Diseño Experimental 4 - Tinciones

TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO
MICROBIOLOGÍA
TEMA: DISEÑO EXPERIMENTAL

TINCIONES
DOCENTE: MIGUEL ANGEL DIAZ ALDAY
NOMBRE DEL ALUMNO:
LEONEL TRANSITO MONDRAGON - 21320893
GRUPO: IB3
ESPECIALIDAD: INGENIERÍA BIOQUÍMICA
FECHA DE ENTREGA: 20 - MARZO - 2024

Introducción
Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del
campo de la microbiología. En microbiología el microscopio se utiliza de
manera de forma rutinaria, ya que proporciona importante información para la
identificación temprana y definitiva de los microorganismos.
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color como a

células, tejidos, fibras, etcétera. De acuerdo con su origen, se pueden dividir
en: colorantes naturales, los cuales son extraídos de plantas o animales, y
colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y
manipulados en el laboratorio. Los colorantes tienen las siguientes funciones:
 Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.

 Revelan su forma y tamaño.
 Muestra la presencia de estructuras internas y externas.
 Producen reacciones químicas específicas.
Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se

tiñe del mismo color y se utiliza un solo colorante (tinta china o azul de
lactofenol); tinción diferencial, cuando se visualiza más de un color porque se
utiliza más de un colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tinción específica,
cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molécula fluorescente para
identificar una estructura celular en particular (inmunocitoquímico). El control
de calidad de los métodos tintoriales es importante, ya que así se asegura
que la preparación de la muestra haya sido adecuada, por lo que se
recomienda realizar al mismo tiempo de la evaluación de la muestra clínica,
la tinción de un agente infeccioso ya identificado mediante esa tinción, el cual
funcionará como un control positivo. Las principales técnicas de tinción en
microbiología se mencionarán a continuación.
Tinción de Gram
La tinción de Gram consiste en una

prueba de laboratorio útil para detectar
la presencia de microorganismos,
especialmente bacterias y algunas
veces hongos, en una muestra obtenida
del foco infeccioso o sospechoso de
serlo. Proporciona resultados con
relativa rapidez y facilidad acerca de la
presencia de bacterias u hongos, y de
ser así del tipo.
La muestra de la zona infectada se extiende sobre un portaobjetos y se deja

secar. Se aplica una tinción especial y posteriormente un profesional con
experiencia observa al microscopio el portaobjetos teñido. Las bacterias que
pueden visualizarse al microscopio se clasifican en función del color y de la
forma:
 Color: las bacterias pueden ser "Gram positivas" (color púrpura) o
"Gram negativas" (color rosado).
 Forma: las formas más comunes son las redondeadas (cocos) o en
forma de bastoncillo (bacilos).
Se puede obtener información adicional observando las agrupaciones que

forman las bacterias en la preparación. Los cocos pueden presentarse
aisladamente, en parejas, en grupos de cuatro, en racimos o formando
cadenas. Los bacilos pueden ser gruesos, finos, cortos, largos, y pueden
presentar esporas en una de sus extremidades. También se detectan
bacterias que se encuentren en el interior de los leucocitos.
La coloración de la tinción de Gram y la forma de las bacterias permiten

predecir el tipo de microorganismo que está causando la infección. Ejemplos
de cocos Gram positivos incluyen l estafilococo (por ejemplo: Staphylococcus
aureus). Un ejemplo de bacteria Gram negativa es la Escherichia coli.
Con la tinción de Gram también pueden visualizarse hongos (en forma de

levaduras o mohos); sin embargo los virus no pueden detectarse con una
tinción de Gram.
La tinción de Gram constituye una prueba de primera línea muy útil para
detectar e identificar bacterias y algunos hongos. Sin embargo, los resultados
obtenidos deben completarse con otras pruebas adicionales. Así, para
confirmar el diagnóstico, son necesarias pruebas como cultivos, pruebas de
detección de antígenos o de anticuerpos, o pruebas moleculares. Puede ser
necesario además realizar un antibiograma, para determinar cuál será el
antibiótico más efectivo para combatir la infección.
Tinción Zielhl-Neelsen
Ciertos microorganismos especialmente los del género Mycobacterium (M.

tuberculosis, M. leprae, etc.) y Nocardia tienen dificultades para colorearse
con las tinciones simples y aún con la de Gram, por lo cual se los denomina
bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR).
Dichos microorganismos contienen una gran cantidad de ceras asociadas a

la mureina de la pared celular. Estas ceras (lípidos sólidos) contienen ácidos
grasos de cadena muy larga (ácidos micólicos) que serían la causa de la
resistencia a los métodos habituales de tinción. Por lo tanto, es necesario
usar una alta concentración del colorante primario (fucsina de Ziehl o
carbolfucsina) y aplicar calor suave sobre la preparación (el calentamiento
derrite la cera y aumenta la penetración y la retención del colorante). A
continuación el extendido se trata con ácido-alcohol, un decolorante que
elimina el color rojo de las bacterias que no son ácido- alcohol resistentes.
Los BAAR retienen el color rojo porque las ceras vuelven a solidificarse al
enfriarse y por lo tanto, no actúa el decolorante.
Las células que no son ácido-alcohol resistentes permanecerán incoloras
hasta que se coloree el extendido con azul de metileno, que actúa como
colorante de contraste. Las bacterias que no son ácido-alcohol resistentes
aparecerán de color azul después de la aplicación del colorante de contraste.
Tincion de Schaeffer-Fulton
La tinción de esporas bacterianas, también llamada tinción Schaeffer-Fulton,
es utilizada ampliamente para la identificación de bacterias esporuladas,
generalmente pertenecientes a los géneros Bacillus y Clostridium, algunas de
las cuales son patógenas por naturaleza. Sin embargo, debido a su
resistencia característica, en muchos casos las endosporas bacterianas
resisten la coloración, dificultando la percepción de las mismas. El objetivo
del presente estudio fue evaluar el efecto que produce una modificación,
aplicada en el laboratorio de microbiología de la facultad de Químico
Farmacobiología-UMSNH, a la técnica original de tinción de esporas,
tomando en cuenta la edad de los bacilos. Se efectuó la comparación entre la
técnica de tinción de esporas bacterianas según Schaeffer-Fulton y con
modificaciones de la misma, aumentando el tiempo de exposición a verde de
malaquita y disminuyendo la concentración de safranina. Para ello se
realizaron tinciones de cultivos de 24 y 48 horas de 8 cepas de bacilos gram
positivos esporulados incubadas a 37ºC, para determinar la eficiencia de las
modificaciones frente a la técnica original. Como resultado a estas
modificaciones, se observo de manera clara, una respuesta positiva de hasta
un 80% sobre los cultivos de 24 horas, mientras que en cultivos de 48 horas
la eficiencia de la técnica original aumento hasta un valor de 90%. Con las
modificaciones introducidas a la técnica original de Schaeffer-Fulton, se
facilito la identificación de los bacilos esporulados de interés medico, al
observar correctamente la posición y la forma de la espora al microscopio.
Objetivos
 Aprender las distintas técnicas de tinción para el análisis de
microorganismos.
 Identificar cuando se deben de emplear las distintas técnicas de tinción

y qué tipo de microorganismos ayuda a identificar cada técnica.
Planteamiento del Problema
Las tinciones son técnicas muy precisas para la identificación de organismos
microscópicos. Existen variedad de técnicas de tinciones; cada una de ellas
tienen una función y utilización para identificar organismos microscópicos
específicos. Son técnicas que usan en distintas áreas, desde medicina hasta
la industria de alimentos, por ello son técnicas globales. Es por ello que cada
técnica de tinción tiene un objetivo específico como el caso de la tinción de
Gram para la identificación y diferenciación de las bacterias Gram negativas y
Gram positivas, la tinción de Ziehl-Neelsen, la cual se usa para identificar
bacterias que puedan resistir y no puedan resistir la decoloración con ácido-
alcohol. Estas técnicas usan distintos reactivos para la identificación de
microorganismos en muestras a analizar.
Materiales
Reactivos:
 Alcohol-Acetona
 Safranina
 Solución de yodo yodurado (Lugol)
 Cristal Violeta
 Verde Malaquita
 Azul de Metileno
Metodología
Tinción de Gram
1. Se entiende la muestra recogida en un portaobjetos y se fija en el mechero

2. Se aplica metanol al portaobjetos; así, las bacterias quedan pegadas en la
superficie.
3. Se añade safranina o violeta de genciana, esto con el propósito de que las
bacterias se tiñan de un color púrpura y rojo. Esperar un minuto después de
aplicar el colorante.
4. Se lava la muestra coloreada con agua y se añade alcohol-acetona para
desteñir las bacterias que deben teñir con el violeta de genciana. Es la parte
más importante de la prueba, ya que si se deja demasiado tiempo se
desteñirían todas las bacterias. Después se lava de nuevo con agua para
eliminar el alcohol.
5. Se añade fucsina; otro colorante que tiñe de rosa las bacterias que no se han
teñido de color púrpura. Así se pueden observar al microscopio, aunque
serán Gram negativas.
6. El microbiólogo estudia la muestra con un microscopio e identifica las
bacterias teñidas.
Tinción de Ziehl-Neelsen
1. Fijar el frotis
2. Poner las láminas en el soporte de coloración
3. Cubrir las láminas con Fucsina de Ziehl
4. Calentar las láminas por 5 minutos, permitiendo la salida de vapores y

evitando la ebullición de la fucsina
5. Luego 5 minutos, escurrir y lavar las láminas delicadamente con agua
6. Decolorar las láminas con solución de alcohol-ácido hasta que se

quede completamente clara
7. Lavar las láminas con agua corriente
8. Colorar con Azul de Metileno por 1 minuto
9. Lavar con agua corriente y secar.
Tinción de Schaeffer-Fulton
Realizar un frotis colocando una capa fina del cultivo sobre el portaobjeto,
dejar secar y fijar con la mínima cantidad de calor
1. Realizar un frotis colocando una capa fina del cultivo sobre el

portaobjeto, dejar secar y fijar con la mínima cantidad de calor
2. Cubrir la preparación con solución al 5% de verde de malaquita,

calentar con hisopo hasta la emisión de vapores y dejar enfriar durante
5 min.
3. Lavar con agua.
4. Colorear durante 30 s con solución acuosa de safranina al 0,5%.
5. Lavar con agua, secar con papel y observar con el objetivo de

inmersión.
Bibliografía
 López Jácome, L.E., Hernández Durán, M., Colín Castro, C.A., Ortega
Peña, S., Cerón González, G., y Franco Cendejas, R. (2014). Las
tinciones básicas en el laboratorio. Investigación en Discapacidad, 3(1),
10-18. Obtenido de: http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-
2014/ir141b.pdf
 Como se hace una tinción de Gram – pruebas médicas. obtenido de:

https://www.webconsultas.com/pruebas-medicas/como-se-hace-una-
tincion-de-gram-13402
 Tinción de Ziehl-Neelsen: Fundamento, Reactivos y Técnica – Lifeder.

Obtenido de: https://www.lifeder.com/tincion-ziehl-neelsen/

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ESPECIALIDAD: INGENIERÍA BIOQUÍMICA

FECHA DE ENTREGA: 20 - MARZO - 2024

Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color como a

 Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.

Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se

La tinción de Gram consiste en una

La muestra de la zona infectada se extiende sobre un portaobjetos y se deja

Se puede obtener información adicional observando las agrupaciones que

La coloración de la tinción de Gram y la forma de las bacterias permiten

Con la tinción de Gram también pueden visualizarse hongos (en forma de

Ciertos microorganismos especialmente los del género Mycobacterium (M.

Dichos microorganismos contienen una gran cantidad de ceras asociadas a

 Identificar cuando se deben de emplear las distintas técnicas de tinción

1. Se entiende la muestra recogida en un portaobjetos y se fija en el mechero

2. Poner las láminas en el soporte de coloración

3. Cubrir las láminas con Fucsina de Ziehl

4. Calentar las láminas por 5 minutos, permitiendo la salida de vapores y

5. Luego 5 minutos, escurrir y lavar las láminas delicadamente con agua

6. Decolorar las láminas con solución de alcohol-ácido hasta que se

7. Lavar las láminas con agua corriente

8. Colorar con Azul de Metileno por 1 minuto

9. Lavar con agua corriente y secar.

1. Realizar un frotis colocando una capa fina del cultivo sobre el

2. Cubrir la preparación con solución al 5% de verde de malaquita,

3. Lavar con agua.

4. Colorear durante 30 s con solución acuosa de safranina al 0,5%.

5. Lavar con agua, secar con papel y observar con el objetivo de

 Como se hace una tinción de Gram – pruebas médicas. obtenido de:

 Tinción de Ziehl-Neelsen: Fundamento, Reactivos y Técnica – Lifeder.

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