Curso de Histología.

FCV. UNLP

Dra. Alicia Flamini

[TÉCNICA DEL FROTIS SANGUÍNEO Y

RECUENTOS CELULARES]
Introducción
La sangre es un tejido cuya sustancia intercelular es líquida, por tal motivo la mejor forma para estudiar la
estructura de los componentes formes es realizando láminas delgadas denominadas frotis o extendidos
sanguíneos coloreados. En el año 1891 el científico Romanovsky utilizó una mezcla de un colorante básico, el
azul de metileno y uno ácido, la eosina para observar los agentes productores del paludismo en glóbulos
rojos humanos. Es así, que desde entonces estas mezclas permitían observar estructuras que no podían
evidenciarse con ninguno de los colorantes por separado. Hoy se han modificado las mezclas aunque se
siguen llamando mezclas de Romanovsky.

Técnica del frotis

Se deben utilizar portaobjetos limpios y desengrasados. En ellos se coloca una pequeña gota
(preferentemente sin anticoagulante) en uno de los extremos. Con otro portaobjetos biselado (para no dañar
los elementos formes), se “toca” la gota y se dirige primero hacia atrás, en ángulo de 45 º dejando que la
sangre se extienda por capilaridad y luego se “arrastra” hacia adelante manteniendo la firmeza para realizar
un extendido parejo (Figura 1).

Figura 1. Método del extendido.

De esta manera el frotis tendrá una cabeza, un cuerpo y una cola (Figura2). De los 3 sitios se prefiere realizar
el recuento en el cuerpo del extendido, por ser el sitio donde mejor se distribuyen los elementos formes.

Figura 2. Zonas de un extendido realizado correctamente.

Tinción

De las mezclas de Romanovky que se conocen, la más utilizada es la de May Grünnwald-Giemsa. El primero
de ellos consiste en una solución de eosinato de azul de metileno en alcohol metílico (este último actúa como
fijador). El May Grünwald se lo utiliza puro, tal como vienen del laboratorio. El Giemsa, contiene azur II
eosina, glicerina y alcohol metílico. El Giemsa no se lo utiliza puro, sino diluido en una solución buffer a razón
de 1-2 gotas por ml.

Los tiempos de la técnica que se describe a continuación pueden variar con la calidad del colorante. Lo ideal
es utilizar colorantes de laboratorios reconocidos a fin de evitar inconvenientes en la práctica.

1. Cubrir el frotis con 20-30

30 gotas de May Grünwald durante 3 a 5 minutos.
2. Colocar sobre este colorante la misma cantidad de solución buffer
buffer y déjalo actuar durante el mismo
tiempo “SIN” volcar el May Grünwald.
3. Volcar toda la mezcla.
4. Cubrir con la solución diluida de Giemsa preparado en el momento y dejar actuar por 15 a 20
minutos.
5. Lavar en agua corriente.
6. Secar.
7. Se puede observar una vez seco o cubrirlo con un cubreobjetos y bálsamo de Canadá.

Interpretación de los resultados

La eosina del eosinato colorea la mayor parte de los citoplasmas y los gránulos acidófilos de color rosado. El
azul de metileno colorea los gránulos basófilos y los núcleos. El azur II tiñe algunos gránulos (por ese motivo
se llaman azurófilos).
). El alcohol metílico actúa como fijador y mordiente, es decir, favorece la acción del
colorante.

Obtención de la fórmula leucocitaria

Las fórmulas leucocitarias relativa y absoluta expresan las cantidades de diferentes tipos de leuco
leucocitos en
porcentaje y en números absolutos, respectivamente.
Para obtener la fórmula relativa, es decir qué porcentaje de cada leucocito encontramos en un frotis, se debe
recorrer el frotis en guarda griega y contar 100 “elementos” (Figura3).. Tal como vayan apareciendo en el
extendido se debe ir anotando qué cantidad de neutrófilos, eosinófilos, basófilos (si los hubiera), linfocitos y
monocitos. El recuento realizado luego se expresará directamente en porcentaje.

Figura 3. Se muestra un frotis sanguíneo en la zona de recuento. Ejemplo de una fórmula relativa expresada
en porcentaje.
 Recuentos celulares

Introducción

Algunas enfermedades afectan primariamente a la sangre y a los órganos formadores de ella, aunque con
más frecuencia las alteraciones en el recuento de glóbulos rojos, blancos y plaquetas (trombocitos) están
relacionados con enfermedades primarias de otros órganos y sistemas.
El examen hematológico es una ayuda para el médico clínico para realizar un diagnóstico, además de del
examen físico y una anamnesis adecuada. Uno de los estudios más frecuentes es conocer el número total de
glóbulos rojos (eritrocitos), glóbulos blancos (leucocitos) y plaquetas. A continuación se expone uno de los
métodos más utilizados en el laboratorio para realizar recuentos celulares.

Toma de muestras
Para realizar el recuento de glóbulos rojos y blancos, se requiere obtener sangre venosa con alguno de los
anticoagulantes disponibles. Son ejemplo de éstos la heparina, el EDTA (ácido etilendiaminotetracético),
entre otros. Los anticoagulantes deben reunir una serie de condiciones:
1. No debe alterar el tamaño de los eritrocitos
2. No debe producir hemólisis
3. No debe producir ruptura de leucocitos
4. Debe reducir al mínimo la agregación plaquetaria
plaquetar
5. Debe ser rápidamente soluble en la sangre

El recuento se puede realizar por medio de procedimientos tradic

tradicionales,
onales, como la cámara cuenta glóbulos o
por medio de métodos más modernos (si el laboratorio cuenta con ellos) como son los equipos automáticos o
electrónicos. Este último se reduce a su uso en centros donde manejan alto número de muestras. De
cualquier manera que se realice, el proceso lleva dos etapas:

1º etapa:: dilución exacta de la sangre que se va a analizar

2º etapa: recuento de los elementos formes de interés por unidad de volumen de la sangre diluida

La dilución se puede realizar empleando las pipetas especiales de Thoma (Figura 4)) o una variante de ésta o
una micropipeta respetando las proporciones para cada caso.

Figura 4. Pipetas de Thoma. A. para dilución de glóbulos rojos. B. pipeta para dilución de glóbulos blancos.
Las pipetas consisten en tubos capilares graduados en unidades relativas (0,5) y poseen un bulbo en la parte
superior que contiene una pequeña bolilla de color rojo o blanca
blanca y finaliza con otro pequeño capilar por
encima de este bulbo también graduado que será hasta donde se debe cargar la pipeta (enrase).

Para cualquier caso, la pipeta se debe cargar hasta la marca 0,5 con sangre. Si el recuento será para glóbulos
rojoss se continuará cargando la pipeta hasta el enrase superior con solución fisiológica isotónica (marca 101).
La dilución de esta manera resulta en 1/200.

Si el recuento es para glóbulos blancos, se carga la pipeta con ácido acético al 1-3%ms
1 3%ms 1 o 2 gotas de azul de
metileno hasta la marca 11. La dilución que se logra es de 1/20.

Cámara de Neubauer

La cámara consiste en una lámina de vidrio gruesa, con 2 plataformas graduadascon exactitud. Estas están
rodeadas por surcos o ranuras para separar las dos plataformas.
plataformas. Por encima de las dos plataformas se coloca
un vidrio más delgado que sirve como portaobjetos y asegura la carga de la cámara, ya que se mantiene a 0,1
mm por encima de las plataformas.

Figura 5. A. Cámara de Neubauer

Neubauer. B. Esquema de las partes de la cámara.C. Cámara vista de perfil.

En cada plataforma se observa un reticulado como el de la figura 6. En el cuadriculado central, se observan

divisiones que en total suman 400 cuadraditos,
cuadraditos, este es el sitio donde se realiza el recuento de los glóbulos
rojos. Sin embargo, no se cuentan los eritrocitos en los 400 cuadraditos, sino se toma una muestra
representativa de los 5 que se observan marcados en rojo en el esquema.
El recuento de glóbulos blancos se realiza en las cuadrículas de las esquinas marcadas
marcadas con color celeste. Estos
cuadrados están divididos en 16 cuadraditos más pequeños. En este caso sí se cuentan los leucocitos que
aparecen en todos los cuadraditos.
 Figura 6. Cuadrícula de la cámara de Neubauer.

Llenado de la cámara
ámara de Neubauer

Una vez que se tienen preparadas las pipetas, el cubreobjetos colocado, se procede entonces al llenado de la
cámara como se muestra en la figura 7, prestando especial atención a que no se exceda el límite y el líquido
se escape por los surcos. Si esto sucediera, hay
hay que limpiar la cámara y volver a cargarla correctamente.

Figura 7. Llenado de la cámara con la pipeta que contiene

contiene la muestra de sangre dilui
diluida.

¿Cómo se cuenta?

Se coloca la cámara en el microscopio y luego de ubicar el sitio donde debemos contar, es necesario seguir un
esquema ordenado para no repetir l recuento de 2 elementos formes nuevamente.
 Figura 8. Cámara colocada correctamente en el microscopio lista para el recuento.

Por lo general se comienza contando de derecha a izquierda y solo se cuentan los elementos que están por
dentro de las 3 rayas, comenzando por el margen superior. Luego se baja a la fila siguiente de izquierda a
derecha respetando también de contar el que está dentro de los cuadraditos. De esta manera se evita contar
dos veces el mismo elemento.

Para los glóbulos blancos se sigue un mismo esquema solo que se cuentan en las 4 esquinas.

NUNCA SE CARGA LA CÁMARA PARA CONTAR SIMULTANEAMENTE ROJOS Y BLANCOS, YA QUE EL ÁCIDO
ACÉTICO UTILIZADO PARA DILUIR LOS LEUCOCITOS PUEDE ROMPER (LISAR) LOS ERITROCITOS:
Cálculos
El recuento total de los elementos formes debe multiplicarse por cifras que ya están establecidas.

Para el caso de los eritrocitos, la cifra que nos dio se multiplica por 10.000, esto nos da la cantidad de
eritrocitos en millones por mm3.

En el caso de los leucocitos la suma obtenida se debe multiplicar por 50, lo cual dará por resultado en miles
por mm3.

Fundamento de la multiplicación

El área graduada donde se realiza el recuento es de 1mm2. El cuadrado central tienen 25 cuadraditos de los
cuales se cuentan 5, por lo tanto la cuenta se lleva a cabo en 5 de 25 de mm2. La cámara tiene 1/10 de mm de
profundidad. La dilución se realiza 1/200 (para los eritrocitos), por lo tanto la fórmula que se aplica es:

Glóbulos rojos o eritrocitos

Glóbulos blancos o leucocitos

Ejemplo glóbulos rojos Ejemplo glóbulos blancos

Cuadrado superior derecho ………. 123 Cuadrado superior derecho …………. 53

Cuadrado superior izquierdo .…… 121 Cuadrado superior izquierdo ……….. 49

Cuadrado central ……………….……. 114 Cuadrado inferior derecho …………… 54

Cuadrado inferior derecho ……. .. 125 Cuadrado inferior izquierdo …………. 55

Cuadrado inferior izquierdo ……. 118 TOTAL………………………………………..211

TOTAL ……………………………….…….. 601

601 x 10.000 = 6.010.000 G.R./mm3 211 x 50= 10.550 G.B./mm3