GRAL.

MANUEL NICOLAS SAVIO

CONTROLES FML

Especialidad: Industria de Procesos

Alumnos:

Astorga Kiara, Manassero Carnevale Dylan,Damiani Milagros,

Gimenez Brisa, Battocchio Augusto,Rios Luca,Rollero Santiago,
Melano Sara y Pelaez Micaela.
CICLO LECTIVO 2023

TECNICATURA EN INDUSTRIA DE PROCESOS

 Rosario, Santa Fe, 2000.

Introducción.
Despalillado.
Agregado de aditivos.
Fermentación alcohólica.
Prensado.
Fermentación maloláctica.
Maceración.
Clarificación.
Filtración.
Producción de vino.
Calibración de pH metro.
Grados Brix (°Bx).
Grados Baumé.
Prensado del vino:
Obtención del vino no prensado.
Fermentación maloláctica.
¿Qué cambios provoca la FML?
Determinación de anhídro sulfuroso (SO2) libre y total en vino tinto.
Teoría del metabisulfito y por qué es importante la adición y determinación del
mismo:
Técnica del metabisulfito
Definiciones
Método Ripper original.
Fundamento
Las reacciones que se producen son:
Material y reactivos.
Procedimiento
Variación del Método Ripper (nuestra técnica)
Procedimiento
Preparación de solución de almidón 2%p/v.
Preparación de solución Yoduro de potasio
Preparación de la solución de Yodo 0,02N.
Preparación de solución ácido sulfúrico
Preparación de hidróxido de potasio 1M
Cálculos de Anhídro sulfuroso
Apartado de las normas propuestas
Conclusión SO2
Recuento de colonias.
Bacterias más importantes en la FML

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 Medios de cultivo MRS y MLO
TEORÍA DEL MRS:
Teoría MLO.
Principios y usos:
Preparación:
Almacenamiento:
Medios de cultivo.
Cálculos:
Esterilización
Preparación de jugo de tomate o licopeno:
Preparación tween 80
Preparación placas de Petri
Procedimiento de la realización de los medios
Plaqueo
Plaqueo y siembra clásica
Plaqueo y siembra Drigalski
Incubación teórica MRS
Incubación teórica MLO
Incubación práctica
Controles para saber que tipo de bacterias estamos tratando:
Coloración Gram
¿En qué consiste la Tinción de Gram?
Material necesario:
Cristal violeta
Safranina O
Procedimiento Tinción de Gram
Prueba de catalasa:
Realización práctica
Resultados.
Acidez fija.
Reactivos.
Técnica operatoria.
Técnica sin phmetro:
Técnica con phmetro
Cálculos.
Bibliografía:
Extracto seco.
Materiales.
Método.
Cálculo de los resultados.
Bibliografía:
Cenizas.
Materiales.
Método.

2
 Cálculo de resultados.
Bibliografía.
Alcalinidad de cenizas.
Fundamento del método.
Reactivos.
Proceso.
Cálculo.
Bibliografía:
Determinación de acidez volátil.
Introducción.
Procedimiento.
Resultados:
Determinacion de Acido Malico
Introducción.
Principio.
Fundamento de la espectrofotometría.
Reactivos utilizados:
Preparación de reactivos:
Preparación de Buffer pH 10:
Preparación de Buffer Tris-Clorhídrico:
Preparación de GOT:
Preparación de MDH L-malato deshidrogenasa:
Preparación de NAD Nicotinamida Adenina Dinucleótido:
Técnica operatorio método de espectrofotometría
Resultados de las tres primeras pruebas
Determinación de antocianos.
¿Qué son los antocianos?
Técnica para determinar antocianos totales:
Método colorimétrico:
Materiales utilizados:
Técnica operatoria:
Cálculos:
Procedimiento que seguimos:
Medidas del vino de 6to:
Medidas vino 5to:
Medidas del vino comercial que utilizamos como referencia:
Conclusiones finales:
Cromatografía en papel.
Ácidos orgánicos por cromatografía de papel.
Materiales.
Reactivos.
Preparación de reactivos.
Solvente revelador:
Método.

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Interpretación de los resultados:
Nuestro procedimiento:
Otro método empleado:
Observaciones finales:
Evolución de pH
Bibliografía:

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Marco teórico
Introducción.
¿Qué es el vino?

El vino es una bebida alcohólica obtenida del jugo de la fermentación del jugo de uvas, para
que dicha fermentación se de se parte desde uvas pisadas y se forma un mosto, sobre él se
va a ir produciendo la fermentación, Consiste en la transformación de los azúcares
presentes en la uva (glucosa y fructosa) en alcohol etílico y anhídrido carbónico, esta
transformación se va a dar gracias a las levaduras presentes mayormente en la piel de la
uva.

Aproximadamente se produce un grado alcohólico por cada 17 gramos de azúcar

contenidos en el mosto.

Como se mencionó anteriormente, la fermentación da como uno de los productos el

anhídrido carbónico en estado gaseoso, el cual le aporta al vino el burbujeo y el aroma
característico de una cuba de mosto en fermentación.

Esta formación de carbónico va a ser importante para la extracción de sustancias

contenidas en los hollejos y en proporcionar una atmósfera protectora de la oxidación de las
uvas que es beneficiosa para la obtención de vinos de calidad sobre todo en el caso de los
tintos.

¿De qué está compuesto el vino?

Existen cerca de 1.000 componentes en el vino, aunque muchos forman cantidades

mínimas, pero aún así son capaces de afectar, sobre todo, a los aromas. Aproximadamente
el 82% de un vino es agua. Sobre el restante 18% se podrían destacar componentes como:
alcoholes (se forman durante la fermentación alcohólica y los más abundantes en el vino
son el etanol y la glicerina); ácidos (provenientes de la uva, de la fermentación y de la
conservación y el envejecimiento); azúcares (pasan de la uva al vino); minerales (potasio,
calcio, magnesio entre otros ); compuestos fenólicos como los taninos y los antocianos
(sustancias presentes en el hollejo de la uva que proporcionan color y estructura) y ésteres.

Algunas clasificaciones en cuanto a las uvas:

Merlot:

La uva Merlot es de hollejo negro, se utiliza en la elaboración de vinos tintos con alto
contenido alcohólico y mucho cuerpo. Se madura muy rápido, por lo que es muy frecuente
en vinos jóvenes.

Cabernet Sauvignon :

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Comparte regiones de cultivo y producción con el Merlot. La uva de Cabernet Sauvignon es
utilizada más que todo para producir grandes cantidades de vinos de gama baja. Aunque
también encontraremos de linaje.

Es un fruto de color negro intenso, rico en taninos que proveen aromas y sabores desde
bayas hasta tonos salados como el pimentón morrón.

Pinot Noir

Según los conocedores, esta cepa es difícil de cultivar y vinificar. Se da en las regiones de
Borgoña en Francia, Pfalz en Alemania y en los Estados Unidos.

A veces es mezclado con uvas Chardonnay en la elaboración del champán. El vino

elaborado con uva Pinot Noir es muy ligero al degustar y bajo en taninos.

Tempranillo
La uva tempranillo es la más popular de España, además cuenta con la Denominación de
origen. Se llama así, porque es de cosecha temprana, mucho antes que otras variedades.

Con ella se elaboran vinos Rioja con alto nivel de alcohol y cuerpo medio. Así como también
para vinos jóvenes, de crianza y reserva. Aporta cierta acidez y aromas suaves entre la
vainilla, ciruelas y chocolates.

Syrah

También conocida como Shiraz son uvas provenientes del norte y sur del Ródano, son de
tamaño pequeño, de hollejo grueso con muchos taninos que crean vinos de cuerpo fuerte y
que pueden ser muy envejecidos.

Otorgan vistosidad en color y aromas frutales.

Malbec

La uva Malbec se cultiva con mucho éxito en Sudamérica, se puede encontrar en vinos de
una sola variedad como mezclado con Merlot o Cabernet Sauvignon.Sus racimos son de
tamaño mediano, de forma cónica y la uva es negra azulada de pulpa blanda. Ofrece en sus
vinos aromas y sabores algo especiados y salados.

Proceso productivo.

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Despalillado.
Luego de medir el azúcar se procederá a despalillar (separar el raspón del hollejo). Esta
práctica se realiza para que el vino no adquiera un sabor ácido debido al presente raspón.
Además, el mayor contenido de glucosa está presente en el hollejo. Antes del ingreso de las
uvas a la despalilladora, nos encargaremos de un control visual de las mismas y de separar
las hojas de las uvas. De esta manera, se sacaron las hojas de todos los cajones más
algunas arañas que se encontraban presentes, es por eso que se deben controlar las uvas
para evitar que entre las mismas se encuentre algún insecto. Paralelamente, mientras un
grupo quita las hojas de las uvas, un operador tomará los racimos de las uvas y los dejará
caer en la entrada del equipo separando así los desechos y la materia.

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Principio de funcionamiento: La despalilladora de uva es una de las primeras máquinas
involucradas en la elaboración de vino y la primera operación que se le realiza a la uva
cuando llega a nuestro laboratorio. Bien sabemos que su función es la de separar la uva del
raspón. También se elimina todo tipo de parte vegetal que provenga de la cosecha, como
hojas pequeñas, restos, etc. que anteriormente no se hayan quitado manualmente.

¿Cómo funciona la despalilladora? La mayoría de las actuales despalilladoras utilizan el

mismo principio desarrollado en la década del 40 en Alemania. Esto implica primero separar
los tallos y bayas antes que se trituren las mismas.

Como bien mencionamos anteriormente, la despalilladora es una máquina que consiste en

un túnel perforado o tambor, en el cual la baya de la uva es separada del raspón por medio
del golpeteo repetido del racimo contra las paletas acopladas de forma perpendicular a un
eje concéntrico o flecha, el cual es hecho girar mediante el uso de un motor en sentido
antihorario, la disposición helicoidal de las paletas tiene la función secundaria de desplazar
los palillos sueltos al extremo extremos del tambor, mientras que las uvas maceradas caen
debajo de la máquina, a través de la rampa de acopio. El diseño de la despalilladora
depende principalmente de la velocidad de giro de las paletas y de las fuerzas que ejercen
las mismas sobre el material que se procesa y que a su vez ejerce una resistencia contraria
a la misma Algunas partes del equipo:

● Tambor o rejilla: Este cumple funciones de tamiz para efecto de mantener

separados los palillos dentro del tambor, de las bayas de las uvas, las cuales
salen a través de la rejilla inferior hacia el cajón recolector.

● Paleta de impacto/tornillo sin fin: El ángulo de impacto y área de contacto esta

se define también de forma que la fuerza resultante, permita a su vez a la masa
que se encuentra siendo procesada, el moverse desde el extremo de
alimentación, hasta el de descarga, esto con el propósito de mover el
desperdicio de forma continua y evitar atascos, en definitiva, esta parte
helicoidal, permite el movimiento de las uvas para conseguir un desprendimiento
de los restos que contengan.

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 ● Tolva: La razón de alimentación es un parámetro que influencia el desempeño
de la máquina. El material seleccionado para la tolva es la lámina de acero
inoxidable.

● Motor eléctrico: Un motor de corriente alterna es la elección más apropiada

para esta máquina, no solo por sus dimensiones y construcción, sino también
porque se pretende pueda utilizar la energía eléctrica disponible.

En conclusión, el racimo ingresa por uno de los extremos superiores que mediante un
tornillo sin fin es empujado hacia el cuerpo central donde se encuentra un cilindro cribado
(agujereado) que gira. En su interior tenemos un sin fin con paletas que también gira en la
misma dirección, pero a diferente velocidad. La uva se desprende del racimo y cae mientras
que el escobajo que queda adentro es empujado por las paletas del sin fin hacia el otro
extremo.

Agregado de aditivos.
Una vez terminado el despalillado procedimos a preparar una solución con el mosto
como solvente y los determinados agregados en sus respectivas concentraciones;
levaduras, taninos, minerales, vitaminas, metabisulfito y ácido tartárico.

¿Por qué el uso de estos aditivos?

Taninos: Además del color, estructura y complejidad que los taninos le otorgan al vino, se
cree que su presencia ayuda a que envejezcan mejor. Y si bien aún se discute sobre esta
teoría, lo cierto es que, a medida que los vinos maduran, sus taninos suelen volverse más
suaves gracias al proceso de polimerización. Los taninos son un antioxidante natural, que
ayudan a proteger tanto al vino como a nosotros los humanos. Los taninos son moléculas
útiles para la salud humana, sobre todo por sus propiedades antioxidantes, su capacidad de
proteger los tejidos de la acción de los radicales libres debidos a procesos de añejamiento
celular.

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Ácido tartárico: Es el más importante de los ácidos del vino y es el más fuerte, es decir
que, al estar más disociado es el que eleva en mayor cantidad la concentración de
hidrógenos del vino. Su pH es de 3,01. Es por lo tanto el mayor responsable de la acidez y
del PH del vino. Organolépticamente se caracteriza por una leve astringencia, por ello si
bien está autorizado su uso para elevar la acidez de los vinos hay que tener cuidado, pues
en exceso puede desarmonizar.

Levaduras: En la producción del vino, las levaduras juegan un papel fundamental: se

utilizan para transformar los azúcares del mosto en etanol y dióxido de carbono, y por ello
son las responsables del éxito de la vinificación. Son las levaduras las que llevan a cabo
ese proceso bioquímico que lleva el nombre de fermentación. Solo las levaduras y algunas
bacterias son capaces de proliferar y, por tanto, de proceder a la fermentación del vino.

Metabisulfito: El Metabisulfito de sodio es un conservante y antioxidante que previene la

acidificación del vino y mejora el color del vino tinto, favoreciendo su apariencia Es un
conservante de alimentos el cual preserva el color natural de la comida y la protege contra
las bacterias. Contrariamente a lo que los consumidores piensan en general, lo que hace es
mantener vivo el color del vino, evitar que se oxide. El uso en vino es un antioxidante que
protege el color y el sabor, sin el uso del Metabisulfito, los vinos desarrollarían un sabor más
fuerte a medida que el vino fuera envejeciendo.

Técnica operatoria: se tomaron 2 litros de mosto 1 litro de cada curso. Se disolvieron los
aditivos sólidos en los 2 litros y se revolvió hasta diluir completamente. Al ser 10 cajones, 5
eran de 5to y 5 de 5to por ende calculamos la mitad (1000ml cada reactor). La cantidad de
metabisulfito fue directamente dada por los profesores y era de 2,5 gr de S2O5Na2 por
cada cajón.

Preparación de metabisulfito: El Metabisulfito de sodio es un conservante y antioxidante

que previene la acidificación del vino y mejora el color del vino tinto, favoreciendo su
apariencia.

Vino sin prensar (medidas)

Nota: El tanque donde se tomaron las medidas no es plano en el fondo, tiene una ligera loma. Por lo tanto, las
medidas tomadas no son exactas.

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(Vino no prensado)

Se debe agregar 2,5 gr de metabisulfito por cada 100 l de vino. se debe agregar un poco
más ya que el metabisulfito que nosotros tenemos está vencido, así que redondeamos a 1
gr.

2,5gr --------100l

0,7125gr = x --------28,5l

(Vino prensado)

2,5 gr --------100 l

0,318gr = x --------12,72l

Fermentación alcohólica.
En primer lugar, la fermentación alcohólica es la encargada de transformar los azúcares de
la uva en alcohol. Se realiza en los “reactores” donde, gracias a la acción de las distintas
levaduras, los azúcares se convierten en alcohol etílico. Durante este proceso natural se
logra suavizar y garantizar una óptima calidad del vino, ya que el alcohol actúa como
barrera ante posibles sustancias que podrían influir negativamente, dañando las
propiedades del vino.

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El oxígeno, la acidez, así como la presencia de distintas sustancias, pueden desencadenar
grandes impedimentos en el proceso de fermentación al dificultar la labor de las levaduras.
Por esta razón, durante la fermentación alcohólica, se debe llevar a cabo un meticuloso
control de las distintas variables que afectan al desarrollo del proceso e impiden la correcta
evolución de las levaduras.

Cuando la fermentación alcohólica va completando el mosto reduce su contenido en azúcar

y se incrementa la cantidad de alcohol, generando así la transformación a vino. El proceso
finaliza cuando el azúcar se reduce tanto que las levaduras no cuentan con alimento,
aunque también se puede detener modificando factores como la temperatura. Dentro de la
fermentación alcohólica es importante hablar del ‘remontado del vino’. Este proceso
consiste en sacar el mosto en fermentación desde la parte baja del depósito (más líquida)
para volver a dejarlo caer en la parte superior (más sólida y llamada ‘sombrero’). Así se
consigue favorecer la actividad de la levadura y extraer componentes de la uva que van a
enriquecer el vino. En nuestro caso se emplea el etanol cómo producto principal para el
alcohol del vino.

Las levaduras: Se puede pensar y decir que aproximadamente el 96% de la fermentación

alcohólica se lleva a cabo por hongos microorganismos. Estas son diferentes especies de
levaduras, entre las cuales destacan la Saccharomyces cerevisiae, Khyveromyces,
Torulospora, etc. Los tres microorganismos principales son las bacterias, hongos y
levaduras. Cuando el medio es rico en azúcar (como puede ser el caso de las melazas o
siropes), la transformación del mismo en alcohol hace que la presencia de una cierta
concentración (generalmente expresada en grados brix) afecte a la supervivencia de
levaduras no pudiendo realizar la fermentación en tal medio (las altas concentraciones de
azúcar frenan los procesos osmóticos de las membranas de las células). Aunque hay
distintos tipos de levaduras con diferentes tolerancias a las concentraciones de azúcares y
de etanol, el límite suele estar en torno a los 14 o de alcohol para las levaduras del vino
Balance energético La fermentación alcohólica es un proceso anaeróbico exotérmico (libera
energía) y moléculas de ATP necesarias para el funcionamiento metabólico de las
levaduras (seres unicelulares). Debido a las condiciones de ausencia de oxígeno durante el
bioproceso, la respiración celular de la cadena del ADP en ATP queda completamente
bloqueada, siendo la única fuente de energía para las levaduras el glicólisis de la glucosa
con la formación de moléculas de ATP mediante la fosforilación a nivel de sustrato. El
balance a nivel molecular del proceso se puede decir que genera 2 moléculas de ATP por
cada molécula de glucosa. Si se compara este balance con el de la respiración celular se
verá que se generan 38 moléculas de ATP. A pesar de ello parece ser suficiente energía
para los organismos anaeróbicos.

Ácidos de origen fermentario:

Entre los ácidos formados durante la fermentación alcohólica tenemos al ácido succínico y
el ácido láctico este último también proviene de la fermentación maloláctica.

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● El ácido succínico: Se forma a partir del ácido pirúvico durante la fermentación
gliceropirúvica El pirúvico no puede ser reducido a láctico y etanol porque los
hidrógenos necesarios han sido utilizados para la formación de etanal Y entonces sirve
de base para la formación de diversos productos y uno de ellos es el ácido succínico.
Primeramente, se forma el ácido fumárico y luego este pasa a ser ácido subínico. Se
produce aproximadamente un gramo de ácido succínico por cada 100 gramos de
alcohol, pero varía según el tipo de uva y según el lugar. Es el ácido típico del vino y
confiere al mismo su vinosidad en soluciones puras en agua los degustadores lo
describen como Salado amargo y de larga sensación final.

● El ácido láctico: Existen en el vino dos formas de ácido láctico que tienen diversos
orígenes. Cuando el ácido láctico proviene de una fermentación maloláctica el
isómero que se encuentra en mayor cantidad es el ácido L (+) que se origina a partir
del L (-) málico. Cuando las hexosas son atacadas por bacterias lácticas
homofermentarias o hetero fermentarías se produce ambos isómeros dependiendo
de la especie de bacterias.

durante la fermentación alcohólica Y a partir de la hidrogenación del ácido pirúvico

las levaduras pueden formar pequeñas cantidades de ácido láctico Se caracteriza
por producir una sensación ácida suave y estable. Se le atribuye un poder
antiséptico.

● El ácido acético: Este ácido se produce como producto secundario de la

fermentación alcohólica por oxidación de los aldehídos aumenta con el desarrollo de
la fermentación para luego ir disminuyendo paulatinamente. Si hay un exceso de
oxígeno en el proceso se puede dar la fermentación acética, en ese caso se
produciría el conocido “vinagre de vino” y es uno de los fallos del vino, un proceso
que degrada sus cualidades.

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Limitaciones.
❖ Concentración de etanol resultante: una de las principales limitaciones del proceso,
es la resistencia de las levaduras a las concentraciones de etanol (alcohol) que se
llegan a producir durante la fermentación, algunos microorganismos como el
saccharomyces cerevisiae pueden llegar a soportar hasta el 20% de concentración
en volumen.[20] En ingeniería bioquímica estos crecimientos se definen y se
modelizan con las ecuaciones de crecimiento celular dadas por las ecuaciones de
Tessier, Moser y de la ecuación de Monod.

❖ Acidez del substrato: el pH es un factor limitante en el proceso de la fermentación ya

que las levaduras se encuentran afectadas claramente por el ambiente, bien sea
alcalino o ácido. Por regla general el funcionamiento de las levaduras está en un
rango que va aproximadamente desde 3.5 a 5.5 pH. Los procesos industriales
procuran mantener los niveles óptimos de acidez durante la fermentación
usualmente mediante el empleo de disoluciones tampón. Los ácidos de algunas
frutas (ácido tartárico, málico) limitan a veces este proceso.

❖ Concentración de azúcares: la concentración excesiva de hidratos de carbono en

forma de monosacáridos y disacáridos puede frenar la actividad bacteriana. De la
misma forma la baja concentración puede frenar el proceso. Las concentraciones
límite dependen del tipo de azúcar, así como de la levadura responsable de la
fermentación. Las concentraciones de azúcares afectan a los procesos de ósmosis
dentro de la membrana celular.

❖ Contacto con el aire: una intervención de oxígeno (por mínima que sea) en el
proceso lo detiene por completo (es el denominado Efecto Pasteur). Esta es la razón
por la que los recipientes fermentadores se cierren herméticamente.

❖ La temperatura: el proceso de fermentación es exotérmico, y las levaduras tienen un

régimen de funcionamiento en unos rangos de temperatura óptimos, se debe
entender además que las levaduras son seres mesófilos. Si se expone cualquier
levadura a una temperatura cercana o superior a 55 ºC por un tiempo de 5 minutos
se produce su muerte. La mayoría cumple su misión a temperaturas de 30ºC.

❖ Ritmo de crecimiento de las cepas: durante la fermentación las cepas crecen en

número debido a las condiciones favorables que se presentan en el medio, esto
hace que se incremente la concentración de levaduras.

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Prensado.
El prensado tiene por objeto extraer la solución acuosa contenida en las uvas, así como
ciertos compuestos del hollejo bajo el efecto de la presión. El líquido así extraído se
llama mosto de uva. Para este proceso se utiliza una máquina llamada prensa

Descripción del equipo

Componentes principales.

1. Base-Plato prensado; Su función es la de soportar todo el peso de la

máquina en vacío o en funcionamiento. Tiene forma de plato para la recogida
del mosto que va exprimiendo de las uvas, y lo canaliza con una boca para
que pueda ser conducido hasta otro recipiente que se sitúa debajo.

2. Sistema cerramiento jaula; Es el que nos permite que toda la estructura

cilíndrica esté fija. Tiene la finalidad de permitir fácilmente la extracción de la
uva pisada y facilita la limpieza de la jaula y todo el conjunto.

3. Jaula; Es donde se tira la uva para prensar. Formada por láminas de acero
horizontales y de madera verticales, con una separación entre sí que permite
la extracción del mosto, pero no la de la uva

4. Talones; A medida que se va exprimiendo la uva, su tamaño también va

disminuyendo y los talones nos facilitan que todo el rato se trabaje de una
forma cómoda. Así pues, sirven para transmitir la fuerza de compresión.

5. Eje; Gracias a él, transformamos la fuerza que aplicamos a la palanca (de

rotación) en fuerza de compresión.

6. Grupo Prensador; Sistema de unión entre el eje y la palanca. Es muy

resistente y tiene disposiciones de funcionamiento (sentido horario y contra
horario) para exprimir el mosto o soltar-lo para añadir más uva pisada. Está
formada por tres cuerpos principales que tienen la finalidad de unirse entre sí
y permitir que el trabajador trabaje desde la posición más cómoda.

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 7. Palanca; Es el elemento mediante el cual se ejerce la fuerza a la máquina.
No está unido solidariamente al grupo prensador

Antes de la puesta en marcha se aconseja tener en cuenta los siguientes aspectos: No

verter en la jaula una cantidad de producto superior a su capacidad. La máquina debe
colocarse lejos de fuentes de calor, llamas o máquina explosiva. Debe mantenerse en
posición vertical, y siempre evitando que se apilen. Antes de usar la prensa es oportuno
eliminar con un cepillo y/o un chorro de aire posibles rastros de polvo presentes en las
partes internas (que entrarán en contacto con la vendimia) y utilizar un paño húmedo para
limpiar: jaula, medias lunas y tacos de madera.

Fermentación maloláctica.
Fermentación maloláctica: La segunda fermentación que ocurre en el vino, conocida como
fermentación maloláctica (FML) o conversión maloláctica, conlleva que un tipo de bacterias
presentes en el vino, las bacterias lácticas, metabolizan el ácido málico hasta convertirlo en
ácido láctico. Junto con las levaduras autóctonas que llegan en las uvas hasta la bodega
llegan también bacterias que se han desarrollado en el viñedo. Las más frecuentes
pertenecen al género Lactobacillus, pero de forma similar a lo que sucede en la FA, estas
bacterias mayoritarias procedentes del viñedo no serán las principales responsables de la
conversión maloláctica. Las bacterias más importantes para la FML pertenecen al género
Oenococcus y dentro de éstas la especie más frecuente y relevante es Oenococcus oeni,
conocida hasta finales del siglo pasado como Leuconostoc oenos.

También de forma análoga a lo que sucede en la FA con las diferentes levaduras, cuando
comienza la FML se producen en el vino una serie de cambios provocados por el propio
metabolismo de las bacterias que permiten a Oenococcus oeni, casi no presente en el
viñedo, imponerse y elevar su presencia hasta dominar toda la fermentación. Las bacterias
Oenococcus oeni presentan unas características especiales que las hacen muy relevantes
para la vinificación ya que pertenecen a la única especie que puede inducir la FML en vinos
que presenten un pH de 3.5 o menor y son más tolerantes a niveles altos de alcohol, a las
bajas temperaturas y al dióxido de azufre (SO2) que el resto de las bacterias lácticas.

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Las bacterias lácticas se encuentran por lo tanto de forma natural en el mosto y pueden
comenzar espontáneamente la descomposición biológica del ácido málico en ácido láctico
durante la fermentación alcohólica o, más frecuentemente, una vez que ha finalizado. Esta
conversión maloláctica puede inducir a través de concentrados de bacterias liofilizadas o
congeladas, cultivadas y procesadas en laboratorios, que en ocasiones se seleccionan de
entre las propias de la bodega. Para facilitar la FML, una vez inoculadas las bacterias, se
mantiene el vino a una temperatura más elevada y no se añade dióxido de azufre (SO2),
condiciones que hacen más fácil su proliferación. Esta fermentación permaneció a lo largo
del tiempo como uno de los grandes misterios de la vinificación, y por lo tanto fuera de
control del enólogo, hasta qué a mediados del siglo pasado se descubrió que era
responsabilidad de las bacterias.

La fermentación maloláctica o conversión maloláctica tiene como principal efecto en el vino

que el carácter verde y agresivo que presenta el ácido málico, término que proviene del latín
malus para manzana, se convierta en el mucho más redondeado y agradable del ácido
láctico. El ácido láctico, comparado con el ácido málico, es más suave y añade complejidad
aromática a los vinos. Durante la conversión las bacterias lácticas metabolizan diferentes
nutrientes generando otros compuestos diferentes al ácido láctico, siendo uno de los más
importantes el diacetilo, responsable principal de los aromas a mantequillas y lácteos. Estas
características organolépticas son un objetivo para muchos elaboradores ya que una gran
parte de los consumidores valoran muy positivamente su presencia en los vinos, al
percibirlas como agradables. También hay que destacar que esta conversión aumenta la
estabilidad de los vinos ya que se consumen nutrientes que podrían utilizar otros
microorganismos alterantes, este efecto es especialmente importante para los tintos ya que
suelen perder la protección del sulfuroso al combinarse con las antocianinas. Podemos por
lo tanto decir que casi todos los vinos tintos pasan por esta fermentación maloláctica pero
no es así en el caso de los vinos blancos y rosados. En los blancos, sobre todo los jóvenes
destinados a consumo temprano, así como en variedades particulares, el elaborador puede
decidir retener el carácter más verde del ácido málico para ganar frescura y por ello evitará
la conversión, principalmente añadiendo sulfuroso (SO2) y bajando la temperatura del vino,
ya que las bacterias son muy sensibles a ambos procesos, o incluso filtrando el vino para
retirar definitivamente las bacterias.

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Maceración.
La maceración es una operación basada en la extracción sólido-líquido, consiste en el
intercambio de sustancias entre las partes sólidas de la uva y el mosto. Se extrae
principalmente antocianos y taninos, pero además se liberan sustancias aromáticas,
polisacáridos, minerales, etc.

Hablando técnicamente, las sustancias que se desean extraer durante este proceso son los
antocianos, sustancias colorantes que se encuentra en los hollejos de la uvas tintas, éstos
son los responsables de aportar el color a los vinos tintos, son fáciles de extraer en fase
acuosa, alcanzando su valor máximo al cabo de 6 o 8 días desde su inicio, también están
los taninos que son sustancias orgánicas de sabor astringente, se encuentran en los
hollejos y las pepitas, éstos también se encuentra en los raspones. Los taninos también son
extraídos desde el inicio de la maceración, pero de forma más lenta y son los responsables
del color, aroma, estructura y otras características. Y también son extraídos los
polisacáridos, son azúcares del vino solubles en alcohol.

A modo de resumen se muestran los componentes del grano de uva que se intenta extraer
en la maceración.

Una vez estudiado la maceración y la fermentación, hay que decidir el método de

vinificación y maceración que se llevará a cabo para la obtención del producto. Los métodos
son los siguientes:

● Maceración a temperatura controlada: En este caso, el proceso de

fermentación alcohólica y maceración tiene lugar simultáneamente a una
determinada temperatura, temperatura que será estipulada. De esta forma se
obtienen vinos en cuanto al aroma, frescor, buena acidez, colores vivos, sabores
frescos y afrutados. El equilibrio existente de antocianos y taninos es óptimo.
Esta técnica de vinificación tiene como inconveniente principal que no permite la
extracción de más de un 20% de sustancias colorantes, aunque da buenos
resultados en variedades típicas del país. Necesita depósitos acondicionados
para realizar este tipo de proceso.

18
 ● Termovinificación: Consiste en calendar hasta 65-75 ºC la uva una vez
estrujada y dejarla macerar en caliente un tiempo determinado, conforme sea
mayor la temperatura, menos es el tiempo de maceración; aproximadamente a
70 ºC se macera entre 30 o 40 minutos. Aumentando los tiempos se incrementa
la cantidad de taninos, se logra un mosto intensamente coloreado. A estas altas
temperaturas, hay una destrucción total de hongos y enzimas presente en la
vendimia. Puede obtenerse hasta un 90% del potencial del color en agua,
dependiendo de la temperatura y del tiempo. Es muy efectiva en vendimias con
alto porcentaje de podredumbre.

Clarificación.
La clarificación es una operación que se realiza una vez finalizado todo el proceso
fermentativo. Una vez finalizado dicho proceso los vinos se muestran turbios por tener en
suspensión diversas materias naturales como levaduras muertas, bacterias, etc. y es
necesario realizar una clarificación para conseguir un vino limpio, brillante y estable. Hay
dos formas de realizar esta operación, de forma natural o provocada.

● Clarificación natural: consiste en la precipitación lenta y progresiva de las

partículas en suspensión en el vino, estas partículas son gruesas y más pesadas
caen al fondo del recipiente y serán eliminadas al realizar el trasiego. Esta forma
de clarificar se logra mejor cuanto menor capacidad y altura tenga el recipiente.

● Clarificación provocada: consiste en añadir al vino unas sustancias

clarificantes que son capaces de flocar y sedimentar arrastrando las partículas
dispersas y suspendidas al fondo del depósito de forma más rápida que la
anterior. Las sustancias empleadas para realizar esta operación son las
gelatinas, el gel de sílice y las bentonitas.

La opción más conveniente para obtener un vino limpio en menor tiempo es la clarificación
provocada, ya que con la natural puede que pase mucho tiempo y las partículas en
suspensión de menor tamaño no decanten y el vino siga estando turbio y esto retrasaría la
comercialización del producto.

Filtración.
Para un aseguramiento de que el vino queda completamente limpio y libre de posibles
materias en suspensión que no hayan floculado y hayan caído al fondo del depósito tras la
clarificación se realiza una filtración, además hay otras dos filtraciones en el proceso,
después de la estabilización tartárica y, por último, filtración esterilizante o amicróbica esta
filtración se realiza antes del embotellado para que en la botella no haya ningún
microorganismo y no haya problemas futuros.

Los tipos de filtros que existen son, de tierra, placas y membranas, que se explican a
continuación:

19
Filtro de tierras: estos filtros se forman depositando sobre un soporte una capa de tierras
filtrantes, más usadas diatomeas o perlita, donde se quedan retenidas las impurezas del
vino. Las tierras de diatomeas tienen su origen en algas microscópicas en estado fósil que
son calcinadas y limpiadas en caliente. Las perlitas es un silicato natural, inerte y está
exento de materias orgánicas, además, puede expandirse ocupando de 10 a 20 veces su
volumen inicial, por lo que aumenta mucho su superficie y su capacidad de filtración.

Los coloides, sustancias gelatinosas, proteínas, etc, son retenidas por absorción en este
tipo de filtros sin llegar a colmatarse fácilmente.

Filtro de placas: las placas filtrantes están constituidas por fibras de celulosa. Cuanto más
finas sean éstas, tanto menores serán los poros de la placa filtrante correspondiente,
aumentando así su capacidad de retención de partículas de pequeño diámetro. El efecto de
filtración se debe más a los fenómenos de absorción de las fibras que al tamizado a través
de las mismas.

Las clasificaciones previas a la filtración son necesarias para que después se pueda
conseguir una buena filtrabilidad en los aparatos de placas. De otro modo se colmatarían
rápidamente. Estos filtros proporcionan mayor capacidad de filtración y mayor seguridad
que los filtros de tierras.

Filtro de membranas: están constituidos por ésteres de celulosa, fluoruro de polivinilideno,

etc. Tienen una estructura continua y un espesor pequeño (150 micras). Estos filtros solo
trabajan por retención en la superficie.

Antes de llegar a este filtro, ha debido de ser filtrado previamente, porque sino los finos
poros se colmatarían muy rápido con un vino sucio.

Cuando se quiere separar solo levaduras, se utilizan membranas con poros de 1.2 micras y
cuando se quiere separar bacterias también se recurre a los de 0.45 micras de diámetro de
los poros. Conociendo los tipos de filtros, las primeras filtraciones, es decir, después de la
clarificación y de la estabilización tartárica se usa tanto filtro de tierras como filtro de placas,
como se usa ambos métodos de filtrado tras esas operaciones, se selecciona el filtro de
placas debido a su funcionalidad, opción de cambiar las placas y su porosidad para obtener
diferentes grados de filtración y su disponibilidad en el mercado. Y para la última filtración se
usa filtro de membrana.

20
Producción de vino.
Recepción de la uva:

Nos llegaron 10 cajones de vino que procedimos a separar 5 y 5 con los chicos de 5to,
nuestros cajones luego fueron pesados y se calculó cuántos kilos de uva iniciales
tendríamos en nuestro trabajo.

Nº de cajón Peso del cajón vacío Peso del cajón lleno Peso de la uva
estimado

1 1,4 kg 16kg 14.6kg

2 1,4 kg 14kg 12,6 kg

3 1,3 kg 13kg 11,7 kg

4 1,1 kg 11kg 9,9 kg

5 1,1 kg 11kg 9,9 kg

total 6,3 kg 65kg 58,7 kg

El peso bruto es de 65kg

El peso de los cajones vacíos de 6,3 kg

El peso de los raspones y las bolsas de 1,7kg

El peso neto de la materia prima: 57kg

21
Preparación del lugar a trabajar:

Limpieza de mesadas:

Antes de comenzar el proceso se limpiaron las mesadas en donde iban a estar colocadas
las uvas a despalillar con una solución diluida de cloro.

Limpieza de pisos:

Se barrio y posteriormente se le pasó el trapo al laboratorio de biología y al de química, que

es en donde se iban a encontrar las uvas almacenadas y luego se iban a trasladar a la
despalilladora, y se colocaron bolsas para evitar el contacto directo con el piso.

Limpieza de los reactores:

Se preparó una solución de peracético 0,05% p/p y se utilizó para limpiar los reactores que
posteriormente fueron enjuagados con abundante agua para evitar que se quede un resto
del ácido en ellos.

TO TA
ACTIVIDADES 6 6

DÍA 1 VIERNES 10/03:

Higienizamos todas las áreas de las mesadas, y las liberamos de elementos que hayan
quedado dando vueltas por estas.

● Se limpió la zona de los guardapolvos y soportes.

● Se desarmó la máquina despalilladora con el fin de eliminar posibles restos que

hayan quedado en el interior y se volvió a armar.

22
 ● Se colocó la despalilladora en su posición final de trabajo y se le agregaron las
bolsas para los residuos, como también el túnel para que la pulpa caiga dentro de
los reactores.

● Se cubrió todo el suelo y alrededores con plásticos para evitar que se ensucie y no
generar un enchastre.

DÍA 4-13/03:

Cajón 1: 16 Kg

Cajón 2: 14 Kg

Cajón 3: 13 Kg

Cajón 4: 11 Kg

Cajón 5: 11 Kg

Peso total 5 cajones = 65 Kg

Dividiendo los trabajos en grupos primero se separó el racimo de las hojas y suciedades. Lo
que ya estaba separado se pasó por la despalilladora.

Durante este proceso vinieron a observar las tareas cuatro cursos.

Los grados Brix medidos al mosto dieron un resultado de 30º.

El pH medido fue de 3,64.

Después de 3 hs de proceso, terminamos de despalillar. Pesamos los cajones y palillos

para sacar el peso total de las uvas.

Peso cajones vacíos y palillos = 8 Kg

Peso neto: 65 Kg – 8 kg = 57 Kg

Análisis del mosto:

ºBrix: 30

Volumen uva: 58,9 lt

Densidad mostimetro: 1,102 g/ml

Densidad balanza: 1,14 g/ml

23
Grados alcohólicos mostimetro: 14

pH: 3,64

Se agrega 2,5 g. de metabisulfito por cajón.

Agregado cada 10 cajones de:

Ac. Tartárico 58 g.

Taninos 6 g.

Levadura 8 g.

Nutrientes 9 g.

Chips de roble 65 g.

DÍA 5-14/03:

El día martes se realizaron en el turno mañana los remontados pertinentes por los alumnos
de 5to año de la especialidad. A su vez, en el turno tarde se realizaron los controles y
remontados. Los resultados de los controles dieron todos de manera normal, se adjuntan
resultados en la planilla de control. Ese mismo día en el turno mañana y tarde se realizó una
limpieza profunda al laboratorio, lo que abarcó, mesadas, despalilladora, pisos y elementos
del laboratorio.

DÍA 6-15/03:

Se realizaron los controles y remontados correspondientes del día. Durante todo el dia
tuvimos que controlar las temperaturas del vino ya que hizo una máxima de 40ºC el
pronóstico del día, y el vino llegó a los 37°C; para bajar estas temperaturas lo que se hizo
fue agregarle botellas de hielo a los reactores, una iniciativa la cual funcionó ya que
pudimos disminuir las temperaturas correctamente.

DÍA 7-16/03:

El día jueves únicamente se realizaron los controles y remontados correspondientes.

Durante todo el día tuvimos que controlar las temperaturas del vino ya que hizo una máxima
de 38ºC por lo cual nuevamente le agregamos hielo para disminuirla. Los resultados de los
análisis se adjuntan en un anexo.

24
DÍA 8-17/03:

El día viernes se realizaron los controles y remontados correspondientes del día. Este día
no se dictó clases debido a las altas temperaturas y por este motivo no se realizaron
controles en el turno tarde, solo a la mañana. El vino fue remontado por un docente a la
tarde, los resultados se adjuntan en un anexo.

DÍA 9-18/3:

El día sábado solo se realizaron los remontados de la mañana, sin controles.

DÍA 10-20/3:

El día lunes se realizaron los análisis y los remontados correspondientes del día, los
resultados se adjuntan en un anexo.

DÍA 11-21/3:

El día martes se realizaron los análisis y los remontados de los vinos. Las densidades por
balanza y del mostímetro,comenzaron a acercarse al 1; y los °Brix ascendían
correctamente, estos tres parámetros fueron nuestras primeras guías de que dentro de los
días próximos teníamos que realizar el prensado del mosto.

DÍA 12-22/3:

Seguimos detalladamente los controles del día para determinar si el prensado lo realizamos
el día jueves 23 o el lunes 27. Se realizaron los remontados del día. A la tarde preparamos
el laboratorio de Química limpiándose con una solución de peracetico con concentración de
0.05 y luego volvimos a limpiar con agua.

DÍA 13-23/3:

Dado que no podíamos dejar pasar el vino el fin de semana largo, luego de realizar los
análisis y remontados del día realizamos el prensado.

25
Técnica operatoria de los análisis:
Control de temperatura: Para medirla se procede a introducir al fermentador un
termómetro de alcohol el cual nos indique cual es la temperatura dentro del recipiente y
verificar que esta no supere los 25°c ya que de hacerlo podría conllevar a la formación de
colonias microbiológicas dentro del fermentador. Se especifica que es un termómetro de
alcohol debido a que si fuese uno de mercurio y se rompe dentro corremos el riesgo de
contaminar todo el vino, a diferencia del termómetro de alcohol.

Alcohol a producir: Es un control que se le realiza al vino con un elemento denominado

mostimetro el cual nos indica mediante una escala graduada la cantidad de alcohol a
producir en función de la cantidad de azúcar presente en la muestra. Para esto se toma del
reactor una muestra de 500 ml aproximadamente, se la filtra y se la coloca en una probeta,
se introduce el mostimetro y con la escalera se busca la medición que dio a la hora de hacer
el análisis.

26
pH: es una medida que nos permite calcular qué tan ácida o alcalina es la sustancia que
medimos con, por ejemplo, un pH metro. Nos puede resultar bastante útil saber la acidez de
una sustancia, como lo puede ser nuestro mosto, ya que se pueden determinar cosas como
qué microorganismos se pueden desarrollar en la misma o si se están formando
compuestos indeseables. A lo largo del proceso nuestro pH se debe mantener constante o
con mínimas variables, los valores óptimos de un pH de vino serían entre 3.5 y 4; por
encima de cuatro significa que la sustancia es un ambiente (en cuanto a acidez) óptimo
para el crecimiento de hongos y bacterias; un pH por debajo de 3.5 nos daría señales de
que, al pH estar bajando, se estarían formando compuestos más ácidos como lo pueden ser
el ácido acético, el mismo es un claro indicativo del avinagramiento del vino o bebida
alcohólica.

El valor del pH se puede medir de forma precisa mediante un potenciómetro, también

conocido como pH-metro, un instrumento que mide la diferencia de potencial entre dos
electrodos: un electrodo de referencia (generalmente de plata/cloruro de plata) y un
electrodo de vidrio que es sensible al ion de hidrógeno. Como los electrodos de vidrio de pH
mesuran la concentración de H + relativa a sus referencias, tienen que ser calibrados
periódicamente para asegurar la precisión. Por eso se utilizan buffers de calibrado
(disoluciones reguladoras de pH conocido) que sirven para leer sustancias.

Calibración de pH metro:

1. Apretar la letra CAL para iniciar a calibrar, colocar en un tubo de ensayo el buffer
con el pH pedido en la parte de debajo de la pantalla del aparato (que
usualmente es el de 7), sumergir el electrodo en la solución, aguardar a que la
medida se estabilice y esperar el pitido, confirmar con la letra CFM mientras el
electrodo siga sumergido, no retirar antes de apretar la tecla para evitar hacerlo
nuevamente

27
 2. Repetir el proceso con la siguiente que pida, usualmente es la de 10 pero como
el vino tendrá (o no debería tener) un pH mayor a 7 se puede saltar usando una
de las teclas de flechas que posee el aparato, aunque se recomienda hacer lo
mismo con el de 10 ya que el pH metro se puede usar posteriormente para medir
otras sustancias con un pH mayor

3. La tercera calibración a realizar es con buffer 4, se realizan los pasos anteriores

para tener una escala apropiada con la cual el aparato pueda trabajar y decirnos
de manera exacta la acidez de mi sustancia

4. Una vez terminado confirmar la última medida apretar nuevamente la letra CAL
para finalizar la calibración

Notas: se recomienda colocar la sonda de temperatura en un vaso de precipitado con agua a temperatura
similar a la del buffer. Para medir con el pH metro recordar Siempre quitar y colocar nuevamente el tapón
una vez que el aparato esté apagado y limpiar con agua desmineralizada antes y después de medir

Grados Brix (°Bx): Miden el cociente total de sacarosa disuelta en un líquido, por
ejemplo, una solución de 25 °Bx tiene 25 g de azúcar (sacarosa) por 100 g de líquido o,
dicho de otro modo, hay 25 g de sacarosa y 75 g de agua en los 100 g de la solución.
Teniendo en cuenta esto sería correcto suponer que a lo largo del proceso los °Bx vayan
bajando en su grado, debido a que en la fermentación alcohólica la sacarosa que posee
naturalmente el jugo se va a transformar en etanol y dióxido de carbono respectivamente
Los grados Brix se miden con un refractómetro. El mismo trabaja mediante el principio
físico de índice de refracción, donde la luz que entra choca contra el líquido que posee el
prisma, esto cambia su ángulo al haber sólidos disueltos, entre ellos la sacarosa, en el
líquido, el ángulo que se forma de este cambio se puede visualizar en la escala interna
del aparato y se puede ajustar para más claridad

A continuación, se presentan instrucciones detalladas para utilizar un refractómetro manual

como el que se muestra en la imagen:

28
1. El refractómetro es un instrumento óptico delicado. Se debe utilizar con
cuidado, evitando que sufra golpes. Proteja el instrumento de calor
excesivo y de cambios drásticos en humedad. Guarde el refractómetro
en su estuche cuando no esté en uso.

2. Proceda a retirar la cubierta plástica translúcida que cubre la lente (área

de vidrio pulido), en la parte posterior del refractómetro. Si es necesario,
limpie con cuidado la superficie del lente con papel de lente, sacando
cualquier mancha o residuo.

3. Tome una alícuota de su muestra de agua, utilizando un cuentagotas

(preferiblemente de plástico). Coloque una o dos gotas sobre la lente,
evitando tocar la superficie de la misma con la punta del cuentagotas.

4. Vuelva suavemente la cubierta plástica a la posición inicial, evitando la

formación de burbujas o espacios de aire entre la lente y la cubierta.

5. Colóquese frente al sol o una fuente de iluminación artificial si trabaja en

el laboratorio y observe a través del ocular del refractómetro. Oriente el
refractómetro a la fuente de iluminación de manera que pueda distinguir
con claridad una escala numérica en el hemisferio de la lente. La escala
está calibrada para leer salinidad en partes por mil (‰). Asimismo, notará
que su campo de visión está dividido en un hemisferio norte de color
opaco y un hemisferio sur translúcido. La línea horizontal que separa
ambos hemisferios será su marcador de salinidad en la escala numérica.
El punto donde esta línea se interseca con la escala numérica indica la
salinidad de su muestra.

6. Una vez realizada la medida de salinidad, levante la cubierta plástica.

Lave la muestra de agua de la lente y de la cara interna de la cubierta
plástica lavando con agua destilada y después seque cuidadosamente
con papel de lente. Vuelva a la cubierta plástica en su posición original.
Al terminar de utilizar el refractómetro recuerde limpiarlo, poner en su
estuche y guardarlo en un lugar apropiado

29
Densidad: es otra medida para saber la cantidad de azúcar que posee el mosto, debido
a que, como anteriormente explicamos, el azúcar se convierte en etanol durante la
fermentación, la densidad de la sustancia se va a ver rebajada mientras el proceso esté
en marcha. Sabemos que la fermentación está casi terminada cuando esta esté lo más
cerca de 1 posible, ya que nos dicta la poca cantidad de azúcares que quedan en el
mosto por convertir en alcohol. Usualmente se mide de dos formas la densidad: la
primera por balanza, prendemos la misma y colocamos el vidrio de reloj y apretamos tar,
luego colocamos por micropipeta una medida de 1 ml de vino en el vidrio y hacemos un
promedio de unas tres pesadas de los pesos dados, la densidad al ser m/v sería la del
promedio ya que el peso es el dictado por la balanza y el volumen no afecta ya que el
mismo es de 1 ml, dándonos una medida en g/ml de sustancia. La segunda es por
mostimetro, el mismo funciona por flotación siendo una de sus escalas la de densidad
por flotación, suele dar bastante cercano al realizado por balanza y es una forma de
comprobar o validar resultados .

30
Peso específico (densidad por flotación): Para verificar el descenso de densidad en el
vino y, por ende, el cambio de azúcar a alcohol, se retira una muestra en una probeta de
250 o 500 ml, únicamente con el líquido. Una vez llena, se emplea un mostímetro, que se
introduce vertical y cuidadosamente en el líquido hasta que flote libre y verticalmente. A
continuación, se observa en la escala graduada en el vástago del mostímetro su nivel de
hundimiento en el líquido. Esa es la lectura de la medida de densidad relativa del líquido.

Grados Baumé: Con el mismo mostimetro, podemos conocer los grados Baumé del
vino, y la cantidad de alcohol a producir. Para ello, basta con leer la otra escala graduada
en el mostimetro.

Prensado del vino:

Obtención del vino no prensado.

Eliminar todas las piezas de madera internas y asegurarse de que la jaula esté cerrada
mediante los pasadores en dotación. Eliminar todas las piezas de madera internas y
asegurarse de que la jaula esté cerrada mediante los pasadores en dotación. Levantar el
trinquete hacia arriba a lo largo del husillo (girando en el sentido contrario a las agujas del
reloj), volcar toda la mezcla (mosto con uvas) dentro de la jaula y esperar que el líquido se
almacene dentro del recipiente. Terminado de escurrir, colocar el líquido, otra vez, en la
jaula. El líquido obtenido de la segunda vez que se dejó escurrir es el vino no prensado. Por
lo tanto, se coloca en un recipiente apto para su posterior almacenamiento.

31
Operatoria para el prensado: Colocarse delante de la palanca y agarrándola con las dos
manos, mover la palanca adelante y atrás. Este movimiento provocará el desplazamiento a
ambos lados de la parte superior del movimiento a trinquete. La acción ejercida sobre la
palanca, además, determina un avance de los topes del agujero en el que están, al
inmediato sucesivo; esto produce el movimiento de rotación del trinquete hacia abajo, con la
consiguiente acción de prensado de las maderas sobre el producto. Una vez acabado el
prensado, llevar el trinquete hacia arriba (girando en el sentido contrario a las agujas del
reloj), quitar todos los tacos, sacar la jaula, extraer la torta de orujos que ha quedado en la
prensa y proceder con cuidado.

32
Obtención de vino prensado: Colocar las medias lunas (los dos robustos semiduros de
madera de haya evaporada) que una vez unidos irán a coincidir con el diámetro de la jaula
misma y en el centro dejarán un espacio solo para el tornillo central. Por encima de estas se
colocarán los tacos, perpendicularmente al sentido en el que se han colocado las
medialunas. Bajar el trinquete, haciéndolo girar en el sentido de las agujas del reloj, hasta
que se apoye sobre los tacos (los tacos superiores tendrán que colocarse cerca de la tuerca
del husillo). Colocar los topes, teniendo cuidado de que las puntas entren en los orificios
redondos de la corona (la corona se encuentra en el movimiento a trinquete). Introducir la
palanca en el agujero presente en el trinquete y bloquearla con la palomilla.

33
 Fermentación maloláctica.
La fermentación maloláctica (FML) del vino es producida por bacterias lácticas:
Leuconostoc, Pediococcus y Lactobacillus sp, que -mediante una vía catabólica- convierten
el ácido L(-) málico en ácido L(+) láctico y CO2 como productos principales. Para que la
reacción ocurra, es necesaria la presencia de la enzima malato-carboxilasa (enzima
maloláctica), nicotinamida-adenina dinucleótido (NAD +) y Mn+2. La FML puede alterar la
calidad del vino debido a que origina descenso de la acidez total, estabilización biológica
ante nuevos ataques de bacterias lácticas y un incremento en la complejidad del aroma y
sabor, causado por la desaparición de algunos componentes y la síntesis microbiana de
nuevas sustancias. Durante la FML, la población de bacterias lácticas llega a 107 -108
células/ml. Las bacterias lácticas, además de producir ácido láctico, dan compuestos
aromáticos tales como acetaldehído, ácido acético, etanol, diacetilo, acetoína, y 2-3 butilen-
glicol, los que influyen en el perfil organoléptico del vino. La disminución de acidez titulable
originada durante la FML oscila entre 1 y 3 g/l mientras que el aumento de pH puede
alcanzar de 0,15 a 0,30 unidades, dependiendo de la concentración de ácido málico y del
pH iniciales, así como de la magnitud del desarrollo microbiano.

Los vinos de regiones frías tienen un alto contenido ácido y pueden beneficiarse con una
desacidificación mediante la FML. Sin embargo, los vinos de las regiones más cálidas:
California, Sudáfrica, Australia y Mendoza (Argentina), que son de menor acidez, pueden
desmejorar su calidad por acción de la FML. Una reducción de acidez, en estos casos,
resulta en un vino chato, insípido, con tendencia al desarrollo de patógenos bacterianos. En
los vinos de alto pH, las características organolépticas en especial, color pueden ser
afectadas negativamente por la FML. Como consecuencia de la FML desciende
apreciablemente la intensidad y la calidad del color de los vinos tintos. Dependiendo del pH,
el color del vino puede desarrollar tintes violetas o azules. Una reducción en la intensidad
colorante del vino de hasta 30 % ha sido observada en vinos donde la FML ha sido
realizada por Leuconostoc sp.

Entre las causas de dicha pérdida de color en los vinos tintos se ha mencionado que una
considerable pérdida de color procede del desplazamiento del equilibrio de la configuración
de los pigmentos antociánicos, resultante del incremento del pH. Los antocianos son
compuestos anfóteros y, a pH = 3,5, el equilibrio químico se desplaza hacia el ión flavilio,
rojo. En cambio, a mayor pH, se obtiene su estructura canónica azul-violeta. Otra posibilidad
es la reducción de los antocianos a las leuco formas correspondientes por catabolismo
bacteriano del ácido cítrico que provee el NADH, necesario para la reacción. También
puede haber decoloración de los antocianos por acción del SO2. El consumo, por parte de
las bacterias lácticas, de compuestos habitualmente combinados con dicho dióxido:
cetoglutarato, piruvato y acetaldehído, libera SO2. El SO2 libre reacciona con los antocianos
formando sus compuestos; en consecuencia, disminuye la intensidad colorante del vino.

34
En las bodegas de Mendoza, durante el proceso de vinificación, la FML ocurre
frecuentemente, ya sea de manera espontánea o provocada. Cuando se la induce, se
obtiene mayor complejidad gustativa aunque se desconoce, en las condiciones locales, su
implicancia sobre el color del vino. La intensidad colorante se considera un factor de
calidad, porque mejora el precio de los vinos comercializados. Existen medios tecnológicos
para favorecer o evitar la ocurrencia de la FML. El conocimiento de los efectos de la FML
sobre el color del vino y el empleo de la tecnología hace posible la elaboración de los
productos buscados por la industria.

¿Qué cambios provoca la FML?

Debido a la degradación total del ácido málico (ácido dicarboxílico) en ácido láctico
(monocarboxílico) y a la liberación de CO2, el cambio esencial es la disminución de acidez.
La FML es una desacidificación biológica del vino. El pH aumenta, la acidez total disminuye
y la acidez del ácido málico es reemplazada por un sabor más suave, debido al ácido
láctico. Esta es la razón por la cual se busca la FML, adaptándose bien para vinos blancos
de regiones septentrionales, vinos base de Champán, vinos blancos de Burgundy y, en
general, vinos de la variedad Chardonnay. Además de las características aromáticas
varietales de los vinos, numerosos vinos blancos se ven beneficiados con esta
fermentación. Pero incluso a partir de Sauvignon, se han obtenido vinos más intensos,
complejos, estructurados y untuosos. En los vinos tintos la disminución de acidez, debida al
FML, es primordial por la suavidad y la redondez que aporta. Todos los vinos tintos, excepto
ciertos casos, requieren una FML.

Sin embargo, la desacidificación no es la única consecuencia. Las muy numerosas

transformaciones son implícitas en la evolución gustativa y aromática. Algunas substancias
volátiles son sintetizadas y ciertos componentes del color (en los vinos tintos) son
modificados. Estos cambios se ponen en evidencia por el análisis sensorial. Hasta ahora, no
se han identificado todas estas sustancias. Una de estas transformaciones es la del ácido
cítrico cuya concentración inicial máxima es del orden de 0,25 g/L. Ella conduce a la
formación de diacetilo (molécula del aroma a manteca) que participa de manera obvia al
bouquet del vino, siempre que no se perciba de manera excesiva. Asimismo, las moléculas
carboxílicas formadas durante la FML conducen, a través de reacciones químicas con
aminoácidos, a la producción de sustancias aromáticas heterocíclicas. Finalmente, el
metabolismo de los aminoácidos, tales como metionina y cisteína, produce compuestos
volátiles interesantes.

Durante la FML, el aumento de acidez volátil es débil, menos de 0,15 g/L. Este aumento
proviene de la fermentación de azúcares residuales de la fermentación alcohólica y de la
degradación del ácido cítrico. La estabilidad microbiológica no debe ser considerada cómo
estricta después del FML. La producción de sustancias tóxicas y la utilización de nutrientes
esenciales durante la FML pueden transformar eficazmente al medio en hostil para las
bacterias. Pero si el pH es demasiado elevado, tal inhibición no se cumple y el medio se
torna sensible a la contaminación.

35
Análisis y determinaciones realizadas.
Determinación de anhídro sulfuroso (SO2) libre y total en vino tinto.

Teoría del metabisulfito y por qué es importante la adición y determinación

del mismo:

El metabisulfito de sodio es una sal sódica que pertenece al grupo de los sulfitos, este
compuesto inorgánico tiene como fórmula Na2S2O5.

Físicamente el metabisulfito de sodio es un polvo de color blanco o ligeramente amarillo de

olor azufroso, es soluble en agua, etanol y glicerina, reacciona en presencia de agua
formando dióxido de azufre (SO2), un gas de olor fuerte que puede causar dificultades
respiratorias, también reacciona con oxígeno formando sulfato.

Los sulfitos son sustancias presentes de manera natural en el vino (procedentes de la uva)
o añadidas en la práctica enológica. Por tanto, no existen los vinos sin sulfitos sino los vinos
sin sulfitos añadidos. En general, los vinos orgánicos, naturales y biodinámicos también
contienen sulfitos, aunque tendrán muchos menos que los vinos convencionales.

El término «sulfito» o «sulfuroso» es una manera abreviada de referirnos al anhídrido

sulfuroso o el dióxido de azufre. De una manera general el anhídrido sulfuroso es una
sustancia, que a las dosis empleadas en los vinos es totalmente inofensivo para el hombre y
en los vinos se comporta como un potente antiséptico polivalente, además de un potente
reductor que protege al vino frente a las oxidaciones. Aunque bien, un contenido alto de
sulfito se ve representado en ciertas personas con mayor sensibilidad en jaquecas o dolores
de cabezas luego de consumir el vino.

El dióxido de azufre (SO2) es un aditivo de vinificación. Es uno de los que más se utilizan y
más controversia provocan. Es un gas incoloro, pero con un característico olor.

Funciones:

AGENTE ANTIOXIDANTE:

Es además utilizado por ser un potente antioxidante. Su acción evita la oxidación química
que se produce por la combinación del O2 con el mosto y la acción de enzimas que
producen la oxidación biológica.

La oxidación del vino modifica sus características físicas, como el brillo y color, en todos los
tipos de vinos blancos y tintos, por tanto, su conservación es primordial para evitar
problemas a la hora de comercializar el producto.

El dióxido de azufre se puede añadir de varias maneras a la preparación, siendo la más

utilizada la adición a través de metabisulfito de potasio o de sodio.

36
La sola presencia de SO2 en la muestra, disminuye la cantidad de O2 libre, evitando la
oxidación. Este hecho es tan importante porque el SO2 es capaz de oxidarse antes que los
compuestos fenólicos presentes, consumiendo el oxígeno. Esta característica, permite que
las enzimas como la polifenoloxidasa o la peroxidasa, que actúan causando el
oscurecimiento, se inactivan. Sin embargo, en función del momento en el que se adiciona el
sulfuroso, las consecuencias pueden ser diversas. Cuando la adición se realiza en la
prefermentación, su función es meramente anti oxidativa, mientras que al adicionarse una
vez finalizada la fermentación o antes del proceso de almacenamiento, sus propiedades son
antimicrobianas. Durante el proceso final de embotellado, se pueden adicionar pequeñas
cantidades de sulfuroso para estabilizar el vino.

EFECTO PROTECTOR:

Se combina con el etanol protegiendo a los vinos de aromas indeseados.

AGENTE ANTIMICROBIANO:

Actúa contra los microorganismos perjudiciales presentes en mostos y vinos como son:
mohos u hongos, levaduras y bacterias.

En el caso del sulfuroso, no solo es importante la concentración presente, sino también, las
diferentes formas en las que se encuentra. Los valores de pH y el momento de adición
durante el proceso de vinificación tendrán influencia directa en la forma química del
sulfuroso y, en consecuencia, en sus propiedades microbianas y bactericidas.

El SO2 se encuentra en forma molecular, como bisulfito y combinado. El sumatorio del

molecular y el bisulfito, es el que mayormente conocemos como libre. Cuando el SO2
molecular se combina con otras sustancias presentes y con el propio oxígeno, se aumenta
la propiedad antimicrobiana de los vinos. Los microorganismos presentes en el medio no
pueden captar el oxígeno libre para la respiración, por lo que se induce la muerte de estos
patógenos.

Sin embargo, esta capacidad depende en gran medida de los valores de pH de la muestra.
Cuando existe un pH elevado y no existe la suficiente cantidad de SO2, la capacidad
antimicrobiana disminuye su efecto, impidiendo únicamente la actividad fúngica, mientras
que, si las muestras se encuentran a pH más ácidos y la concentración es lo
suficientemente elevada, la actividad fúngica no solo aumenta, sino que también se
destruyen todos los microorganismos presentes en la muestra.

En el vino y en equilibrio existen tres tipos de SO2:

1. SO2 L = "Sulfuroso libre" (útil para la conservación)

2. SO2 C = "Sulfuroso combinado"

37
 3. SO2T= "Sulfuroso total"

Técnica del metabisulfito

Realizamos una técnica con metabisulfito para asegurarnos
de que todos los reactivos creados estén bien y funcionen
correctamente.

La técnica fue pesar 0,300gr de metabisulfito y diluir en 10

ml con agua desmineralizada, de esa disolución tomar 0,5
ml y agregarlo a un erlenmeyer junto con 5 ml de ácido
sulfúrico, 3 ml de almidón y cantidad suficiente de agua
desmineralizada para notar el cambio de color que fue en un
gasto de solución de yodo de 25,2ml.

Definiciones
● Se denomina anhídrido sulfuroso libre al anhídrido sulfuroso al estado SO2, y al de
combinaciones tales como: SO3H2, SO3H- o SO3.

● Se denomina anhídrido sulfuroso combinado, al que se encuentra combinado al

acetaldehído, a los azúcares, polifenoles y otras sustancias capaces de adicionar
ácido sulfuroso.

● El anhídrido sulfuroso (anhídrido sulfuroso total) contenido en el vino o en el mosto,

se encuentra en estado libre y en estado combinado.

Método Ripper original.

Fundamento

La determinación del dióxido de azufre se basa en una valoración de óxido-reducción con I2

como reactivo valorante en medio ácido y en presencia de almidón como indicador.

Las reacciones que se producen son:

SO2 +H2O→SO42– +2H+ +2e

I2 +2e→2I–

38
––––––––––––––––––––––––––––––––––––

SO2 +H2O+I2 →SO42– +2H+ +2I–

Material y reactivos.

● Matraz erlenmeyer de 250 mL.

● Pipetas de 5, 10, 20 y 50 mL.

● Bureta de 25 mL.

● Propanal PS.

● Solución de propanal de 10 g/L.

● Potasio Hidróxido 1 mol/L (1N).

● Ácido sulfúrico 1⁄3 p/v.

● Almidón solución 2%.

● Yodo 0,01 mol/L (0,02N).

● Patrón de Referencia para Enología (Vino Blanco) CRS.

● Patrón de Referencia para Enología (Vino Tinto) CRS.

Procedimiento

Dióxido de azufre libre En un matraz se introducen 50 mL de vino, con una pipeta seca o
lavada con el propio vino, 5 mL de ácido sulfúrico y 1 mL de solución de almidón. Se valora
con la solución de yodo 0,01M hasta coloración azul que persista durante 15 s. Sea v el
volumen de yodo consumido en la valoración (mL). En el caso de mostos sulfitados o de
vinos con una gran cantidad de SO2 (>300 mg/L) se recomienda diluir la muestra.

Dióxido de azufre total En un erlenmeyer se introducen 10 mL de hidróxido de potasio 1M

y 20 mL de vino introduciendo la punta de la pipeta dentro del hidróxido de potasio para
evitar la pérdida de SO2 gas, se tapa, se agita y se deja en reposo durante 15 min para
realizar la hidrólisis alcalina de los complejos entre el SO2 y algunos componentes del vino
como el acetaldehído. Pasado este tiempo, se añaden 5 mL de ácido sulfúrico, 1 mL de la
solución de almidón y se valora rápidamente con la solución de yodo hasta la aparición de
la coloración azul persistente (15 s). Sea v’ el volumen de yodo gastado.

Observaciones: En el caso de vino con niveles altos de ácido ascórbico (vitamina C) se ha

de determinar también el ácido ascórbico porque su presencia puede inducir a error en la
cuantificación del SO2 ya que se trata de una sustancia reductora, que al igual que el SO2
consume yodo en la valoración.

39
Variación del Método Ripper (nuestra técnica)

Procedimiento

Preparación de solución de almidón 2%p/v.

Preparamos una solución de almidón 2%p/v, disolviendo exactamente 2 gramos de almidón

en 100ml de agua fría, a esa solución se la lleva a ebullición hasta completa disolución, se
deja enfriar y se filtra en caso de que sea necesario, en nuestro caso no fue necesario, por
ende, tapamos y dejamos en la heladera para utilizarlo a la brevedad.

Preparación de solución Yoduro de potasio

Debimos preparar en la campana una solución de Ioduro de potasio que ayudará a

disminuir la volatilización del Yodo.

Para ello, tomamos 4 g de Yoduro de potasio y lo diluimos en 100ml de agua

desmineralizada y agregamos a un matraz de 1000ml.

Preparación de la solución de Yodo 0,02N.

Tuvimos que trabajar en la campana debido a la volatilización de gases tóxicos del yodo,
pesamos 1,27 gr de yodo (no pesar en balanza analítica debido a los vapores de yodo) y
pasamos, mediante un embudo seco, al matraz aforado que contiene la solución
concentrada de yoduro de potasio. Se tapa el matraz, se agita hasta que el yodo se haya
disuelto, se deja en reposo para que tome la temperatura ambiente, se lleva a volumen con
agua destilada y se lo deja reposando unos días.
Cálculos basados en el libro de Arthur L. Vogel.

Preparación de solución ácido sulfúrico

Además, necesitamos otra solución para llevar la reacción a un medio ácido y que se realice
en las condiciones necesarias. Una de ácido sulfúrico (1 gramo en 3 ml).

Nosotras decidimos preparar 200 ml diluidos.

En el laboratorio contábamos con una botella de H2SO4 Prueba Análisis (1,84 kgr de
densidad y 95%p/p) y medimos en probeta aproximadamente 37ml trasvasamos a un
erlenmeyer con previa cantidad de agua desmineralizada y enrasamos a 200 ml con agua
desmineralizada, con un embudo limpio y seco colocamos en un frasco de vidrio con tapa y
rotulamos.

1g H2SO4 ____ 3 ml solución

x = 66g H2SO4 ____ 200 ml

Como el ácido sulfúrico que tenemos en el laboratorio es de concentración de 95% p/p:

40
1,84kgr/l • 95%p/p = 174,8%p/v

174,8g H2SO4 ____ 100ml H2SO4

66g H2SO4 ___ x = 37 ml H2SO4

Concluimos entonces que, debemos preparar 37 ml de H2SO4 95% p/p y enrasar a 200ml
con agua desmineralizada.

Preparación de hidróxido de potasio 1M

Para la realización del hidrólisis alcalina de los complejos entre el SO2 y algunos complejos
del vino debimos preparar una solución de KOH. Para ello, nos guíamos con el peso molar
de la sustancia:

56 g KOH ____ 1000 ml sol.

x = 5,6 g KOH ____ 100 ml sol

Una vez que se ha diluido ese yodo sólido (en caso de que no, añadir más ioduro de
potasio), procedimos a realizar las titulaciones.

Como mencionamos anteriormente, con el método Ripper a nuestro

modo.
a) Dióxido de azufre libre En un matraz se introducen 7 mL de vino, con una pipeta seca o
lavada con el propio vino, 5 mL de ácido sulfúrico y 3 mL de solución de almidón. Se valora
con la solución de yodo 0,02 N hasta que la coloración violeta persista durante 15 s. Sea v
el volumen de yodo consumidos en la valoración (mL).

b) Dióxido de azufre total En un erlenmeyer se introducen 3,5 mL de hidróxido de potasio

1M y 7 ml de vino introduciendo la punta de la pipeta dentro del hidróxido de potasio para
evitar la pérdida de SO2 gas, se tapa, se agita y se deja en reposo durante 15 min para
realizar la hidrólisis alcalina de los complejos entre el SO2 y algunos componentes del vino
como el acetaldehído (pasando a un color verdoso). Pasado este tiempo, se añaden 5 ml de
ácido sulfúrico (volviendo al color natural del vino), 3 mL de la solución de almidón, se lo
agita y se lo enraza a 100ml con agua desmineralizada para notar cambio de color y se
valora rápidamente con la solución de yodo hasta la aparición de la coloración azul
persistente (15 s). Sea v’ el volumen de yodo gastado.

41
Cálculos de Anhídro sulfuroso

Fórmula original

(v – v’’) x 0,02 x 32 x 1.000

SO2 libre, mg/L = –––––––––———–––––––––––––––– = (v – v’’) x 12,8

Fórmula con datos obtenidos

(1,28 – 0) x 0,02 x 32 x 1.000

SO2 libre, mg/L = –––––––––———–––––––––––––––– = 117,029 mg/l

Fórmula original

SO2 total, mg/L = (v’/20 – v’’/50) x 0,02 x 32 x 1.000 = [v’ – (0,4 x v’’)] x 32 v’’ x 0,02
x 88 x 1.000

Fórmula con datos obtenidos

SO2 total, mg/L = (1,73/7 – 0) x 0,02 x 32 x 1.000 = 158,446 mg/l

Ácido ascórbico, mg/L = ––––––——–––––––––––––––– = v’’ x 35,2 50

(no se puede realizar valoración de ácido ascórbico ya que no trabajamos con propanal en
el laboratorio)

Apartado de las normas propuestas

Instituto Nacional de Vitivinicultura.

VINOS Resolución C. 227/91 Fíjase el límite máximo de Anhídrido Sulfuroso Total para la
liberación al consumo de vinos. Mendoza, 20/3/91 VISTO lo establecido por el artículos 2°
de la Ley N° 21.764 por el que el Instituto Nacional de Vitivinicultura puede establecer los
límites legales de los componentes del vino, y

42
CONSIDERANDO: Que los distintos Organismos Nacionales e Internacionales aconsejan
disminuir al mínimo compatible con la estabilidad de los productos, los niveles de
antisépticos y conservadores. Que la tecnología y las prácticas enológicas autorizadas a la
fecha hacen posible mantener estabilidad en los vinos con valores inferiores a los
establecidos en la Resolución N° C-141/ 88. Que establecer el límite citado, redundaría en
beneficio de la calidad de los vinos que se comercialicen y de la salud de la población. Por
ello, y en uso de las facultades conferidas por la Ley N° 14.878 y el Decreto N° 302/ 89.

EL CONSEJO DIRECTIVO DEL INSTITUTO NACIONAL DE VITIVINICULTURA

RESUELVE:

Artículo 1° — Fijar como límite máximo de Anhídrido Sulfuroso Total para la liberación al
consumo de los vinos:

1. Tintos Secos: CIENTO CINCUENTA MILIGRAMOS POR LITRO (150 mg/l).

2. Blancos y Rosados Secos: DOSCIENTOS MILIGRAMOS POR LITRO (200 mg/l).
3. Tintos Abocados y Dulces: DOSCIENTOS MILIGRAMOS POR LITRO (200 mg/l).
4. Blancos y Rosados, Abocados y Dulces: DOSCIENTOS TREINTA MILIGRAMOS
POR LITRO (230 mg/1).

Art. 2°—En el límite fijado en el punto 1°, para los vinos en circulación se aplicará la
tolerancia fijada en el Decreto N° 1469/71, es decir TREINTA Y CINCO MILIGRAMOS POR
LITRO (35 mg/1) en más o menos, no pudiendo superar los CIENTO OCHENTA Y CINCO
MILIGRAMOS POR LITRO (185 mg/1), DOSCIENTOS TREINTA Y CINCO MILIGRAMOS
POR LITRO (235 mg/1) y DOSCIENTOS SESENTA Y CINCO MILIGRAMOS POR LITRO
(265 mg/1) de Anhídrido Sulfuroso Total, respectivamente.

Art. 3° — Establecer como definición y metodología analítica, para Anhídrido Sulfuroso

Total, la descrita en el Anexo de la presente Resolución.

Art. 4° — La presente Resolución tendrá vigencia a partir de la Vendimia 1991 y los vinos
elaborados con anterioridad mantendrán los tenores establecidos en la Resolución N° C.
141/88 hasta agotar su stock, con la tolerancia de TREINTA Y CINCO MILIGRAMOS POR
LITRO (35 mg/ Q) de acuerdo a lo fijado en el Decreto N° 1469/71.

Art. 5° — Todo producto que se libere al consumo, con cantidades de anhídrido sulfuroso
superior al límite establecido, será considerado como "Producto en infracción al Artículo 14
y 20 inc. g) de la Ley N° 14.878" y sancionado por el Artículo 24 de la referida Ley y demás
complementarios.

Art. 6°—Derógase la Resolución INV N° 76/85, el punto 16, del Capítulo III, del
Anexo I, Vino Reserva y el punto 20, del Capítulo III del Anexo II - Vino Fino,
Resolución INV N° 200/85, Resolución N° C. 141/88 y todo acto administrativo que
se oponga a la presente.

Art. 7° — Regístrese, comuníquese, dése a la Dirección Nacional del Registro

Oficial para su publicación y cumplido, archívese.

43
Conclusión SO2

Límite máximo de SO2 Total en vinos tintos secos: 150 mg/l con una variación
permitida de 35 mg/l en más o en menos.

Nuestros resultados SO2 Total: 158,446 mg/l

Concluimos entonces que nuestro vino se encuentra dentro del límite establecido
por el Instituto Nacional de Vitivinicultura.

Recuento de colonias.

Bacterias más importantes en la FML

Las bacterias más importantes para la FML pertenecen al género Oenococcus y dentro de
éstas la especie más frecuente y relevante es Oenococcus oeni, conocida hasta finales del
siglo pasado como Leuconostoc oenos.

Entre las características bioquímicas utilizadas destaca la pureza fermentativa de los

azúcares, lo que permite agrupar estas bacterias en homofermentativas, aquellas que llevan
a cabo una fermentación láctica pura generando exclusivamente ácido láctico y
heterofermentativas, aquellas que a partir de azúcares producen, además de ácido láctico,
gran cantidad de CO2 y otros compuestos como etanol, ácido acético, succínico, manitol,
etc. La utilización de las pentosas como xilosa y arabinosa, la de otros azúcares, y el
metabolismo de otros compuestos como los ácidos málico, cítrico y tartárico son utilizados
para clasificar las distintas especies.

De todas estas especies la más frecuentemente aislada en los vinos en plena F.M.L. es
Leuconostoc oenos a la que actualmente se denomina Oenococcus oeni.

Especies de bacterias lácticas encontradas en el vino:

44
se las denomina coloquialmente "bacterias útiles" y se caracterizan por su incapacidad para
metabolizar ácido tartárico y glicerol, producir poca acidez volátil y resistir los bajos pHs
siendo selectivas en estas condiciones para la utilización de ácido málico frente a los
azúcares. Dentro de ellas predominan los cocos heterofermentativos. Existen, sin embargo,
otras bacterias lácticas denominadas "perjudiciales" que se caracterizan por metabolizar
preferentemente los azúcares, el ácido tartárico y el glicerol y elevar la acidez volátil
causando con ello las enfermedades del vino que se citan en un apartado posterior, dentro
de ellas predominan los lactobacilos.

La F.M.L. Suele desencadenarse espontáneamente al finalizar la F.A. o algún tiempo

después cuando las condiciones sean favorables a las bacterias lácticas.

Oenococcus oeni es la principal especie de este género, nombre que fue propuesto para la
especie conocida hasta entonces como Leuconostoc oenos. Antes se consideraban
Leuconostoc porque son cocos y realizan la fermentación heteroláctica, o sea, que
fermentan los azúcares produciendo otros compuestos además de ácido láctico, sobre todo
CO2 y también acético y etanol en pequeñas cantidades. Sin embargo, Oenococcus tiene
unas características exclusivas, que lo hacen diferente de Leuconostoc: su hábitat es
exclusivamente el mosto y el vino, pueden crecer al pH del vino (entre 3 y 4), y toleran el
etanol, un 10 % (v/v) y más. O. oeni es la especie predominante en la FML de vinos, si bien
en algunos casos se ha comprobado que esta fermentación la realizan otras especies,
como Lactobacillus plantarum.

El dato más relevante para proponer que Oenococcus era otro género distinto fue la
comprobación, por comparación de las secuencias del RNA ribosomal, de que
filogenéticamente está bien separado de Leuconostoc y otras especies de bacterias
lácticas.

Medios de cultivo MRS y MLO

Luego de una ardua búsqueda de información, los medios de cultivo MRS y MLO son los
más adecuados para determinar que la FML está en curso.

45
TEORÍA DEL MRS:

Usos:

Medio utilizado para detección de bacterias ácido-lácticas (Lactobacillus spp.Pediococcus

spp.Oenococcus oeni) en muestras de vino, insumos enológicos, agua y alimentos.
Preparados por personal técnico de laboratorio capacitado, implementando procedimientos
y registros en trazabilidad y certificación. Norma de calidad (ISO 9001).

Instrucciones de uso

46
Placas listas para usar, por métodos de filtración por membrana. Luego de filtrar la muestra
tomar la membrana con pinza previamente esterilizada, y colocarla cuidadosamente sobre
el medio de cultivo. Evitar dejar burbujas de aire entre la membrana y el medio. Siembra en
superficie Repicar directamente estriando la superficie del medio con un asa previamente
esterilizada.

Incubación

En anaerobiosis, a 35+/- 2°C durante 7 a 10 días.

Fundamento: Durante la incubación, los nutrientes del medio migran hacia la superficie de la
membrana, nutren los microorganismos y permiten el desarrollo de las colonias que luego
serán evaluadas por observación en microscopio óptico.

Características del producto

Medio de cultivo agarizado color rojizo- anaranjado.

Almacenamiento

Se recomienda mantener a 2-10 °C.

Interpretación de los resultados

Observar el crecimiento microbiano y las características de las colonias. Realizar el Test de

Gram para posterior observación microscópica de las células.

Precauciones

● Solamente para uso diagnóstico in vitro. Uso profesional exclusivo.

● No utilizar el producto si al recibirlo su envase está abierto o dañado
● No utilizar el producto si existen signos de contaminación o deterioro, así como
tampoco si ha expirado su fecha de vencimiento
● Las características del producto pueden alterarse si no se conserva apropiadamente

Indicaciones al consumidor

● Mantener a 2-10 °C en bolsa plástica cerrada. Pueden mantenerse hasta 45 días en

estas condiciones. Ver fecha de elaboración.
● Durante la incubación en estufa, almacenar las placas de modo invertido (agar en
parte superior) para evitar la caída del agua de condensación sobre el medio de
cultivo.

47
Características macroscópicas de las colonias
Colonias variables pueden ser de borde definido o difuso de consistencia cremosas o
mucosas lisas, brillantes y viscosas. Tamaño variable de 0,5 a 5 mm de diámetro
aproximadamente, color blanco, crema o traslúcidas (pueden teñirse de rosa por la materia
colorante del vino).

Teoría MLO.

Principios y usos:
El medio MLO se utiliza para la propagación y el mantenimiento de las bacterias del vino.

La fermentación maloláctica es un proceso bioquímico, llevado a cabo en la mayoría de los

vinos tintos y algunos vinos blancos por ciertas bacterias del ácido láctico, lo que resulta en
una acidez más valorable, mejora la estabilidad microbiana además del sabor y la
sensación en boca. Oenococcus oeni es la principal especie bacteriana que se encuentra
en los vinos durante la fermentación maloláctica y está bien adaptada al bajo pH y a la alta
concentración de etanol del vino.

La triptona y el extracto de levadura proporcionan nitrógeno, vitaminas, minerales y

aminoácidos esenciales para el crecimiento. La glucosa y la fructosa se utilizan como fuente
de carbono y energía. El uso de fructosa en el medio de crecimiento como un aceptor de
electrones generalmente se considera beneficioso para la mayoría de las cepas de O. oeni.
El sulfato de magnesio y el sulfato de manganeso proporcionan iones inorgánicos.

El citrato es una fuente de energía alternativa al metabolismo del azúcar, está relacionado
con la producción de diacetilo en los vinos y, a un pH bajo, inhibe la mayoría de los
microorganismos. El clorhidrato de L-cisteína es el agente reductor. Tween 80 es un
emulsionante.

Preparación:
Disuelva 35,2 gramos de medio deshidratado en 900 ml de agua destilada. Mezclar bien y
disolver por calentamiento para completar la disolución.

Dispensar en recipientes apropiados y esterilizar a 121 C durante 10 minutos. Enfriar a 50

°C y agregar 100 ml de suero de tomate estéril.

48
Almacenamiento:
● Temp. Min. 2 °C
● Temp. Máx.:25 °C

Medios de cultivo.
Al no conseguir los medios de cultivo mencionados, decidimos realizarlo por nuestra cuenta,
buscando como suplementar algunos compuestos, cambiando los valores de los gramos
para un volúmen de 250ml ya que en caso de ser una prueba fallida, no tengamos tanta
pérdida de producto.

Cálculos:

49
50
Esterilización

En un primer momento, y luego de hacer los cálculos correspondientes, procedimos a

preparar el medio MRS. Sin embargo y antes de pesar los reactivos, procedimos a
esterilizar dos frascos con tapa que si bien no es necesario (pues todavía no armamos el
medio) es un aspecto que consideramos puede mejorar el resultado final. Para ello lo que
hicimos fue limpiar con una esponja los frascos y luego llevarlos a una olla, dejarlos
destapados y cubiertos por agua que previamente fue calentada en la pava eléctrica para
ahorrar tiempo, se encendió el anafe y se esperó aproximadamente 40 min.

Una vez listo y con los elementos de seguridad para evitar quemaduras, llevamos los
frascos y las tapas a la campana microbiológica para que se sequen. Paralelamente a este
paso, se pesaron los reactivos necesarios para el medio, utilizando los siguientes medios:

51
Una vez pesados y corroborado que los frascos están secos, se procede a con un embudo
de papel, pasar los polvos al frasco.

Para el reactivo MLO el procedimiento fue exactamente el mismo solo que en este caso lo
hicimos a las 16:53 pm y no usamos el medio “sangre agar base”.

Luego de pesar y de depositar con el embudo los polvos pesados dejamos los frascos con
los polvos para cuándo los necesitemos, se los almacenó en la campana.

Una aclaración importante a hacer, es que agregamos fructosa ya que el profesor Cristian
encontró una que él consideraba que se veía en buen estado.

¿Qué queda hacer?

Reactivo MRS: agregado del jugo de tomate, el agua desmineralizada, tween 80 y nueva
esterilización

Reactivo MLO: agregado del agua desmineralizada, tween 80 y nueva esterilización

Actualización del medio de cultivo

Preparación de jugo de tomate o licopeno:

Se procedió a lavar 4 tomates y pelarlos para posteriormente cortarlos en trozos pequeños.
Colocamos los pedazos junto con agua desmineralizada y se comienza a “mixear” con una
multiprocesadora, haciendo movimientos ascendentes y descendentes para un óptimo
triturado.

Una vez que queda el jugo de tomate, se procede a colar para separar las semillas y los
pedazos que no pudieron ser triturados.

Una vez realizado el paso anterior, queda un jugo de tomate líquido que posteriormente se
va a esterilizar junto con los medios.

52
Preparación tween 80
Se procede a pesar en la balanza analítica 1 g de tween 80 depositado en un vaso de
precipitados para posteriormente agregarle unos pequeños ml de agua desmineralizada
calentada en la pava eléctrica

Para la disolución uno se peso 1,051 g y para la próxima, 1,063 g

Preparación placas de Petri

Se limpian con agua desmineralizada las placas de Petri de vidrio a utilizar, y se envuelven
con papel madera para posteriormente colocar la cinta reveladora y esterilizar.

Procedimiento de la realización de los medios

Para el reactivo MLO se le agrega agua desmineralizada previamente calentada con la pava
eléctrica, hasta completar 200 ml al igual que al reactivo MRS. Se calienta con el anafe
para que los polvos y el agua se homogenicen lo mejor posible, se agrega 30/40 ml del
licopeno (al medio correspondiente) y el tween 80. Una vez que se volvió el medio líquido se
le agrega agua hasta completar los 250ml.

Una vez que se preparó el medio en solución se procede a esterilizar en un equipo de

extracción.

Se visualiza que el equipo en su interior posee unas cápsulas las cuales en su interior
contienen los materiales a esterilizar.

53
Una vez limpiado el equipo, se dispone a llenarla hasta el nivel recomendado de agua
desmineralizada.

Se van disponen las placas de Petri y los medios de cultivo (cerrados correctamente y
dispuestos con cintas reveladoras para corroborar una óptima esterilización)

Una vez que se ubican correctamente los materiales, se controla el cerrado correcto de la
tapa del equipo, el cerrado de las válvulas, el nivel del agua interior requerido y la correcta
disposición de entrada y salida del agua, se procede a iniciar la esterilización durante
aproximadamente 30/40 minutos guiándonos de la óptima esterilización en base al
condensador.

Se aclara que el conducto naranja es la entrada de agua y la manguera

azul la salida de agua

Una vez
transcurrido ese tiempo, se apaga el equipo y se deja reposar unos segundos. Se dejan
tanto los medios como las placas en la campana y luego de 5 horas aproximadamente se
llevan los medios a la heladera para evitar un shock térmico. Se limpia y guarda el equipo
con sumo cuidado.

Plaqueo
Los medios de cultivo que habíamos conservado en la heladera, fueron calentados a baño
maría para pasarlos a fase líquida, una vez que los mismos estaban en dicha fase, los
trasladamos a la campana microbiológica de flujo laminar, la encendimos y abrimos las
placas de petri de vidrio que estaban previamente esterilizadas, procedemos a rotular cada
placa y dividirla para hacer distintos estriados.

54
Agregamos medios de cultivos correspondientes a cada placa según la rotulación, dejamos
15 minutos a que solidifiquen y las damos vuelta.

Hicimos 2 placas de vidrio para 6to año una con MRS y la otra con MLO y 2 placas de
plástico también rotuladas y con ambos medios de cultivo pero el estriado en ellas fue
distinto ya que estriamos con el asa de Drigalsky, luego para tener parámetros de un antes
y un después hicimos 2 placas con medios de cultivo sin muestra de vino estriado,
simplemente para ver un antes y un después.

También hicimos ensayos para el vino prensado de 5to año, realizamos 4 placas de petri de
plástico dos con estriado con asa clásica y otras 2 placas con asa de Drigalsky.

Con muestra de vino de 5to en un tubo de ensayo y muestra de vino de 6to en otro tubo de
ensayo, el mechero de alcohol, el asa y el asa de Drigalsky, encendedor y las placas
rotuladas, comenzamos a plaquear.

55
Plaqueo y siembra clásica
Una vez que el medio se encuentra lo suficientemente sólido, se procede de la siguiente
manera:

Se traza en la base una línea y otra perpendicular a esta para dividir y estriar en los 4
fragmentos.

Se esteriliza el asa microbiológica a llama directa, una vez que la herramienta se encuentra
"al rojo vivo" se espera que se enfríe y se introduce en el tubo de ensayo que contiene la
muestra a analizar, en este caso, el vino de 6to año. Se aclara que se debe visualizar la
película de muestra de vino en el asa luego de sacarla del tubo de ensayos.

Con el ansa empezamos a hacer el estriado en cada fracción del cultivo, teniendo el inóculo
inicial, el segundo, tercero, y cuarto grupo de estrías. Es importante hacer el estriado
superficialmente en el medio de cultivo y visualizar que en la parte superficial del mismo se
forma una película de producto del estriado.

Luego de dicho proceso, se lo deja reposar en la campana.

Plaqueo y siembra Drigalski

Tomamos la micropipeta y
configuramos un volumen de 1ml y
como consideramos que era un
volumen grande, lo modificamos a
0,5ml. El tip que debemos utilizar
debe ser previamente esterilizado
con alcohol y debemos darle tiempo
a que seque interna y externamente.
Tomamos de la muestra de vino que
teníamos en el tubo de ensayo los
0,5 ml con la micropipeta y el tip
estéril y colocamos en el centro de la
placa encima del medio de cultivo.

Luego colocamos una cantidad

suficiente de alcohol en una placa de
petri para poder mojar el asa de
Drigalsky y flamear sobre la llama del
mechero de alcohol para poder
esterilizarla, la dejamos enfriar cerca
de la llama y con la misma vamos a arrastrar esa alícuota agregada por todas las
direcciones de la placa de petri. Tapamos la placa pero no la vamos a dar vuelta ya que
sino volcaremos.

56
Incubación teórica MRS
La incubación teórica era en atmósfera con 5% de CO2 , a 33-37 °C durante 24-72 horas.

Incubación teórica MLO

En aerobiosis, a 33-37 °C durante 18-24 horas.

Incubación práctica
Incubamos a 30°C ambos cultivos, durante 72hs para el MRS y 24hs para el MLO, cómo se
observa la temperatura es distinta a la teórica, ésto debido a que al siguiente día no íbamos
a poder estar por la mañana para llevar el control, por ende para atrasarlo unas horas más,
debimos disminuir la temperatura y ralentizar el proceso. Luego de pasadas 12hs nuestro
profesor modificó las temperaturas a 33°C. Por ende de 24 hs pasamos a observar luego de
las 25 hs y 30 minutos aproximadamente.

Imágenes ilustrativas sobre los medios de cultivo y el crecimiento visible 5to año pasadas
25 horas y 30 minutos:

57
Imágenes ilustrativas sobre los medios de cultivo y el crecimiento visible 6to año pasadas
25hs y 30 minutos:

58
Debido a factores externos como por ejemplo bacterias en el ambiente, varias placas se nos
han contaminado, esto ocurrió de la noche a la mañana, por ende podemos concluir que la
muestra se haya contaminado esa misma noche o durante el día anterior al que
encontramos las placas así:

59
60
Controles para saber que tipo de bacterias estamos tratando:

Coloración Gram

¿En qué consiste la Tinción de Gram?

La Tinción de Gram consiste en una técnica de laboratorio diseñada por Christian Gram En
el año 1884. El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible
diferenciar diferentes grupos de bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas.
Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular que las envuelve, se tiñen de
una forma u otra.
Así, las bacterias que no se tiñen mediante esta técnica se denominan Gram negativas.
Están formadas por una pared más fina formada por menos capas de peptidoglicano y una
segunda membrana rica en lípidos (que repele la tinción Gram), al microscopio aparecen
incoloras.
El cristal violeta se une a la pared bacteriana y se estabiliza con el lugol. La mezcla alcohol-
acetona disuelve la membrana externa de las bacterias Gram negativas (más fina que la de
las Gram positivas) extrayéndose el cristal violeta. Después se tiñen solo las Gram
negativas con safranina.

Material necesario:

● Placa Petri con siembra

● Asa de siembra o material estéril para sembrar
● Mechero de alcohol
● Agua destilada
● Colorantes de tinción Gram (cristal violeta, lugol, safranina)
● Cristalizador y varillas de tinción
● Portaobjetos
● Alcohol 96º
● Papel secante
● Microscopio óptico

Cómo en nuestro caso los colorantes estaban en estado sólido, debíamos hacer la
disolución, luego de una ardua búsqueda en internet, farmacopea y libros encontramos la
relación.

Cristal violeta

Para 5gr de cristal violeta se necesitaba 100ml de solución, en nuestro caso no necesitaba
tanta cantidad por ende decidimos usarlo en 30ml. Haciendo la regla de 3, el resultado fue
de 0,15gr en 30 ml. Diluimos y agregamos solución en un frasco con gotero.

61
Safranina O

Para 2gr de safranina se necesitaba 1000ml de solución, en nuestro caso no necesitaba

tanta cantidad por ende decidimos usarlo en 30ml. Haciendo la regla de 3, el resultado fue
de 0,06 gr en 30 ml. Diluimos y agregamos solución en un frasco con gotero.

Procedimiento Tinción de Gram

En primer lugar, para realizar una tinción, lo que tenemos que tener son microorganismos
sembrados. En nuestro caso ya lo teníamos y son de la muestra de vino tanto de 5to y de
6to.

Siempre que “destapemos” una placa con colonias, deberá hacerse en condiciones de
esterilidad. Para conseguir estas condiciones podemos utilizar un mechero Bunsen o un
mechero de alcohol. Con el mechero, conseguiremos que se forme un ambiente de
esterilidad alrededor de la llama, por lo tanto, si trabajamos cerca del mechero, tendremos
un ambiente estéril. En nuestro caso para mayor esterilidad lo trabajaremos en campana de
flujo laminar y mechero.

A la hora de comenzar con la tinción, lo primero que hay que realizar es un frotis del
microorganismo, para ello hay que añadir una gota pequeña de agua destilada (cuanto
mayor sea la gota, tardará más tiempo en secarse).

Debemos coger la muestra con el asa bacteriológica previamente esterilizada. Para ello
encendemos el mechero de alcohol y ponemos el asa en posición vertical encima del
mechero hasta que el hilo del extremo del asa se quede totalmente incandescente.

Después debemos esperar a que se enfríe porque si tocamos con el hilo incandescente las
colonias podemos matar al microorganismo.

Abrimos la placa con las bacterias y con el asa tocamos en el agar para comprobar que éste
está frío.

A continuación, cogemos unas colonias de las bacterias y las extendemos sobre la gota de
agua destilada.

Una vez extendido, volvemos a esterilizar el asa, ya que todo material debe ser esterilizado
antes de volver a ser guardado. A continuación, lo que tenemos que hacer es fijar la
muestra, la cual se puede fijar con metanol o se puede fijar con calor. En este caso
utilizaremos la fijación por calor.

Tenemos que hacer movimientos circulares o en zig zag por encima de la llama del
mechero, levantando constantemente la muestra para que no se nos queme el tiempo
suficiente para que la muestra quede totalmente seca y por lo tanto fijada.

Una vez fijada la muestra apagamos el mechero por seguridad.

Ahora, vamos a teñir nuestra siembra de microorganismos en el portaobjeto con diferentes

tipos de tinciones para poder visualizar cada microorganismo (bacteria) al microscopio.

62
Las tinciones se realizan en un cristalizador, también utilizamos varillas de tinciones y el
porta con la muestra.

Vamos a utilizar diferentes reactivos para la tinción. En primer lugar el cristal violeta, en
segundo lugar el lugol, usaremos también alcohol de 96º (el decolorante puede estar
formado por una mezcla de alcohol, alcohol-acetona y por diferentes mezclas), y por último
la safranina.

¿Qué va a ocurrir?

Las bacterias gram positivas y las bacterias gram negativas tienen diferente grosor en el
peptidoglicano de su pared celular, de tal forma que cuando echemos el cristal violeta se
nos van a teñir tanto las gram positivas como las gram negativas. El lugol lo que hará, será
fijar el colorante del cristal violeta a las bacterias, con el alcohol (o mezcla decolorante), lo
que haremos será eliminar el cristal violeta de las gram negativas y por último, la safranina,
va a teñir solamente a las gram negativas que son las que están decoloradas. Por lo tanto,
las gram positivas estarán teñidas de cristal violeta y las gram negativas de safranina (color
fucsia).

El protocolo será aplicar a las bacterias fijadas cristal violeta durante un minuto, luego lavar
con el frasco lavador. A continuación, añadir lugol durante un minuto, volver a lavar con el
frasco lavador. Después, añadir durante 10 o 15 segundos la mezcla de alcohol o alcohol-
acetona…, lavar la muestra con el frasco lavador. Y finalmente, añadir safranina durante un
minuto y lavar con agua destilada.

Por lo tanto, tal y como hemos dicho, aplicamos el cristal violeta. El protocolo será aplicar a
las bacterias fijadas cristal violeta durante un minuto, luego lavar con el frasco lavador. A
continuación, añadir lugol durante un minuto, volver a lavar con el frasco lavador. Después,
añadir durante 10 o 15 segundos la mezcla de alcohol o alcohol-acetona…, lavar la muestra
con el frasco lavador. Y finalmente, añadir safranina durante un minuto y lavar con agua
destilada.

● Por lo tanto, tal y como hemos dicho, aplicamos el cristal violeta

● Una vez que ha transcurrido el minuto lo lavamos con agua destilada.

● Ahora vamos a añadir el lugol justo por encima de la zona de la muestra y

esperamos otro minuto.

● Ya ha transcurrido el minuto y lavamos con agua destilada. A continuación

decoloraremos la muestra con el alcohol. Para conseguirlo hay que incorporar el
porta de un lado para ir añadiendo el alcohol y que vaya resbalando para abajo.
Cada protocolo estipula un tiempo pero con 15 segundos aproximadamente la
muestra quedará decolorada

63
 ● Tras los 15 segundos de decoloración, aclararemos con agua destilada para que el
alcohol no siga actuando, porque si no paramos el proceso de decoloración a
tiempo, todas las bacterias quedarían decoloradas, no solamente las gram negativas
y por lo tanto no podríamos diferenciar unas de otras.

● Por último, aplicamos a la muestra la safranina y la dejamos actuar durante otro

minuto.

● Transcurrido el minuto, volvemos a aclarar la muestra con agua destilada y

dejaríamos que la muestra se secara.

● Posteriormente observaremos la muestra con el microscopio.

Imágenes ilustrativas teóricas de cómo deberían verse las bacterias:

64
Imágenes de cómo se ven las bacterias 6to año (nuestras imágenes):

Izquierda MLO - Derecha MRS

65
Imágenes 5to año:

Izquierda MLO-derecha MRS

66
Prueba de catalasa:
Fundamento

La catalasa es una enzima típica de las bacterias aerobias que tienen un metabolismo
oxidativo, capaz de descomponer el agua oxigenada, que es un producto tóxico, en agua y
oxígeno. Desde el punto de vista práctico, se toma la colonia de los microorganismos que
hay que investigar y se mezcla con una gota de agua oxigenada. Si la bacteria posee
catalasa, ésta escindirá dicho compuesto formando una serie de burbujas visibles, debidas
al oxígeno liberado.

Por tanto, en esta prueba, la prueba de catalasa debe ser negativa. Debido a que Las
lactobacterias no son capaces de llevar a cabo esta reacción y por lo tanto no forman
burbuja, son catalasa negativa; al contrario que las bacterias acéticas y levaduras, que son
catalasa positiva

67
Realización práctica
Se vierten unos mililitros de peróxido de hidrógeno 10 volúmenes en unos tubos de ensayo.

Se esteriliza el asa microbiológica y se procede a tomar una muestra de la colonia.

Se introduce el asa dentro del tubo de ensayo y se visualiza si hay burbujas o no.

Resultados.

Medios de cultivo: ambos negativo en prueba de catalasa

Medios MRS Y LO 5TO AÑO: positivo en catalasa

MEDIOS MRS Y LO 6TO negativos en catalasa

Acidez fija.
Reactivos.

Erlenmeyer pequeño, baño de agua a ebullición, Pipeta de doble aforo, solución de

NaOH 0.1N, fenolftaleína al 1%, phmetro

Técnica operatoria.
Técnica sin phmetro:

Eliminar el CO, si está presente, por alguno de los métodos siguientes: 1) colocar 25 ml
de muestra en un pequeño erlenmeyer y conectarlo a una trompa de aspiración de agua.
Agitar 1 min con vacío Y) Colocar 25 ml de muestra en un pequeño erlenmeyer, calentar
a ebullición incipiente y mantener 30 seg, agitar y enfriar. El anhídrido carbónico y el
anhídrido sulfuroso libre y combinado no están comprendidos en la acidez total.

Para la determinación de acidez, medir 10 ml de vino con pipeta de doble aforo y

colocarlos en un erlenmeyer de 150-200 ml de capacidad (se puede agregar 30 ml de
agua destilada). Titular con solución de NaOH 0,1 N. El punto final se apreciará de la
siguiente forma;

Vinos blanco: empleando como indicador 5 gotas de fenolftaleína en solución alcohólica

al 1% Se dará por terminada la titulación cuando el líquido adquiera un color rosado
persistente.

68
Vinos tintos: se considera terminada la titulación cuando se observa un enturbiamiento,
o cuando el color del vino vire a verde.

Técnica con phmetro

Se toma una alícuota de 50 ml en un matraz erlenmeyer de 100 ml. Se toman 20 ml del

vino desgasificado y se ponen en un vaso de 100 ml. Se valora con electrodo de ph
hasta y valor próximo a 7. A partir de aquí se valora de 0.1 en 0.1 ml hasta anotar los
valores inmediatamente inferior y superior de 7. Se anota el volumen y se continúa
valorando igual hasta ph 8,1

Cálculos.

Los valores de referencia Tintos finos: De 4,50 a 5,50 Blancos finos: De 5,50 a 7. Se puede
calcular como una titulación ácido-base, tomado como ácido el tartárico. También se puede
aplicar la siguiente fórmula si se utilizan 10 ml de muestra M1 de Na(OH) gastados de 0,1 N x
0,0075 x 100=Gr de ácido Tartárico % Expresar la acidez total en gramos de deido tartárico por
litro (PM tartárico = 150)

Bibliografía:

https://www.google.com/url?
sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=&cad=rja&uact=8&ved=2ahUKEwjo7Pz_3u7-
AhWks5UCHVxkCFwQFnoECAkQAw&url=https%3A%2F%2Fwww.assal.gov.ar%2Fassa
%2Fdocumentacion%2F230acidez-total.pdf&usg=AOvVaw0Gv992djRhjHIUM5dwmvF9

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sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=&cad=rja&uact=8&ved=2ahUKEwjo7Pz_3u7-
AhWks5UCHVxkCFwQFnoECCMQAQ&url=https%3A%2F%2Feprints.ucm.es
%2F29446%2F9%2FPIMCD%2520N%25C2%25BA%2520243.%2520ANEXO
%25203.%2520%2520PR%25C3%2581CTICAS%2520DE%2520AN%25C3%2581LISIS
%2520DE%2520VINOS.pdf&usg=AOvVaw1W-F1yRmsKuHYEc-ZyIuem

Extracto seco.
El extracto seco del vino es el peso del residuo fijo obtenido después de la evaporación
de las sustancias volátiles, a presión atmosférica y a temperatura de ebullición del agua.
El vino está compuesto por agua, ácidos fijos y volátiles, polifenoles, sustancias
nitrogenadas, sustancias aromáticas, azúcares, enzimas, minerales, sustancias pépticas,
gomas, mucílagos y alcoholes. El extracto está constituido por sustancias no volátiles:
azúcares, glicerina, ácidos fijos, polifenoles, minerales, sustancias nitrogenadas. Algunas
de estas sustancias sufren transformaciones durante la determinación del extracto seco
por la acción del calor:

a) Los azúcares se caramelizan dando compuestos menos pesados

b) El ácido láctico, la glicerina y el 2-3- butanodiol se volatilizan parcialmente

69
 c) El ácido tartárico y el málico se esterifican internamente.

El método utilizado es el Método Oficial Argentino- El valor normal de extracto seco libre
de azúcares reductores es diferente en los distintos tipos de vinos

Valores normales de extracto seco libre de azúcares reductores:

● Tipo de vino Extracto seco (g L-1)

● Vino blanco 15 a 18
● Vino rosado 18 a 22
● Vino tinto 22 a 25

El valor del extracto seco puede alterarse por el agregado ilícito de alcohol o agua al
vino, así también como por otras prácticas lícitas, tales como el proceso de añejamiento.
Algunos procesos como la oxidación de la materia colorante o polifenoles, la
fermentación de azúcares residuales y ciertas enfermedades, modifican también los
valores de extracto seco.

Cuando se quiere comparar los extractos de diferentes vinos, se trabaja con el extracto
seco libre de azúcares reductores: para ello se determina el extracto seco, y en la misma
muestra se determina el contenido de azúcares reductores, también en g L-1. Luego por
diferencia se obtiene el valor de extracto seco libre de azúcares reductores.

Materiales.

● Pipeta doble aforo de 10 mL

● Cristalizador de vidrio modelo oficial: fondo perfectamente plano, 6,2 a 6,5 cm de
diámetro, 1,8 a 2 cm de alto y 1 a 1,5 mm de espesor
● Balanza analítica
● Baño maría
● Estufa de agua hirviente o estufa Moislinger-Borgman
● Desecador

Método.

Colocar 10 mL de vino, medidos con pipeta de doble aforo en un cristalizador de vidrio

modelo oficial, previamente tarado (P1: tara del cristalizador). Anotar el número del
cristalizador y llevarlo al Baño María (BM) en ebullición, durante 80 minutos. Debe
cuidarse que el BM esté bien nivelado. Llevar luego a la estufa de agua hirviente o estufa
Moslinger-Borgman, durante 30 minutos si el extracto es inferior a 60 g L-1. Cuando el
extracto es superior a 60 g L-1, deberá estar en estufa durante 60 minutos, como es en el
caso de un mosto o un vino dulce.

Llevar a desecador hasta que se enfríe y luego pesar colocando el cristalizador invertido,
para que los compuestos higroscópicos (tales como la glicerina y los azúcares)
incorporen la menor cantidad de agua posible. Registrar el peso del cristalizador con el
extracto seco, identificado como P2.

70
Cálculo de los resultados.

Extracto seco (g L-1) = (P2 - P1) x 100

P1: tara del cristalizador

P2: peso de cristalizador con el extracto seco

Extracto seco libre de azúcares reductores (g L-1) = Extracto seco (g L-1) - Azúcares
reductores (g L-1)

Bibliografía:

https://www.google.com/url?
sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=&cad=rja&uact=8&ved=2ahUKEwjSo8Pp4O7
-AhW0p5UCHeXIAjEQFnoECBEQAQ&url=https%3A%2F%2Fcore.ac.uk
%2Fdownload%2Fpdf
%2F335289779.pdf&usg=AOvVaw2NJf7GwFR0XpLAMSSsLsdx

Cenizas.
La uva contiene una gran cantidad de sustancias minerales provenientes del suelo,
pudiendo citarse P, S, K, Na, Mg, Si, Fe, Mn. En menor proporción están F, Cl, Br, I, Al,
B, Ti, Rb y Mo. Las sustancias minerales se localizan principalmente en las partes
sólidas de la uva: película, pepitas y las paredes celulósicas-pécticas de las células de la
pulpa. El contenido mineral del mosto puede variar durante el proceso de vinificación.
Algunas de las sustancias disminuyen por formación de sales insolubles, otras aumentan
su contenido por disolución durante la maceración. Debido a tratamientos durante la
elaboración y conservación pueden aumentar la concentración de elementos particulares
y aun incorporarse elementos extraños. Se llama cenizas del vino al residuo de
calcinación a 500-550º C del extracto seco, libre de todo residuo carbonoso. Los
constituyentes minerales primarios son: cloruros, sulfatos y fosfatos de potasio, sodio,
magnesio y calcio. Durante la calcinación, las sales de los ácidos orgánicos son
transformadas en carbonatos y los iones se agrupan de maneras diversas, dando sales
que no existían antes en el vino. El peso de las cenizas varía generalmente entre 1,5 y
3,0 g L-1. Existe una relación bastante constante de aproximadamente 1/10, entre el
peso de las cenizas y el del extracto seco libre de azúcares reductores.

71
Para esta determinación se utiliza el Método Oficial Argentino, el cual se lleva a cabo por
calcinación de la materia orgánica. La muestra se coloca en una cápsula de porcelana y
se calienta en Baño María. De esta forma, se evita la descomposición brusca de la
materia orgánica, que provocaría proyecciones y como consecuencia pérdidas. Esta
precaución debe tenerse especialmente en cuenta cuando se trabaja con vinos dulces.
Luego la muestra es llevada al mechero y posteriormente a una mufla a una temperatura
entre 500 y 550º C. Se recuerda que la temperatura no debe superar los 550º C pues
habría pérdidas de cloruros y carbonatos, que se convierten en óxidos. Además, un
calentamiento mayor provoca la fusión de las cenizas y los carbonatos alcalinos fundidos
atacarán las cápsulas, utilizando las. El calentamiento es preciso realizarlo en un
ambiente oxidante para prevenir la volatilización de los cloruros, reducción de los sulfatos
y fusión de los carbonatos alcalinos alrededor de las partículas de carbón. Normalmente
las cenizas son blancas o grisáceas. Si son verdes y viran al rojo con los ácidos indica
gran cantidad de magnesio. Si son amarillas, el contenido de hierro es elevado.

Materiales.

● Pipeta doble aforo de 20 mL

● Cápsula de porcelana
● Baño maría
● Mechero, con tela de amianto y triángulo de pipa
● Mufla
● Desecador
● Balanza de precisión

Método.

Colocar 20 mL de vino, medidos con pipeta de doble aforo, en una cápsula de porcelana
previamente tarada (P1). Llevar al Baño María hasta obtener una consistencia siruposa
(de jarabe). Llevar al mechero con tela de amianto y luego con triángulo de pipa, hasta
lograr la carbonización. Pasar a mufla a una temperatura de 525º C (rojo sombra) para
su calcinación. Una vez desaparecido completamente el carbón, retirar la cápsula de la
mufla. La temperatura de la mufla, debe ser controlada para que la misma no supere los
550º C. Llevar la cápsula al desecador, para su enfriamiento. Pesar en balanza de
precisión y registrar peso de cápsula con cenizas (P2).

Cálculo de resultados.

Cenizas del vino (g L-1) = : (P2 - P1) x 1000 / 20

P1: Tara de cápsula (g)

P2: Peso de la cápsula con ceniza (g)

72
Bibliografía.

https://www.google.com/url?
sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=&cad=rja&uact=8&ved=2ahUKEwjSo8Pp4O7-
AhW0p5UCHeXIAjEQFnoECBEQAQ&url=https%3A%2F%2Fcore.ac.uk%2Fdownload%2Fpdf
%2F335289779.pdf&usg=AOvVaw2NJf7GwFR0XpLAMSSsLsdx

Alcalinidad de cenizas.
La alcalinidad de las cenizas trata de la suma de los cationes de amonio que se
encuentran mezclados en los ácidos orgánicos del vino.

Fundamento del método.

Valoración por retroceso de las cenizas solubilizadas en caliente por exceso de ácido
valorado.

Reactivos.

1. Solución de ácido sulfúrico 0.05 M.

2. Solución hidróxido sódico 0.1 M.

3. Solución de naranja de metilo al 0.1% en agua destilada.

4. Baño de agua a una temperatura igual a 100 ºC.

Proceso.

Se añade a la cápsula que ya contiene las cenizas, 10 ml de ácido sulfúrico. Luego se

coloca en agua a 100 ºC durante 15 minutos. Se añade de 2 a 3 gotas de naranja de
metilo y se valora el exceso de ácido sulfúrico con una solución 0.1 M de hidróxido de
sodio hasta que el indicador adopte una tonalidad amarilla.

Cálculo.

Alcalinidad de las cenizas = meqv/l

A = 5 (10n)n igual al número de milímetros de hidróxido sódico.

Bibliografía:

https://www.infoagro.com/viticultura/vino/analisis_vinos2.htm

Otros lugares donde buscamos información para completar la anterior:

73
 https://www.google.com/url?
sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=&ved=2ahUKEwjRherw0-7-
AhVippUCHdHvC9MQFnoECDcQAQ&url=https%3A%2F%2Fe-natura.unsa.edu.ar
%2Fmoodle%2Fpluginfile.php%2F157215%2Fmod_folder%2Fcontent
%2F0%2FCapitulo%252013-17.pdf%3Fforcedownload
%3D1&usg=AOvVaw2nBpIJRoaOM0NfiawTtrZ8

https://www.academia.edu/26762370/
DETERMINACION_DE_CENIZAS_EN_BEBIDAS_ALCOHOLICA

Determinación de acidez volátil.

Introducción.
La acidez volátil está formada por los ácidos grasos de la serie acética que se encuentran
en el vino, básicamente son los ácidos: acético, fórmico, propiónico y butírico. Se excluyen
de la acidez volátil los ácidos láctico y succínico, como así también el anhídrido carbónico,
el ácido carbónico y el anhídrido sulfuroso (ácido sulfuroso).

En todo vino sano se encuentra acidez volátil, ya que los ácidos volátiles que la forman son
productos secundarios de la fermentación alcohólica. Durante el transcurso de la
fermentación maloláctica también se genera acidez volátil. Pero como todas las
enfermedades bacterianas producen ácidos volátiles, su valoración tiene valor de
diagnóstico del estado del vino. Las bacterias acéticas son aerobias, de modo que cuando
una vasija no se mantiene completamente llena de vino (vasija merma), se dan condiciones
favorables a las bacterias para desarrollarse y producir incrementos de acidez volátil. En
vinos sanos encontramos tenores de 0,20 a 0,40 g L-1 expresado en ácido acético. Estos
tenores normales contribuyen en su forma natural al perfume del vino. El límite legal en
Argentina para que un vino pueda salir al consumo (análisis de libre circulación) es de 1 g L-
1. Los mostos no tienen acidez volátil, excepto aquellos provenientes de uvas enfermas con
podredumbre ácida.

Procedimiento.

74
Se emplea el principio de la destilación por arrastre de vapor, comúnmente utilizada para la
extracción de aceites
esenciales. La extracción
funciona gracias a que,
cuando el vapor entra en
contacto con el material
vegetal, hace que los
compuestos aromáticos se
vaporicen y sean arrastrados
junto con el vapor hasta el
condensador, donde se
condensan junto con el vapor
de agua. En este caso no
nos interesa aprovechar el
destilado, sino titularlo para
conocer su concentración. Le
realizamos unos cambios al
método Duclaux, armando el
equipo de la siguiente manera:

Tomar 50 ml del vino y volcar en el burbujeador. Destilar regulando el anafe de modo tal
que la operación dure unos cuarenta minutos (al variar el tiempo, varían las proporciones de
los ácidos que pasan). La operación termina cuando se han destilado 40ml. Trasvasar
cuantitativamente el destilado a un Erlenmeyer de 250ml y calentar sobre tela de amianto
hasta emisión de vapores blancos (aproximadamente 60º C), para la eliminación de CO2. El
calentamiento es sólo recomendable en vinos nuevos con grandes cantidades de CO2. En
vinos de más de un año de elaborado es recomendable evitar el calentamiento, ya que no
mejora la precisión del método y se corre el riesgo de excederse y eliminar también ácidos
volátiles. Dejar enfriar y titular con NaOH N/10 en presencia de fenolftaleína, como
indicador, hasta leve color rosado persistente. Registrar el gasto de NaOH N/10 (primera
titulación).

Resultados:

Las tres titulaciones realizadas obtuvieron el mismo gasto de hidróxido: 0,2 ml

Observaciones: en la primera destilación cometimos el error de colocar el vino en el balón

donde debería ir el agua que desplaza a los ácidos volátiles.

Cálculo para la determinación de acidez volátil (se expresa en g/ml de ácido tartárico):
0,049x(Vg/Vm)x 1000

0,049: factor de las relaciones estequiométricas del tartárico y el hidróxido sódico.

Vg: volumen gastado de NaOH 0,098N (0,2 ml)

Vm: volumen de la muestra (10 ml)

1000: factor equivalente de ml a l

75
Acidez volátil: 0,049x(0,2 ml/10 ml)x 1000

Acidez volátil: 0,98 g/ml de ác. tartárico.

Determinacion de Acido Malico

Introducción.
Como componente del ciclo del ácido cítrico, el ácido L-málico (L-malato) se encuentra en
todos los organismos vivos. Su determinación cuantitativa es especialmente importante en
la elaboración del vino, cerveza, pan, fruta y productos vegetales, así como en productos de
cosmética y farmacéuticos. Es uno de los ácidos más importantes de la fruta, y tiene la
concentración más alta de todos los ácidos en el vino. En la industria vinícola, el nivel de
ácido L-málico se supervisa, junto con el ácido L-láctico, durante la fermentación malo-
láctica. El ácido L-málico tiene muchas aplicaciones como conservante alimentario.

Principio.
La detección del ácido L-málico requiere dos reacciones enzimáticas. En la primera
reacción catalizada por L-malato deshidrogenasa (L-MDH), el ácido L-málico se oxida en
oxaloacetato por la nicotinamida adenina dinucleotido (NAD+).

Sin embargo, dado que el equilibrio de la reacción cae en favor del ácido L-málico y NAD+,
se requiere una reacción adicional para “atrapar” el NADH, lo cual se consigue convirtiendo
el oxaloacetato en Laspartato y 2-oxoglutarato, en presencia de un exceso de L-glutamato,
por glutamato-oxaloacetato transaminasa (GOT).

La cantidad de NADH que se forma en la doble reacción anterior es estequiométrica con la

cantidad de ácido L-málico. Lo que se mide es el NADH, por el aumento de la capacidad de
absorción a 340 nm.

76
 Fundamento de la espectrofotometría.

En la espectrofotometría se aprovecha la absorción de radiación electromagnética en la

zona del ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la radiación
incidente en este espectro y promueve la transición del analito hacia un estado excitado,
transmitiendo un haz de menor energía radiante. En esta técnica se mide la cantidad de luz
absorbida como función de la longitud de onda utilizada. La absorción de las radiaciones
ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es
característica de cada sustancia química. Esta medición también puede usarse para medir
la cantidad de un producto químico conocido en una sustancia.

Reactivos utilizados:

● NAD.

● Extracto de corazón (GOT).

● Buffer de pH 10.

● Buffer Tris-Clorhídrico.

● MDH.

Preparación de reactivos:

Preparación de Buffer pH 10:

Pesar 4,0 g de NaOH en un matraz Erlenmeyer. Con una pipeta volumétrica medir 20 ml de
agua y agregar en el matraz Erlenmeyer e ir agitando para una mejor disolución. Pesar 0,88
g de ácido L-Glutámico en un vaso de precipitado. Agregar un poco de la solución de
hidróxido de sodio hasta formar una pasta, simultáneamente ir agitando con una varilla de
vidrio. Esto debido a que el glutámico es insoluble en agua. Pesar 4,75 g de glicilglicina en
un vidrio de reloj. En el vaso de precipitado con glutámico trasvasar la glicilglicina con la
espátula e ir agregando agua al vidrio de reloj para terminar de traspasar restos del
compuesto. Agregar 50ml de agua destilada. Ajustar a pH 10 con la solución de hidróxido
de sodio. Aproximadamente utilizamos 13 ml. de NaOH. Una vez ajustado a pH 10 llevar en
un matraz Erlenmeyer o aforado y cerrar con un tapón.

Preparación de Buffer Tris-Clorhídrico:

Pesar 0,6 g de tris(hidroximetil)amino metano en un matraz Erlenmeyer Agregar 40 ml de

agua y 50 ml de glicerina al 87% al matraz. Medir 7 ml de agua destilada en un tubo de
ensayo, agregar 3 ml de ácido clorhídrico en el tubo. Regular a pH entre 7,5 a 8 (lo ideal
7,8) agregando de a gotas la solución HCL 10 M al matraz Erlenmeyer con tris. Poner un
tapón a la solución para su conservación.

77
 Preparación de GOT:

Se traen un pedazo de miocardio (músculo del corazón) cortado recientemente porque o si

no se pierde la enzima por contacto con el aire. En el miocardio están presentes los
cardiomiocitos que son las células productoras de GOT. Se cortan en trozos más pequeños
del músculo y se licua el miocardio luego de que se haya dejado reposar por al menos 3
minutos hasta que quede una pasta, posterior a eso se centrífuga la mezcla por 10 minutos
velocidad. Se extrae con una pipeta la parte líquida y la parte sólida se desecha, se deja en
un matraz Erlenmeyer y agrega el 87 % de glicerina, se almacena en refrigeración hasta la
hora de uso. Nota: Antes de utilizar dejar atemperar al ambiente.

Preparación de MDH L-malato deshidrogenasa:

Se pesan 0,025 g de MDH, agregar la pesada en un tubo de ensayo y adicionar al tubo de

ensayo 1 ml del Buffer 7, 8.

Preparación de NAD Nicotinamida Adenina Dinucleótido:

se pesan 0, 11 g de NAD, agregar en un tubo de ensayo, adicionar 4 ml. de agua al tubo de

ensayo

Técnica operatorio método de espectrofotometría

1. Se prepara un baño maría a 30°C para dejar reposar las muestras en una
temperatura fisiológica.

2. Se enciende el espectrofotómetro y con las funciones básicas se lo setea en

método por absorbancia con una longitud de onda de 340 nm. Se lo deja realizar las
labores de calibración. Se le agrega una cubeta con agua desmineralizada para
llevar al equipo a 0 de absorbancia.

3. Preparar una solución de ácido málico estándar, en nuestro caso ya estaba

preparada, por ende, usamos málico 0,005% para esta determinación además de 3
tubos de ensayos con diferentes muestras para poder comparar con las siguientes
cantidades;

78
 1. Con cada una de las adicciones hay que agitar un poco para que los reactivos se
mezclan, así hasta llegar a la adición de la muestra de, vino o málico sea el caso
necesario en la cual una vez después de la adición se dejará reaccionar por 3
minutos en el baño maría.

2. Cuando pasen esos 3 minutos automáticamente vamos a tener que medir la

absorbancia sin dejar que pase tiempo, una vez medida luego de los tres minutos se
procede a añadir la solución de MDH en un volumen de 0,04 ml y se lo deja en el
baño maría nuevamente hasta pasen 7 minutos y realizar la siguiente medición

Resultados de las tres primeras pruebas

Debido a problemas con el reactivo NAD no se pudieron realizar las pruebas.

Determinación de antocianos.
¿Qué son los antocianos?

Las antocianinas son sustancias presentes en las pieles de las uvas y que, además de
aportar el color característico del vino tinto, son responsables de importantes beneficios
para la salud. Se trata de pigmentos hidrosolubles que se hallan en las vacuolas de las
células vegetales y que otorgan color rojo, púrpura o azul a hojas, flores y frutos.

Desde el punto de vista químico, las antocianinas pertenecen al grupo de los flavonoides y
son glucósidos de las antocianidinas, es decir, están unidas a moléculas de azúcar por
medio de un enlace glucosídico. Sus funciones en las plantas son múltiples, desde la de
protección de la radiación ultravioleta hasta la de atracción de insectos polinizadores.

En viticultura, se refiere a un grupo de pigmentos rojos, morados o púrpura que se forman

en la piel de la uva tinta y pertenecen, como hemos visto, a los flavonoides, una clase de
polifenoles que son solubles en el agua.

Sus precursores consecutivos en orden descendente de complejidad son: antocianinas (que

no contienen azúcares y que en variedades tintas son la malvidina —mayoritaria—,
cianidina, peonidina, delfinidina y petunidina), proantocianidinas (taninos condensados o
fiarnos), y finalmente, en el origen, monómeros de catequina. Estos pigmentos se generan
durante el 'envero' en los hollejos de las uvas para protegerlas de la radiación solar, la
oxidación y la degeneración celular.

Técnica para determinar antocianos totales:

Método colorimétrico:

Se basa en la transformación de las leucoantocianinas en cianidina, con variación del color

hacia el rojo, en medio ácido y caliente. Ya que esta reacción viene interferida por los
azúcares presentes en el vino, se siguen métodos por separado para los vinos secos y para
vinos dulces.

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 Materiales utilizados:

● Pipetas volumétricas de 10ml y 20ml

● Pipetas de 2ml, 5ml y 10ml
● Propipetas de 2ml, 5ml y 25 ml
● Vasos de precipitados de 50ml y 100ml
● Matraz erlenmeyer de 100ml y 250ml
● Matraz aforado de 100ml
● Micropipeta
● Espectrofotómetro de luz visible
● Cubetas para el espectrofotómetro
● Papel de cocina

reactivos:

Solución de Etanol-Clorhídrico (95 volúmenes de etanol de 96% y 5 volúmenes de HCl

concentrado)

Solución n-Butanol y Clorhídrico (60 volúmenes de n-Butanol y 40 volúmenes de HCl

concentrado. A 100 ml de la mezcla anterior se le añade 30 mg de sulfato ferroso)

Técnica operatoria:

1. Se diluye el vino con la mezcla etanol clorhídrico, según la variedad, la dilución será
entre 50 y 200 veces. El Cabernet y Merlot, se diluyen 100 veces.
2. En un matraz de 100 mL con tapón esmerilado, se introducen 5.00 mL del vino
diluido y 15 mL de la mezcla de butanol,clorhidrato y sulfato ferroso.
3. Se coloca el matraz, provisto de un refrigerante de reflujo, en un baño maría
hirviente y se mantiene la ebullición durante 40 minutos.
4. Se enfría rápidamente al chorro del agua.
5. Como solución de referencia se emplea una solución igual a la obtenida en 2), pero
mantenida a la temperatura ambiente
6. En una cubeta de 10 mm de paso de luz, se lee la absorbancia en la longitud de
onda de 550 nm.

Cálculos:

La cantidad de leucoantocianinas se calcula por la siguiente fórmula:

C=A X 208 X F en mg/L

En donde:

C es la concentración de leucoantocianinas

80
 A es la absorbancia con respecto al ensayo en frío.

F es el factor de dilución.

Procedimiento que seguimos:

En una primera medida, tomamos como factor de dilución 1 en 50 para el vino con el HCl.

La solución de n-Butanol con HCl y sulfato ferroso ya se encontraba preparada, pero

descubrimos que por la inestabilidad que tiene el ferroso para oxidarse a férrico, la solución
ya preparada no nos servía para la determinación, así que tuvimos que preparar una
nuevamente.

El ferroso empleado para esa nueva solución no estaba en óptimas condiciones, ya que
tenía un aspecto de que se había oxidado y pasado a férrico, pero lo utilizamos igual y
quedó pendiente un ensayo de regeneración de férrico a ferroso.

A la hora de hacer el baño maría no colocamos el refrigerante reflujo ya que era muy poca
la solución a hidrolizar y no lo encontramos necesario, solo colocamos la solución en un
vaso de precipitados e hicimos el baño maría con otro vaso de precipitados con agua
hirviendo y tapamos el vaso menor con un vidrio reloj.

Luego procedimos con la medida de absorbancias:

Medidas del vino de 6to:

Muestra Hidrolizada: 0,890abs

Muestra s/Hidrolizar : 0,214abs

Abs final= 0,676

C= ABS X 208 X F mg/L

C= 0,676 x 208 x 50 mg/l

C= 7.030,4 mg/l

Medidas vino 5to:

Muestra hidrolizada: 0,620abs

Muestra s/hidrolizar= 0,214

Abs final= 0,474

81
 C= ABS X 208 X F mg/L

C= 0,474 x 208 x 50 mg/l

C= 4.929,6 mg/l

Medidas del vino comercial que utilizamos como referencia:

Muestra hidrolizada: 0,762abs

Muestra s/hidrolizar= 0,137abs

Abs final= 0,625

C= ABS X 208 X F mg/L

C=0,625 x 208 x 50 mg/l

C= 6.500mg/l

Conclusiones finales:

No podemos determinar con exactitud la diferencia de concentraciones de antocianinas ya

que las tres muestras fueron realizadas en tiempos distintos, la del vino de 6to se realizó un
miércoles a la mañana, la de 5to un miércoles al mediodía y la del vino comercial al otro día.
Tendríamos que haber trabajado las 3 muestras separadas pero en un mismo baño maría y
con las temperaturas iguales a las que fueron expuestos.

observaciones: es recomendable trabajar siempre debajo de la campana, tener mucho

cuidado a la hora de preparar la solución de n-Butilo con Ácido Clorhídrico ya que
desprende muchos vapores y levanta temperatura, más que nada a la hora de agitar la
solución para diluir el sulfato ferroso agregado.

Cromatografía en papel.
Ácidos orgánicos por cromatografía de papel.

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 Las propiedades ácidas de los vinos son el resultado de los ácidos orgánicos que
contienen. Estos son elementos constitutivos esenciales de los vinos e influyen en su
calidad, y eventualmente en sus defectos. De su naturaleza y concentración dependen los
equilibrios ácido/base de los vinos, y por consiguiente su gusto ácido. Los ácidos orgánicos
que se han identificado en la uva son: tartárico, málico, cítrico, glucurónico, ascórbico,
oxálico, glicólico, fumárico, shikímico. En uvas
alteradas por podredumbres pueden aparecer
además los ácidos múcico, glucónico, ceto-2-
glucónico y diceto-2-5-glucónico. No todos estos
ácidos se encuentran presentes en el vino,
algunos desaparecen durante la vinificación y otros
aparecen procedentes de la fermentación, como
succínico, láctico, citra málico y dimetil-glicérico.

El ácido tartárico es el más abundante en la uva y

en el vino es el ácido más fuerte y más disociado,
es decir el que aumenta más la concentración de
iones hidrógeno. El pH del vino depende entonces,
en gran parte, de su contenido en ácido tartárico.
De los tres ácidos principales (tartárico, málico y
cítrico) es el más resistente a la descomposición bacteriana. Su concentración disminuye
por la precipitación de bitartrato de potasio al aumentar el alcohol en la fermentación, y
también por la acción del frío. También precipita como trato neutro de calcio, aunque este
proceso es más lento. Su agregado a la vendimia y al mosto está permitido y resulta útil
cuando la acidez de la uva es demasiado débil. En concentraciones demasiado elevadas le
confiere al vino dureza, además de cierta astringencia.

El ácido málico es un ácido orgánico que abunda en el reino vegetal y es el principal en

muchas frutas. Durante la maduración de la uva su concentración disminuye por respiración
celular. Por esto su determinación puede ser importante para establecer el grado de
madurez. Su concentración es más alta en uvas de zonas frías. Su contenido influye en la
calidad del vino y cuando está presente en alta concentración contribuye al sabor herbáceo.
La fermentación maloláctica hace disminuir progresivamente el tenor de ácido málico,
llevándolo hasta casi cero en los vinos tintos. La desacidificación resultante de la
fermentación maloláctica, torna a los vinos jóvenes más suaves.

Materiales.

● Papel para cromatografía Whatman N 1

● Pipetas de 2ml, 5ml y 10ml
● Propipetas de 2ml, 5ml y 25 ml
● Vasos de precipitados de vidrio
● Recipiente más grande para tapar los vasos
● Matraz aforado
● Matraz erlenmeyer
● Ventilador

83
● Tip

Reactivos.

● Solvente revelador para cromatografía en papel

● Solución testigo de ácido tartárico
● Solución testigo de ácido málico
● Solución testigo de ácido láctico

Preparación de reactivos.

Solvente revelador:

Preparar butanol al azul de bromofenol. Para esto disolver 0,5 g de azul de

bromofenol p.a. en 500 mL de alcohol butílico normal.

Preparar ácido acético al 50%, para lo cual se mezcla 250 mL de ácido acético para
análisis con 250 mL de agua destilada.

Mezclar en un vaso de precipitados 40 mL de butanol al azul de bromofenol y 20 mL

de ácido acético al 50%.

Solución testigo de ácido tartárico:

Pesar 300 mg de ácido tartárico. Trasvasar en forma cuantitativa a un vaso de

precipitación y disolverlo con una pequeña cantidad de agua destilada agitando con
varilla de vidrio. Luego trasvasar este líquido en forma cuantitativa a un matraz de
250 mL (volcando al matraz los dos o tres enjuagues del vaso) y enrasar con agua
destilada.

Solución testigo de ácido málico: Pesar 300 mg de ácido málico. Trasvasar en forma
cuantitativa a un vaso de precipitación y agregar 38 mL de alcohol 95% v/v. Agitar
con varilla de vidrio para permitir la disolución. Luego trasvasar este líquido en forma
cuantitativa a un matraz de 250 mL (volcando al matraz los dos o tres enjuagues del
vaso) y enrasar con agua destilada.

Solución testigo de ácido láctico: Medir 2 mL de ácido láctico. Agregarlo a un matraz

aforado de 100 mL. Llevar a volumen y enrasar el matraz con agua destilada

84
 Método.

Cortar el papel para cromatografía Whatman Nº 1 en forma de rectángulo (18 x 20 cm). El

ancho del papel cortado debe ser inferior a la altura de la cámara cromatográfica( en este
caso usaremos como cara un vaso de precipitados con el recipiente para taparlo) , y la
longitud 10 cm inferior aproximadamente a la circunferencia de la misma. Marcar una línea
con lápiz de grafito (no usar tinta) a 4 - 5 cm del borde inferior del papel. Esta línea servirá
para depositar las gotas de vino y las de las soluciones testigo, separadas
aproximadamente entre sí unos 3 cm. Depositar en cada punto el mismo volumen de líquido
de vino, como también de cada solución testigo (0,01-0,03 mL), con pipeta de punta curva.
Secar rápidamente esta mancha con aire frío, proveniente de un ventilador colocado a una
distancia de 1 metro y en su potencia mínima.

Colocar solvente revelador en el recipiente o cubeta cromatográfica, tal que permita

humedecer el borde inferior del papel. Enrollar el papel en forma de cilindro, abrochar y
colocar en la cubeta pescando sobre el solvente, con la precaución que los bordes del papel
no estén en contacto entre sí. Cerrar la cubeta para que el líquido ascienda por capilaridad.
Esperar 3 ó 4 horas, hasta que el solvente haya llegado a 2 - 3 cm del borde superior.,

Retirar el papel de la cubeta y secar el papel en ambiente aireado y seco, al abrigo de

vapores ácidos (una campana de vidrio con extractor de aire puede ser de gran utilidad).
Esperar tres o cuatro horas, hasta que el papel pase del amarillo al verde; después al azul,
apareciendo manchas amarillas sobre el fondo azul. Estas manchas corresponden a los
ácidos orgánicos. Una vez seco, se interpretan los resultados observando la posición de las
manchas amarillas sobre el fondo azul .La identificación de los ácidos se hace por
comparación con las manchas de los testigos de los ácidos tartárico, málico, láctico.

Interpretación de los resultados:

En el papel para cromatografía los ácidos se separan netamente en el siguiente orden: en la

parte inferior el ácido tartárico (cerca de la mancha inicial), luego aproximadamente en la
parte media el ácido málico y en la parte superior el ácido láctico, esta técnica es sólo
cualitativa.

Nuestro procedimiento:

¿Partimos de la complicación de no tener a nuestra disposición el papel whatman 1 y

tuvimos que trabajar con un Whatman 101?

85
Tampoco contábamos con el largo específico para el desarrollo de las manchas de los
ácidos, ni del ancho necesario, asique tuvimos que trabajar con tres papeles en simultáneo,
con muestras testigos de los ácidos en cada papel y de vino y observamos el siguiente
desarrollo:

Vino/ Ácido Láctico vino/ Ácido tartárico Vino/ Acido Málico

Este papel necesito aproximadamente 5 horas de estar sumergido en la solución reveladora

y lo dejamos más de 12 hs revelándose.

Otro método empleado:

También trabajamos con cromatografía por capa fina, a la espera de obtener mejores
resultados que con la cromatografía en papel, pero llegamos a la conclusión de que no es
tanta la diferencia observable.

vino / Acido tartarico.

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 Observaciones finales:

tener máxima precaución y limpieza a la hora de trabajar con el azul de bromofenol ya que
es propenso a dejar manchas en todos los objetos con el que lo pongas en contacto, y
siempre antes de colocar parte de la solución reveladora en el vaso de precipitados
cerciorarse de que esté 100% seco.

Evolución de pH

Bibliografía:

file:///C:/Users/PC/Downloads/335289779.pdf

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