DEPARTAMENTO DE PRECLÍNICAS

Cátedra de Fisiología
Trabajos Prácticos Fisiología I – 2022

FISIOLOGÍA I
TRABAJO PRÁCTICO:

SANGRE
Parte 2: Hemograma

2022

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Objetivos

A. Familiarizarse con el uso de los materiales de hematología, las tinciones y el microscopio.

B. Conocer técnicas hematológicas y comprender su importancia en la medicina veterinaria.
C. Reconocer los diferentes tipos celulares, observar su morfología, describir las características
de cada uno de ellos y relacionarlos con su función.

Para asistir al trabajo práctico es imprescindible la lectura de la bibliografía sugerida sobre el tema
sangre, disponible en el programa de estudio de la asignatura.

INTRODUCCIÓN:

El hemograma es un estudio cuantitativo y cualitativo de la sangre en el que se cuantifican y evalúan

diferentes grupos celulares, glóbulos rojos (eritrocitos), glóbulos blancos (leucocitos), plaquetas,
hemoglobina, y otros parámetros relacionados con su cantidad, forma y contenido. El recuento de los
elementos formes sanguíneos (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) constituye un estudio cuantitativo y
puede hacerse por métodos manuales o automáticos. El examen cualitativo se basa en la observación
de las características morfológicas de las células, proporciona información diagnóstica. Los estudios
hematológicos tienen como finalidad conocer el patrón hematológico característico de un
individuo. Con el objeto de realizar una correcta interpretación de los resultados, el veterinario
debe disponer de datos exactos. Para obtenerlos se requiere tomar correctamente la muestra de
sangre, una adecuada presentación y conservación de la misma y seleccionar un método de análisis
que provea resultados confiables.

HEMOGRAMA:

Partes de un hemograma:

ERITROGRAMA: LEUCOGRAMA:

▪ Hematocrito. ▪ Recuento total de glóbulos blancos.

▪ Recuento total de glóbulos rojos. ▪ Fórmula leucocitaria relativa (FLR)

▪ Hemoglobina. ▪ Fórmula leucocitaria absoluta (FLA)

▪ Índices hematimétricos.

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ERITROGRAMA

▪ HEMATOCRITO

El hematocrito (Hto) es la relación existente entre el volumen de eritrocitos y el volumen total de

sangre, expresado como porcentaje. Está directamente relacionado con la concentración de
hemoglobina y con el total de glóbulos rojos. El Hto refleja la concentración y no la masa total de
glóbulos rojos.

Datos que podemos extraer:

- VMG (volumen de la masa globular).

- Estimar la concentración de hemoglobina.
- Examen de la capa flogística.
- Examen del plasma: Lipemia, Ictericia, Hemólisis.

El método de referencia para la determinación del Hto es la centrifugación de sangre total en tubo
capilar. Es una técnica sencilla, económica y accesible. Se basa en la medición del
empaquetamiento de la columna de eritrocitos, cuando la sangre total con anticoagulante se
somete a la acción de una fuerza centrífuga.
Entre sus factores de error está el plasma que queda atrapado entre los eritrocitos empaquetados
y el posible efecto de leucocitos y plaquetas en la lectura. En la actualidad, todos los auto-
analizadores hematológicos suministran, dentro del contexto del hemograma automatizado, un
valor de Hto que resulta de un cálculo electrónico a partir del Volumen Corpuscular Medio
(obtenido por conductividad o campo oscuro) y la concentración de eritrocitos. Obviamente, este
valor obtenido electrónicamente, difiere del obtenido por centrifugación, en que no considera el
efecto del plasma atrapado entre los eritrocitos ni el efecto de las restantes células sanguíneas,
por lo que es siempre algo inferior (0,2-0,3 %).

Actividad Nº 1 Medición del microhematocrito.

MATERIALES
1) Papel absorbente
2) Muestra de sangre con anticoagulante.
3) Capilares para microhematocrito (75mm x 1mm) no heparinizados.
4) Mechero o plastilina.
5) Centrífuga (12.000 r.p.m.).
6) Lector de Kaneko.

TÉCNICA
1) Cargue el tubo con sangre hasta tres cuartas partes de su capacidad (aproximadamente 50
µl). El llenado de los tubos se realiza por capilaridad, favoreciendo el proceso inclinando el
capilar hacia abajo a medida que se va llenando (Fig. 1).
2) Mantenga el capilar en posición horizontal para evitar que se vacíe el mismo.

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3) Limpie con papel absorbente o gasa el exterior del tubo.

4) Obture el extremo libre de sangre, colocando sobre la llama azul del mechero mientras lo
rota entre los dedos (Fig. 1). También puede utilizarse plastilina.
5) Una vez cerrado, coloque los capilares en la centrífuga con el extremo del capilar cerrado
hacia afuera y de modo que quede perfectamente equilibrada.
6) Centrifugue a 12.000 r.p.m. durante 3 a 5 minutos.
7) Luego de la centrifugación, obtenemos el microhematocrito (Fig. 2).
8) Lea el microhematocrito utilizando el lector de Kaneko (Fig. 3).
9) Colocado el microhematocrito sobre la tabla, se hacer coincidir el extremo superior del
plasma con la línea del 100 de la tabla, y el extremo inferior de la columna de rojos con el
0 de la misma. El valor que toma el punto de separación entre los glóbulos rojos y el
plasma es el valor del microhematocrito y se expresa en %.

Fig.1: Pasos para realizar un hematocrito

Fig.2: Microhematocrito

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Fig. 3. Lector de Kaneko para hematocrito

CAUSAS DE ERROR
• Fugas de muestra. Al no quedar bien sellados los capilares, producen una disminución en
el valor, al perderse mayor proporción de células que de plasma.
• El uso de anticoagulantes líquidos provoca un error por dilución de la muestra.
• En muestras capilares, no descartar la primera gota, produce una mezcla con los líquidos
tisulares que provoca hemodilución.
• En muestras de sangre venosa, el lazo colocado durante un cierto tiempo produce
hemoconcentración.
• La lectura no inmediata de los capilares, provoca que el sedimento de hematíes vaya
tomando forma de bisel, si el capilar permanece en posición horizontal.

Responda:

1) ¿Qué valor de microhematocrito obtuvo?

2) ¿Cuál es el valor fisiológico de microhematocrito para la especie?
3) Enumere variaciones fisiológicas del microhematocrito.

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▪ RECUENTOS TOTAL DE GLÓBULOS ROJOS:

Se puede realizar mediante contadores automáticos o manualmente utilizando la

cámara de Neubauer. Además, se puede calcular aplicando la siguiente fórmula:

VCM= volumen corpuscular medio, varía según la especie.

▪ DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA.
Para la determinación de la concentración de hemoglobina en g/dl (gramos/decilitros) existen
diferentes métodos, pero el más utilizado, debido a la fiabilidad y estabilidad de los reactivos,
es el método de cianuro de hemoglobina.
Una forma de estimar el valor de la hemoglobina, es a partir del hematocrito. La relación
hemoglobina (Hb) - hematocrito (Hto), consiste en calcular el valor de la hemoglobina al
dividir el Hto entre un factor, usualmente entre 3,0 a 3,3.
▪ ÍNDICES HEMATIMÉTRICOS:
Sirven para clasificar a los eritrocitos de acuerdo con su tamaño y contenido de hemoglobina.
Para calcular los índices hematimétricos se necesita conocer el valor del hematocrito, el total
de eritrocitos y la concentración de hemoglobina.
o VCM (Volumen Corpuscular Medio). Es el volumen medio correspondiente a
un eritrocito, expresado en micrones cúbicos o fentolitro. De acuerdo con el
resultado, los glóbulos rojos se clasifican en macrocíticos si son mayores al
tamaño normal, microcíticos si son menores, o normocíticos si se
corresponden con el tamaño esperado según la especie.
o CMHC (Concentración Media de la Hemoglobina Corpuscular). es la cantidad
promedio de hemoglobina presente en un eritrocito, expresado en picogramo.
El valor que toma este parámetro permite clasificar la sangre en hipocrómica si
el valor es por debajo del normal, hipercrómica si el valor está por encima del
normal o normocrómica si el valor hallado es el esperado.
o HCM (Hemoglobina Corpuscular Media). es la cantidad de hemoglobina por
unidad de volumen eritrocitario, es decir comparado con el hematocrito,
expresada en gr/dl.

LEUCOGRAMA

▪ RECUENTO TOTAL DE GLÓBULOS BLANCOS.

Al igual que en los glóbulos rojos, se puede realizar mediante contadores automáticos o
manualmente utilizando la cámara de Neubauer.

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Recuento mediante cámara de Neubauer:

Se realiza una dilución con la Pipeta de Thoma para glóbulos blancos (Fig. 4).

Fig. 4. Pipeta de Thoma

Cámara de Neubauer:

Se trata de un portaobjetos especial con un área central ligeramente deprimida dividida en 2 por
un surco transversal (Fig. 5). En cada división del campo central (= fondo cámara) se encuentra un
reticulado de dimensiones conocidas. El reticulado se cubre con un cubrecámaras, apoyando sobre
las barras laterales. Se carga la cámara con la dilución realizada en la pipeta de Thoma (Fig. 6) y se
procede a realizar el recuento en el reticulado.

Fig. 5. Cámara de Neubauer.

Fig. 6. Carga de la cámara de Neubauer con la dilución.

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El reticulado de la cámara consta de una superficie total de 9 mm². Esta superficie se encuentra
dividida en 9 cuadros grandes de 1 mm². Los cuatro cuadros grandes de los extremos divididos en
16 cuadrados medianos de 0,25 mm de lado, son los que se emplean para contar leucocitos. En el
cuadrado central se realiza el recuento de glóbulos rojos y plaquetas. Luego de realizar el
recuento, se realiza una fórmula para obtener el número total de glóbulos blancos por microlitro
(o mm³).

IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS SANGUÍNEAS EN UN EXTENDIDO

Actividad Nº 2 Realizar un Frotis Sanguíneo:

Técnica:
1) Tomar un portaobjetos y asegurarse de que este bien limpio y desengrasado. Rotularlo con la
identificación del animal.
2) Colocar una gota de sangre en el centro de uno de los extremos del portaobjeto.
3) Colocar uno de los extremos de otro portaobjeto (extensor) sobre portaobjeto soporte, unos
mm por delante de la gota de sangre formando un ángulo con una inclinación de 45° (Fig. 7.1).
4) Desplazarlo hacia atrás hasta que tome contacto con la gota de sangre y permitir que por
capilaridad se extienda a lo largo del borde del portaobjeto extensor (Fig. 7.2).
5) Deslizar el extensor hacia el lado contrario de donde se colocó la gota, de manera suave y
rápida para permitir que la sangre quede extendida. El movimiento debe ser continuo e
ininterrumpido (Fig. 7.3).
6) Secar el frotis al aire lo más rápido posible con movimiento en forma de abanico, nunca
soplando. La desecación rápida evita la deformación de las células sanguíneas.
7) Teñir y observar al microscopio con el objetivo de INMERSION (100X) y aceite de cedro.
8) Una vez realizado un frotis sanguíneo, se debe proceder a colorearlo. Esto permitirá la
identificación de los distintos tipos de células sanguíneas.

Fig. 7. Técnica del frotis.

CARACTERÍSTICAS DE UN BUEN FROTIS

• Uniforme, de aspecto liso y homogéneo.

• Bordes largos, rectos y que no lleguen a los bordes del portaobjetos.
• Delgado, Eritrocitos situados en una sola capa.

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Fig. 8: Errores en la realización de un frotis

En la figura 8.A se muestra un frotis de forma correcta, bordes laterales largos que no llegan al
final del portaobjetos, terminando en forma irregular producto de la extensión total de la sangre.
En este caso la cantidad de sangre colocada en la gota fue la correcta.
Figura 8.B, la cantidad de sangre colocada en la gota fue excesiva ya que no se pudo terminar de
distribuir la totalidad de la sangre antes de terminar el portaobjetos. Resultando un frotis
demasiado grueso.
Figura 8.C, los bordes son correctos, la cantidad de sangre es la adecuada pero el portaobjetos
estaba engrasado o sucio por lo que la sangre no se adhirió a la superficie del vidrio y quedaron
espacios en blanco. Esto dificultará la lectura posterior. No es posible utilizar un frotis con estas
características.
Figura 8.D, presenta estrías longitudinales lo que puede resultar del uso de un extensor que no
posee bordes netos. No hubo uniformidad en la extensión. No se puede utilizar.
Figura 8.E, frotis demasiado corto, muy poca cantidad de sangre colocada en la gota inicial. No se
puede utilizar.

Actividad 3 Realizar la tinción MAY GRUNWAL – GIEMSA del frotis sanguíneo.

TECNICA DE COLORACIÓN:

1. Colocar 5 gotas de MAY GRUNWAL sobre el extendido de sangre, dejar 3'.

2. Colocar 5 gotas de agua destilada sin volcar el colorante, dejar 3'.
3. Volcar sobre un recipiente los líquidos agregados anteriormente.
4. Cubrir con GIEMSA diluido toda la superficie del frotis, dejar 15'.
5. Lavar con agua destilada.

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Actividad 4: Identificación de células sanguíneas en un extendido

A partir del extendido de sangre de realizado, observar e identificar los diferentes tipos de células
presentes en la sangre.

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LOS LEUCOCITOS

NEUTRÓFILO SEGMENTADO:
Son los leucocitos más comunes en la sangre periférica de todas las especies domésticas, excepto en
los rumiantes. Los neutrófilos segmentados tienen normalmente un diámetro de 10 a 12 μm y poseen
un solo núcleo con múltiples lóbulos, normalmente de 3 a 5 (Fig. 9). La cromatina del núcleo consiste
en áreas muy oscuras condensadas, entremezcladas con áreas claras. El citoplasma se tiñe ligeramente
azul o rosa según el tipo y la calidad de la tinción utilizada. Los neutrófilos de las distintas especies son
similares. Los gránulos citoplasmáticos no adquieren ningún tipo de coloración, siendo esta la principal
característica de la célula. La principal excepción es que el citoplasma de los neutrófilos bovinos se tiñe
a menudo de un rosa más intenso en comparación con el de otras especies.

NEUTRÓFILO EN BANDA:
Se parecen a los neutrófilos segmentados excepto en que los núcleos tienen forma de banda o
herradura (Fig. 10). Los neutrófilos en banda son un estado inmaduro de neutrófilos. El límite normal
de neutrófilos en banda en la sangre periférica es de 1 a 2 % pero con frecuencia faltan por completo.

EOSINÓFILOS:
El tamaño de estas células es similar al de los neutrófilos o ligeramente más grandes. Los núcleos están
segmentados El citoplasma se tiñe de azul pálido y tiene múltiples gránulos rojizos o rojizo-anaranjados
(Fig. 11). La cantidad y las formas de los gránulos es muy diversas en las especies domésticas. Los
gránulos del eosinófilo del perro son redondos y muy variables en tamaño y número. Asimismo,
aparecen a menudo en el citoplasma, múltiples vacuolas de tamaños variados. Los gránulos del
eosinófilo felino tienen forma de bacilo y normalmente llenan el citoplasma. Los eosinófilos de caballo
tienen grandes gránulos redondos, ovales u oblongos que llenan el citoplasma y a veces enmascaran el
núcleo. Los eosinófilos de los rumiantes tienen pequeños gránulos redondos, completamente
uniformes que normalmente llenan el citoplasma.

BASÓFILOS:
Son semejantes en tamaño o ligeramente más grandes que los neutrófilos y el citoplasma es púrpura
claro. Su núcleo es segmentado, pero presenta menos lóbulos que el de los neutrófilos (Fig. 12). En los
basófilos caninos a veces pueden aparecer poca cantidad de pequeños gránulos citoplasmáticos
redondos y de color púrpura. La presencia o ausencia de gránulos puede depender del tipo de
colorante utilizado. Los basófilos felinos contienen gránulos pequeños imperceptibles y de una
coloración azul lavanda. Tanto los basófilos de bovino como los de equino tienen varios gránulos
pequeños bien teñidos de color púrpura en el citoplasma.

LINFOCITOS:
Son el segundo tipo de célula más común en la sangre periférica de la mayoría de las especies
domésticas y son el tipo de célula predominante de los rumiantes. Normalmente, estas células son
redondas y ligeramente más pequeñas que los neutrófilos (Fig. 13). El tipo de cromatina consiste en

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áreas vítreas, suaves, entremezcladas con áreas más densas o en forma de mancha. Presentan una
pequeña cantidad de citoplasmas azul claro. Pueden tener en el citoplasma múltiples gránulos
pequeños de color rosa púrpura. En sangre periférica, podemos encontrar linfocitos pequeños y
grandes. Esto sucede especialmente en los rumiantes. Los linfocitos grandes tienen más citoplasma que
los pequeños.

MONOCITOS
Estas células tienen normalmente un diámetro de 15 a 10 μm y los núcleos pueden tener formas
diversas: ovales, ovales con una única muesca (riñón), o con muescas múltiples y lóbulos (Fig. 14). La
cromatina nuclear tiene un aspecto finamente granular con sólo unas pocas áreas de condensación. La
cantidad moderada de citoplasma es normalmente azul-gris y puede tener vacuolas múltiples discretas
de varios tamaños. También puede presentar una vacuola intranuclear. A veces se encuentran
presentes numerosos gránulos azurófilos pequeños, que toman coloración rosada. Generalmente están
presentes en cantidades reducidas en sangre periférica y son muy similares en todas las especies
domésticas.

Fig. 9. Neutrófilos segmentados Fig. 10. Neutrófilos en banda

Fig. 11. Eosinófilos Fig. 12. Basófilos

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Fig. 13. Linfocitos Fig. 14. Monocito

Responder
1. Nombre las células que logro identificar.
2. Describa características generales de las mismas.
3. ¿De qué especie es el frotis? ¿Qué características notables encontró en el frotis?

▪ FÓRMULA LEUCOCITARIA RELATIVA (FLR)

Es el porcentaje de cada tipo de leucocitos hallados en la muestra de sangre. Para realizar la
determinación de los diferentes tipos de glóbulos blancos, se recorre el frotis teñido utilizando la
técnica de guarda griega. Esta metodología permite minimizar los errores de distribución de los
leucocitos ya que los NEUTRÓFILOS por su peso migran al borde del frotis. Los EOSINÓFILOS y
MONOCITOS se distribuyen por todo el campo y los LINFOCITOS en la parte central.

▪ FÓRMULA LEUCOCITARIA ABSOLUTA (FLA)

Es el valor de cada tipo expresado como leucocitos/mm3. Teniendo en cuenta el valor en % de
cada uno de los glóbulos blancos identificados en la FLR y el recuento total de Glóbulos blancos en
cámara de Neubauer, se determina el número de cada uno de los distintos leucocitos/mm3
mediante una operación matemática, regla de tres simples, para cada uno de los distintos tipos de
células.

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BIBLIOGRAFÍA:

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- Toma Y Remisión De Muestras Laboratorios De Sanidad Animal Y Química. Méd. Vet.
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Mercedes. Centro Regional Corrientes.
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- Willard, Md; Tvedten, H. Diagnóstico clínico patológico práctico en los pequeños
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- Rebar, A.H. Interpretación del hemograma canino y felino. Nestlé Purina PetCare
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- William J. Reagan, Teresa G. Sanders, Denis B. DeNicola (Eds.), Hematología
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- G. A Mc. Donald, P. James, B. Cruickshank, Atlas de hematología. 5ta ed, Editorial
Panamericana
- Lewis, S., Bates, I, Bain, B. DACIE Y LEWIS. Hematología Práctica 10 ª ed. Ed ELSEVIER
2007

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