Histología

Es la rama de la anatomía llamada “anatomía microscópica”

que se encarga del estudio de aquellos tejidos, órganos,
células y sistemas (niveles de organización estructural) no
percibibles al ojo humano y que por ende son vistas a través
de un microscopio con el fin de comprender la micro
anatomía, empezó a raíz de los años 1600 cuando se inventó
el primer microscopio y paulatinamente el descubrimiento de
la célula por Hooke
Ingeniería Tisular
Es una disciplina relativamente moderna (1987) parte de la
MEDICINA REGENERATIVA surgiendo de la histología
con el fin de generar tejidos que permitan restaurar, mantener
o mejorar la función de un tejido u órgano; a través de la
triada comprendida por :
Células (ej células madres)
 Biomateriales (ej naturales, sintéticos, hidrogeles)
Señales (ej factores de crecimiento, fuerza mecánica
En la odontología esta se encuentra presente
 Coplejo dentino-pulpar (endodoncia regenerativa)
 Mucosa oral (mucosa oral in vitro)
Microscopio Fotonico

Sistema mecánico
Dentro del sistema mecánico se incluyen todos los elementos
estructurales que dan estabilidad al microscopio y mantienen
los elementos ópticos correctamente alineados.
Base o pie: Es la pieza que se encuentra en la parte inferior
del microscopio y sobre la cual se montan el resto de
elementos. Acostumbra a ser la parte más pesante para
proporcionar suficiente equilibrio y estabilidad al
microscopio. Es habitual que incluya algunos topes de goma
para evitar que el microscopio se deslice sobre la superficie
donde se encuentra.
Brazo: El brazo constituye el esqueleto del microscopio. Es
la pieza intermedia del microscopio que conecta todas sus
partes. Principalmente conecta la superficie donde se coloca
la muestra con el ocular por donde ésta se puede observar.
Tanto las lentes del objetivo como del ocular se encuentran
también conectadas al brazo del microscopio.
Platina: Esta es la superfície donde se coloca la muestra que
se quiere observar. Su posición vertical con respecto a las
lentes del objetivo se puede regular mediante dos tornillos
para generar una imagen enfocada. La platina tiene un agujero
en el centro a través del cual se ilumina la muestra.
Generalmente hay dos pinzas unidas a la platina que permiten
mantener la muestra en posición fija.
Pinzas: Las pinzas tienen la función de mantener fija la
preparación una vez esta se ha colocado sobre la platina.
Tornillo macrométrico: Este tornillo permite ajustar la
posición vertical de la muestra respecto el objetivo de forma
rápida. Se utiliza para obtener un primer enfoque que es
ajustado posteriormente mediante el tornillo micrométrico
Tornillo micrométrico: El tornillo micrométrico se utiliza
para conseguir un enfoque más preciso de la muestra.
Mediante este tornillo se ajusta de forma lenta y con gran
precisión el desplazamiento vertical de la platina.
Revólver: El revólver es una pieza giratoria donde se montan
los objetivos. Cada objetivo tiene proporciona un aumento
distinto, el revólver permite seleccionar el más adecuado a
cada aplicación. Habitualmente el revólver permite escoger
entre tres o cuatro objetivos distintos.
Tubo: El tubo es una pieza estructural unida al brazo del
telescopio que conecta el ocular con los objetivos. Es un
elemento esencial para mantener una correcta alineación entre
los elementos ópticos.

Sistema óptico
El sistema óptico incluye todos los elementos necesarios para
generar y desviar la luz en las direcciones necesarias y así
acabar generando una imagen aumentada de la muestra.
Foco o fuente de luz: Este es un elemento esencial que
genera un haz de luz dirigido hacia la muestra. En algunos
casos el haz de luz es primero dirigido hacia un espejo que a
su vez lo desvía hacia la muestra. La posición del foco en el
microscopio depende de si se trata de un microscopio de luz
transmitida o de luz reflejada.
Condensador: El condensador es el elemento encargado de
concentrar los rayos de luz provenientes del foco a la muestra.
En general, los rayos de luz provenientes del foco son
divergentes. El condensador consiste en un seguido de lentes
que cambian la dirección de estos rayos de modo que pasen a
ser paralelos o incluso convergentes.
Diafragma: El diafragma es un pieza que permite regular la
cantidad de luz incidente a la muestra. Normalmente se
encuentra situado justo debajo la platina. Regulando la luz
incidente es posible variar el contraste con el que se observa
la muestra. El punto óptimo del diafragma depende del tipo
de muestra observada y de su transparencia.
Objetivo: El objetivo es el conjunto de lentes que se
encuentran más cerca de la muestra y que producen la primera
etapa de aumento. El objetivo suele tener una distancia focal
muy corta. En los microscopios modernos distintos objetivos
están montados en el revólver. Este permite seleccionar el
objetivo adecuado para el aumento deseado. El aumento del
objetivo junto con su apertura numérica suele estar estar
escrito en su parte lateral.
Ocular: Este es el elemento óptico que proporciona la
segunda etapa de ampliación de imagen. El ocular amplia la
imagen que ha sido previamente aumentada mediante el
objetivo. En general, el aumento aportado por el ocular es
inferior al del objetivo. Es a través del ocular que el usuario
observa la muestra. En función del número de oculares se
puede distinguir entre microscopios monoculares, binoculares
e incluso trinoculares. La combinación de objetivo y ocular
determina el aumento total del microscopio.
Prisma óptico: Algunos microscopios incluyen también
prismas en su interior para corregir la dirección de la luz. Por
ejemplo, esto es imprescindible en el caso de los
microscopios binoculares, donde un prisma divide el haz de
luz proveniente del objetivo para dirigirlo hacia dos oculares
distintos
Tipos
Microscopio de transparencia o de campo claro. Este
microscopio se caracteriza porque emplea luz natural o luz
artificial como energía luminosa para formar las imágenes del
objeto que se observa. La imagen muestra puntos o áreas
iluminadas (generalmente coloreados) sobre un fondo claro o
transparente
Microscopio de campo oscuro. Se denomina así porque la
imagen que se forma está constituida por una serie de
estructuras brillantes sobre un fondo oscuro.
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES. es el microscopio
fotónico más utilizado para observar objetos o estructuras
transparentes sin teñir. Al igual que el microscopio de campo
oscuro facilita la observación de células vivas para distinguir
y analizar sus componentes morfológicos y ciertas funciones
que ellas puedan desarrollar (fagocitosis, mitosis,
movimientos ameboideos, ciliares o flagelares, etc.).
Unidades de medición
Micrómetro 1X10 -6 Mayor
Nanómetro 1X10 -9 Menor
Preparación en fresco
La preparación en fresco es ideal para la observación de
microorganismos o de tejidos biológicos que requieren
ser hidratados.

1. Si la muestra es líquida colocamos unas gotas de la

muestra en el centro del portaobjetos con la ayuda de
una pipeta.
2. Si la muestra es sólida colocamos primero unas gotas
de agua destilada o de solución salina sobre el
portaobjetos y a continuación un fragmento de la
muestra con la ayuda de unas pinzas.
3. Sujetando el cubreobjetos por dos de sus lados,
apoyamos otro de sus lados sobre el portaobjetos de
modo que forme un ángulo de aproximadamente 45
grados.
4. A continuación podemos soltar con cuidado
el cubreobjetos de modo que quede colocado sobre el
líquido que hemos depositado anteriormente. (Mediante
este procedimiento se evita la formación de burbujas
dentro de la muestra. En caso de que hayan aparecido
burbujas entre el portaobjetos y el cubreobjetos será
necesario repetir el procedimiento anterior.)
 5. En caso de que haya un exceso de líquido alrededor del
cubreobjetos podemos eliminarlo mediante papel
absorbente.

Preparación en seco

La preparación en seco es ideal para muestras que no

necesitan hidratación. Esto incluye, por ejemplo, un cabello,
granos de polen, esporas, muestras de plantas, insectos, etc.
1. Si la muestra es totalmente opaca el primer paso
consistirá en cortar primero una sección muy fina de la
muestra. Esto permitirá observarla en el microscopio
mediante luz transmitida.
2. Colocamos la sección que hemos cortado en el centro
del portaobjetos con la ayuda de una pinzas. Si la
muestra tiene un cierto volumen es recomendable utilizar
un portaobjetos con una cavidad cóncava.
3. Para mantener la muestra fija en su sitio la cubrimos con
un cubreobjetos. Esto evita también que el objetivo
llegue a tocar la muestra en caso de cometer algún error
durante la manipulación del microscopio.
Preparación con tinción
Existen distintas técnicas para aplicar una tinción que se
adecuan a los distintos tipos de muestras.
Si hemos preparado una muestra en fresco, podemos aplicar
un tinte siguiendo los siguientes pasos:
1. Depositamos unas gotas del tinte sobre uno de los bordes
del cubreobjetos.
2. Colocamos papel absorbente al lado opuesto del
cubreobjetos para forzar el movimiento del tinte a través
de la muestra.
3. Una vez la muestra ha absorbido el tinte retiramos el
papel absorbente.

Los tintes permiten aumentar el contraste y facilitar la

observación de algunos detalles concretos de la muestra.
Existen tintes de distintos colores y características adecuados
para distintos tipos de muestras.

Muestra para estudios con microscopio fotonico

Toma de muestras
Las muestras para estudios por microscopía
fotónica se obtienen de dos formas principales: por
biopsia(obtención de un fragmento de tejido u órgano de un
animal vivo, pudiendo ser por incisión, incisión, punción,
absorción, y trepanación) a partir de organismos vivos y por
necropsia a partir de organismos muertos o sacrificados para
el propósito(La selección del material para el estudio de
laboratorio depende del tiempo transcurrido desde la muerte,
de la preservación del cadáver, de las circunstancias en que
ocurrió la muerte y de la posible causa de ésta).
Manejo de muestras
Se estudiarán muestres en medio acuoso de distinta
procedencia sin fijar, es decir los organismos que aparezcan
estarán vivos y moviéndose, por lo que se pueden escapar del
campo de visión. Se podrán observar organismos
unicelulares, eucariotas (protozoos) y procariotas (cabe la
posibilidad que alguna bacteria o levadura pudiera aparecer
en la muestra), y organismos multicelulares, tanto animales
(rotíferos, nemátodos, etc) como vegetales (algas verdes
filamentosas, etc). Una vez observada la muestra se llevará a
cabo una segunda intervención en la preparación, mediante la
incorporación de un Colorante vital. La muestra una vez
teñida se volverá a examinar
Procesamientos
1er paso.- Coge una gota de una de las muestras con una
pipeta Pasteur y deposítala sobre un portaobjeto. A
continuación cubre la gota con un cubreobjetos y analizar la
preparación al microscopio óptico de campo claro.
2do paso.- Una vez analizada la muestra añadir a la
preparación una gota del colorante.
Para realizar esta operación la gota se ha de añadir justo en el
borde del cubreobjeto y el colorante entrará por capilaridad en
la preparación.
Tinciones de Rutina
Luego del montaje de las muestras, se procede a la coloración
de las mismas para darles el contraste necesario que permita
la observación al microscopio óptico.
Hematoxilina Eosina: La tinción con hematoxilina y la
Eosina son los más frecuente de los preparados histológicos.
La hematoxilina es un colorante básico (tiñe azul/púrpura) y
la eosina es un colorante ácido (tiñe rojo/rosa). La cromatina
nuclear, que contiene gran porcentaje de ácidos nucleicos es
altamente basófila, por lo que atrae a la hematoxilina. La
mayor parte de las proteínas estructurales son teñidas por la
eosina, por lo que los citoplasmas celulares son teñidos de un
rosado-rojizo.
PAS:La técnica de Schiff, es una reacción colorimétrica que
se usa comúnmente en Histoquímica Permitiendo la tinción
de componentes celulares que contienen hidratos de carbono,
por ejemplo algunas membranas celulares, células
caliciformes en la mucosa del intestino, fibras reticulares que
están rodeados por hidratos de carbono, etc. Entonces en esta
técnica, el ácido peryódico oxida a los grupos oxhidrilo (–
OH) de dos carbonos cercanos, formando de esta manera
grupos aldehídos compuestos por carbono, oxígeno e
hidrógeno. Así la leucofucsina puede reaccionar con estos y
dejar una tinción rojiza.
.
Azul de Toluidina o cloruro de tolonio, también abreviado
TBO es un colorante de color azul, utilizado en histología y
algunas veces en el ambiente clínico ,se encarga de
seleccionar los componentes ácidos de los tejidos, tales como
sulfatos y radicales fosfatos incorporados en el ADN y ARN
de las células.Dependiendo del pH y de la naturaleza química
de la sustancia tiñe de color azul o color violeta-rojo.
.
Tricromica de Masson es una técnica de coloración especial
que emplea tres colorantes para una mejor visualizacion,estos
son la hematoxilina, la fucsina y el verde luz. Esta tinción es
muy útil para poner de manifiesto las fibras de colágeno, y el
conectivo en general, en comparación con células musculares
o epitelios dando como resultado:
Colágeno: verde azulado.
Músculo: rojo, marrón.
Citoplasma: rosado.
Núcleos: negro.
Citoplasma: rosado.
Microscopía Electrónica de Transmisión (MET)
Es un microscopio que aprovecha los fenómenos físico-
atómicos utilizando un haz de electrones para visualizar en
una muestra delgada convenientemente preparada para formar
una imágen al emerger por la cara contraria.Se suele utilizar
en estudio de los metales , minerales y el estudio de las
células a nivel molecular. Siendo así un papel muy importante
en la industria de la metalurgia. A su vez se utiliza en la
microbiología, para observar la estructura de los virus.
También es usado en la anatomía patológica, para
diagnosticar partiendo de la ultraestructura celular.
Manejo de muestras
Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe
cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de
miles de ángstroms-diez mil millonésima parte del metro-ya
que cuanto menor sea el espesor de la muestra mejor calidad
de imágenes se puede obtener.
Si la muestra se recibe en polvo o en suspensión, se realizará
la preparacióncorrespondiente y se colocará sobre una rejilla
con soporte. Las muestras deben tener un espesor menor de
100 nm e ir soportadas sobre una rejilla de 3,05 mm. Si la
muestra es un polímero o está incluida en resina se cortará
con ultramicrotomía. En todos los casos, los cortes se colocan
sobre una rejilla de 3,05 mm.
Procesamiento
Utiliza alto voltaje para producir y enfocar un haz de
electrones acelerados en alto vacío que al impactar en una de
las caras de una muestra de tejido dichos electrones atraviesan
la muestra, produciéndose la dispersión de los mismos en
diferentes trayectorias características de la ultraestructura del
material observado. La imagen de alta resolución formada es
aumentada y proyectada sobre una pantalla fluorescente para
su visualización en tiempo real, pudiendo registrarse
digitalmente o en negativos para su estudio posterior. ultra
delgada formando una imágen al emerger por la cara contraria
Observación
La información que se obtiene es una imagen con distintas
intensidades de gris que se corresponden al grado de
dispersión de los electrones incidentes. Hace posible ver
desde los cromosomas y las moléculas de ADN (ácido
desoxiribonucleico) hasta átomos con un poder de resolución
de 0.2 nm
Microscopía Electrónica de Barrido(MEB)
Es un instrumento que proporciona imágenes tridimensionales
de la morfología externa de una muestra,aplicando un haz de
electrones para permitir la observación y la caracterización de
materiales orgánicos e inorgánicos, mediante contraste
topográfico o composicional
Manejo de muestras
Las muestras destinadas al MEB han de cumplir dos
condiciones: deben estar secas y ser conductoras.El proceso
de secado ha de llevarse a cabo preservando al máximo la
estructura original de la muestra ya sea por fijación y
deshidratación química o por fijación física (criofijación). En
caso de las muestras no conductoras (orgánicas, biológicas,
vidrios, polímeros) necesitan una cubierta metálica para
lograr su observación, generalmente una cubierta de oro, o
con carbono cuando se quiere realizar análisis químico por
EDS. Por otro lado, las muestras conductoras pueden ser
revisadas sin ningún tipo de cubierta. Los materiales
restrictivos para realizar análisis son aquellos con propiedades
magnéticas, a menos, que se fijen apropiadamente en alguna
matriz de contención.
Procesamiento y Observaciones
utiliza electrones en lugar de luz para formar una imagen.
Para lograrlo, el equipo cuenta con un dispositivo (filamento)
que genera un haz de electrones para iluminar la muestra y
con diferentes detectores se recogen después los electrones
generados de la interacción con la superficie de la misma para
crear una imagen que refleja las características superficiales
de la misma, pudiendo proporcionar información de las
formas, texturas y composición química de sus
constituyentes.