Impacto de La Concentración de Suero Fetal Bovino Sobre Las Células Epiteliales Dentales

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Entramado

ISSN: 1900-3803
ISSN: 2539-0279
Universidad Libre de Cali

Impacto de la concentración de suero


fetal bovino sobre las células epiteliales
dentales
*

Simancas-Escorcia, Victor; Diaz-Caballero, Antonio


*
Impacto de la concentración de suero fetal bovino sobre las células epiteliales dentales
Entramado, vol. 15, núm. 1, 2019
Universidad Libre de Cali
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=265460762017
DOI: 10.18041/1900-3803/entramado.1.5420

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Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
Ciencias de la Salud

Impacto de la concentración de suero


fetal bovino sobre las células epiteliales
dentales*
Impact of bovine fetal serum concentration on dental
epithelial cells
Impacto da concentração de soro bovino fetal nas células
epiteliais dentárias

Victor Simancas-Escorcia ** [email protected]


Universidad de Cartagena, Colombia
***
Antonio Diaz-Caballero [email protected]
Universidad de Cartagena, Colombia

Entramado, vol. 15, núm. 1, 2019


Resumen: El esmalte dental, tejido más duro del cuerpo humano, es formado por medio
Universidad Libre de Cali de la diferenciación de células epiteliales conocidas como ameloblastos. Recientemente,
las células epiteliales dentales de incisivo de rata han sido utilizadas como modelo
Recepción: 01 Noviembre 2018
Aprobación: 20 Diciembre 2018 celular de eventos fisiopatológicos durante la formación del esmalte dental. Sin embargo,
en función de los eventos estudiados es meritorio comprender su comportamiento,
DOI: 10.18041/1900-3803/ particularmente cuando la concentración del Suero Fetal Bovino (SFB) varia. El
entramado.1.5420
propósito de este trabajo es evaluar el impacto de la concentración del SFB sobre el
crecimiento, proliferación y supervivencia de las células epiteliales dentales. Células
CC BY-NC-SA
epiteliales dentales fueron cultivadas en DMEM/F12, en presencia y ausencia de
SFB. Observaciones morfológicas e inmunohistoquímicos de la actina, vimentina y
fibronectina fueron realizados. Los resultados permitieron constatar que la ausencia
de SFB afectó negativamente la proliferación de las células epiteliales dentales, pero
mantuvo una expresión óptima de la actina y vimentina. Se identificó una alteración en
la expresión de la fibronectina en las células tratadas en ausencia de SFB. En conclusión,
la carencia de SFB disminuyo drásticamente la supervivencia, proliferación y expresión
de la fibronectina en las células epiteliales dentales de rata.
Palabras clave: Ameloblastos, esmalte dental, medios de cultivo, medio de cultivo libre
de suero, proliferación celular (Fuente: DeCS).
Abstract: Dental enamel, the hardest tissue in the human body is formed by the
differentiation of epithelial cells known as ameloblasts. Recently rat incisor dental
epithelial cells have been used as a cellular model of pathophysiological events during
tooth enamel formation. However depending on the events studied, it is necessary to
understand the behavior of these cells, particularly when the concentration of Bovine
Fetal Serum (FBS) varies. e purpose of this work is to evaluate the impact of FBS
concentration on the growth, proliferation, and survival of dental epithelial cells. Dental
epithelial cells were cultured in DMEM/F12 culture medium in the absence and
presence of 10% FBS. Morphological and immunohistochemical observations of actin,
vimentin, and fibronectin were performed. e results confirm that the absence of FBS
negatively affected the proliferation of dental epithelial cells but maintained an optimal
expression of actin and vimentin. An alteration in the expression of fibronectin in
the cells treated in the absence of FBS was identified. In conclusion, the lack of FBS
dramatically decreased the survival, proliferation, and expression of fibronectin in rat
dental epithelial cells.

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Keywords: Ameloblasts, dental enamel, culture media, culture media serum-free, cell
proliferation (Source: Decs).
RESUMO: O esmalte dentário, o tecido mais duro do corpo humano, é formado pela
diferenciação de células epiteliais conhecidas como ameloblastos. Recentemente, células
epiteliais dentárias de incisivo de rato têm sido utilizadas como modelo celular de eventos
fisiopatológicos durante a formação do esmalte dentário. No entanto, dependendo dos
eventos estudados, é meritório entender seu comportamento, particularmente quando
a concentração de soro fetal bovino (FBS) varia. O objetivo deste trabalho é avaliar o
impacto da concentração de SFB no crescimento, proliferação e sobrevivência de células
epiteliais dentárias. Células epiteliais dentárias foram cultivadas em DMEM / F12, na
presença e ausência de SFB. Observações morfológicas e imunohistoquímicas de actina,
vimentina e fibronectina foram realizadas. Os resultados permitiram confirmar que a
ausência de SFB afetou negativamente a proliferação de células epiteliais dentárias, mas
manteve uma ótima expressão de actina e vimentina. Uma alteração na expressão de
fibronectina nas células tratadas na ausência de SFB foi identificada. Em conclusão,
a falta de SFB diminuiu drasticamente a sobrevivência, proliferação e expressão de
fibronectina em células epiteliais dentárias de ratos
Palavras-chave: Ameloblastos, esmalte dentário, meios de cultura, meio de cultura livre
de soro, proliferação celular (Fonte: DeCS).

Introducción

En el ser humano, la formación dental resulta de la interacción


biológica de dos agrupamientos celulares provenientes del ectodermo
y el ectomesénquima. Cada diente es el resultado de movimientos
morfogenéticos celulares y la cooperación entre células epiteliales y
mesenquimatosas (Rothová et al. 2011; esleff, 2003). Este proceso
inicia a partir de la formación del germen dental, que se divide en una
estructura de origen epitelial: el órgano del esmalte y, en dos estructuras
ectomesenquimatosas: la papila primitiva y el folículo fibroso. La papila
primitiva dará origen a los odontoblastos, la dentina y la pulpa dental,
mientras que el folículo fibroso originara el cemento, hueso alveolar y
ligamento periodontal (Liyanage, 2013).
Las células del órgano del esmalte generan la producción del esmalte
dental a través de los ameloblastos, células responsable de la secreción de
la matriz orgánica, gracias al proceso de la amelogénesis o diferenciación
celular que implica el paso por varios estados sucesivos finalizando con la
formación del esmalte dental (Zheng et al. 2014). Los ameloblastos crean
y mantienen un microambiente extra-celular que propicia la formación
del esmalte y secretan las proteínas matriciales que controlan los depósitos
de minerales. Estas células presentan varios cambios fenotípicos a lo largo
de la amelogénesis, desarrollados en tres etapas: la citodiferenciación,
secreción de la matriz amelar y la maduración del esmalte (Berkovitz,
Holland y Moxham, 2009).
Durante la citodiferenciación, los ameloblastos denominado pre-
ameloblastos, se diferencian y convierten en funcionales; es una fase
donde el diente adquiere su forma y los ameloblastos se preparan para
ingresar en una fase de secreción. Esta etapa incluye la salida del ciclo
celular, alargamiento y polarización de los ameloblastos (Berkovitz,
Holland y Moxham, 2009). Durante la secreción de la matriz del esmalte,
los ameloblastos fabrican diversas proteínas matriciales. Primero, ocurre

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la secreción lateral alrededor de las prolongaciones de Tomes, dando


lugar a una red de esmalte prismático seguido de los espacios ocupados
por las prolongaciones de Tomes que son ocupados por un esmalte
interprismático. En la maduración del esmalte, ocurre un crecimiento en
el espesor y dimensión de los cristales gracias a la degradación de la matriz
orgánica y la llegada masiva de iones de calcio y fosfato (Zheng et al 2013;
Boskey, 2003).
Al final de las etapas mencionadas, una estructura acelular, avascular y
sin inervación que recubre la totalidad de la corona dental y cuya principal
característica es la ausencia de renovación conocida como esmalte dental,
es creada (Zheng et al. 2013), cualquiera alteración que afecte su proceso
de formación, puede generar anomalías en su estructura. Alteraciones
genéticas y funcionales, así como modificaciones en la incorporación de
iones como el estroncio, magnesio, carbonatos (CO3 2), plomo o incluso
el flúor son reportados por su capacidad en generar alteraciones en la
formación del esmalte dental y sus propiedades fisicoquímicas (Boskey,
2003).
El estudio de los diferentes procesos y eventos fisiológicos que dan
origen al esmalte dental ha sido posible por medio de modelos animales,
uno de estos modelos son los incisivos de los roedores; ellos tienen
la capacidad de crecer continuamente y renovar el epitelio dental que
produce la matriz del esmalte gracias a células madres. Sin embargo,
resulta conveniente continuar dilucidando los procesos sobre la actividad
biológica que llevan a cabo los ameloblastos durante su diferenciación.
Para ello, se han propuestos modelos celulares como las células epiteliales
dentales originadas del asa cervical de incisivos de rata.
Las células epiteliales dentales de incisivos de rata, también
denominadas células ameloblásticas de rata, han sido útiles en el
estudio de transporte de iones epiteliales durante la amelogénesis (Bori
et al. 2016). De acuerdo a estudios inmunohistoquímicos realizados
recientemente, las células epiteliales presentan características de los
ameloblastos, incluyendo la expresión de la amelogenina, ameloblastina,
calicreína-4 y la amelotina. Estas dos últimas, marcadores de los
ameloblastos en la etapa de maduración (Kawano et al. 2002). Estas
células también han sido usadas con el propósito de conocer el papel
de la autofagia en la fluorosis dental y sus mecanismos de acción (Lei
et al. 2015). Sin embargo, se requieren más estudios para determinar si
las células epiteliales de rata pueden servir como un modelo óptimo que
permita conocer los roles fisiopatológicos de los ameloblastos a lo largo
de su proceso de diferenciación y el papel de factores que modifiquen una
adecuada formación del esmalte dental.
Sistemáticamente, la implementación de modelos celulares implica
la utilización de suplementos con Suero Fetal Bovino (SFB). El SFB
es una composición que contiene factores biológicos como proteínas,
vitaminas, hormonas, glucosa y factores de crecimientos necesarios para el
crecimiento, proliferación y mantenimiento de las células (Lee et al 2003;
Mucci et al. 2006). El uso del SFB en los cultivos celulares continua siendo
debatible dada la probable introducción de elementos que pueden inducir

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efectos inhibitorios en el desarrollo y diferenciación celular, además de


la posibilidad de generar contaminación biológica (Van der Valk et al.
2010). Sin embargo, su uso es casi rutinario por el aporte de factores de
crecimiento necesarios para la supervivencia celular.
El uso de medios de cultivos sin suero fetal bovino ni moléculas de
origen animal fue fuertemente sugerido por parte de los organismos
regulatorios como la FDA (Food and Drug Administration) dado los
riegos biológicos potenciales. Desafortunadamente, la eliminación de este
componente para muchas líneas celulares representa la disminución en
el crecimiento, viabilidad y mantenimiento celular. De allí que se hace
necesario profundizar en los conocimientos de base sobre el crecimiento,
metabolismo y muerte de líneas celulares cultivados en ausencia de suero
fetal bovino.
Con el propósito de comprender los mecanismos implicados en el
proceso de la formación del esmalte dental, el desarrollo de un modelo
in vitro a partir de células epiteliales dentales se hace necesario. En
consecuencia, la comprensión de los aspectos fisiológicos de estas células
requiere prioritariamente la caracterización de los elementos necesario
para su cultivo, entre ellos, el SFB. El propósito de este trabajo es evaluar
el efecto concentración-dependiente de la suplementación de SFB en
el medio de cultivo y el comportamiento, crecimiento, proliferación y
supervivencia de células epiteliales dentales.

1. Metodología

1.1. Cultivo celular

Células epiteliales dentales originadas del asa cervical de incisivos de


rata descritas previamente por Kawano et al. (2002) fueron cultivadas
en dos medios de cultivo diferentes: Medio de cultivo 1 (DMEM/
F12 + SFB 10%), compuesto de Dulbecco's Modified Eagle Medium:
Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) Gibco™, 10% de Suero Fetal
Bovino-SFB (Gibco™), 1% de penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)
(Gibco™), 0,5 de Anfotericina B (Gibco™). Medio de cultivo 2 (DMEM/
F12 + SFB 0%), constituido de DMEM/F12 DMEM Gibco™, 1% de
penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL) (Gibco™), 0,5 de Anfotericina
B (Gibco™). Cada pasaje celular correspondía alrededor de una semana
de cultivo. La caja de Petri con las células y el medio de cultivo fueron
incubados a 37°C en una atmosfera húmeda que contenía 5% de CO2. El
medio de cultivo fue reemplazado dos veces por semana hasta la obtención
de células a una confluencia de 70-80%.

1.2. Análisis morfológico

La morfología celular fue observada a lo largo de la proliferación y una


vez alcanzada la confluencia por medio de la microscopia de contraste
de fases (Zeiss) gracias a cámara fotográfica. En paralelo, una contra-

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coloración nuclear con el marcador de ácido nucleico Hoechst 33342


(ermo Fisher Scientific) en las dos condiciones de cultivo fue llevado a
cabo con el fin de constatar la supervivencia de las células epiteliales.

1.3. Inmunohistoquímica

A una confluencia de aproximadamente 90%, las células epiteliales


dentales fueron fijadas mediante una solución de PBSIX (Gibco™)
que contenía 4% de paraformaldehído (Sigma-Aldrich®) - 5% sacarosa
(Sigma-Aldrich®) durante 15 minutos. Seguidamente, las células
fueron permeabilizadas utilizando 0.5% de Triton X-100 (Sigma-
Aldrich®). Evitando una eventual coloración no especifica, las células
fueron incubadas 20 minutos en PBSIX que contenía 1% de BSA
(Sigma-Aldrich®) / 1% de glicina (Sigma-Aldrich®) a temperatura
ambiente. Posteriormente, las células estuvieron en contacto con los
anticuerpos primarios a 4°C durante toda la noche. Para la doble
inmunofluorescencia, los anticuerpos primarios se incubaron tal como se
indicó precedentemente. Finalmente, las células estuvieron en contacto
con los anticuerpos secundarios apropiados durante 2h a temperatura
ambiente. Los núcleos celulares fueron coloreados con DAPI (Life
Technologies Corporation), seguido por el montaje de las células mediante
la solución Immu-MountTM (ermo Scientific).
Los anticuerpos primarios utilizados para la coloración inmunológica
fueron: anti-Fibronectin sc-71113 (Santa Cruz Biotechnology INC)
(1/200), anti-Vimentin (Sigma-Aldrich®) 1/200. Los anticuerpos
secundarios fueron Alexa Fluor 488 donkey anti-ratón (Life Technologies
Corporation) -1/400 y Alexa Fluor 594 donkey anti-ratón (Life
Technologies Corporation) -1/400, respectivamente. La coloración
mediante la faloidina fue realizada después de la incubación del segundo
anticuerpo, mediante Alexa FluorTM 594 Phalloidin (ermo Fisher
Scientific) durante 15 minutos y siguiendo las recomendaciones del
fabricante. Todas las coloraciones fueron observadas utilizando el
microscopio Fluorescente Zeiss AxioSkop.

2. Resultados

La variación en la concentración de SFB en el cultivo de células epiteliales


dentales, como un elemento vital que participa en la supervivencia,
crecimiento y proliferación de las células cultivadas in vitro fue
estandarizada en este estudio. Microscópicamente, las células mostraron
un aspecto circular u ovoide junto a un núcleo redondos y voluminoso
durante el tiempo de cultivo, haciendo constatar la supervivencia y
viabilidad de estas células durante el tiempo de cultivo (Figura 1).

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Figura 1
Marcaje de los núcleos en azul (Hoechst) de las células epiteliales dentales después de ser
cultivadas con SFB 10% (A,C) y SFB 0% (B,D,) a 24 y 96 horas. Barra blanca: 200 μm.
Fuente: Simancas-Escoraa, Díaz-Caballero

Las células epiteliales dentales cultivadas en ambos grupos


experimentales mostraron una supervivencia a lo largo 7 días (Figura 2).
Sin embargo, en función de la concentración del SFB, una variación en la
confluencia de las células epiteliales dentales fue observada (Figura 2, A-
H). En la condición de cultivo 1 (DMEM/F12 + SFB 10%), las células
epiteliales alcanzaron una confluencia de aproximadamente 20% luego de
24 horas de cultivo (Figura 2,A). Estos resultados fueron muy similares a
los resultados hallados en las células epiteliales cultivadas en ausencia de
SFB en el mismo periodo de tiempo (Figura 2,B). Las células epiteliales
en contacto con el SFB a 10% continuaron proliferando hasta obtener
una confluencia de aproximadamente 100% a las 96 horas (Figura 2.
C,E,G). Sin embargo, una cantidad no cuantificable de células flotantes
fueron evidentes con el paso del tiempo en las células epiteliales cultivas en
ausencia de SFB y la confluencia a 100% no fue observada en los periodos
de tiempo estudiados (Figura 2. D,F,H).

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Figura 2
Proliferación de las células epiteliales dentales cultivadas con SFB 10% (A,C,E,G) y
SFB 0% (B,D,F,H) a 24,48,72 y 96 horas. DMEM/F12: Dulbecco’s Modified Eagle
Medium: Nutrient Mixture F-12. SFB: Suero Fetal Bovino. Barra blanca: 1000 μm.
Fuente: Simancas-Escorcia, Díaz-Caballero

2.2. Matriz extracelular y citoesqueleto

La expresión de la actina, elemento fundamental en la arquitectura del


citoesqueleto y el movimiento celular fue inmunodetectado por medio
de la faloidina. Una detención positiva de la actina presente en las células
epiteliales fue observada en las dos condiciones de cultivo celular llevadas
a cabo en el presente estudio (Figura 3, A-F). Sin embargo, en el medio de
cultivo 1 (DMEM/F12 + SFB 10%), probablemente debido a la presencia
de una mayor cantidad de células, el marcaje de la actina mostró una
relación estrecha entre las células epiteliales dentales (Figura 3, A-C),
contraria a la observación de las células epiteliales cultivadas en el medio
de cultivo 2 (DMEM/FI2 + SFB 0%)(Figura 3, D-F).

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Figura 3
Microfotografías del citoesqueleto mediante inmunofluorescencia de los
filamentos de actina (faloidina) de células epiteliales dentales a 10% y 0% de SFB.
Núcleos coloreados con DAPI (azul). DMEM/FI2: Dulbecco's Modified Eagle
Medium: Nutrient Mixture F-12. SFB: Suero Fetal Bovino. Barra blanca: 200 μm.
Fuente: Simancas-Escorcia, Díaz-Caballero

Haciendo uso de la técnica de doble inmunofluorescencia, la monocapa


de células epiteliales dentales cultivadas a diferentes concentraciones de
SFB pusieron de manifiesto la expresión de las proteínas vimentina y
fibronectina (Figura 4, A-F). Las células epiteliales dentales en contacto
con el medio de cultivo 1 (DMEM/F12 + SFB 10%) registraron una
mayor red entre los componentes de la MEC y las células. Estos datos se
confirman de acuerdo a lo identificado con la fibronectina y una proteína
fibrosa que forma los filamentos intermedios del citoesqueleto tal como
la vimentina (Figura 4, A-C). En el medio de cultivo 2 (DMEM/F12 +
SFB 0%) aunque fue vista la expresión de la fibronectina y la vimenti-
na, se constató una red menos compacta de los componentes de la MEC
y las células epiteliales dentales comparadas con las células en contacto
con el medio de cultivo 1 (Figura 4, D-F). Se identifica que el marcaje
emitido en las células epiteliales cultivadas con 10% de SFB se destaca
por ser nítido y ubicado de manera uniforme en la zona externa de las
células en cultivo. Estos mismo marcaje se encuentra ausente en las células
epiteliales tratadas con la ausencia de SFB (Figura 4, B,E).

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Figura 4
Microfotografías del citoesqueleto y matriz extracelular: Expresión de la
vimentina y fibronectina en células epiteliales dentales a 10% y 0% de SFB.
Núcleos coloreados con DAPI (azul). DMEM/F12: Dulbecco's Modified Eagle
Medium: Nutrient Mixture F-12. SFB: Suero Fetal Bovino. Barra blanca. 200 μm.
Fuente: Simancas-Escorcia, Díaz-Caballero

3. Discusión

El mantenimiento, crecimiento y diferenciación de células humanas y


animales in vitro requiere de condiciones adecuadas de cultivo. Una de
ellas corresponde al medio de cultivo, elemento encargado de suministrar
los componentes esenciales para la proliferación y diferenciación celular.
Frecuentemente, los medios basales son complementados con suero
de origen humano o animal. El suero es una composición que
contiene elementos como hormonas, proteínas de transporte, factores de
crecimiento, etc. El suero más utilizado en los medios de cultivo celular
es el suero fetal bovino, esencial en promover de manera fisiológica el
crecimiento y proliferación celular (Gstraunthaler, Seppi y Pfaller, 1999).
El presente trabajo fue realizado gracias a la utilización del medio de
cultivo DMEM/F12 y la suplementación de SFB dada su disponibilidad,
frecuente utilización en la literatura científica y diminuta presencia de
gamma-globulina, quien garantiza un bajo contenido de anticuerpos y en
consecuencia un menor impacto en la inhibición y proliferación celular.
Con el cultivo de las células epiteliales dentales del asa cervical de incisivos
de rata fueron estudiados los efectos de la concentración del SFB en su
comportamiento, crecimiento, proliferación y supervivencia. En el marco
de lo anterior, de manera global nos propusimos conocer y comprender
cuales eran los efectos de la ausencia de factores hormonales que estimulan
el crecimiento y proliferación de las células epiteliales dentales. Así
como, diversos factores que afectan la diferenciación y proporcionan
proteínas de transporte, minerales, oligoelementos, factores de unión, de
estabilización y detoxificación presentes en el SFB.
Actualmente, el uso del SFB en cultivos celulares ha sido objeto de
discusión por el impacto que puede tener en estudios experimentales in

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vitroe interpretación de los resultados. Uno de los cuestionamiento en


la utilización del SFB se basa en la posibilidad de introducir a través de
este producto, elementos que puedan ocasionar efectos inhibitorios en
el desarrollo y diferenciación celular pero también por la contaminación
que puede inducir el uso de SFB dado el origen biológico y producción
(Van der Valk et al. 2010). Estos cuestionamientos surgen de inquietudes
al momento de la extracción de la sangre fetal. Los fetos bovinos de los
cuales i se extrae la sangre y que va dirigida a la producción de SFB, se
obtiene de vacas preñadas enviadas al sacrificio. Una vez presente en la
línea de sacrificio, el feto es separado de la vaca y la sangre fetal se recoge
en condiciones asépticas mediante la perforación del corazón del feto,
implicando la manipulación del feto tal como lo indica Jochems et al.
(2002). Si por diversos motivos esta manipulación presenta alteraciones,
la composición del SFB se verá afectada y el riesgo de contaminación de
los cultivo será mayor. Sin nombrar la falta de garantía que en términos de
bienestar de los animales tendrá lugar producto de la producción del SFB.
En consecuencia, es de anotar que por composiciones indebidas de
SFB, riesgo de contaminación, bienestar animal y costos, las autoridades
regulatorias, aunque no han desestimado su uso, si se encuentran
promoviendo la utilización de elementos alternativos en el cultivo de
células tanto en la industria como en la comunidad investigativa en
general (Van der Valk et al. 2010). Por ello, con el fin de evitar la
proliferación de muchas células en un medio de cultivo suplementado
con SFB por las razones evocadas, los equipos de investigación ha
volcado su mirada hacia sustitutos de origen humano autógenos que
permitan evitar el contacto de células con productos de origen animal,
principalmente si se trata de líneas celulares humanas. Estos sustitutos
son en su mayoría representados por la familia de derivados plaquetarios
que contienen diferentes concentraciones de factores de crecimiento.
Entre ellos encontramos diversos derivados plaquetarios utilizados como
suplemento de medios de cultivo in vitro: lisa plaquetario, plasma rico en
plaquetas, los concentrados plaquetarios y el suero humano (Burnouf et
al.2016).
Sin embargo, a pesar de los riesgos biológicos y bioéticos que pueda
representar la utilización de SFB en el cultivo celular, la utilización de este
suplemento es aun importante. De hecho, la utilización de SFB en nuestro
trabajo es aceptable dado que principalmente se buscaba establecer las
condiciones óptimas de cultivo en un modelo celular in vitro que será útil
en el estudio de los aspectos fisiopatológicos de las células que participan
en la formación del esmalte dental. Contrariamente, las recomendaciones
encaminadas a desestimar el uso de SFB está focalizado primordialmente
en el cultivo de células que pretenden ser utilizadas con fines regenerativos
y de tratamiento en muchas patologías humanas.
Se ha establecido que la provisión de factores de crecimiento es esencial
en la supervivencia de las células cultivadas. El medio de cultivo DMEM/
F12 hace posible el crecimiento de una amplia gama de tipos celulares,
además de permitir estudiar sus características biológicas (Roozafzoon
et al. 2015; Nishikawa et al. 2018). El presente trabajo ha demostrado

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que la utilización del medio de cultivo DMEM/F12 en ausencia de SFB


disminuyen la proliferación celular de las células epiteliales dentales del
asa cervical de incisivos de rata. Cuando estas células fueron cultivadas
utilizando el medio de cultivo DMEM/F12 junto a una concentración
de 10% de SFB, estas células lograron un nivel de confluencia mucho
más elevado en comparación con las células con DMEM/F12 sin la
presencia de SFB. Estos resultados que se encuentran en correlación con
los presentados por Fujii et al. (2018) y Gürdal et al (2018) quienes
haciendo usos de diferentes tipos celulares han permitido constatar que
los medios de cultivo suplementados con diferentes concentraciones de
SFB influye en el rendimiento de los cultivos celulares.
La disminución aparente en la proliferación de las células epiteliales
dentales hallados es el resultado de la ausencia de SFB en el medio
de cultivo. La ausencia de este elemento pudo ser el responsable de
la inducción de la apoptosis o interrupción del ciclo celular de las
células epiteliales dentales. Esta hipótesis puede ser corroborada gracias
a la presencia de un número no cuantificable de células epiteliales
flotantes en el medio de cultivo o sin adherencia a la caja de Petri en la
condición de cultivo donde hubo ausencia de SFB. Muy probablemente,
la células epiteliales cultivadas en estas condiciones de cultivo impidió
la interacción de receptores membranales y moléculas de adhesión como
las integrinas y en efecto, indujo cambios en la MEC, reservorio de
diversos factores de crecimiento y moléculas bioactivas determinantes en
funciones como la adhesión, migración, diferenciación y apoptosis celular
(Yue, 2014).
Dado que las moléculas de la MEC interactúan mediante proteínas,
entre ellas las integrinas, es probable que la disminución en la adhesión
de las células epiteliales cultivadas sin SFB sea la consecuencia de una
deficiente comunicación entre la MEC y el citoesqueleto. Eventualmente,
la ausencia de SFB en la condición de cultivo 2 afecto la activación de
las integrinas y su cambio conformacional, evitando la exposición de sus
dominios citoplasmáticos. En consecuencia, la ausencia de la activación
de las integrinas impidió la generar de cascadas de fosforilación y el
inicio de los eventos de señalización necesarios para la proliferación,
diferenciación y contractibilidad de las células epiteliales dentales. Es
de anotar que las integrinas además de aportar en la organización del
citoesqueleto y la migración celular, también actúan en la transmisión de
señales y la conexión entre los compartimientos intracelular y extracelular
(Wolfenson, Lavelin y Geiger, 2013).
La actina y vimentina, proteínas fundamentales del citoesqueleto
celular, fueron visualizadas en las células epiteliales dentales en el presente
trabajo. Aunque sus marcajes fueron más notorios en las células epiteliales
cultivadas con una concentración de 10% de SFB, dada la mayor cantidad
de células presentes, sus expresiones también fueron observadas en
las células cultivas en ausencia de SFB. Nuestros resultados también
constataron la presencia de la fibronectina en las células epiteliales
dentales. Sin embargo, contrario a lo observado con la actina y vimentina,
donde el marcaje celular fue muy similar independientemente de la

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concentración de SFB, el inmunomarcaje observado en las células


cultivadas en ausencia de SFB difiere de un marcaje nítido y uniforme que
bordea la parte externa de las células epiteliales cultivadas con 10% de SFB.
Es reconocido que la fibronectina suele ser fundamental en la unión y
migración de las células, funcionando como una especie de 'pegamento
biológico' por medio de enlaces de disulfuro al colágeno, heparina y
receptores de la superficie celular. Tal parece la alteración en el marcaje
de las células epiteliales cultivadas con ausencia de SFB comparada con las
células que estuvieron en contacto con 10% de SFB, indica la presencia
de cambios importantes en la arquitectura intersticial de estas células.
Probablemente, las células epiteliales dentales perdieron la organización
polarizada característica, producto de la falta de interacción célula -
célula y célula - MEC llevada a cabo por proteínas de adhesión e incluso
dominios específicos de la membrana plasmática, por la falta de los
elementos encontrados en el SFB. Precisamente, uno de los elementos
que facilita la comunicación entre las células y células-MEC a parte de
las integrinas es la fibronectina. De allí que deducimos que ante una
modificación fisiológica de la fibronectina, la comunicación intercelular
se vería severamente afectada e incluso conduciendo a cambios en la
MEC dependientes de la ausencia de interacción entre células (Zollinger y
Smith, 2017). Sin embargo, es necesario continuar explorando el impacto
de la concentración del SFB mediante análisis de la expresión génica
de proteínas involucradas en la adhesión, migración, diferenciación y
apoptosis de las células epiteliales de rata.

3. Conclusión

La ausencia de suero fetal bovino en el cultivo de las células epiteliales


de rata afecta de manera importante la supervivencia, proliferación y
altera la expresión de la fibronectina en estas células. Futuros estudios
son necesarios para mejorar el conocimiento de la expresión génica de la
fibronectina e integrinas que participan en la unión, migración y cambios
en la arquitectura de las células epiteliales de rata.

Agradecimientos

Al programa Bolívar Gana con Ciencia de la Gobernación de Bolívar,


Colombia y la Fundación Ceiba por el acompañamiento y financiamiento

Referencias bibliográficas

1. BERKOVITZ, Barry; HOLLAND, G y MOXHAM, Bernard. Oral


Anatomy, Histology and Embryology. S.l.: Mosby/Elsevier. ISBN
978-0-7234-3411-5.
2. BORI, E et al. Evidence for Bicarbonate Secretion by Ameloblasts in a Novel
Cellular Model. In: Journal of Dental Research. 2016. vol. 95, no. 5, pp.
588-596. https://doi.org/10.1177/0022034515625939.

PDF generado a partir de XML-JATS4R por Redalyc


Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
Entramado, 2019, 15(1), ISSN: 1900-3803 / 2539-0279

3. BOSKEY, Adele. Bone mineral crystal size. In: Osteoporosis International.


2003. vol. 14, no. 0, pp. 16-21. https://doi.org/10.1007/s00198-003-14
68-2.
4. BURNOUF, ierry et al. Human platelet lysate: Replacing fetal bovine
serum as a gold standard for human cell propagation? In: Biomaterials.
2016. vol. 76, pp. 371-387. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.
10.065.
5. CHIEGO, Daniel. Essentials of oral histology and embryology: a clinical
approach, 4th edition. Bdj. 2013. vol. 215, pp. 55.
6. FUJII, Sakiko et al. Characterization of human dental pulp cells grown in
chemically defined serum-free medium. In: Biomedical Reports. 2018. vol.
8, no. 4, pp. 350-358. https://doi.org/10.3892/br.2018.1066.
7. GSTRAUNTHALER, Gerhard; SEPPI, omas y PFALLER, Walter.
Impact of culture conditions, culture media volumes, and glucose content
on metabolic properties of renal epithelial cell cultures. Are renal cells
in tissue culture hypoxic? In: Cellular Physiology and Biochemistry:
International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry,
and Pharmacology. 1999. vol. 9, no. 3, pp. 150-172. https://doi.org/10.1
159/000016312.
8. GÜRDAL, Mehmet., BARUT SELVER, Özlem; BAYSAL, Kemal y
DURAK, Ösmet. Comparison of culture media indicates a role for
autologous serum in enhancing phenotypic preservation of rabbit limbal
stem cells in explant culture. In: Cytotechnology. 2018. vol. 70, no. 2, pp.
687-700. https://doi.org/10.1007/s10616-017-0171-7.
9. JOCHEMS, Carlo; VAN DER VALK, Jan; STAFLEU, Frans y BAUMANS,
Vera. e use of fetal bovine serum: ethical or scientific problem? In:
Alternatives to laboratory animals: ATLA. 2002. vol. 30, no. 2, pp.
219-227. https://doi.org/10.1177/026119290203000208.
10. KAWANO, Shintaro et al. Establishment of dental epithelial cell line
(HAT-7) and the cell differentiation dependent on Notch signaling
pathway. In: Connective Tissue Research. 2002. vol. 43, no. 2-3, pp.
409-412. https://doi.org/10.1080/03008200290000637.
11. LEE, James et al. Biological alchemy: engineering bone and fat from fat-
derived stem cells. In: Annals of Plastic Surgery. 2003. vol. 50, no. 6, pp.
610-617. https://doi.org/10.1097/01.SAP.0000069069.23266.35.
12. LEI, Shuang; ZHANG, Ying; ZHANG, Kaiqiang; LI, Jian y LIU, Lu. Effects
of Fluoride on the Expression of Beclin1 and mTOR in Ameloblasts. In:
Cells Tissues Organs. 2015. vol. 200, no. 6, pp. 405-412. https://doi.org
/10.1159/000441052.
13. MUCCI, N et al. Effect of estrous cow serum during bovine embryo
culture on blastocyst development and cryotolerance aer slow freezing or
vitrification. In: eriogenology. 2006. vol. 65, no. 8, pp. 1551-1562. htt
ps://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2005.08.020.
14. NISHIKAWA, Masaki et al. An optimal serum-free defined condition for
in vitro culture of kidney organoids. In: Biochemical and Biophysical
Research Communications. 2018. vol. 501, no. 4, pp. 996-1002. https://
doi.org/10.1016/j.theriogenology.2005.08.020.
15. ROOZAFZOON, Reza et al. Dental pulp stem cells differentiation into
retinal ganglion-like cells in a three dimensional network. In: Biochemical

PDF generado a partir de XML-JATS4R por Redalyc


Proyecto académico sin fines de lucro, desarrollado bajo la iniciativa de acceso abierto
Victor Simancas-Escorcia, et al. Impacto de la concentración de suero fetal bovino sobre las células epiteliales dentales*

and Biophysical Research Communications. 2015. vol. 457, no. 2, pp.


154-160. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2014.12.069.
16. ROTHOVÁ, Michaela; FENG, Jifan; SHARPE, Paul; PETERKOVÁ,
Renata y TUCKER, Abigail. Contribution of mesoderm to the
developing dental papilla. In: e International Journal of Developmental
Biology. 2011. vol. 55, no. 1, pp. 59-64. DOI https://doi.org/10.1387/ij
db.103083mr.
17. THESLEFF, Irma. Epithelial-mesenchymal signalling regulating tooth
morphogenesis. In: Journal of Cell Science. 2003. vol. 116, no. Pt 9, pp.
1647-1648. https://doi.org/10.1242/jcs.00410.
18. VAN DER VALK, J et al. Optimization of chemically defined cell culture
media--replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods. In:
Toxicology in vitro: an international journal published in association with
BIBRA. 2010. vol. 24, no. 4, pp. 1053-1063. https://doi.org/10.1016/j.t
iv.2010.03.016.
19. WOLFENSON, Haguy., LAVELIN, Irena. y GEIGER, Benjamin.
Dynamic regulation of the structure and functions of integrin adhesions.
In: Developmental Cell. 2013. vol. 24, no. 5, pp. 447-458. https://doi.or
g/10.1016/j.devcel.2013.02.012.
20. YUE, Beatrice. Biology of the Extracellular Matrix: An Overview. In: Journal
of glaucoma. 2014. pp. S20-S23. https://doi.org/10.1097/IJG.00000000
00000108.
21. ZHENG, Li et al. e tick tock of odontogenesis. In: Experimental Cell
Research. 2014. vol. 325, no. 2, pp. 83-89. https://doi.org/10.1016/j.yex
cr.2014.02.007.
22. ZHENG, Li et al. Circadian rhythms regulate amelogenesis. In: Bone. 2013.
vol. 55, no. 1, pp. 158-165. https://doi.org/10.1016/j.bone.2013.02.011.
23. ZOLLINGER, Alicia y SMITH, Michael. Fibronectin, the extracellular
glue. In: Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix
Biology. 2017. vol. 60-61, pp. 27-37. https://doi.org/10.1016/j.matbio.2
016.07.011.

Notas
* http://dx.doi.org/10.18041/1900-3803/entramado.1.5420 Este es un artículo Open
Access bajo la licencia BY-NC-SA (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0
/) Published by Universidad Libre - Cali, Colombia.

Licencia Creative Commons

Cómo citar este artículo: SIMANCAS ESCORCIA, Victor; DIAZ CABALLERO,


Antonio. Impacto de la concentración de suero fetal bovino sobre las células epiteliales
dentales. En: Entramado . Enero - Junio, 2019. vol. 15, no. 1, p. 276-284 http://dx.doi
.org/10.18041/1900-3803/entramado.1.5420.

Notas de autor

Conflicto
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses
de
intereses

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