyelination 20. Proc Natl Acad Sci U S A 100: 1867-1872.

Pedotti, R., Sanna, M., Tsai, M., DeVoss, J., Steinman, L., McDevitt, H. et al. (2003) Severe
anaphylactic reactions to glutamic acid decarboxylase (GAD) self peptides in NOD mice
that spontaneously develop autoimmune type 1 diabetes mellitus 17. BMC Immunol 4: 2.

Pedraza, C. E., Podlesniy, P., Vidal, N., Arevalo, J. C., Lee, R., Hempstead, B. et al. (2005) Pro-
NGF isolated from the human brain affected by Alzheimer's disease induces neuronal
apoptosis mediated by p75NTR 17. Am J Pathol 166: 533-543.

157
 Bibliografía

Pei, D. (1999) Leukolysin/MMP25/MT6-MMP: a novel matrix metalloproteinase specifically

expressed in the leukocyte lineage 2. Cell Res 9: 291-303.

Pinkstaff, J. K., Lynch, G., and Gall, C. M. (1998) Localization and seizure-regulation of integrin
beta 1 mRNA in adult rat brain 4. Brain Res Mol Brain Res 55: 265-276.

Porter, S., Clark, I. M., Kevorkian, L., and Edwards, D. R. (2005) The ADAMTS metalloproteinases
17. Biochem J 386: 15-27.

Powell, I. F., Li, T., Jack, H. M., and Ellis, T. M. (1998) Construction and expression of a soluble
form of human CD30 ligand with functional activity 3. J Leukoc Biol 63: 752-757.

Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M., Yamada, Y., and Kleinman, H. K. (1998) Laminin-like
proteins are differentially regulated during cerebellar development and stimulate granule
cell neurite outgrowth in vitro 1. J Neurosci Res 54: 233-247.

Preece, G., Murphy, G., and Ager, A. (1996) Metalloproteinase-mediated regulation of L-selectin
levels on leucocytes 8. J Biol Chem 271: 11634-11640.

Prochiantz, A. (1995) Neuronal polarity: giving neurons heads and tails 2. Neuron 15: 743-746.

Prochiantz, A. and Theodore, L. (1995) Nuclear/growth factors 6. Bioessays 17: 39-44.

Puente, J., Salas, M. A., Canon, C., Miranda, D., Wolf, M. E., and Mosnaim, A. D. (1996) Activation
of protein tyrosine kinase: a possible requirement for fixed-bacteria and lipopolysaccharide-
induced increase in human natural killer cell activity. Int J Clin Pharmacol Ther 34: 212-
218.

Puente, X. S., Pendas, A. M., Llano, E., Velasco, G., and Lopez-Otin, C. (1996) Molecular cloning
of a novel membrane-type matrix metalloproteinase from a human breast carcinoma.
Cancer Res 56: 944-949.

Quian, X. L., Decker, S. J., and Greene, M. I. (1992) p185c-neu and epidermal growth factor
receptor associate into a structure composed of activated kinases. Proc Natl Acad Sci U S
A 89: 1330-1334.

Ranum,L.P., Daughters,R.S., Tuttle,D.L., Gao,W., Ikeda,Y., Moseley,M.L., Ebner,T., and

Swanson,M.S. (2010). Double the trouble: bidirectional expression of the SCA8 CAG/CTG
expansion mutation - evidence for RNA and protein gain of function effects. Rinsho
Shinkeigaku 50, 982-983.

Rastegar,F., Shenaq,D., Huang,J., Zhang,W., Zhang,B.Q., He,B.C., Chen,L., Zuo,G.W., Luo,Q.,

Shi,Q., Wagner,E.R., Huang,E., Gao,Y., Gao,J.L., Kim,S.H., Zhou,J.Z., Bi,Y., Su,Y.,
Zhu,G., Luo,J., Luo,X., Qin,J., Reid,R.R., Luu,H.H., Haydon,R.C., Deng,Z.L., and He,T.C.
(2010). Mesenchymal stem cells: Molecular characteristics and clinical applications. World
J. Stem Cells 2, 67-80.

Rauch, U. (2004) Extracellular matrix components associated with remodeling processes in brain
1. Cell Mol Life Sci 61: 2031-2045.

158
 Bibliografía

Rauch, U., Hirakawa, S., Oohashi, T., Kappler, J., and Roos, G. (2004) Cartilage link protein
interacts with neurocan, which shows hyaluronan binding characteristics different from
CD44 and TSG-6 3. Matrix Biol 22: 629-639.

Reichard, J. F. and Petersen, D. R. (2006) Involvement of phosphatidylinositol 3-kinase and

extracellular-regulated kinase in hepatic stellate cell antioxidant response and
myofibroblastic transdifferentiation 30. Arch Biochem Biophys 446: 111-118.

Reichard, J. F., Dalton, T. P., Shertzer, H. G., and Puga, A. (2005) Induction of oxidative stress
responses by dioxin and other ligands of the aryl hydrocarbon receptor 1. Dose Response
3: 306-331.

Reichard, J. F., Schnekenburger, M., and Puga, A. (2007) Long term low-dose arsenic exposure
induces loss of DNA methylation 8. Biochem Biophys Res Commun 352: 188-192.

Reichardt, L. F. (2006) Neurotrophin-regulated signalling pathways 12. Philos Trans R Soc Lond B
Biol Sci 361: 1545-1564.

Renehan,W.E. and Munger,B.L. (1990). The development of Meissner corpuscles in primate digital
skin. Brain Res. Dev. Brain Res. 51, 35-44.

Riccio, A., Aaltonen, L. A., Godwin, A. K., Loukola, A., Percesepe, A., Salovaara, R. et al. (1999)
The DNA repair gene MBD4 (MED1) is mutated in human carcinomas with microsatellite
instability 6. Nat Genet 23: 266-268.

Riccio, A., Ahn, S., Davenport, C. M., Blendy, J. A., and Ginty, D. D. (1999) Mediation by a CREB
family transcription factor of NGF-dependent survival of sympathetic neurons 1. Science
286: 2358-2361.

Riehl,R., Johnson,K., Bradley,R., Grunwald,G.B., Cornel,E., Lilienbaum,A., and Holt,C.E. (1996).

Cadherin function is required for axon outgrowth in retinal ganglion cells in vivo. Neuron 17,
837-848.

Rilla, K., Tiihonen, R., Kultti, A., Tammi, M., and Tammi, R. (2008) Pericellular hyaluronan coat
visualized in live cells with a fluorescent probe is scaffolded by plasma membrane
protrusions 3. J Histochem Cytochem 56: 901-910.

Robinson, R. C., Radziejewski, C., Stuart, D. I., and Jones, E. Y. (1995) Structure of the brain-
derived neurotrophic factor/neurotrophin 3 heterodimer 2. Biochemistry 34: 4139-4146.

Rodriguez-Manzaneque, J. C., Graubert, M., and Iruela-Arispe, M. L. (2000) Endothelial cell

dysfunction following prolonged activation of progesterone receptor 1. Hum Reprod 15
Suppl 3: 39-47.

Rodriguez-Manzaneque, J. C., Milchanowski, A. B., Dufour, E. K., Leduc, R., and Iruela-Arispe, M.
L. (2000) Characterization of METH-1/ADAMTS1 processing reveals two distinct active
forms 2. J Biol Chem 275: 33471-33479.

Rodriguez-Tebar, A., Dechant, G., and Barde, Y. A. (1990) Binding of brain-derived neurotrophic
factor to the nerve growth factor receptor /1. Neuron 4: 487-492.

159
 Bibliografía

Rohrbough, J., Grotewiel, M. S., Davis, R. L., and Broadie, K. (2000) Integrin-mediated regulation
of synaptic morphology, transmission, and plasticity 1. J Neurosci 20: 6868-6878.

Rudick, C. N., Bryce, P. J., Guichelaar, L. A., Berry, R. E., and Klumpp, D. J. (2008) Mast cell-
derived histamine mediates cystitis pain 11. PLoS One 3: e2096.

Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., and Thumbikat, P. (2008) Experimental autoimmune prostatitis
induces chronic pelvic pain 14. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 294: R1268-
R1275.

Rueff,A. and Mendell,L.M. (1996). Nerve growth factor NT-5 induce increased thermal sensitivity of
cutaneous nociceptors in vitro. J. Neurophysiol. 76, 3593-3596.

Rueff,A., Dawson,A.J., and Mendell,L.M. (1996). Characteristics of nerve growth factor induced
hyperalgesia in adult rats: dependence on enhanced bradykinin-1 receptor activity but not
neurokinin-1 receptor activation. Pain 66, 359-372.

Ruoslahti, E. (1997) Integrins as signaling molecules and targets for tumor therapy 9. Kidney Int
51: 1413-1417.

Ruoslahti, E. (1997) Stretching is good for a cell 8. Science 276: 1345-1346.

Ruoslahti, E. and Engvall, E. (1997) Integrins and vascular extracellular matrix assembly 1. J Clin
Invest 100: S53-S56.

Ruoslahti, E. and Vaheri, A. (1997) Cell-to-cell contact and extracellular matrix 2. Curr Opin Cell
Biol 9: 605-607.

Saade, N. E., Baliki, M., El-Khoury, C., Hawwa, N., Atweh, S. F., Apkarian, A. V. et al. (2002) The
role of the dorsal columns in neuropathic behavior: evidence for plasticity and non-
specificity 7. Neuroscience 115: 403-413.

Saade, N. E., Massaad, C. A., Ochoa-Chaar, C. I., Jabbur, S. J., Safieh-Garabedian, B., and
Atweh, S. F. (2002) Upregulation of proinflammatory cytokines and nerve growth factor by
intraplantar injection of capsaicin in rats4. J Physiol 545: 241-253.

Saffell,J.L., Williams,E.J., Mason,I.J., Walsh,F.S., and Doherty,P. (1997). Expression of a dominant

negative FGF receptor inhibits axonal growth and FGF receptor phosphorylation stimulated
by CAMs. Neuron 18, 231-242.

Sah,D.W., Ossipo,M.H., and Porreca,F. (2003). Neurotrophic factors as novel therapeutics for
neuropathic pain. Nat. Rev. Drug Discov. 2, 460-472.

Sah,J.F., Balasubramanian,S., Eckert,R.L., and Rorke,E.A. (2004). Epigallocatechin-3-gallate

inhibits epidermal growth factor receptor signaling pathway. Evidence for direct inhibition of
ERK1/2 and AKT kinases. J. Biol. Chem. 279, 12755-12762.

Sakurai, H., Bush, K. T., and Nigam, S. K. (2001) Identification of pleiotrophin as a mesenchymal
factor involved in ureteric bud branching morphogenesis 311. Development 128: 3283-
3293.

160
 Bibliografía

Sandy, J. D. (2001) Proteoglycan core proteins and catabolic fragments present in tissues and
fluids 10. Methods Mol Biol 171: 335-345.

Sandy, J. D. and Verscharen, C. (2001) Analysis of aggrecan in human knee cartilage and synovial
fluid indicates that aggrecanase (ADAMTS) activity is responsible for the catabolic turnover
and loss of whole aggrecan whereas other protease activity is required for C-terminal
processing in vivo 7. Biochem J 358: 615-626.

Sandy, J. D., Westling, J., Kenagy, R. D., Iruela-Arispe, M. L., Verscharen, C., Rodriguez-
Mazaneque, J. C. et al. (2001) Versican V1 proteolysis in human aorta in vivo occurs at the
Glu441-Ala442 bond, a site that is cleaved by recombinant ADAMTS-1 and ADAMTS-4 19.
J Biol Chem 276: 13372-13378.

Sandy, J. R., Irvine, G. H., and Leach, A. (2001) Update on orthognathic surgery 4. Dent Update
28: 337-5.

Sandy, J. R., Williams, A. C., Bearn, D., Mildinhall, S., Murphy, T., Sell, D. et al. (2001) Cleft lip and
palate care in the United Kingdom--the Clinical Standards Advisory Group (CSAG) Study.
Part 1: background and methodology 24. Cleft Palate Craniofac J 38: 20-23.

Sanes, J. R. (1989) Analysing cell lineage with a recombinant retrovirus 9. Trends Neurosci 12: 21-
28.

Sanes, J. R. (1989) Extracellular matrix molecules that influence neural development 8. Annu Rev
Neurosci 12: 491-516.

Saragovi, H. U., Bhandoola, A., Moreau, J. L., Lavine, N., Gagnon, M., Lemercier, M. M. et al.
(1998) Functional and physical association of a cell surface phospholipid and interleukin-2
receptor p55(alpha) subunits 2. Biochim Biophys Acta 1414: 51-64.

Saragovi, H. U., Rebai, N., Roux, E., Gagnon, M., Zhang, X., Robaire, B. et al. (1998) Signal
transduction and antiproliferative function of the mammalian receptor for type 3 retrovirus
5. Curr Top Microbiol Immunol 233: 155-166.

Saragovi, H. U., Zheng, W., Maliartchouk, S., DiGugliemo, G. M., Mawal, Y. R., Kamen, A. et al.
(1998) A TrkA-selective, fast internalizing nerve growth factor-antibody complex induces
trophic but not neuritogenic signals 1. J Biol Chem 273: 34933-34940.

Saxod,R. (1996). Ontogeny of the cutaneous sensory organs. Microsc. Res. Tech. 34, 313-333.

Saxod,R., Pays,L., and Hemming,F.J. (1996). [Development of the cutaneous nervous system].
Pathol. Biol. (Paris) 44, 838-848.

Schecterson, L. C. and Bothwell, M. (1992) Novel roles for neurotrophins are suggested by BDNF
and NT-3 mRNA expression in developing neurons. Neuron 9: 449-463.

Schecterson,L.C. and Bothwell,M. (1992). Novel roles for neurotrophins are suggested by BDNF
and NT-3 mRNA expression in developing neurons. Neuron 9, 449-463.

161
 Bibliografía

Scheinman, R. I., Cogswell, P. C., Lofquist, A. K., and Baldwin, A. S., Jr. (1995) Role of
transcriptional activation of I kappa B alpha in mediation of immunosuppression by
glucocorticoids 1. Science 270: 283-286.

Scheinman, R. I., Gualberto, A., Jewell, C. M., Cidlowski, J. A., and Baldwin, A. S., Jr. (1995)
Characterization of mechanisms involved in transrepression of NF-kappa B by activated
glucocorticoid receptors 2. Mol Cell Biol 15: 943-953.

Schimmelpfeng, K., Gogel, S., and Klambt, C. (2001) The function of leak and kuzbanian during
growth cone and cell migration 1. Mech Dev 106: 25-36.

Schmalfeldt, M., Bandtlow, C. E., Dours-Zimmermann, M. T., Winterhalter, K. H., and

Zimmermann, D. R. (2000) Brain derived versican V2 is a potent inhibitor of axonal growth
2. J Cell Sci 113 (Pt 5): 807-816.

Scholz, J. and Woolf, C. J. (2007) The neuropathic pain triad: neurons, immune cells and glia. Nat
Neurosci 10: 1361-1368.

Schonthal, A., Gebel, S., Stein, B., Ponta, H., Rahmsdorf, H. J., and Herrlich, P. (1988) Nuclear
oncoproteins determine the genetic program in response to external stimuli 3. Cold Spring
Harb Symp Quant Biol 53 Pt 2: 779-787.

Schonthal, A., Herrlich, P., Rahmsdorf, H. J., and Ponta, H. (1988) Requirement for FOS gene
expression in the transcriptional activation of collagenase by other oncogenes and phorbol
esters 2. Cell 54: 325-334.

Schwartz, L. B. (1994) Mast cells: function and contents 12. Curr Opin Immunol 6: 91-97.

Schwartz, L. B. (1994) Tryptase: a clinical indicator of mast cell-dependent events 10. Allergy Proc
15: 119-123.

Schwartz, L. B. (1994) Tryptase: a mast cell serine protease 14. Methods Enzymol 244: 88-100.

Schwartz, L. B. and Kepley, C. (1994) Development of markers for human basophils and mast cells
1. J Allergy Clin Immunol 94: 1231-1240.

Schwartz, L. B., Bradford, T. R., Rouse, C., Irani, A. M., Rasp, G., Van der Zwan, J. K. et al. (1994)
Development of a new, more sensitive immunoassay for human tryptase: use in systemic
anaphylaxis 9. J Clin Immunol 14: 190-204.

Scott, S. Sesory neurons: Diversity, development and Plasticity. New York: Oxford University
Press. 1992. Ref Type: In Press

Seidah, N. G., Benjannet, S., Pareek, S., Chretien, M., and Murphy, R. A. (1996) Cellular
processing of the neurotrophin precursors of NT3 and BDNF by the mammalian proprotein
convertases 13. FEBS Lett 379: 247-250.

Seidah, N. G., Benjannet, S., Pareek, S., Savaria, D., Hamelin, J., Goulet, B. et al. (1996) Cellular
processing of the nerve growth factor precursor by the mammalian pro-protein convertases
11. Biochem J 314 ( Pt 3): 951-960.

162
 Bibliografía

Seidah, N. G., Hamelin, J., Mamarbachi, M., Dong, W., Tardos, H., Mbikay, M. et al. (1996) cDNA
structure, tissue distribution, and chromosomal localization of rat PC7, a novel mammalian
proprotein convertase closest to yeast kexin-like proteinases 8. Proc Natl Acad Sci U S A
93: 3388-3393.

Seiki, M. (1999) Membrane-type matrix metalloproteinases 21. APMIS 107: 137-143.

Sekine-Aizawa, Y., Hama, E., Watanabe, K., Tsubuki, S., Kanai-Azuma, M., Kanai, Y. et al. (2001)
Matrix metalloproteinase (MMP) system in brain: identification and characterization of
brain-specific MMP highly expressed in cerebellum 3. Eur J Neurosci 13: 935-948.

Selby, M. J., Edwards, R., Sharp, F., and Rutter, W. J. (1987) Mouse nerve growth factor gene:
structure and expression 1. Mol Cell Biol 7: 3057-3064.

Shanahan, F., Denburg, J. A., Fox, J., Bienenstock, J., and Befus, D. (1985) Mast cell
heterogeneity: effects of neuroenteric peptides on histamine release 13. J Immunol 135:
1331-1337.

Shelton, D. L., McMahon, S. B., Winslow, J. W., and Qao, W. Q. (1995) Neurotrophins and
neurotrophin antagonists as potential therapeutics. Restor Neurol Neurosci 8: 99-100.

Shelton, D. L., Sutherland, J., Gripp, J., Camerato, T., Armanini, M. P., Phillips, H. S. et al. (1995)
Human Trks: molecular cloning, tissue distribution, and expression of extracellular domain
immunoadhesins 70. J Neurosci 15: 477-491.

Shindler, K. S., Yunker, A. M., Cahn, R., Zha, J., Korsmeyer, S. J., and Roth, K. A. (1998) Trophic
support promotes survival of bcl-x-deficient telencephalic cells in vitro 1. Cell Death Differ
5: 901-910.

Shingai, T., Ikeda, W., Kakunaga, S., Morimoto, K., Takekuni, K., Itoh, S. et al. (2003) Implications
of nectin-like molecule-2/IGSF4/RA175/SgIGSF/TSLC1/SynCAM1 in cell-cell adhesion and
transmembrane protein localization in epithelial cells 5. J Biol Chem 278: 35421-35427.

Shu,X. and Mendell,L.M. (1999). Nerve growth factor acutely sensitizes the response of adult rat
sensory neurons to capsaicin. Neurosci. Lett. 274, 159-162.

Shu,X.Q. and Mendell,L.M. (1999). Neurotrophins and hyperalgesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A
96, 7693-7696.

Silos-Santiago, I., Greenlund, L. J., Johnson, E. M., Jr., and Snider, W. D. (1995) Molecular
genetics of neuronal survival. Curr Opin Neurobiol 5: 42-49.

Silos-Santiago, I., Jeng, B., and Snider, W. D. (1995) Sensory afferents show appropriate
somatotopy at the earliest stage of projection to dorsal horn. Neuroreport 6: 861-865.

Silos-Santiago, I., Molliver, D. C., Ozaki, S., Smeyne, R. J., Fagan, A. M., Barbacid, M. et al. (1995)
Non-TrkA-expressing small DRG neurons are lost in TrkA deficient mice. J Neurosci 15:
5929-5942.

163
 Bibliografía

Smeyne, R. J., Klein, R., Schnapp, A., Long, L. K., Bryant, S., Lewin, A. et al. (1994) Severe
sensory and sympathetic neuropathies in mice carrying a disrupted Trk/NGF receptor
gene. Nature 368: 246-249.

Smith,E.J., Allantaz,F., Bennett,L., Zhang,D., Gao,X., Wood,G., Kastner,D.L., Punaro,M.,

Aksentijevich,I., Pascual,V., and Wise,C.A. (2010). Clinical, Molecular, and Genetic
Characteristics of PAPA Syndrome: A Review. Curr. Genomics 11, 519-527.

Snow, D. M., Steindler, D. A., and Silver, J. (1990) Molecular and cellular characterization of the
glial roof plate of the spinal cord and optic tectum: a possible role for a proteoglycan in the
development of an axon barrier 1. Dev Biol 138: 359-376.

Song,C., Gu,X., Feng,C., Wang,Y., Gao,Y., Hu,X., and Li,N. (2011). Evaluation of SNPs in the
chicken HMGA2 gene as markers for body weight gain. Anim Genet. 42, 333-336.

Stead, R. H., Tomioka, M., Quinonez, G., Simon, G. T., Felten, S. Y., and Bienenstock, J. (1987)
Intestinal mucosal mast cells in normal and nematode-infected rat intestines are in intimate
contact with peptidergic nerves 3. Proc Natl Acad Sci U S A 84: 2975-2979.

Steinhoff, M., Vergnolle, N., Young, S. H., Tognetto, M., Amadesi, S., Ennes, H. S. et al. (2000)
Agonists of proteinase-activated receptor 2 induce inflammation by a neurogenic
mechanism. Nat Med 6: 151-158.

Sternberg, E. M. (1997) Neural-immune interactions in health and disease 2. J Clin Invest 100:
2641-2647.

Stewart,M.J., Emery,D.L., McClure,S.J., and Bendixsen,T. (1996). The effects of four

neuropeptides on the degranulation of mucosal mast cells from sheep. Immunol. Cell Biol.
74, 255-257.

Straub, R. H. (2004) Complexity of the bi-directional neuroimmune junction in the spleen 1. Trends
Pharmacol Sci 25: 640-646.

Straub, R. H., Dorner, M., Riedel, J., Kubitza, M., Van, R. N., Lang, B. et al. (1998) Tonic
neurogenic inhibition of interleukin-6 secretion from murine spleen caused by opioidergic
transmission. Am J Physiol 274: R997-1003.

Strohmaier, C., Carter, B. D., Urfer, R., Barde, Y. A., and Dechant, G. (1996) A splice variant of the
neurotrophin receptor TrkB with increased specificity for brain-derived neurotrophic factor
7. EMBO J 15: 3332-3337.

Stucky,C.L. and Lewin,G.R. (1999). Isolectin B(4)-positive and -negative nociceptors are
functionally distinct. J. Neurosci. 19, 6497-6505.

Stucky,C.L., Koltzenburg,M., Schneider,M., Engle,M.G., Albers,K.M., and Davis,B.M. (1999).

Overexpression of nerve growth factor in skin selectively affects the survival and functional
properties of nociceptors. J. Neurosci. 19, 8509-8516.

164
 Bibliografía

Suzuki, A., Suzuki, R., Furuno, T., Teshima, R., and Nakanishi, M. (2004) N-cadherin plays a role
in the synapse-like structures between mast cells and neurites. Biol Pharm Bull 27: 1891-
1894.

Suzuki, M., Raab, G., Moses, M. A., Fernandez, C. A., and Klagsbrun, M. (1997) Matrix
metalloproteinase-3 releases active heparin-binding EGF-like growth factor by cleavage at
a specific juxtamembrane site 1. J Biol Chem 272: 31730-31737.

Suzuki, R., Furuno, T., Okamoto, K., Teshima, R., and Nakanishi, M. (2007) ATP plays a role in
neurite stimulation with activated mast cells 1. J Neuroimmunol 192: 49-56.

Suzuki, R., Furuno, T., Teshima, R., and Nakanishi, M. (2001) Bi-directional relationship of in vitro
mast cell-nerve communication observed by confocal laser scanning microscopy 6. Biol
Pharm Bull 24: 291-294.

Szolcsanyi, J., Nagy, J., and Petho, G. (1993) Effect of CP-96,345 a non-peptide substance P
antagonist, capsaicin, resiniferatoxin and ruthenium red on nociception 1. Regul Pept 46:
437-439.

Tal,M. and Liberman,R. (1997). Local injection of nerve growth factor (NGF) triggers degranulation
of mast cells in rat paw. Neurosci. Lett. 221, 129-132.

Tanaka, H., Shan, W., Phillips, G. R., Arndt, K., Bozdagi, O., Shapiro, L. et al. (2000) Molecular
modification of N-cadherin in response to synaptic activity 2. Neuron 25: 93-107.

Tang,Z.H., Liu,K.Y., Mei,J., and Gao,X.Z. (2010). [In vitro anti-Trichomonas vaginalis effects of a
mixture of dihydroartemisinin and metronidazole]. Zhongguo Ji. Sheng Chong. Xue. Yu Ji.
Sheng Chong. Bing. Za Zhi. 28, 416-421.

Tao, X., West, A. E., Chen, W. G., Corfas, G., and Greenberg, M. E. (2002) A calcium-responsive
transcription factor, CaRF, that regulates neuronal activity-dependent expression of BDNF
1. Neuron 33: 383-395.

Tegoshi, T., Nishida, M., Ishiwata, K., Kobayashi, T., Uchiyama, F., Nabeshima, K. et al. (2000) E-
cadherin and cadherin-associated cytoplasmic proteins are expressed in murine mast cells
1. Lab Invest 80: 1571-1581.

Tessarollo, L., Vogel, K. S., Palko, M. E., Reid, S. W., and Parada, L. F. (1994) Targeted mutation
in the neurotrophin-3 gene results in loss of muscle sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U
S A 91: 11844-11848.

Theoharides, T. C., Bondy, P. K., Tsakalos, N. D., and Askenase, P. W. (1982) Differential release
of serotonin and histamine from mast cells 3. Nature 297: 229-231.

Thoenen, H. and Barde, Y. A. (1980) Physiology of nerve growth factor 2. Physiol Rev 60: 1284-
1335.

Thoumine,O. (2008). Interplay between adhesion turnover and cytoskeleton dynamics in the
control of growth cone migration. Cell Adh. Migr. 2, 263-267.

165
 Bibliografía

Thoumine,O., Ewers,H., Heine,M., Groc,L., Frischknecht,R., Giannone,G., Poujol,C., Legros,P.,

Lounis,B., Cognet,L., and Choquet,D. (2008). Probing the dynamics of protein-protein
interactions at neuronal contacts by optical imaging. Chem. Rev. 108, 1565-1587.

Togashi,H., Abe,K., Mizoguchi,A., Takaoka,K., Chisaka,O., and Takeichi,M. (2002). Cadherin

regulates dendritic spine morphogenesis. Neuron 35, 77-89.

Tojo, H., Kaisho, Y., Nakata, M., Matsuoka, K., Kitagawa, M., Abe, T. et al. (1995) Targeted
disruption of the neurotrophin-3 gene with lacZ induces loss of TrkC-positive neurons in
sensory ganglia but not in spinal cords. Brain Res 669: 163-175.

Tojo, H., Nishida, M., Matsuoka, K., Igarashi, K., and Shiho, O. (1995) Establishment of a novel
embryonic stem cell line by a modified procedure. Cytotechnology 19: 161-165.

Tojo, H., Takami, K., Kaisho, Y., Nakata, M., Abe, T., Shiho, O. et al. (1995) Neurotrophin-3 is
expressed in the posterior lobe of mouse cerebellum, but does not affect the cerebellar
development. Neurosci Lett 192: 169-172.

Tong,W., Zhu,Y., Wang,Z., Gao,C., and Mohwald,H. (2010). Micelles-encapsulated microcapsules

for sequential loading of hydrophobic and water-soluble drugs. Macromol. Rapid Commun.
31, 1015-1019.

Toran-Allerand, C. D. (1996) Mechanisms of estrogen action during neural development: mediation

by interactions with the neurotrophins and their receptors? 3. J Steroid Biochem Mol Biol
56: 169-178.

Toran-Allerand, C. D. (1996) The estrogen/neurotrophin connection during neural development: is

co-localization of estrogen receptors with the neurotrophins and their receptors biologically
relevant? 2. Dev Neurosci 18: 36-48.

Tosney, K. W. (1991) Cells and cell-interactions that guide motor axons in the developing chick
embryo 4. Bioessays 13: 17-23.

Tracey, K. J. (2007) Physiology and immunology of the cholinergic antiinflammatory pathway 6. J

Clin Invest 117: 289-296.

Turk, B. E., Huang, L. L., Piro, E. T., and Cantley, L. C. (2001) Determination of protease cleavage
site motifs using mixture-based oriented peptide libraries 1. Nat Biotechnol 19: 661-667.

Ultsch, M. H., Wiesmann, C., Simmons, L. C., Henrich, J., Yang, M., Reilly, D. et al. (1999) Crystal
structures of the neurotrophin-binding domain of TrkA, TrkB and TrkC 5. J Mol Biol 290:
149-159.

Utton, M. A., Eickholt, B., Howell, F. V., Wallis, J., and Doherty, P. (2001) Soluble N-cadherin
stimulates fibroblast growth factor receptor dependent neurite outgrowth and N-cadherin
and the fibroblast growth factor receptor co-cluster in cells 2. J Neurochem 76: 1421-1430.

Utton, M. A., Gibb, G. M., Burdett, I. D., Anderton, B. H., and Vandecandelaere, A. (2001)
Functional differences of tau isoforms containing 3 or 4 C-terminal repeat regions and the
influence of oxidative stress 1. J Biol Chem 276: 34288-34297.

166
 Bibliografía

Vaillant, A. R., Mazzoni, I., Tudan, C., Boudreau, M., Kaplan, D. R., and Miller, F. D. (1999)
Depolarization and neurotrophins converge on the phosphatidylinositol 3-kinase-Akt
pathway to synergistically regulate neuronal survival 25. J Cell Biol 146: 955-966.

Vasioukhin,V., Bauer,C., Yin,M., and Fuchs,E. (2000). Directed actin polymerization is the driving
force for epithelial cell-cell adhesion. Cell 100, 209-219.

Velasco, G., Cal, S., Merlos-Suarez, A., Ferrando, A. A., Alvarez, S., Nakano, A. et al. (2000)
Human MT6-matrix metalloproteinase: identification, progelatinase A activation, and
expression in brain tumors 1. Cancer Res 60: 877-882.

Vu, T. H. and Werb, Z. (2000) Matrix metalloproteinases: effectors of development and normal
physiology. Genes Dev 14: 2123-2133.

Wang, L., Antonini, J. M., Rojanasakul, Y., Castranova, V., Scabilloni, J. F., and Mercer, R. R.
(2003) Potential role of apoptotic macrophages in pulmonary inflammation and fibrosis 9. J
Cell Physiol 194: 215-224.

Wang, X., Yi, J., Lei, J., and Pei, D. (1999) Expression, purification and characterization of
recombinant mouse MT5-MMP protein products 1. FEBS Lett 462: 261-266.

Wang, Y., Johnson, A. R., Ye, Q. Z., and Dyer, R. D. (1999) Catalytic activities and substrate
specificity of the human membrane type 4 matrix metalloproteinase catalytic domain 4. J
Biol Chem 274: 33043-33049.

Wang,B., Ma,R., Liu,G., Liu,X., Gao,Y., Shen,J., An,Y., and Shi,L. (2010). Effect of Coordination on
the Glucose-Responsiveness of PEG-b-(PAA-co-PAAPBA) Micelles. Macromol. Rapid
Commun. 31, 1628-1634.

Wang,L., Zhao,X., Gao,K., Lao,J., and Gu,Y.D. (2011). Reinnervation of thenar muscle after repair
of total brachial plexus avulsion injury with contralateral C7 root transfer: report of five
cases. Microsurgery 31, 323-326.

Wang,Y.P., Xu,M., and Gao,W. (2010). [Advances in study of biomarkers of myocardial fibrosis].
Sheng Li Ke. Xue. Jin. Zhan. 41, 461-463.

Watkins, L. R. and Maier, S. F. (1999) Implications of immune-to-brain communication for sickness

and pain 5. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 7710-7713.

Webber, C. A., Hocking, J. C., Yong, V. W., Stange, C. L., and McFarlane, S. (2002)
Metalloproteases and guidance of retinal axons in the developing visual system 20. J
Neurosci 22: 8091-8100.

Weidner,C., Schmidt,R., Schmelz,M., Torebjork,H.E., and Handwerker,H.O. (2003). Action

potential conduction in the terminal arborisation of nociceptive C-fibre afferents. J. Physiol
547, 931-940.

Werb, Z. (1997) ECM and cell surface proteolysis: regulating cellular ecology 2. Cell 91: 439-442.

167
 Bibliografía

Westling, J., Gottschall, P. E., Thompson, V. P., Cockburn, A., Perides, G., Zimmermann, D. R. et
al. (2004) ADAMTS4 (aggrecanase-1) cleaves human brain versican V2 at Glu405-Gln406
to generate glial hyaluronate binding protein9. Biochem J 377: 787-795.

White, F. A., Silos-Santiago, I., Molliver, D. C., Nishimura, M., Phillips, H., Barbacid, M. et al.
(1996) Synchronous onset of NGF and TrkA survival dependence in developing dorsal root
ganglia. J Neurosci 16: 4662-4672.

Wilhelm, S. M., Collier, I. E., Marmer, B. L., Eisen, A. Z., Grant, G. A., and Goldberg, G. I. (1989)
SV40-transformed human lung fibroblasts secrete a 92-kDa type IV collagenase which is
identical to that secreted by normal human macrophages1. J Biol Chem 264: 17213-
17221.

Woessner, J. F., Jr. (1998) Role of matrix proteases in processing enamel proteins 3. Connect
Tissue Res 39: 69-73.

Woiciechowsky, C., Asadullah, K., Nestler, D., Eberhardt, B., Platzer, C., Schoning, B. et al. (1998)
Sympathetic activation triggers systemic interleukin-10 release in immunodepression
induced by brain injury1. Nat Med 4: 808-813.

Woiciechowsky, C., Asadullah, K., Nestler, D., Schoning, B., Glockner, F., Docke, W. D. et al.
(1998) Diminished monocytic HLA-DR expression and ex vivo cytokine secretion capacity
in patients with glioblastoma: effect of tumor extirpation2. J Neuroimmunol 84: 164-171.

Wooten, M. W. (1999) Function for NF-kB in neuronal survival: regulation by atypical protein kinase
C8. J Neurosci Res 58: 607-611.

Wooten, M. W., Seibenhener, M. L., Zhou, G., Vandenplas, M. L., and Tan, T. H. (1999)
Overexpression of atypical PKC in PC12 cells enhances NGF-responsiveness and survival
through an NF-kappaB dependent pathway13. Cell Death Differ 6: 753-764.

Wulfhekel,W. and Gao,C.L. (2010). Investigation of non-collinear spin states with scanning
tunneling microscopy. J. Phys. Condens. Matter 22, 084021.

Xiao,H.Y., Gao,F., and Weber,W.J. (2010). Threshold displacement energies and defect formation
energies in Y2Ti2O7. J. Phys. Condens. Matter 22, 415801.

Xie,X., Wang,H.T., Li,C.L., Gao,X.H., Ding,J.L., Zhao,H.H., and Lu,Y.L. (2010). Ginsenoside Rb1
protects PC12 cells against beta-amyloid-induced cell injury. Mol. Med. Rep. 3, 635-639.

Xu,M., Gao,J., Du,Y.Q., Gao,D.J., Zhang,Y.Q., Li,Z.S., Zhang,Y.L., Gong,Y.F., and Xu,P. (2010).
Reduction of pancreatic cancer cell viability and induction of apoptosis mediated by siRNA
targeting DNMT1 through suppression of total DNA methyltransferase activity. Mol. Med.
Rep. 3, 699-704.

Xu,W.N., Gao,X.X., Guo,X.L., Chen,Y.C., Zhang,W.M., and Luo,Y.S. (2010). [Study on volatile
components from peel of Aquilaria sinensis and the anti-tumor activity]. Zhong. Yao Cai.
33, 1736-1740.

168
 Bibliografía

Yagi, T. and Takeichi, M. (2000) Cadherin superfamily genes: functions, genomic organization, and
neurologic diversity1. Genes Dev 14: 1169-1180.

Yamada, H., Watanabe, K., Shimonaka, M., Yamasaki, M., and Yamaguchi, Y. (1995) cDNA
cloning and the identification of an aggrecanase-like cleavage site in rat brevican1.
Biochem Biophys Res Commun 216: 957-963.

Yamaguchi, Y. (2000) Lecticans: organizers of the brain extracellular matrix2. Cell Mol Life Sci 57:
276-289.

Yanagida, H., Tanaka, J., and Maruo, S. (1999) Immunocytochemical localization of a cell
adhesion molecule, integrin alpha5beta1, in nerve growth cones1. J Orthop Sci 4: 353-360.

Yee, C. L., Jones, K. R., and Finger, T. E. (2003) Brain-derived neurotrophic factor is present in
adult mouse taste cells with synapses1. J Comp Neurol 459: 15-24.

Yoneda, A. and Couchman, J. R. (2003) Regulation of cytoskeletal organization by syndecan

transmembrane proteoglycans6. Matrix Biol 22: 25-33.

Yong, V. W. (2005) Metalloproteinases: mediators of pathology and regeneration in the CNS. Nat
Rev Neurosci 6: 931-944.

Yong, V. W., Power, C., Forsyth, P., and Edwards, D. R. (2001) Metalloproteinases in biology and
pathology of the nervous system7. Nat Rev Neurosci 2: 502-511.

York, R. D., Molliver, D. C., Grewal, S. S., Stenberg, P. E., McCleskey, E. W., and Stork, P. J.
(2000) Role of phosphoinositide 3-kinase and endocytosis in nerve growth factor-induced
extracellular signal-regulated kinase activation via Ras and Rap117. Mol Cell Biol 20:
8069-8083.

Yu,H.Y., Guo,Y.H., and Gao,W. (2010). [Mitochondrial fusion protein Mfn2 and cardiovascular
diseases]. Sheng Li Ke. Xue. Jin. Zhan. 41, 11-16.

Yuan, J. and Yankner, B. A. (2000) Apoptosis in the nervous system6. Nature 407: 802-809.

Zakharenko, S. S., Patterson, S. L., Dragatsis, I., Zeitlin, S. O., Siegelbaum, S. A., Kandel, E. R. et
al. (2003) Presynaptic BDNF required for a presynaptic but not postsynaptic component of
LTP at hippocampal CA1-CA3 synapses1. Neuron 39: 975-990.

Zeng, X., Overmeyer, J. H., and Maltese, W. A. (2006) Functional specificity of the mammalian
Beclin-Vps34 PI 3-kinase complex in macroautophagy versus endocytosis and ysosomal
enzyme trafficking7. J Cell Sci 119: 259-270.

Zhang,C., Yuan,X., Mao,W., Yue,L., Kong,X., Gao,Y., Luo,L., and Yin,Z. (2010). Inhibition of
cadmium-induced apoptosis by glutathione S-transferase P1 via mitogen-activated protein
kinases and mitochondrial pathways. Environ. Toxicol. Pharmacol. 30, 202-208.

Zhou, L., Dosanjh, A., Chen, H., and Karasek, M. (2000) Divergent effects of extracellular oxygen
on the growth, morphology, and function of human skin microvascular endothelial cells10. J
Cell Physiol 182: 134-140.

169
 Bibliografía

Zighelboim,I., Reinhart,A.J., Gao,F., Schmidt,A.P., Mutch,D.G., Thaker,P.H., and Goodfellow,P.J.

(2011). DICER1 expression and outcomes in endometrioid endometrial adenocarcinoma.
Cancer 117, 1446-1453.

Zucker, S., Pei, D., Cao, J., and Lopez-Otin, C. (2003) Membrane type-matrix metalloproteinases
(MT-MMP)3. Curr Top Dev Biol 54: 1-74.

Zuo, J., Ferguson, T. A., Hernandez, Y. J., Stetler-Stevenson, W. G., and Muir, D. (1998) Neuronal
matrix metalloproteinase-2 degrades and inactivates a neurite-inhibiting chondroitin sulfate
proteoglycan3. J Neurosci 18: 5203-5211.

Zuo, J., Hernandez, Y. J., and Muir, D. (1998) Chondroitin sulfate proteoglycan with neurite-
inhibiting activity is up-regulated following peripheral nerve injury7. J Neurobiol 34: 41-54.

Zuo, J., Neubauer, D., Dyess, K., Ferguson, T. A., and Muir, D. (1998) Degradation of chondroitin
sulfate proteoglycan enhances the neurite-promoting potential of spinal cord tissue1. Exp
Neurol 154: 654-662.

Zuo, Z., Dean, N. M., and Honkanen, R. E. (1998) Serine/threonine protein phosphatase type 5
acts upstream of p53 to regulate the induction of p21(WAF1/Cip1) and mediate growth
arrest4. J Biol Chem 273: 12250-12258.

Zurn, A. D. and Bandtlow, C. E. (2006) Regeneration failure in the CNs: cellular and molecular
mechanisms4. Adv Exp Med Biol 557: 54-76.

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 Anexo

ANEXO

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