VARIACIONES BACTERIANAS ASOCIADAS A CAMBIOS EN EL GENOTIPO

  Los diversos cambios morfológicos, estructurales y funcionales ocurridos a lo largo

de la evolución de los seres vivos tienen como base los cambios en los genotipos, que
esencialmente pueden ser de dos tipos:
mutaciones. A pesar de que el mecanismo de la herencia genética es fiel y tiende a
la conservación, esta fidelidad no es absoluta e inflexible. Las mutaciones son
cambios bruscos ocurridos en el genotipo, y que son transmitidos a las
generaciones siguientes.
recombinaciones subsiguientes a intercambio genético. En la mayoría de los
eucariotas, pueden ocurrir recombinaciones entre genotipos individuales de una
misma población. En los fenómenos de sexualidad se origina una variedad casi
infinita de nuevas ordenaciones o genotipos, sin necesidad del aporte de nuevas
mutaciones. Ello suministra una materia prima sobre la que puede actuar la
selección, de modo que las poblaciones pueden ir evolucionando con el paso del
tiempo, en función de presiones ambientales.
¿Qué ocurre en bacterias?
Los procariotas son organismos con tiempos cortos de generación: se reproducen
rápidamente y pueden dar origen en poco tiempo a grandes poblaciones. Por
supuesto, experimentan fenómenos de mutación, por lo que las poblaciones pueden
acumular gran número de mutaciones. Estudiaremos la mutación (y los modos
posibles de su eliminación) en el presente capítulo.
Pero la mutación no es el único tipo de variación genotípica en bacterias. Aunque
los procariotas carecen de fenómenos de sexualidad auténtica, existen variaciones
genéticas asociadas a la adquisición por una bacteria de parte del material
genético de otra bacteria o de un bacteriófago. Los posibles mecanismos de
transferencia de información genética entre bacterias son:
transformación (que estudiaremos en el capítulo 17);
conjugación (ver capítulo 18);
transducción (ver capítulo 19).
Los fenómenos de recombinación genética asociados a la transferencia serán
abordados en la primera parte del capítulo 17.
1     INTRODUCCIÓN A LAS VARIACIONES HEREDITARIAS NO ASOCIADAS A
TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO
Definiciones básicas:
            Desde un mero punto de vista fenotípico, mutación es la aparición brusca y
espontánea de una variación fenotípica de un individuo, la cual se transmite
hereditariamente a la progenie.
            Pero tras el descubrimiento del ADN como material de la herencia, podemos
plasmar una definición más ajustada, desde el punto de vista
genotípico:  Mutación es cualquier alteración de la secuencia de bases de un
segmento de ADN correspondiente a un gen o a un locus (sea éste transcribible o no),
aun cuando esta alteración no se refleje en forma de cambio fenotípico observable o
detectable.
 Alelo es cada una de las distintas versiones en que puede presentarse un gen.
  alelo silvestre: “forma” (secuencia) de un gen en las bacterias aisladas de su
hábitat natural (estirpes silvestres). En la naturaleza es muy frecuente la
existencia de polimorfismo:existen diversos alelos silvestres diferentes para
un mismo locus.
alelos mutantes: las distintas “formas” (secuencias) que resultan de mutaciones
del alelo silvestre.
Una pareja de conceptos que también conviene incluir aquí es la diferenciación entre
mutaciones espontáneas y mutaciones inducidas:
Mutaciones espontáneas: son resultado de la actividad normal de la célula, o de
sus interacciones con su medio natural. La mayoría aparecen por errores en los
procesos de replicación, reparación o recombinación del ADN. (O sea, para
 abreviar, serían aquellas mutaciones no provocadas de forma experimental).
Mutaciones inducidas: aquellas provocadas por previa alteración experimental del
ADN, bien sea directamente, o indirectamente, por agentes físicos o químicos
denominados mutágenos.
2          MUTACIONES ESPONTÁNEAS.
Los principales tipos son:
1)      Mutaciones puntuales: sustituciones de pares de bases. Pueden ser:
a)      transiciones: suponen cambio de una pareja Pu:Py à Pu:Py;
b)      transversiones: cambio de una pareja Pu:Py à Py:Pu.
2)      Mutaciones por desplazamiento de la pauta (=fase o marco) de
lectura [“frameshift”]. Se deben a:
a)      eliminación de uno o un corto número de nucleótidos;
b)      incorporación de uno o un corto número de nucleótidos.
3)      Grandes delecciones (o borraduras)
4)      Inversiones
5)      Traslocaciones
6)      Duplicaciones en tándem
7)      Mutaciones insercionales ocasionadas por elementos genéticos
transponibles.
Los estudiaremos a continuación, comentando algo sobre su base molecular.
2.1        MUTACIONES PUNTUALES
            Las transiciones suponen cambios de una pareja purina: pirimida a otra
purina:pirimidina:
A:T ßà G:C
Las transversiones suponen el cambio de un par purina:pirimidina a una
pirimida:purina (o viceversa):
A:T ßà T:A
G:C ßà C:G
2.1.1        BASE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES PUNTUALES
2.1.1.1       Base molecular de las transiciones
            Se deben, en esencia, a la ocurrencia espontánea, durante la replicación, de
formas raras tautoméricas de las bases nitrogenadas. Los desplazamientos
tautoméricos del protón cambian las propiedades de formación de puentes de H, de tal
modo que:
forma tautomérica Se comporta como
A* (imino) G
G* (enol) A
C* (imino) T
T* (enol) C
Por lo tanto, los emparejamientos propiciados por las formas tautoméricas serían:
A* : C
C* : A
T* : G
G* : T
2.1.1.2       Base molecular de las transversiones
(Modelo de Topal & Fresco:observen en el gráfico los emparejamientos de las
formas sin y anti)
El modelo predice que la frecuencia de mutaciones puntuales en un par de bases
dependerá de:
constante de equilibrio (k) de tautomerización del par de bases (unos 10-4 - 10-5);
frecuencia de dNTPs en forma sin. (G sin aparece con frec. de 10-1, A , con 5·10-2).
De este modo, teóricamente deberían darse las siguientes frecuencias de mutaciones
puntuales:
frec. prevista de transiciones: 10-4 - 10-5
 frec. prevista de transversiones: 10-5 - 10-6 (para la G) y 5·10-6 - 5·10-7 (para la A)
            Sin embargo, en la realidad, las frecuencias observadas son mucho más
bajas (del orden de 10-10). Esto implica que debe de existir un sistema que corrija los
emparejamientos erróneos: como ya sabemos, las ADN polimerasas poseen
una capacidad correctora de pruebas (“editing”): cada paso de elongación es
seguido inmediatamente por una comprobación del emparejamiento. Si este
emparejamiento es erróneo, la polimerasa usa su actividad exonucleasa 3'à5' para
elimininar la base mal emparejada, y a continuación vuelve a polimerizar en el mismo
lugar (por su actividad polimerasa 5'à3').
Ejemplo: Durante la replicación puede ocurrir que la citosina pase a su forma imino,
que se empareja con la adenina:
1)      C à Cimino : A (la A es incorporada por la ADN polimerasa)
2)      Ahora la Cimino vuelve rápidamente a su forma normal, con lo que queda…
3)      C : A (este emparejamiento anómalo es detectado por la polimerasa)
4)      La actividad exonucleasa 3'à5' elimina la A recién incorporada
5)      Vuelve a intervenir la actividad polimerasa 5'à3', que incorpora G
6)      El resultado final es el emparejamiento correcto C à G
             De esta forma, la tasa real de transiciones a partir de una C es
aproximadamente equivalente al cuadrado de la correspondiente cte. (k) de
tautomerización.
            Parece ser que en la naturaleza existe una selección natural que propicia
una frecuencia baja, pero no nula, de errores durante la replicación. El significado
biológico es que de esta forma se combina una alta tasa de fidelidad en la replicación,
pero con suficiente flexibilidad (oportunidad de errores) como para generar
innovaciones sobre las que pueda actuar la presión selectiva, lo cual permite
evolución.
Puntos calientes de mutación (“hot-spots”): son puntos o zonas dentro del genomio
donde se concentran mutaciones con una frecuencia mayor que la esperada si se
distribuyeran al azar.
Ejemplo: en el gen lacI hay una zona especialmente “caliente” cerca de la base
200, donde la probabilidad de encontrar mutaciones es muy superior a la del
resto de la secuencia de ADN de ese gen.
Explicación: algunas bases, dentro de un determinado contexto de secuencia,
son modificadas químicamente por acción de alguna enzima (normalmente una
metilasa), y ello provoca una mayor susceptibilidad a la aparición de
mutaciones puntuales:
La citosina (C), dentro del contexto de secuencia siguiente:
C C A G G
G G T C C
es metilada por una metilasa específica (que reconoce precisamente a esas dos
citosinas dentro de esa secuencia), para dar 5-metilcitosina. La 5-metil citosina
experimenta espontáneamente una desaminación oxidativa, que la convierte en timina,
de manera que se produce finalmente una transición: C:G à 5-metil-C:G à T:G
(emparejamiento anómalo)àT:A
2.1.2        CONSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIÓN PUNTUAL
Si la mutación afecta a una región en 5' que actúa en cis:
Determinadas mutaciones puntuales en el promotor impiden que la ARN
polimerasa se una a esta secuencia; entonces el promotor queda inactivado y no se
produce la expresión de los genes del operón.
En otros casos los efectos son diferentes. Por ejemplo: se recordará que el promotor
del operón lac tiene una secuencia -10 atípica, que obliga a que la expresión a alto
nivel requiera el concurso de la proteína CAP activa. Pues bien, por medio de
mutaciones puntuales se puede lograr que esa secuencia atípica adquiera las
características de las secuencias -10 típicas (a base de TATA, o similar). En este
caso, el efecto de estas mutaciones es que el operón lac se vuelve independiente
 de la proteína CAP para su expresión eficiente: el operón se hará independiente de
la represión catabólica.
En los operones sometidos a control negativo, determinadas mutaciones en el
operador provocan una menor afinidad de la proteína reguladora (del represor). El
efecto es el de crear una expresión constitutiva (es decir, el operón se expresa
incluso en presencia del represor activo, debido a que éste no reconoce al operador
mutante).
Si la mutación afecta a una zona codificadora: se produce la alteración de un
codón. Las consecuencias de la alteración pueden ser muy variadas:
1)      Si la nueva tripleta (codón) codifica el mismo aa. que la antigua (debido a la
sinonimia o “degeneración” del código genético, que afecta sobre todo a la tercera
base del codón) se origina una mutación neutra, que es “silenciosa” (no hay
ningún cambio en el fenotipo).
2)      Si la nueva tripleta codifica un aa. diferente del original, tenemos varias
posibilidades:
a)      mutaciones de sentido erróneo o alterado (“missense”):
i)        si el nuevo aa. es de un tipo químico similar al antiguo, puede cumplir
una función semejante en la proteína mutante, por lo que el fenotipo sería
también una mutación silenciosa por sustitución de aa.
ii)       En otros casos el nuevo aa. provoca una inestabilidad estructural, que
puede reflejarse en que la proteína sea termosensible o criosensible, o más
susceptible a efectores alostéricos. La proteína termosensible es funcional
a temperaturas moderadas, pero se inactiva a temperaturas relativamente
altas, a las cuales la correspondiente proteína silvestre es activa. La
proteína criosensible es funcional a temperaturas moderadas, pero se
inactiva a temperaturas relativamente bajas, a las cuales la proteína
silvestre es activa. La proteína más susceptible a efectores alostéricos es
aquella que se inhibe por efectores de forma más acusada. En esta
categoría entran también las proteínas con actividad residual.
iii)     Por otro lado, podemos encontrar proteínas que pierden su actividad
biológica debido a que la sustitución del aa. provoca la alteración de la
estructura secundaria y terciaria de la proteína: por ejemplo, la aparición
por mutación de una prolina en mitad de una a-hélice destruye esta
estructura, y puede originar inactivación de la función.
iv)     La alteración del centro activo suele provocar inactivación total o
parcial. NOTA: Aquí se plantea la siguiente pregunta: si la mutación inactiva
totalmente la capacidad funcional de la proteína, ¿cómo podemos
reconocer que esa proteína alterada está presente en la célula? La proteína
se puede identificar por medio de anticuerpos (Ac) obtenidos frente a la
proteína silvestre. Si ponemos en contacto estos Ac con un extracto de las
células mutantes, se producirá una reacción antígeno-anticuerpo. Las
proteínas inactivas caracterizadas de esta manera se suelen denominar
como “CRM” iniciales de “cross-reactive material” (material que da reacción
cruzada respecto de la proteína silvestre).
b)      mutaciones “sin sentido” (“nonsense”), o sea, aquellas que cambian un
codón original a una de las tres tripletas que significan “señal de parada” de la
traducción:UAG (codón “ámbar”), UAA (codón “ocre”), UGA (codón “ópalo”).
Obviamente, el efecto de estas mutaciones sin sentido es producir la detención
de la lectura del ARNm por parte de los ribosomas. Por lo tanto se produce
una proteína truncada, que suele ser inactiva.
           Si la mutación sin sentido se produce en un gen de un operón policistrónico, y si
esa mutación cae cerca de una zona del ARNm capaz de formar estructuras
secundarias en horquilla, aparte del efecto de mutación sobre el gen afectado, se
detectará un fenómeno de polaridad, debido a que el acoplamiento transcripción-
traducción provoca la no transcripción de la región situada más allá (en sentido 3') de
la zona de la horquilla. O sea, no habrá transcripción de los genes distales del operón.
2.2      MUTACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA FASE (=DEL MARCO O
PAUTA) DE LECTURA [“FRAMESHIFTS”]
            Se pueden originar por pérdida o ganancia de un pequeño nº de nucleótidos
(que no sea 3 o múltiplo de 3)
Base molecular: Suelen ocurrir en zonas del ADN con secuencias repetitivas. En este
tipo de secuencias, durante la replicación o la recombinación, se pueden
producir malos alineamientos por desplazamiento de una o varias copias de la
secuencia repetitiva.
Ejemplo:
G T C C G T C C G T C C G T C C
C A G G C A G G C A G G C A C C
Se produce un cambio total en el sentido del mensaje genético, a partir del sitio de
la mutación se sintetiza una proteína inactiva, a menudo truncada (debido a que al
cambiar la pauta de lectura, pueden aparecer tripletas sin sentido).
Si la pérdida es de 3 nucleótidos (o múltiplo de 3), y la pequeña delección no afecta a
una zona importante de la proteína, se puede producir un producto que aún tenga
actividad biológica.
2.3        GRANDES DELECCIONES (O BORRADURAS)
Suponen la eliminación de cientos e incluso miles de nucleótidos.
Base molecular: Formación de grandes bucles intracatenarios, con posterior
escisión de dichos bucles. Normalmente en los extremos del material que se va a
delecionar existen secuencias de ADN que son repeticiones directas una de otra, lo
que facilita algún fenómeno de recombinación que lleva a la eliminación del material
(bucle) intercalado entre esas secuencias.
Consecuencias: Mutación irreversible e inactivadora total de uno o varios genes.
2.4        INVERSIONES
Cambio de orientación de un segmento de ADN. En muchos casos se deben a
emparejamiento y ulterir recombinación entre secuencias inversamente repetidas en
los extremos del material que sufre la inversión.
Consecuencias: En muchos casos no hay consecuencias fenotípicas, ya que
simplemente se ha invertido el orden de los genes del segmento invertido en relación
al resto del genoma.[1]A diferencia de las deleciones, las inversiones suelen
revertir, precisamente por un nuevo proceso de recombinación entre las secuencias
inversamente repetidas.
2.5        TRANSLOCACIONES
Traslado de un segmento a otro lugar del genomio.
2.6        DUPLICACIONES EN TÁNDEM
            Se trata de la aparición de una copia de una zona de ADN a continuación de la
localización del original. Suelen deberse al emparejamiento y recombinación entre
secuencias similares en dos moléculas de ADN (en realidad, en este evento, de las
dos moléculas de ADN, una se queda con una duplicación mientras que la otra se
queda con una delección).
            Si el segmento duplicado es grande y lleva varios genes, no suele conducir a
inactivación génica (ya que aunque en la juntura de la duplicación puede haber una
mezcla de dos genes truncados, sigue habiendo copias silvestres de dichos genes en
el mutante).
            Una de las propiedades más características de las duplicaciones en tándem es
su inestabilidad, ya que revierten con gran frecuencia por nueva recombinación dentro
del segmento duplicado.
            A pesar de esto, las duplicaciones parecen haber jugado un papel importante
en la evolución. Tras una duplicación que se haya estabilizado, hay dos copias de uno
o varios genes, de modo que una de las copias de cada pareja puede lentamente ir
evolucionando e incluso adquirir una nueva función.
2.7        MUTACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS GENÉTICOS
TRANSPONIBLES
            La inserción de una secuencia de inserción (IS) o de un transposón (Tn) en de
un gen origina la inactivación insercional, debida a:
desplazamientos de la pauta de lectura, que como antes indicamos, generan
frecuentes señales de fin de traducción;
terminación de transcripción dependiente de Rho, con efectos polares (debido a que
las IS llevan frecuentes señales de terminación compleja de la transcripción,
dependiente de r).
           Una vez que ha ocurrido una inserción de una IS o de un Tn, pueden producirse
ulteriores delecciones secundarias de todo o de parte del elemento transponible, y a
veces también delecciones del material genético adyacente (fenómenos de escisión
imprecisa del IS o Tn).
            Por otro lado, dadas dos secuencias IS del mismo tipo, situadas a cierta
distancia una de la otra, por fenómenos de recombinación propiciados por dichas IS se
pueden producir:
inversiones del material intercalado entre ambias copias del IS;
translocaciones del material intercalado entre esas secuencias de inserción.
2.8        REPASO DE CONCEPTOS ÚTILES EN EL TRABAJO CON MUTANTES
BACTERIANOS
            Repasemos algunos conceptos y términos que son igualmente de uso común
en muchos estudios de genética:
            Dependiendo de que la mutación genética se manifieste o no a nivel fenotípico,
y según el grado de afectación fenotípica, podemos clasificar las mutaciones de la
siguiente manera:
mutaciones silenciosas (o neutras), si no hay efecto fenotípico;
mutaciones que implican alteración del fenotipo silvestre:
letales: si ocasionan la muerte o pérdida de viabilidad del microorganismo;
condicionalmente letales: si bajo determinadas condiciones el mutante pierde la
viabilidad, pero bajo otras la mantiene.
mutaciones de alteración fenotípica que suponen la pérdida o la merma de
alguna función que no sea esencial para la viabilidad del organismo. Dentro de
ellos están los mutantes condicionales (su fenotipo alterado se manifiesta en
determinadas circunstancias).
            Las mutaciones condicionales (incluidas las condicionalmente letales) son muy
útiles para estudiar aquellos genes esenciales para la bacteria. En estos mutantes hay
que distinguir dos tipos de condiciones:
condiciones restrictivas (también llamadas no-permisivas): son aquellas
condiciones ambientales bajo las cuales el mutante pierde la viabilidad, o su
fenotipo se ve alterado, debido a que el producto afectado por la mutación pierde su
actividad biológica.
condiciones permisivas: son aquellas bajo las cuales el producto del gen mutado
es aún funcional.
Algunos ejemplos de mutantes condicionales muy empleados en genética:
mutantes sensibles al calor (termosensibles). Se suelen denominar con las siglas ts.
El producto del gen mutado es más sensible al calor que el producto silvestre
mutantes de biosíntesis sensible al calor;
mutantes sensibles al frío (criosensibles)
mutantes sensibles a efectores alostéricos
mutantes suprimibles por supresores extragénicos (por ejemplo, por ARNt
supresores, mutantes);
mutantes dependientes de estreptomicina;
mutantes estabilizados osmóticamente (sólo son estables en altas concentraciones
de sales).
            En principio, y “por definición”, es imposible obtener mutantes letales estrictos
de genes esenciales para la viabilidad de la bacteria (p. ej., en genes de la ADN-
polimerasa, ARN-polimerasa, ADN-ligasa, etc.), pero sí es posible conseguir mutantes
condicionalmente letales, especialmente los termosensibles. Por ejemplo, si tras un
tratamiento mutagénico sembramos células de Escherichia coli en placas y las
cultivamos a 30ºC, y luego hacemos réplicas en placas que se incuban a 42ºC, las
colonias “ausentes” en estas últimas nos señalan correspondientes colonias de la
placa matriz candidatas a mutantes termosensibles.
            Otro tipo de mutantes condicionales muy empleados en bacterias son aquellos
con mutaciones sin sentido. Como se recordará, cuando el ribosoma llega al codón sin
sentido, se detiene la traducción ulterior. Sin embargo, si esa bacteria tiene
simultáneamente una segunda mutación de tipo supresor extragénico, a saber, un
ARNt mutante adecuado, se puede restablecer el fenotipo silvestre (al menos
parcialmente).
3        CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES
            Para caracterizar genéticamente una mutación (es decir, para conocer qué tipo
de mutación es) se recurre normalmente a pruebas de reversión de cada mutante.
Las mutaciones puntuales pueden revertir o ser suprimidas por una 2ª mutación (ver
más adelante, en este mismo capítulo).
Igual ocurre con algunas mutaciones de desfase de la pauta de lectura.[2]
Las inserciones sólo pueden revertir por una delección exacta del material insertado.
Las delecciones no pueden revertir.
Por otro lado, las mutaciones generadas por elementos genéticos transponibles no
aumentan su frecuencia por tratamiento con agentes mutagénicos, mientras que el
resto sí lo hacen.
4          TASA DE MUTACIÓN
            En una población bacteriana se define la tasa de mutación (T) para un
determinado fenotipo como la probabilidad de que una célula mute a ese fenotipo en
un determinado intervalo de tiempo. Luria y Delbrück (1943) escogieron como intervalo
de tiempo unitario el correspondiente a un ciclo celular (o sea, a una generación), que
es el tiempo necesario para completar una ronda de división celular. Por lo tanto:
T = m / d, donde m es el nº de mutaciones surgidas en un tiempo t, y d es el nº de
divisiones ocurridas en ese tiempo t.
 Si expresamos d en función del número de células: T= m / (N-N0)
NOTA 1: La tasa T de mutación espontánea es constante para cada división celular a
distintas tasas de crecimiento
En la expresión anterior hay que introducir un factor de corrección, ya que en el
momento de determinar el número de células (N), las bacterias se encuentran en
distintas etapas del siguiente ciclo celular, de modo que el promedio real de divisiones
es mayor que N en un factor equivalente a 1/ln 2. Resulta, entonces:
T= m·ln2 /(N-N0) = 0,69·m / (N-N0)
A pesar de lo sencillo de esta fórmula, el cálculo en la práctica de la tasa de mutación
no es tan fácil como ésta parece dar a entender. Ello se debe a que el
parámetro m mide el número de eventos de mutación en un lapso de tiempo, que no
equivale al número de bacterias mutantes medidas. Por lo tanto, y a pesar de lo fácil
que suele ser cuantificar el número de mutantes, en el experimento, en ese cantidad
medida se incluyen los descendientes de eventos más o menos antiguos de mutación
a lo largo de ese experimento. Para calcular m hay que recurrir a ciertos métodos
estadísticos.
Por ejemplo, se puede combinar un experimento de tipo de Luria y Delbrück con la
distribución de Poisson. Imaginemos que sembramos 20 tubos independientes con la
misma cantidad inicial de bacterias sensibles a la estreptomicina e incubamos el
mismo tiempo en las mismas condiciones, de modo que la N-N 0 sea 5.6X108;
imaginemos que en esa prueba de las fluctuaciones en 11 de los 20 tubos no han
surgido mutantes resistentes al antibiótico. De acuerdo con la aproximación de
Poisson a la distribución normal, la probabilidad de tener cero (0) mutaciones en un
cultivo sería:
P0 = m0·e-m/0!
Aplicando esto a nuestro ejemplo:
P0 = 11/20 = 1·e-m/1
Y por lo tanto, podemos despejar y resolver el valor de m = -ln11/20 = 0.59. Ahora
podemos calcular la tasa de mutación:
T = 0.6·0.59/5.6X108 = 7.3·10-9
NOTA 2: Obsérvese que hemos definido la tasa de mutación respecto de
un fenotipo. Esto significa que aquellos fenotipos que dependan de varios genes
tendrán tasas de mutación superiores a las de aquellos que dependan de un solo gen.
Por ejemplo, la tasa de mutación hacia auxotrofía para la histidina o el triptófano (cuya
biosíntesis depende de varios genes) está en torno a 10-7, mientras que la tasa de
mutación a resistencia a estreptomicina (que, como se recordará, depende de la
alteración del gen de la proteína ribosómica S12) es de sólo 10-10 o 10-11.
5          REVERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS
            Las variaciones fenotípicas producidas por las mutaciones no-silenciosas son
transmisibles a la descendencia. Es decir, una vez producido el cambio, éste
es permanente, pero no necesariamente irreversible (como ya dijimos, solamente
las grandes delecciones son irreversibles).
            La reversibilidad de las mutaciones suele deberse a una segunda mutación
que restaura el fenotipo original. Esta 2ª mutación puede ser de dos tipos principales, y
varios subtipos:
1)      Reversión (en sentido estricto), que restaura el genotipo original. Esto
equivale a una retromutación (“back-mutation”).
2)      Supresión: la 2ª mutación suprime los efectos de la 1ª pero no restaura el
genotipo original. Por lo tanto, tras la mutación supresora, la célula queda con
dos mutaciones. La supresión se clasifica a su vez en:
a)      Supresión indirecta: no se corrige el producto del primer gen, pero la 2ª
mutación anula las consecuencias fenotípicas. Ejemplos:
i)        Se abre una nueva vía para la síntesis del producto afectado por la 1ª
mutación.
ii)       El producto mutado de la 2ª mutación puede sustituir al producto de la
primera.
iii)     Se provoca un cambio en el medio intracelular, que hace que el producto
alterado de la primera mutación vuelva a ser funcional.
b)      Supresión directa: la 2ª mutación corrige el producto del primer gen
mutado. Puede ser de dos tipos principales:
i)        Supresión intragénica: la 2ª mutación ocurre en el mismo gen donde
ocurrió la primera.
ii)       Supresión intergénica (= extragénica): la mutación supresora afecta a
otro gen, que suele ser uno de los genes implicados en la maquinaria
de traducción del ARNm: ARNt y proteínas ribosómicas.
5.1        BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS
INTRAGÉNICAS
1.      Introducción de un desfase de signo opuesto al de la primera
mutación à restauración de la pauta de lectura alterada por una previa mutación de
desfase de lectura (“frameshift”). La única zona alterada tras la mutación supresora
sería la que queda entre ella y la 1ª mutación. Si esta zona es corta y no es
esencial para la actividad biológica, se puede restablecer el fenotipo primitivo.
2.      Supresiones en el mismo codón que quedó afectado por la 1ª mutación, de
modo que se codifica un aminoácido distinto del silvestre y distinto del aa. del
primer mutante, pero que restaura la funcionalidad de la proteína. A este tipo de
supresión se la denomina también pseudorreversión.
3.      Mutación puntual compensatoria en un sitio distante respecto de la primera
mutación: la 2ª mutación compensa a la 1ª, de modo que se restaura la estructura
tridimensional y/o el centro activo de la proteína.
5.2        BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS
INTERGÉNICAS
1)      Por ARNt mutantes (= ARNt supresores)
a)      supresores de mutaciones que introducen codones de parada de
lectura (o sea, de codones “sin sentido, nonsense”): son ARNt mutados
en el anticodón, de modo que este anticodón mutado puede emparejarse con
alguno de los tres tipos de codones “sin sentido”, insertando ahora los aa.
correspondientes que transportan; por lo tanto, impiden la terminación
prematura de la traducción. Ejemplos: El codón sin sentido UAG (“ámbar”)
puede ser suprimido por versiones mutantes (supresoras) de los siguientes
ARNt:
Tipo de ARNt supresor Normalmente reconoce
ARNtSer UCG
Gln
ARNt    CAG
ARNtTyr   UC
ARNtLys AAG
(La letra sombreada indica la base que cambia en la mutación supresora).
b)      El codón sin sentido UAA (“ocre”) puede ser suprimido por una versión
mutante de ARNtGly à GAA
c)      Existen supresores más raros que suprimen mutaciones de sentido
erróneo (“missense”): Ejemplo: El ARNtGly cuyo anticodón es UCC, por
mutación se convierte en un ARNt supresor cuyo anticodón es UCU, que
entonces reconoce al codón AGA (de la Arg). Por lo tanto, este supresor
inserta Gly frente a cada codón AGA.
d)      supresores de desfases de lectura de +1 nucleótido: son ARNt mutantes
que tienen un anticodón con 4 nucleótidos, en lugar de los 3
habituales.Ejemplo: Existe un ARNtPheque tiene un anticodón que reconoce la
secuencia UUUC.
2)      Por proteínas ribosómicas mutantes: Los ribosomas derivados de la alteración
por mutación de determinadas proteínas adquieren zonas de conformación
cambiada, de modo que reconocen tripletas de forma errónea. Al introducir
aminoácidos cambiados en codones que a su vez proceden de mutaciones,
pueden restaurar la funcionalidad de algunas proteínas mutantes.Ejemplos:
a)      mutaciones ram, que afectan a las proteínas S4 y S5 de la subunidad 30S
del ribosoma, de modo que éste puede suprimir una gran variedad de
mutaciones sin sentido y por desfases. (El nombre de ram corresponde a las
iniciales de ribosomas ambiguos).
b)      Mutaciones StrR: tienen afectada la proteína S12 del ribosoma. Hacen que
las mutaciones sin sentido sean menos defectuosas (“leaky” = débiles).
5.3        EFICACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS POR ARNt MUTANTES
            Cada supresor tiene una eficacia característica de supresión, que se refleja
en la proporción de cadenas polipeptídicas mutantes que son terminadas de forma
normal (en lugar de quedarse truncadas). Esta eficacia depende, esencialmente de:
la concentración del ARNt supresor en la célula;
afinidad del ARNt supresor hacia la aminoacil-ARNt-sintetasa;
afinidad del aa-ARNt por el ribosoma, en competencia con los factores de
terminación de traducción que reconocen el mismo codón “sin sentido” (de parada
de lectura).
           La mutación supresora, por sí misma disminuye la velocidad de
crecimiento de la bacteria, debido a que, aparte de su capacidad supresora, introduce
errores de lectura en los ARNm normales.
            Los supresores han de ser, por fuerza, poco eficientes, como para no hacer
que la célula muera por introducción de demasiados errores en la lectura de los ARNm
normales (es decir, la mayor parte de las veces, los supresores introducen el
aminoácido correcto). Pero por otro lado, han de ser suficientemente
eficicientes como para poder introducir aminoácidos en codones mutantes con la
frecuencia adecuada para suprimir la mutación primaria. Normalmente, los supresores
típicos suprimen 5-10% de las veces. Es decir, la mayoría de las veces se introduce el
aa. correcto frente al codón correcto.
6          AGENTES MUTAGÉNICOS E INDUCCIÓN DE MUTACIONES
            Anteriormente comentamos que el medio ambiente no induce mutaciones
concretas (p. ej., el antibiótico no provoca la aparición de los mutantes resistentes).
Ahora bien, lo que sí pueden hacer determinadas condiciones ambientales es elevar
la tasa global de aparición de mutaciones.
            Determinados agentes ambientales físicos o químicos pueden dañar el ADN o
interferir con la maquinaria replicativa, de modo que provocan una mayor frecuencia
de aparición de mutaciones (y en este sentido hablamos de “mutaciones inducidas”).
A dichos agentes se les llama mutágenos o agentes mutagénicos. Así pues, en
última instancia, los mutágenos causan alguna alteración en el ADN que
bien no puede ser reparada convenientemente,
o bien es un daño tan extenso que sobrepasa la capacidad de los mecanismos
celulares normales de reparación (consultar en el tema 13 el apartado sobre
“Mecanismos de Reparación de los daños al ADN”).
6.1        AGENTES FÍSICOS
6.1.1        RADIACIÓN UV
            Es el mutágeno físico más empleado en el laboratorio para obtener mutaciones
en las bacterias. Como ya estudiamos en su momento, su efecto principal es originar
dímeros de pirimidina intracatenarios (con creación de una anillo ciclobutano entre dos
Py consecutivas). Las proporciones de lesiones son las siguientes:
50% T-T
40% T-C
10% C-C
           Las mutaciones aparecen principalmente como consecuencia del mecanismo
posreplicativo de reparación propenso a error (o sea, el sistema SOS). Con menor
frecuencia la luz UV ocasiona hidratación de la C, lo que da origen a transiciones.
6.1.2        RAYOS X Y RADIACIONES IONIZANTES
            Tienen mayor poder de penetración que los rayos UV, pero son de difícil
manejo, por lo que se emplean poco en bacterias. Los rayos X ocasionan daños
reparables por el sistema SOS.
             Las radiaciones ionizantes (p. ej., rayos g) provocan labilizaciones en el ADN,
que terminan en roturas en las hebras del ADN (por ataque al enlace fosfodiéster), que
finalmente pueden conducir a delecciones.
6.2        AGENTES QUÍMICOS
Se pueden agrupar en varias categorías:
1)      Análogos de bases, que se incorporan durante la replicación del ADN.
2)      Agentes hidroxilantes o desaminantes de las bases nitrogenadas.
3)      Agentes alquilantes.
4)      Agentes intercalantes, que se introducen en la doble hélice del ADN, entre pares
de bases consecutivas.
5)      Bloqueadores del emparejamiento de las bases.
6.2.1        ANÁLOGOS DE BASES
            Son sustancias con una estructura en anillo similar a las bases naturales de los
ácidos nucleicos, pero con propiedades químicas diferentes. Como ejemplos tenemos:
5-bromouracilo (5-BrU)
2-aminopurina (2AP).
            Estas moléculas entran a las células y son convertidas a los correspondientes
“dNTP”, de modo que su estructura les permite ser incorporados durante la replicación
del ADN.
1) El 5-BrU es análogo de la T. Propicia transiciones T:A àG:C debido a que
experimenta frecuentes cambios tautoméricos desde su forma ceto a su forma enol:
BUceto:AàBUenol:G
Si partimos de una pareja A=T y en la 1ª ronda de replicación la ADN-polimerasa
introducen un BUceto frente a la adenina, los acontecimientos hasta llegar a la mutación
se pueden resumir así:
A:T à (la primera replicación incorpora BU) àA:BUceto à(tautomerización y 2ª
replicación)  à G:BUenol à (3ª replicación) à G:C
2) La 2-AP es un análogo de la A. Provoca transiciones A:Tà C:G debido a sus
frecuentes tautomerizaciones (APamino à APimino). Veamos el proceso:
A:T à (primera replicación) à APamino:T à (tautemerización y 2ª
replicación) à APimino:C à (3ª replicación) à G:C
6.2.2        AGENTES DESAMINANTES O HIDROXILANTES
Alteran las Pu o las Py, de modo que:
causan errores en el emparejamiento, o bien
labilizan las bases, de modo que éstas espontáneamente se modifican
químicamente con gran frecuencia.
1) Ácido nitroso: provoca una desaminación oxidativa de A y C, lo que
origina transiciones
sobre C à dU, que se empareja con la A.
sobre A (6-aminopurina) à hipoxantina (HX) (6-oxopurina), que en su forma ceto se
empareja con la citosina: A:T à HXceto:C à G:C
El nitroso también desamina oxidativamente a la G, pero en este caso no hay
mutación: G à xantina, que al igual que la G, se empareja con la C.
 
2) Hidroxilamina (NH2OH): actúa específicamente sobre la citosina, añadiéndole un
hidroxilo a su grupo -NH2.
6.2.3        AGENTES ALQUILANTES
            Introducen radicales alquílicos en una cadena (los alquilantes
monofuncionales) o en las dos cadenas (los bifuncionales) del ADN, produciendo
efectos letales y mutagénicos.
Los efectos letales fueron estudiados en el capítulo 19 (“Acción de los agentes
químicos”).
Los efectos mutagénicos dependen sobre todo de la reacción con el O6 de la G.
Algunos agentes alquilantes empleados en laboratorio:
gas mostaza: mostazas nitrogenadas y sulfuradas, como por ejemplo:
Cl-CH2-CH2-S-CH2-CH2-Cl : di-(2-cloroetil)-sulfuro.
etil-etano-sulfonato (EES): CH3-CH2-SO2-O-CH2-CH3
etil-metano-sulfonato (EMS): CH3-SO2-O-CH2-CH3
nitrosoguanidina (NTG), que es la N-metil, N'-nitro, N-nitrosoguanidina.
          Todos estos agentes, excepto la NTG, actúan tanto in vivo como in vitro. La
NTG sólo actúa in vivo, ya que su efecto lo ejerce sobre la horquilla de replicación del
ADN. La NTG es uno de los mutágenos más potentes que se conocen, pero es un
agente “sucio”, en el sentido de que genera varias mutaciones en la misma célula.
Induce reparación SOS propensa a error, dando origen a transiciones, transversiones
y desfases del marco original del lectura.
           Como hemos dicho, estos agentes originan un daño premutagénico principal
consistente en alquilación del O6 de la G. Ello provoca una gran distorsión en la
doble hélice, que posteriormente se plasma en transiciones del tipo G:C à A:T.
            Sin embargo, muchas bacterias poseen un sistema específico para reparar
las lesiones de  la O6-alquil-guanina, que funciona de la siguiente manera:
1)      La bacteria posee una O6-alquil-glucosilasa, que rompe el enlace N-glucosídico
entre la O6-alquil-guanina y la desoxirribosa. Esto provoca la creación de un sitio
apurínico (sitio AP).
2)      El sitio AP es reconocido por una endonucleasa correctora (apurinasa), que
rompe el enlace fosfodiéster del lado 5' del sitio apurínico.
3)      Se produce una reparación por escisión-resíntesis de un pequeño nº de
nucleótidos, pero si el daño es muy grande se produce una situación SOS que
tiende a ser reparada por el sistema propenso a error ya estudiado, lo que
provoca introducción de errores, que conducen a transiciones y transversiones.
6.2.4        SUSTANCIAS INTERCALANTES
            Se introducen entre los pares de bases del ADN, dando origen a pérdida o
ganancia de nucleótidos (o sea, generan mutaciones de cambio de la pauta de
lectura del mensaje genético). Estas sustancias son moléculas planares con 3 o 4
anillos conjugados, que presentan un cierto parecido con los pares de bases del ADN,
pero no se pueden incorporar covalentemente al esqueleto de éste, sino que se
intercalan entre dos pares de bases consecutivas, con lo que provocan distorsiones de
la doble hélice.
Algunos ejemplos:
derivados de la acridina, como el naranja de acridina
bromuro de etidio (ver nota[3])
derivados de la flavina (como la proflavina).
            Estabilizan emparejamientos erróneos durante la replicación y la
recombinación del ADN, dando origen a desplazamientos de la pauta de lectura.
Aplicaciones: Algunos se están ensayando en cuanto a su capacidad de inhibir
tumores cancerígenos, o como antivirásicos, o contra el protozoo causante de la
malaria.
6.2.5        AGENTES QUE BLOQUEAN TOTALMENTE EL EMPAREJAMIENTO DE
BASES
Este grupo incluye potentes carcinógenos como:
benzo-a-pireno
aflatoxina-B1
            Modifican purinas, provocando grandes lesiones en el ADN, que inducen el
sistema SOS de reparación, lo que finalmente implica reparación propensa a error. Las
aflatoxinas son unas micotoxinas (producidas por hongos, como Aspergillus).
8        ALGUNOS MUTANTES BACTERIANOS EMPLEADOS EN LABORATORIO
8.1        TIPOS Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS EN LABORATORIO
8.1.1        MUTACIONES QUE AFECTAN A RASGOS MORFOLÓGICOS DE LAS
COLONIAS:
            Los rasgos culturales de las bacterias son muy fáciles de ver en los cultivos en
placas de Petri, por lo que igualmente es fácil detectar cambios en los aspectos de las
colonias que pudieran deberse a mutaciones. Antes de nada, vamos a describir
brevemente tres tipos de colonias que pueden darse en una misma especie:
colonias S (lisas): son circulares, de borde liso o continuo; convexas obtusas
(plano-convexas); superficie lisa y brillante; se dispersan fácilmente en agua, dando
suspensiones homogéneas.
colonias M (mucosas): son parecidas a las S, pero son convexas más agudas;
textura mucosa (al cogerlas con asa de siembra, se arrastra un “moco”).
colonias R (rugosas): a menudo presentan un borde ondulado o festoneado; son
planas; textura rugosa, y aspecto mate (no brillante); no se dispersan bien en agua,
dando grumos más o menos gruesos.
            Pues bien, en muchas especies bacterianas se pueden estudiar fenómenos
de disociación de tipos de colonias en cultivos, debido a mutaciones que alteran
moléculas de las envueltas (p. ej., de la membrana externa de las bacterias Gram-
negativas, de la cápsula, etc.). Veamos algunos ejemplos:
 En algunas bacterias se puede observar una disociación M à S, que se suele deber
a la pérdida de la capacidad de sintetizar cápsula.
En algunas bacterias Gram-positivas la disociación S à R se debe a pérdida de la
cápsula.
En bacterias Gram-negativas, las disociación S à R se debe a menudo a la pérdida
de la capacidad de sintetizar las cadenas laterales polisacarídicas del LPS (antígeno
somático “O”).
 
           Muchas de estas disociaciones tienen bastante interés clínico, ya que en
bacterias patógenas, el fenotipo mutado (sobre todo el rugoso) implica la pérdida de
propiedades de virulencia y de especificidad antigénica.
8.1.3        MUTANTES RESISTENTES A DROGAS Y A FAGOS
            Los mutantes resistentes a antibióticos surgen por varios tipos de mecanismos,
entre los que se encuentran:
alteración de algún gen que codifica una diana (sitio de unión) del antibiótico;
alteración de algún gen responsable de permeabilidad al antibiótico.
Los mutantes resistentes a fagos surgen esencialmente por alteración de receptores
de la superficie celular, sobre los que se adsorben los fagos.
            Ambos tipos de mutantes son de muy amplio uso para “marcar” cepas
bacterianas en experimentos de genética (especialmente los que implican algún
proceso de transferencia de material genético desde una estirpe donadora a otra
receptora). Estos marcadores genéticos permiten seleccionar directamente la cepa
que los porte añadiendo al medio de cultivo el correspondiente agente selectivo
(antibiótico o fago), que obviamente mata o inhibe el crecimiento de las cepas
sensibles.
8.1.4        MUTANTES AFECTADOS EN EL USO DE AZÚCARES U OTRAS
FUENTES DE C Y ENERGÍA
            Estos mutantes pierden la capacidad de metabolizar determinados sustratos,
pero pueden recurrir a otros alternativos. Para aislar estos mutantes se puede recurrir
en muchos casos al uso de medios diferenciales que incorporan indicadores de pH,
que cambian de color en función del uso o no del sustrato en cuestión.
Por ejemplo: si quisiéramos aislar mutantes Lac-- de E. coli, sembraríamos en Agar
Mac Conckey. Los mutantes Lac-- dan colonias transparentes, mientras que el fenotipo
silvestre Lac+ da colonias rojas opacas con un precipitado alrededor de sales
biliares (recordar el uso de este medio en las prácticas).
9          VARIACIONES BACTERIANAS POR CURACIÓN DE PLÁSMIDOS
            Como ya sabemos, los plásmidos son material genético extracromosómico que
se replican independientemente del cromosoma (replicones autónomos), y que no son
indispensables para la viabilidad de la bacteria que los posee. Hay plásmidos crípticos
que no dan ningún fenotipo detectable (función desconocida), pero existen muchos
plásmidos que codifican funciones como resistencia a antibióticos o a metales
pesados, virulencia a plantas o animales, capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, etc.
            Como es lógico, el material genético plasmídico es susceptible de experimentar
mutaciones. Pero la posesión de plásmidos por muchas bacterias puede condicionar
otro tipo de variaciones genotípicas heredables: la curación, consistente en
la pérdida del plásmido, lo que acarrea obviamente la pérdida concomitante de las
funciones y fenotipos codificado por aquel, sin que se afecte la viabilidad de la
bacteria.
Métodos de curación de plásmidos:
Sometimiento del cultivo bacteriano a altas temperaturas (cercanas a la temperatura
máxima);
Tratamiento del cultivo con agentes químicos que se intercalan en el ADN,
interfiriendo con la replicación, estabilidad o reparto del plásmido a las células hijas
(bromuro de etido, naranja de acridina, etc.)