Actividad Cultivo Celular

Yandri Valarezo
17/04/2021
Actividad Cultivos Celulares
Actividad cultivo celular
1.Completa en tu cuaderno un mapa conceptual como el siguiente con los

conceptos relacionados a continuación. Las casillas verdes corresponden a
material biológico, las azules a tipos de cultivos, las moradas a líneas
celulares y las naranja a procedimientos o procesos.
-Conceptos: Cultivo celular secundario, Disgregación celular, Cultivo de

explantes, Línea celular continua, Pase, Cultivo de órganos, Cultivo celular
primario, Órganos, Fragmentación mecánica, Transformación, Suspensión celular,
Línea celular primaria, Fragmentos de tejido.
Yandri Valarezo
17/04/2021
2. Define los siguientes conceptos relacionados con la biología de las células en

cultivo:
a) Dependencia de anclaje: Es una característica común a muchos tipos celulares que

necesitan adherirse a un sustrato sólido para proliferar en cultivo.
b) Crecimiento en monocapa: Es típico de células dependientes de anclaje. Una vez que se

han adherido a la superficie de cultivo proliferan, expandiéndose sobre la superficie y
formando una monocapa de células sobre la misma.
c) Crecimiento en suspensión: Es típico de células no dependientes de anclaje. Se

mantienen dispersas en suspensión en el medio de cultivo, proliferando, por lo que la
densidad celular aumenta con el tiempo.
d) Inhibición por contacto: Se produce cuando un cultivo en monocapa alcanza la

confluencia, es decir, ocupa toda la superficie de cultivo y las células están en contacto
unas con otras. La consecuencia es que el crecimiento se detiene, pero las células
permanecen vivas.
e) Senescencia: Es un fenómeno que se produce en líneas celulares primarias tras

múltiples pases. Las células pierden progresivamente la capacidad de dividirse por
acortamiento de telómeros y acumulación de anomalías cromosómicas y el cultivo acaba
muriendo. El número de pases en el que aparece este fenómeno es característico de cada
línea celular.
3. Enumera cinco diferencias entre una línea celular primaria de crecimiento en

monocapa y una línea celular continua.
‐ La línea primaria se mantiene en cultivo un número de pases limitado, la línea
continua se mantiene un número de pases ilimitado (es inmortal)
‐ La línea primaria es dependiente de anclaje, la línea continua no.
‐ La línea primaria muestra inhibición por contacto, la línea continua no.
‐ La línea primaria no puede invadir tejidos y producir tumores, la línea continua sí.
‐ La línea primaria suele ser diploide, la línea continua suele ser aneuploide con
múltiples aberraciones cromosómicas.
4. En un laboratorio de cultivos celulares disponen de los siguientes recipientes
para cultivo: placas multipocillos de 24 pocillos, frascos roux de 25 cm2 , botellas
roller de 850 cm2 , frascos de cultivo con portaobjetos. Indica qué tipo de recipiente
de cultivo utilizarías para las siguientes situaciones y justifica la respuesta:
a) Cultivo celular de líquido amniótico para hacer un cariotipo:

Un frasco de roux convencional para mantener el cultivo el tiempo suficiente para
que crezcan las células del líquido amniótico y sacrificarlo cuando todavía esté
en fase exponencial para estudiar las metafases y hacer el cariotipo.
b) Ensayo de inhibición de la síntesis de una oncoproteína citoplásmica mediante

tratamiento con un fármaco antitumoral.
Yandri Valarezo
17/04/2021
Frascos de cultivo con portaobjetos. Al terminar el tratamiento se pueden teñir las
células pegadas al portaobjetos mediante inmunohistoquímica con un
anticuerpo específico de la oncoproteína para ver si se ha reducido o inhibido la
síntesis de la misma.
c) Ensayo de citotoxicidad en varias líneas celulares con varias concentraciones de un

aditivo alimentario nuevo.
La placa de multipocillos permite realizar simultáneamente múltiples ensayos con
varias líneas celulares y varias concentraciones del aditivo.
d) Expansión de una línea celular de crecimiento en monocapa para purificar un

antígeno de membrana característico de aquella.
Botella roller. En este caso interesa obtener el mayor número posible de células, por
lo que hay que utilizar el recipiente de mayor superficie.
5. Explica la función o justifica el motivo por el que son necesarios los

siguientes componentes de un medio de cultivo celular:
a) Glucosa: Va a ser utilizada por las células para obtener toda la energía
necesaria para poder vivir y multiplicarse.
b) Tampón: Mantiene el pH del medio de cultivo en un intervalo idóneo para el

crecimiento de las células.
c) Aminoácidos esenciales: No pueden ser sintetizados por las células, por lo que hay
que suministrarlos en el medio de cultivo para que los utilicen en la síntesis de
proteínas.
d) Indicador de pH: Vira cuando el pH del medio se aleja del intervalo adecuado para el
crecimiento celular. El viraje indica que el poder tamponador del tampón se ha
sobrepasado y hay que hacer un cambio de medio.
Yandri Valarezo
17/04/2021
6. Indica ventajas e inconvenientes del uso de suero animal para complementar los
medios de cultivo celulares no definidos.
a) Ventajas:
‐ Aporta innumerables componentes beneficiosos para el cultivo celular (hormonas,
factores de crecimiento, proteínas, hierro, oligoelementos, factores de adhesión, etc.) que
son difíciles de estandarizar en los medios de cultivo definidos.
‐ Aporta una ligera viscosidad al medio de cultivo, con un efecto protector sobre las células.
‐ Contiene inhibidores de la tripsina, por lo que detiene el proceso de tripsinización
cuando se quiere despegar una monocapa de células.
b) Desventajas:
- Su composición varía en cada lote, por lo que es imposible estandarizar unas condiciones de
cultivo determinadas.
‐ Puede ser una fuente de contaminación por micoplasmas y virus.
7.Respecto de los procedimientos habituales en el laboratorio de cultivos celulares, di si

son verdaderas o falsas las siguientes afirmaciones. Justifica las que consideres
falsas:
a) La mejor manera de disgregar células de un órgano o tejido es combinar métodos mecánicos

con métodos enzimáticos. Verdadero.
b) La descongelación de células para cultivo se realiza a temperatura ambiente, conservando las

células en la solución de congelación hasta el momento de sembrarlas. Falso. La
descongelación se realiza en baño a 37°C y hay que retirar inmediatamente la solución de
congelación y sustituirla por medio de cultivo, porque el DMSO que contiene la solución de
congelación es tóxico para las células.
c) Conviene controlar los cultivos periódicamente mediante observación

microscópica con un microscopio invertido para observar la morfología celular y la evolución del
crecimiento. Verdadero
d) Un cambio de color en el medio de cultivo por viraje del indicador de pH indica que el cultivo
evoluciona normalmente y, en consecuencia, no es necesario cambiar el medio. Falso. El viraje
del indicador de pH indica que el pH está fuera del rango adecuado para el crecimiento, por lo
que hay que cambiar el medio.
e) Es conveniente realizar siempre dos pases del cultivo por semana para que las células no
pierdan vitalidad. Falso. Los pases se dan cuando las células van a entrar en confluencia o van
a alcanzar una densidad crítica, independientemente del tiempo que tarden en alcanzar esta
situación.
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17/04/2021
8.Se quiere hacer un pase de un cultivo en monocapa que está a punto de entrar en
confluencia. Una vez despegadas y lavadas las células, se resuspenden en 5 ml de medio
de cultivo. Para hacer el recuento de viables, 20 ul de la suspensión se mezclan con 20 ul
de azul tripán y con la mezcla se carga una cámara de Neubauer. El recuento de las
células blancas y azules en las cuatro esquinas de la cámara (1-4) ha sido el siguiente:
1 - 76 células blancas y 16 azules.
2-68 células blancas y 20 azules.
a) ¿Cuál es la densidad celular total de los 5 ml de suspensión? ¿Y la densidad celular

¿Es viable?
El número total de células blancas en las cuatro esquinas es 76 + 68 + 72 + 64 = 280

El número total de células azules en las cuatro esquinas es 16 + 20 + 16 + 12 = 64
El número total de células en las cuatro esquinas es 280 + 64 = 344
La densidad celular total = 344 • 2 • 10º / 4 = 1,7 • 10 células totales/ml
La densidad celular viable = 280 • 2 • 104 / 4 = 1,4 • 10 células viables/ml
b) ¿Qué viabilidad tienen las células (porcentaje de viables respecto del total)?
Viabilidad = 280 • 100 / 344 = 81,4 % (El 81,4% de las células de la suspensión son
viables).
c) Las células se van a subcultivar en frascos roux de 25 cm? y se quieren sembrar

7• 10° células por frasco en un volumen final de medio de 5 ml por frasco.
¿Cuántos frascos se necesitan?
¿Qué cantidad de medio y de suspensión celular hay que colocar en cada uno?
Como queremos sembrar 7 • 105 células viables en cada frasco nuevo, se necesitan 0,5 ml
de la suspensión celular. Como hay 5 ml de suspensión, sembraremos 10
frascos nuevos.
En cada frasco se colocarán 4,5 ml de medio de cultivo nuevo + 0,5 ml de la suspensión
celular.
9.Queremos congelar células de una línea celular que crece en suspensión. Partimos
de una suspensión de células lavadas y resuspendidas en 5 ml de medio de cultivo.
Para hacer el recuento de viables, se hace una dilución previa 1/10 de la suspensión
con PBS. Después se mezclan 20 _I de la dilución con 20 _I de azul tripán y con la
mezcla se carga una cámara de Neubauer. El recuento de las células blancas y azules
en las cuatro esquinas de la cámara 1-4) ha sido el siguiente:
2-41 células blancas y 9 azules
Yandri Valarezo
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a) ¿Cuál es la densidad celular total de los 5 ml originales de la suspensión? ¿Y la
densidad celular viable?
El número total de células blancas en las cuatro esquinas es 48 + 41 + 44 + 47 = 180
El número total de células azules en las cuatro esquinas es 10 + 9 + 12 + 11 = 42
El número total de células en las cuatro esquinas es 180 ÷ 42 = 222
La densidad celular total = 222 • 2 • 10 • 10 / 4 = 11,1 • 10 células totales/ml
La densidad celular viable = 180 • 2 • 10 • 104 / 4 = 9 • 10° células viables/ml
c) Queremos congelar las células en criotubos a una densidad de 10% células

viables/ml, colocando 1,5 ml de suspensión en cada criotubo. Explica qué pasos
seguirías desde la suspensión de células en medio de cultivo hasta colocar los
criotubos en nitrógeno líquido
Para conseguir una densidad de 10º células viables/ml de solución de congelación,

necesitamos 45 ml de solución de congelación. Como en cada criotubo vamos a pipetear
1,5 ml, necesitamos 45/1,5 = 30 criotubos.
El proceso será el siguiente:

- Centrifugar la suspensión celular a 700-800 rpm y eliminar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 45 ml de solución de congelación (suero + 10% de
DMSO)
- Alicuotar, pipeteando 1,5 ml en cada uno de los 30 criotubos.
- Colocar los criotubos en congelador a -20°C, 24 h.
- Colocar los criotubos en congelador a -80°C, 24 h.
- Llevar los criotubos al tanque de nitrógeno líquido.

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2. Define los siguientes conceptos relacionados con la biología de las células en

a) Dependencia de anclaje: Es una característica común a muchos tipos celulares que

b) Crecimiento en monocapa: Es típico de células dependientes de anclaje. Una vez que se

c) Crecimiento en suspensión: Es típico de células no dependientes de anclaje. Se

d) Inhibición por contacto: Se produce cuando un cultivo en monocapa alcanza la

e) Senescencia: Es un fenómeno que se produce en líneas celulares primarias tras

3. Enumera cinco diferencias entre una línea celular primaria de crecimiento en

a) Cultivo celular de líquido amniótico para hacer un cariotipo:

b) Ensayo de inhibición de la síntesis de una oncoproteína citoplásmica mediante

c) Ensayo de citotoxicidad en varias líneas celulares con varias concentraciones de un

d) Expansión de una línea celular de crecimiento en monocapa para purificar un

5. Explica la función o justifica el motivo por el que son necesarios los

b) Tampón: Mantiene el pH del medio de cultivo en un intervalo idóneo para el

7.Respecto de los procedimientos habituales en el laboratorio de cultivos celulares, di si

a) La mejor manera de disgregar células de un órgano o tejido es combinar métodos mecánicos

b) La descongelación de células para cultivo se realiza a temperatura ambiente, conservando las

c) Conviene controlar los cultivos periódicamente mediante observación

a) ¿Cuál es la densidad celular total de los 5 ml de suspensión? ¿Y la densidad celular

El número total de células blancas en las cuatro esquinas es 76 + 68 + 72 + 64 = 280

c) Las células se van a subcultivar en frascos roux de 25 cm? y se quieren sembrar

c) Queremos congelar las células en criotubos a una densidad de 10% células

Para conseguir una densidad de 10º células viables/ml de solución de congelación,

El proceso será el siguiente:

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