DISEÑO DE UNA METODOLOGÍA DE CULTIVO DE MICROALGAS PARA LA

OBTENCIÓN DE CARBOHIDRATOS, PROTEÍNAS, LÍPIDOS Y CLOROFILAS

A PARTIR DE CULTIVOS MIXOTRÓFICOS DE Chlorella vulgaris UTEX 1803.

AUTOR: IVÁN SEBASTIÁN QUINTERO RANGEL.*

C.C. 1098407574

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE INGENIERÍAS FISICOQUÍMICAS
ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA
BUCARAMANGA
2014
DISEÑO DE UNA METODOLOGÍA DE CULTIVO DE MICROALGAS PARA LA
OBTENCIÓN DE CARBOHIDRATOS, PROTEÍNAS, LÍPIDOS Y CLOROFILAS
A PARTIR DE CULTIVOS MIXOTRÓFICOS DE Chlorella vulgaris UTEX 1803.

AUTOR: IVÁN SEBASTIÁN QUINTERO RANGEL.

C.C. 1098407574

Proyecto de Jóvenes Investigadores financiado por COLCIENCIAS

TUTOR:

PH.D. VIATCHESLAV KAFAROV.

C.E. 264762

Ingeniero Químico Dr. Sc

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE INGENIERÍAS FISICOQUÍMICAS
ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA
BUCARAMANGA
2014
AGRADECIMIENTOS

El autor agradece a:

COLCIENCIAS y su programa de Jóvenes Investigadores, por darme la

oportunidad de trabajar como Joven Investigador en el laboratorio de Biomasa
perteneciente al grupo de investigación CIDES de la Universidad Industrial de
Santander.

DR. SC. VIATCHESLAV KAFAROV, por la oportunidad de trabajar en su grupo de

investigación CIDES y por su respaldo como Tutor del proyecto.

BIÓLOGO ANDRÉS BARAJAS por su orientación, comprensión y apoyo para

contribuir al buen desarrollo del presente proyecto.

La Universidad Industrial de Santander, los profesores de Biología que hicieron

parte de mi formación profesional.
 TABLA DE CONTENIDO

Pág.

1. INTRODUCCIÓN...................................................................................................... 10

2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 12

2.1. General: ........................................................................................................................... 12

2.2. Específicos: ..................................................................................................................... 12

3. DESCRIPCIÓN METODOLÓGICA ........................................................................... 13

3.1. Medio de cultivo y microalga. ....................................................................................... 13

3.2. Fotobioreactor ................................................................................................................. 14

3.3. Diseño experimental ...................................................................................................... 14

3.4. Cuantificación de metabolitos ....................................................................................... 15

3.4.1. Cuantificación de Carbohidratos Totales ............................................................ 15

3.4.2. Cuantificación de Proteínas .................................................................................. 15

3.4.3. Cuantificación de lípidos........................................................................................ 15

3.4.4. Cuantificación de Clorofilas totales...................................................................... 16

4. RESULTADOS Y ANÁLISIS ..................................................................................... 17

4.1. Caracterización de los metabolitos .............................................................................. 17

4.1.1. Carbohidratos .......................................................................................................... 17

4.1.2. Proteínas .................................................................................................................. 18

4.1.3. Clorofilas .................................................................................................................. 24

4.2. Análisis Estadístico ........................................................................................................ 27

4.2.1. Productividad de carbohidratos ................................................................................. 27

4.2.2. Productividad de Proteínas ........................................................................................ 29

 4.2.3. Productividad de Lípidos ............................................................................................ 31

4.2.4. Productividad de Clorofilas ........................................................................................ 33

5. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 35

6. RECOMENDACIONES ................................................................................................ 36

7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 37
 LISTA DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Diseño experimental de los cultivos con Acetato de Sodio de C. Vulgaris............ 14

Tabla 2. Diseño experimental de los cultivos con Carbonato de Amonio de C. Vulgaris ... 14

Tabla 3. Productividad de Carbohídratos(g/L) en función del tiempo para los 15

tratamientos cultivados con acetato de sodio. ........................................................................... 17

Tabla 4. Productividad de Carbohídratos(g/L) en función del tiempo para los 15

tratamientos cultivados con carbonato de amonio. ................................................................... 17

Tabla 5. Productividad de Proteinas (g/L) en función del tiempo para los 15 tratamientos
cultivados con Acetato de Sodio. ................................................................................................. 19

Tabla 6. Productividad de Carbohídratos(g/L) en función del tiempo para los 15

tratamientos cultivados con Carbonato de Amonio. ................................................................. 19

Tabla 7. Productividad de Lípidos (g/L) en función del tiempo para los 15 tratamientos
cultivados con Acetato de Sodio. ................................................................................................. 23

Tabla 8. Productividad de Lípidos (g/L) en función del tiempo para los 15 tratamientos
cultivados con Carbonato de Amonio. ........................................................................................ 23

Tabla 9. Productividad de Clorofilas (g/L) en función del tiempo para los 15 tratamientos
cultivados con Acetato de Sodio. ................................................................................................. 25

Tabla 10. Productividad de Clorofilas (g/L) en función del tiempo para los 15 tratamientos
cultivados con Carbonato de Amonio. ........................................................................................ 25

Tabla 11. Tratamientos que maximizan la producción de proteínas, carbohidratos lípidos y

clorofilas empleando Acetato de sodio como fuente de carbono. ......................................... 26

Tabla 12. Tratamientos que maximizan la producción de proteínas, carbohidratos lípidos y

clorofilas empleando Carbonato de amonio como fuente de carbono. ................................ 26
 LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Metodología Experimental............................................................................................ 13

Figura 4. Composición porcentual de la biomasa de C. vulgaris durante los 15 días de

cultivo con Acetato de Sodio. ....................................................................................................... 20

Figura 5 Composición porcentual de la biomasa de C. vulgaris durante los 15 días de

cultivo con Carbonato de Amonio. ............................................................................................... 20

Figura 8. Diagrama de Pareto para la producción de carbohidratos. a). cultivo con acetato
de sodio, b). Cultivo con carbonato de amonio. ........................................................................ 27

Figura 9. Superficie de respuesta para la producción de carbohidratos, Cultivo con Acetato

de sodio: a). Tiempo-Nitrato, b). Tiempo-Fosfato; Cultivo con Carbonato de Amonio: c).
Tiempo-Nitrato, d). Tiempo-Carbonato Amonio......................................................................... 28

Figura 10. Diagrama de Pareto para la producción de Proteínas. a). cultivo con acetato de
sodio, b). Cultivo con carbonato de amonio ............................................................................... 29

Figura 11. Superficie de respuesta para la producción de proteínas, Cultivo con Acetato
de sodio: a). Tiempo-acetato, b). Tiempo-Nitrato; Cultivo con Carbonato de Amonio: c).
Tiempo-Nitrato, d). Tiempo-Carbonato Amonio......................................................................... 30

Figura 12. Diagrama de Pareto para la primera extracción de proteínas. a). cultivo con
acetato de sodio, b). Cultivo con carbonato de amonio ........................................................... 31

Figura 13. Superficie de respuesta para la producción de Lípidos, Cultivo con Acetato de
sodio: a). Tiempo-Nitrato, b). Tiempo-Acetato de sodio; Cultivo con Carbonato de Amonio:
c). Tiempo-Nitrato, d). Tiempo-Carbonato Amonio ................................................................... 32

Figura 14. Diagrama de Pareto para la producción de Clorofilas. a). cultivo con Acetato de
Sodio, b). Cultivo con Carbonato de Amonio ............................................................................. 33

Figura 15. Superficie de respuesta para la producción de Clorofilas; Cultivo con Acetato
de sodio: a). Tiempo-Nitrato, b). Tiempo-Fosfato; Cultivo con Carbonato de Amonio: c).
Tiempo-Fosfato, d). Tiempo-Carbonato Amonio ....................................................................... 33
 RESUMEN

TITULO: DISEÑO DE UNA METODOLOGÍA DE CULTIVO DE MICROALGAS PARA LA

OBTENCIÓN DE CARBOHIDRATOS, PROTEÍNAS, LÍPIDOS Y CLOROFILAS A
PARTIR DE CULTIVOS MIXOTRÓFICOS de Chlorella vulgaris UTEX 1803.
AUTOR: QUINTERO RANGEL IVÁN SEBASTIÁN.* C.C. 1098407574

TUTOR: PH.D. KAFAROV VIATCHESLAV. ** C.E. 264762

PALABRAS CLAVES: Microalgas, proteínas, carbohidratos, lípidos, clorofilas,

selectividad.

Las modificaciones en el medio de cultivo Bold Basal generadas por la incorporación de

nutrientes como acetato y nitrato de sodio, además de incrementar la productividad de
biomasa, carbohidratos, lípidos, proteínas y pigmentos, permite establecer escenarios
específicos de producción en cultivos semi-contínuos, los cuales requieren la adición
periódica de otros nutrientes como nitrato (NO3-N) y fosfato (PO4-P) que son consumidos
por las microalgas durante el tiempo de cultivo para sintetizar tanto la biomasa como los
demás compuestos metabólicos. Al acoplar estos escenarios, con sistemas de
aprovechamiento como la biorefinería, se puede mejorar el uso de la biomasa generada,
ya que cada uno de ellos posee otros metabolitos en menor proporción que pueden ser
aprovechados en las diferentes corrientes del proceso de valorización de dicha biomasa.
En el presente trabajo se analizó el efecto del carbonato de amonio, acetato de sodio,
nitrato de sodio, fosfato de potasio y del tiempo de cultivo en la productividad de
metabolitos de valor agregado en Chlorella vulgaris UTEX 1803. Para ello, se realizó dos
diseños de experimentos 33 utilizando el software STATISTICA 7.0, éstos fueron
realizados para evaluar el efecto de las variables acetato de sodio (3,27; 10,00; 20,00;
30,00; 36,73 mM), carbonato de amonio (0.351, 1.074, 2.149, 3.223 y 3.947 mM), nitrato
de sodio (0.320, 0.98, 1.96, 2.94 y 3.60 mM) y fosfato de potasio (0.187, 0.574, 1.147,
1.721 y 2.107 mM), posteriormente se midió la cantidad de biomasa formada, así como
los carbohidratos, proteínas, pigmentos y lípidos producidos durante los días 0, 2, 5, 7 10,
12 y 15 de cultivo. Según los resultados obtenidos se puede concluir que el diseño de
cultivo que mejora la producción de proteínas es T3 (30 mM Acetato de sodio, 2,94 mM
Nitrato de sodio y 1,721 mM Fosfato de sodio) a los 5 días de cultivo, obteniéndose una
concentración de 0,953 g/L y 76% de la biomasa total; mientras, que el diseño de cultivo
que mejora la producción de carbohidratos es T4 (30 mM Acetato de sodio, 0,98 mM
Nitrato de sodio y 0,574 mM Fosfato de sodio) a los 12 días de cultivo, obteniéndose una
concentración de 1,008 g/L y 70% de la biomasa total; para lípidos, se encontró, que el
diseño de cultivo que mejora la producción de Lípidos es T13 (20 mM Acetato de sodio,
0,32 mM Nitrato de sodio y 1,147 mM Fosfato de sodio) a los 10 días de cultivo,
obteniéndose una concentración de 0,169 g/L y 14% de la biomasa total. Por último, para
Clorofilas se observó, que el diseño de cultivo que mejora producción de Clorofilas es T2
(1,074 mM Carbonato de amonio, 0,98 mM Nitrato de sodio y 1,721 mM Fosfato de sodio)
a los 10 días de cultivo, obteniéndose una concentración de 0,178 g/L y 13% de la
biomasa total.

*Facultad de Ciencias. Escuela de Biología.

** Facultad de ingenierías fisicoquímicas. Escuela de ingeniería química. Director. Dr. Sc

Viatcheslav Kafarov.
 ABSTRACT

TITLE: DESIGN METHODOLOGY FOR CULTURE MICROALGAS OBTAINING

CARBOHYDRATE, PROTEIN, LIPID AND CHLOROPHYLL FROM CROP OF
MIXOTROPHIC Chlorella vulgaris UTEX 1803.

AUTHOR: QUINTERO RANGEL IVÁN SEBASTIAN * C.C. 1098407574

TUTOR: PH.D. KAFAROV VIATCHESLAV. ** C.E. 264762

KEYWORDS: Microalgae, proteins, carbohydrates, lipids, chlorophylls selectivity.

Changes in Bold Basal medium generated by the addition of nutrients such as nitrate and
sodium acetate, and increase biomass productivity, carbohydrates, lipids, proteins and
pigments, allows for specific production scenarios in semi - continuous cultures, which
require periodic addition of other nutrients such as nitrate (NO3 - N ) and phosphate (PO4
-P ) that are consumed by the microalgae in the culture time to synthesize both biomass
and other metabolic compounds. By coupling these scenarios, with harvesting systems as
biorefinery, it can improve the use of biomass generated, since each of them has to a
lesser extent other metabolites that can be exploited in different process streams for
recovery of the biomass. In this paper the effect of ammonium carbonate, sodium acetate,
sodium nitrate, potassium phosphate and culture time on the productivity of value-added
metabolites in Chlorella vulgaris UTEX 1803 was analyzed. To do this, two designs was
performed 33 experiments using the STATISTICA 7.0 software, they were self made to
evaluate the effect of varying sodium acetate (3.27 , 10.00 , 20.00 , 30.00 , 36.73 mM),
ammonium carbonate (0.351 , 1.074 , 2.149 , 3.223 and 3.947 mM), sodium nitrate (0.320
, 0.98 , 1.96 , 2.94 and 3.60 mM) and potassium phosphate (0.187 , 0.574 , 1.147 , 1.721
and 2.107 mM), then the amount of biomass was measured formed as well as
carbohydrates, proteins , lipids and pigments produced on days 0, 2 , 5, 7, 10, 12 and 15
of culture . According to the results it can be concluded that the culture method of
improving protein production is T3 (30 mM Sodium Acetate, 2.94 mM sodium nitrate and
1.721 mM sodium phosphate) at 5 days of culture, resulting in a concentration of 0.953 g/L
and 76% of the total biomass; while, the method of cultivation to improve the production of
carbohydrates is T4 (30 mM Sodium Acetate, 0.98 mM sodium nitrate and 0.574 mM
sodium phosphate) at 12 days of culture, resulting in a concentration of 1.008 g/L and 70%
of the total biomass; to lipid was found that the culture method that enhances the
production of lipids is T13 (20 mM Sodium Acetate, 0.32 mM sodium nitrate and 1.147 mM
sodium phosphate) at 10 days of culture, obtaining a concentration 0.169 g / L and 14 % of
the total biomass. Finally, it was observed to chlorophylls, that the improved cultivation
method chlorophylls production is T2 ( 1,074 mM ammonium carbonate, 0.98 mM sodium
nitrate and 1.721 mM sodium phosphate) at 10 days of culture, resulting in a concentration
of 0.178 g/L and 13% of the total biomass.

__________________________________

* Faculty of Science. School of Biology.

** Physical-Chemical Engineering Faculty. Chemical Engineering. Departament. Director:

Dr. Sc Viatcheslav Kafarov.
 1. INTRODUCCIÓN
Las microalgas son microorganismos autótrofos que emplean la radiación solar, nutrientes
inorgánicos, agua y CO2 [1], para producir diferentes metabolitos [2], tales como lípidos,
carbohidratos, aminoácidos, proteínas, pigmentos y triglicéridos [3], por medio de la
fotosíntesis [4]. Por esta razón, Las microalgas constituyen una buena opción para la
producción de metabolitos de valor agregado para sintetizar productos como biodiesel,
bioetanol, biometano, biohidrógeno, fármacos, productos de cosméticos, alimento para
animales y suplementos proteicos de alto nivel nutricional [5, 6].

En especial, las microalgas son una fuente atractiva para la obtención de biodiesel ya que
poseen mayores productividades en comparación con los cultivos de plantas y con
frecuencia pueden duplicar la biomasa dentro de 24 horas [4 y 7].

Por otro lado algunas especies pueden acumular grandes cantidades de triglicéridos, que
constituyen la principal materia prima para la producción de biodiesel [7]. La mayoría de
microalgas presenta un crecimiento muy rápido, produciendo lípidos transesterificables [1]
y muchas especies, son excesivamente ricas en aceites [4]. Otra ventaja, es que la
producción de alimentos no se verá afectada al emplear las microalgas para producir
biodiesel, ya que presentan la habilidad de crecer en condiciones poco comunes como en
aguas marinas o residuales [8], por tanto no necesitan grandes extensiones de tierra para
su crecimiento [9].

La producción de biodiesel a partir de la biomasa de microalgas no es un proceso rentable

[10], por lo cual los metabolitos presentes en la biomasa son separados y aprovechados
usando diferentes tecnologías con el fin de ser transformados por diferentes mecanismos
en productos de valor agregado y biocombustibles [11], proceso conocido como
biorefinería. Entre los productos de valor agregado se encuentran suplementos
alimenticios ricos en nutrientes y proteínas, biocombustibles renovables como el biodiesel
derivado del aceite de microalgas, el metano generado de la digestión anaeróbica de la
biomasa de la microalga, y el biohidrógeno producido fotobiológicamente [4]. De esta
manera se reduce la concentración de gases de efecto de invernadero en la atmósfera
como el CO2 y la quema de combustibles fósiles [2, 12 y 13].

Las microalgas pueden cultivarse bajo condiciones autótrofas, heterótrofas, y mixotróficas.

Las células autótrofas cosechan la luz como fuente de energía y asimilan el CO2 como
fuente de carbono, las células heterótrofas utilizan sustratos orgánicos como fuente de
carbono y energía, y las células mixotróficas cosechan luz y utilizan sustratos inorgánicos
y orgánicos como fuentes de energía y carbono [14]. Las áreas de interés actual en la
investigación de microalgas están dominadas principalmente en la selección de las cepas
de autótrofos y condiciones de cultivo que conducen a los rendimientos más altos de
lípidos en menos tiempo [14, 15]. Las microalgas heterotróficas y mixotróficas están
relativamente menos estudiadas debido a su exigencia de carbonos orgánicos.

La microalga Chlorella vulgaris, es una de las cepas microalgales ampliamente

disponibles comercialmente para fines alimentarios y nutricionales [16]. Sus aplicaciones
actuales más representativas son la producción de biomasa para la alimentación, la
acuicultura y los suplementos alimenticios, y muchos otros avances en el tratamiento de
aguas residuales, la fijación de CO2 industrial y futuras y mejoradas aplicaciones
potenciales para fines relacionados con la energía y sistemas de soporte de vida en el
espacio [17]. Por otro lado, productos comunes pero menos contaminantes como el
biodiesel y los ésteres de alquilo son obtenidos a partir de los lípidos [6], y el bioetanol se
obtiene mediante la fermentación de los azúcares disponibles de la biomasa [18].

Estudios anteriores han mencionado que las especies de Chlorella son capaces de crecer
utilizando glucosa (C6H12O6), acetato (C2H3O2-), glicerol (C3H5 (OH) 3), y otras fuentes
de carbono [2 y 19], pero hasta donde sabemos, sólo hay la escasez de datos acerca de
sus productividades de lípidos cuando se cultivan en estas fuentes de carbono con
diferentes condiciones de cultivo. Las especies de Chlorella son microorganismos
resistentes que pueden crecer en muchas condiciones de todo el mundo, ya que pueden
servir de ejemplo para los crecimientos heterótrofos y mixotróficos suministrados con
glucosa, glicerol, acetato, u otros compuestos orgánicos a partir de los recursos
residuales con cero o costos negativos como fuente de carbono para acumular lípidos
para la producción de biodiesel.
La concentración de metabolitos presentes en la biomasa de C. vulgaris, se encuentra
entre un 12-17% en carbohidratos, 51-58% en proteínas y 14-22% en lípidos [20], a
diferencia del contenido general presente en la mayoría de algas (40-70% de
carbohidratos, 10-20% de proteínas) con otro tipo de metabolismo [1]. En las microalgas
marinas se ha encontrado que alrededor del 20-30% de la biomasa está conformada por
celulosa o almidón, junto con otros monosacáridos como la xilosa y glucosa, entre otros
[21].

Los carbohidratos son a menudo las principales reservas de energía [22]. Comúnmente la
glucosa y el almidón se emplean para la producción de biocombustibles, principalmente el
bioetanol [23]. Por otro lado los pigmentos son metabolitos empleados como colorantes
naturales en la industria de alimentos, cosméticos [24], en la industria farmacéutica para
el tratamiento de enfermedades junto con las proteínas. Contribuyendo de esta manera
con la viabilidad de la producción de biocombustibles a partir de microalgas gracias a su
gran valor comercial.

La composición química de la biomasa está relacionada con el diseño del medio de

cultivo; donde factores ambientales como la temperatura, la intensidad luminosa y
factores químicos como el pH del medio afectan directamente la productividad [25].
Además, Factores como la concentración de los nutrientes presentes en el medio juegan
un papel fundamental en la optimización de la producción de biomasa [26]. El nitrógeno
constituye uno de los nutrientes que más afecta el crecimiento celular en la microalga
[24], y la producción de lípidos [27]. Cambios en la concentración de nitrógeno en el
medio puede incrementar la productividad en la composición de la biomasa [28],
especialmente los pigmentos, proteínas y carbohidratos. De acuerdo a lo descrito
anteriormente, el objetivo principal de esta investigación es diseñar medios de cultivo
selectivo mediante la modificación del nitrógeno, carbono y fósforo del medio de cultivo
Bold Basal que mejoren la productividad de metabolitos específicos (proteínas,
carbohidratos, lípidos, y clorofilas) presentes en Chlorella vulgaris UTEX 1803.
 2. OBJETIVOS

2.1. General:
Diseñar medios de cultivo selectivo, que mejoren la productividad de metabolitos
específicos (carbohidratos, proteínas, lípidos y clorofilas) presentes en Chlorella vulgaris
UTEX 1803, mediante la modificación de la fuente de nitrógeno, fósforo y carbono del
medio de cultivo Bold Basal.

2.2. Específicos:
Diseñar un medio de cultivo selectivo, que mejore la productividad de proteínas presentes
en Chlorella vulgaris, a escala de laboratorio.

Diseñar un medio de cultivo selectivo, que mejore la productividad de carbohidratos

presentes en Chlorella Vulgaris, a escala de laboratorio.

Diseñar un medio de cultivo selectivo que mejore la productividad de Lípidos presentes en

Chlorella vulgaris, a escala de laboratorio

Diseñar un medio de cultivo selectivo que mejore la productividad de clorofilas totales

presentes en Chlorella vulgaris, a escala de laboratorio.
 3. DESCRIPCIÓN METODOLÓGICA

La metodología experimental se desarrolló mediante la realización de un diseño de

experimentos donde se varían las condiciones de cultivo (Acetato de sodio, Nitrato de
sodio y Fosfato de potasio) y se determinan los experimentos a realizar, a los cuales se
les cuantificaron los principales componentes de la biomasa, como lo son: lípidos,
carbohidratos, proteínas y pigmentos. Para finalizar se realiza un análisis estadístico de
los datos obtenidos en las pruebas y se realizan las conclusiones pertinentes.

Figura 1. Metodología Experimental

Cultivo Inoculo Cuantificación Carbohidratos

Centrífuga Cuantificación Proteínas

Cuantificación Clorofílas

Cuantificación Lípidos
Biomasa

10 ml 1 ml 10 ml Horno 0.05 g
Siembra muestra muestra muestra Biomasa
experimentos
medición días
2-5-7-10-12-
15
Método Método Método Método
colorimét de espectro espectrofotométrico de
Medio fotométri
rico proteína lípidos por formación de
Bold Basal co
fenol- s por propuest complejos de Cu-FA.
ácido reacción o por Propuesto por Chen
sulfúrico de Folin Wiley & (2012) [33].
[30]. [32] Songs
(2005)

3.1. Medio de cultivo y microalga.

La microalga Chlorella vulgaris UTEX 1803 es proveniente de la colección de cultivo de
algas de la universidad de Texas (Austin, TX, USA). Inicialmente, esta cepa se mantuvo
en crecimiento en fotobiorreactores a escala de laboratorio, en medio de cultivo Bold
basal (MBB), cada litro de medio está compuesto por: NaNO3, 2,94x10-3 M; MgSO4.7H2O,
3,04x10-4 M; NaCl, 4,28x10-4 M; K2HPO4, 4,31x10-4 M; KH2PO4, 1,29x10-3 M; CaCl2.2H2O,
1,70x10-4 M; H3BO3, 1,85x10-4 M; KOH, 5,53x10-4 M; EDTA, 1,71x10-4 M ; FeSO4.7H2O
1,79x10-5M y 1 mL de solución de metales [29].
 El medio debe cumplir con las siguientes condiciones: temperatura ambiente (23°C), pH
neutro, aireación permanente y ciclos luz-oscuridad 12-12 horas, sin ningún suministro
complementario de CO2 considerándose este cultivo como tratamiento control.

3.2. Fotobioreactor
Se usaron botellas de vidrio de 1 L de capacidad. En el extremo superior de cada uno de
los reactores se colocó un sistema de suministro de aire continuo por burbujeo (tubo-
difusor) con el fin de proveer de aire los cultivos y garantizar que todas las células estén
expuestas a la luz y los nutrientes del medio.

3.3. Diseño experimental

Para el desarrollo del diseño experimental se realizó en la herramienta informática
STATISTIC 7.0. Los diseños realizados están basados en composición central, no
factorial 33 de 17 experimentos , cada uno con su original y dos replicas (Tabla 1 y 2), éste
fue realizado para evaluar el efecto de las variables acetato de sodio (3,27; 10,00; 20,00;
30,00; 36,73 mM), carbonato de amonio (0.351, 1.074, 2.149, 3.223 y 3.947 mM), nitrato
de sodio (0.320, 0.98, 1.96, 2.94 y 3.60 mM) y fosfato de potasio (0.187, 0.574, 1.147,
1.721 y 2.107 mM), los demás componentes del medio se mantuvieron contantes
(macronutrientes y micronutrientes) según las especificaciones del Medio Bold Basal
(MBB).

Tabla 1. Diseño experimental de los cultivos con Acetato de Sodio de C. Vulgaris

TRATAMIENTO T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15

Acetato de sodio (mM) 10,00 10,00 30,00 30,00 20,00 10,00 10,00 30,00 30,00 3,27 36,73 20,00 20,00 20,00 20,00

Nitrato sodio (mM) 2,940 0,980 2,940 0,980 1,960 2,940 0,980 2,940 0,980 1,960 1,960 3,600 0,320 1,960 1,960

Fosfato potasio (mM) 0,574 1,721 1,721 0,574 1,147 1,721 0,574 0,574 1,721 1,147 1,147 1,147 1,147 0,187 2,107

Tabla 2. Diseño experimental de los cultivos con Carbonato de Amonio de C.

Vulgaris

Tratamientos T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15

Carbonato de Amonio (mM) 1,074 1,074 3,223 3,223 2,149 1,074 1,074 3,223 3,223 0,351 3,947 2,149 2,149 2,149 2,149

Nitrato sodio (mM) 2,94 0,98 2,94 0,98 1,96 2,94 0,98 2,94 0,98 1,96 1,96 3,6 0,32 1,96 1,96

Fosfato potasio (mM) 0,574 1,721 1,721 0,574 1,147 1,721 0,574 0,574 1,721 1,147 1,147 1,147 1,147 0,187 2,107
 3.4. Cuantificación de metabolitos
Se realizaron mediciones para cada tratamiento, durante los días 0, 2, 5, 7, 10, 15 de
cultivo en los que se cuantificó la cantidad de biomasa y de cada uno de los metabolitos
producidos (carbohidratos, proteínas, lípidos y clorofilas).

3.4.1. Cuantificación de Carbohidratos Totales

Se utilizó el método colorimétrico fenol-ácido sulfúrico [30]. Se tomó 1mL de cada extracto y a
estos se les adicionó por separado 0,5 mL de fenol al 5% se homogenizó la mezcla y adicionó 2,5
mL de ácido sulfúrico al 95%. Por último la muestra se medió en un espectrofotómetro
(Spectroquant Pharo 300, Merck) a longitudes de onda de 480nm, 485 nm y 490nm para identificar
Xilosa, Arabinosa, Glucosa y Fructosa presentes en la biomasa. Se calculó el contenido de
carbohidratos de las muestras en mg de carbohidrato/L a partir de la correlación contra las curva
de calibración de solución de xilosa, arabinosa, glucosa y fructosa estándar.

3.4.2. Cuantificación de Proteínas

La extracción de proteínas se desarrolló siguiendo el procedimiento de Rausch, T. (1981)
[31] empleado por Chen & Vaidyanathan (2013) [22]. En el proceso se centrifugó 10 mL
de la muestra a 3400 rpm durante 20 minutos, 1 mL 1M de NaOH se añadió al sedimento
y se extrajo a 80°C por 10 minutos con agitación ocasional. Después de enfriar y
centrifugar, el sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo. La extracción alcalina fue
repetida 3 veces. La última repetición fue calentada a 100 °C por 10 minutos para extraer
completamente las proteínas. Las tres extracciones fueron combinadas y mezcladas
antes del análisis.
El contenido de proteínas totales en el extracto fue estimado usando el método de
proteínas por reacción de Folin [32], empleado por Dorey y Draves (1998). Un volumen de
1 mL de las muestras extraída junto a 1.4 mL de solución Lowry fue añadido a un tubo de
ensayo, luego se mezcló con un vortex por 3 min. Después de 20 minutos de incubación
se agregó 0.2 mL del reactivo de Folin en solución con agua, el cual se dejó reaccionar
por 30 minutos con agitación ocasional. Los ácidos amino aromáticos de la muestra
tratada reducen el ácido presente en el reactivo de Folin. Finalmente el producto de esta
reacción tiene un color azul. La concentración de proteínas en la muestra se estimó por
lectura de la absorbancia en un espectrofotómetro Spectroquant Pharo 300 (Merck) a una
longitud de onda de 750 nm. Se calculó el contenido de proteína de las muestras en mg
de BSA / L a partir de la correlación contra una curva de calibración de solución de
proteínas estándar (solución de albúmina de suero bovino con concentración máxima de 2
g/L).

3.4.3. Cuantificación de lípidos

La cuantificación de lípidos se estimó siguiendo el procedimiento de Chen (2012) [33], que

consiste, en realizar la lisis celular, seguida, de la saponificación de los lípidos, extracción
de FA, y la formación de complejos de Cu-FA. Para cada experimento realizado, se tomó
0,05 g de biomasa de los días 5, 10 y 15 de cultivo. Esta biomasa se resuspendió en 100
µl de Tris - HCl (1 M, pH 8,0). Seguidamente, de añadió 2.400 µl de reactivo de
saponificación (25 % de metanol en 1 M NaOH) y se añadió aproximadamente 250 mg de
perlas de vidrio de 0,1 mm (Sigma - Aldrich).Posteriormente, se realizó la ruptura celular
mediante la agitación con vórtex vigorosa durante 3 min. Luego, se añaden otros 2.500 µl
de del reactivo de saponificación. Después, la mezcla se saponifica en baño maría a 90 °
C durante 30 min y se agitó con vórtex cada 5 min para hidrolizar los enlaces éster de los
lípidos de membrana y triglicéridos [33, 34].

Después de la saponificación, las muestras se enfriaron a temperatura ambiente y se

tomaron 3.000 µl de la mezcla saponificada y se añadieron a un tubo Eppendorf
(Eppendorf) que contenía 4.500 µl de una mezcla disolvente de cloroformo y metanol
(2:01). Después de agitación durante 2 min, las muestras se centrifugan a 5.000 rpm
durante 2 min. A continuación, se tomó un volumen de 2.500 µl de la fase orgánica y se
transfirió a un nuevo tubo Eppendorf que contenía reactivo de cobre (9 vol. AQ. 1 TEA M,
1 vol. Ácido acético 1 M, 10 vol. 6,45 % w / v de Cu
(NO3) 2.3 H2O). Después de este paso, 1.500 µl de la fase orgánica se transfirió
cuidadosamente a una cubeta de cuarzo y se mide la absorbancia a 260 nm usando un
espectrofotómetro (Spectroquant Pharo 300, Merck).

3.4.4. Cuantificación de Clorofilas totales.

Un volumen de 10 mL de muestra de cada tratamiento se centrifugó a 3400 rpm durante
15 minutos (Centrifuga PowerSpin™ MX). Luego se extrajo el sobrenadante con el fin de
eliminar el medio presente, 3 ml de etanol al 95% se añadió al sedimento. La mezcla se
calentó al baño maría durante 10 minutos a 80°C. Después de enfriar se aforó hasta 5 mL
con etanol al 95% y se centrifugó nuevamente a 3400 rpm durante 15 minutos para
eliminar la biomasa libre de pigmento. La concentración de la clorofila a (Ca) y clorofila b
(Cb) en el sobrenadante se cuantificó al usar el método espectrofotométrico propuesto por
Wiley & Songs (2005), por lectura de la absorbancia a longitudes de onda de 645 nm y
663 nm en un espectrofotómetro Spectroquant Pharo 300 (Merck). La relación de la
cantidad de clorofila (a), (b) y (a+b) en el sobrenadante Ca (mg/L), Cb (mg/L) y Ca+b (mg/L)
con el valor de la absorbancia fue correlacionado de acuerdo a las ecuaciones:

( 1)

( 2)

( 3)
 4. RESULTADOS Y ANÁLISIS

4.1. Caracterización de los metabolitos

En las Tablas 3-9, se observan los resultados de cuantificación en gramos por litros de las
mejores productividades de metabolitos, entre ellos, carbohidratos, proteínas, lípidos y
clorofilas para cada una de las pruebas de los diseños experimentales.

4.1.1. Carbohidratos
La tabla 3 y 4, se resume la producción de carbohidratos en función del tiempo para los
cultivos en acetato sodio y carbonato de amonio, en donde se destacan las mayores
productividades: T4 (con acetato de sodio al día 12) y T3 (con carbonatao de amonio al
dia 15), observandose que la mejor productividad de carbohidratos se obtiene con acetato
de sodio a los 12 días de cultivo en el tratamiento 4 (30 mM de Acetato de sodio, 0,980
mM de Nitrato de sodio y 0,574 mM de Fosfato de Potasio), obteniéndose una
concentración de 1,008 g/L y 69,9 % de carbohidratos.

Tabla 3. Productividad de Carbohídratos(g/L) en función del tiempo para los 15

tratamientos cultivados con acetato de sodio.

TIEMPO (días)
CARBOHIDRATOS 0 2 5 7 10 12 15
g/L
T1 0,040 0,107 0,248 0,236 0,306 0,303 0,427
T2 0,040 0,064 0,165 0,248 0,377 0,889 0,377
T3 0,040 0,191 0,357 0,201 0,447 0,531 0,545
T4 0,040 0,268 0,209 0,273 0,319 1,008 0,553
T5 0,040 0,113 0,233 0,297 0,497 0,327 0,529
T6 0,040 0,095 0,132 0,197 0,341 0,409 0,459
T7 0,040 0,008 0,113 0,389 0,487 0,248 0,644
T8 0,040 0,012 0,068 0,280 0,356 0,294 0,605
T9 0,040 0,225 0,266 0,394 0,581 0,797 0,412
T10 0,040 0,156 0,163 0,219 0,450 0,365 0,896
T11 0,040 0,131 0,411 0,422 0,465 0,500 0,231
T12 0,040 0,136 0,212 0,196 0,273 0,365 0,210
T13 0,040 0,115 0,339 0,219 0,745 0,542 0,326
T14 0,040 0,014 0,280 0,149 0,436 0,381 0,455
T15 0,040 0,112 0,300 0,376 0,449 0,602 0,503

Tabla 4. Productividad de Carbohídratos(g/L) en función del tiempo para los 15

tratamientos cultivados con carbonato de amonio.

TIEMPO (días)
CARBOHIDRATOS 0 2 5 7 10 12 15
g/L
T1 0,040 0,093 0,192 0,202 0,216 0,168 0,492
T2 0,040 0,087 0,085 0,218 0,183 0,379 0,620
T3 0,040 0,009 0,153 0,107 0,025 0,173 0,319
 T4 0,040 0,006 0,062 0,108 0,094 0,092 0,247
T5 0,040 0,033 0,095 0,076 0,148 0,184 0,217
T6 0,040 0,027 0,175 0,272 0,275 0,309 0,421
T7 0,040 0,046 0,089 0,070 0,137 0,489 0,441
T8 0,040 0,023 0,043 0,075 0,052 0,129 0,189
T9 0,040 0,093 0,120 0,122 0,233 0,251 0,480
T10 0,040 0,121 0,111 0,121 0,187 0,321 0,537
T11 0,040 0,059 0,068 0,055 0,207 0,263 0,355
T12 0,040 0,081 0,138 0,157 0,275 0,266 0,249
T13 0,040 0,095 0,123 0,122 0,271 0,350 0,447
T14 0,040 0,059 0,121 0,142 0,278 0,204 0,432
T15 0,040 0,043 0,026 0,112 0,093 0,144 0,386

Todos los monosacáridos evidencian una disminución en la presencia de estos en la

biomasa durante los 5 primeros días, En la Figura 4 y 5, se puede observar, que tanto
para los experimentos cultivados con Acetato de sodio como, para los cultivados con
Carbonato de Amonio, las menores productividades de carbohidratos se presentaron en el
día 2 (tratamiento 7 con un 0,008 g/L, 1,1% de carbohidratos). A partir del 10º día
comienza un aumento gradual de la presencia de estos metabolitos en la biomasa hasta
estabilizarse en sus valores máximos alrededor del 15º día, los mayores porcentajes se
obtienen en el día 15 de cultivo.

Los carbohidratos a partir de microalgas son adecuados para la producción de bioetanol,

aunque aún debe crearse una tecnología más económica para la recolección de células y
así hacer factible la producción comercial de etanol basado en microalgas [22]. Algunos
cepas de C. vulgaris han logrado concentraciones en la biomasa de 55% [1 y 35] y 41%
[36]. Los monosacáridos estudiados componen hasta un 69,9% del total de la biomasa al
12º día, con una producción de biomasa de 1,44 g/L, esto en comparación a lo obtenido
en el cultivo en medio mixotrófico usando acetato de sodio como fuente de carbono
significa un aumento en promedio del 14,9%.

Como se observa en los resultados, la concentración de acetato está relacionada con la

producción de carbohidratos, permitiendo afirmar que altas concentraciones de dicho
nutriente (30mM) incrementan la productividad de éste metabolito con el tiempo
(p=0,0000), lo que concuerda con estudios realizados por Chinnasamy et al. (2009) [37] y
Laliberté (1993) [38], quien plantea además que las elevadas concentraciones de acetato,
promueven la síntesis de clorofila y la producción de lípidos.

4.1.2. Proteínas
La tabla 5 y 6, se resume la producción de proteinas en función del tiempo para los
cultivos en acetato sodio y carbonato de amonio, en donde se destacan las mayores
productividades: T3 (con acetato de sodio al día 5) y T12 (con carbonatao de amonio al
dia 12), observandose, que la mejor productividad de proteínas se obtiene con acetato de
sodio a los 5 días de cultivo en el tratamiento 3 (30 mM de Acetato de sodio, 2,94 mM de
Nitrato de sodio y 1,721 mM de Fosfato de Potasio), obteniéndose una concentración de
0,953 g/L y 76,1 % de proteínas.

Tabla 5. Productividad de Proteinas (g/L) en función del tiempo para los 15

tratamientos cultivados con Acetato de Sodio.

TIEMPO (días)
PROTEÍNAS 0 2 5 7 10 12 15
g/L
T1 0,127 0,192 0,359 0,375 0,399 0,373 0,414
T2 0,127 0,242 0,218 0,233 0,236 0,391 0,402
T3 0,127 0,394 0,953 0,415 0,586 0,922 0,204
T4 0,127 0,142 0,653 0,649 0,183 0,298 0,457
T5 0,127 0,193 0,107 0,184 0,317 0,337 0,265
T6 0,127 0,133 0,090 0,172 0,443 0,679 0,291
T7 0,127 0,189 0,266 0,171 0,211 0,167 0,091
T8 0,127 0,283 0,316 0,384 0,405 0,307 0,196
T9 0,127 0,179 0,120 0,120 0,087 0,183 0,128
T10 0,127 0,190 0,082 0,196 0,156 0,254 0,265
T11 0,127 0,069 0,135 0,104 0,075 0,060 0,167
T12 0,127 0,121 0,131 0,115 0,119 0,067 0,253
T13 0,127 0,082 0,111 0,068 0,105 0,389 0,103
T14 0,127 0,088 0,081 0,083 0,214 0,412 0,170
T15 0,127 0,214 0,092 0,151 0,206 0,353 0,181

Tabla 6. Productividad de Carbohídratos(g/L) en función del tiempo para los 15

tratamientos cultivados con Carbonato de Amonio.

TIEMPO (días)
PROTEÍNAS 0 2 5 7 10 12 15
g/L
T1 0,127 0,170 0,297 0,142 0,271 0,371 0,292
T2 0,127 0,066 0,105 0,192 0,262 0,256 0,181
T3 0,127 0,130 0,075 0,134 0,212 0,229 0,268
T4 0,127 0,078 0,110 0,094 0,158 0,120 0,231
T5 0,127 0,089 0,115 0,191 0,208 0,225 0,292
T6 0,127 0,087 0,117 0,224 0,250 0,171 0,376
T7 0,127 0,074 0,115 0,151 0,155 0,228 0,263
T8 0,127 0,091 0,082 0,119 0,227 0,254 0,186
T9 0,127 0,086 0,185 0,175 0,226 0,213 0,319
T10 0,127 0,102 0,286 0,274 0,121 0,254 0,227
T11 0,127 0,116 0,133 0,150 0,183 0,371 0,214
T12 0,127 0,098 0,214 0,277 0,306 0,429 0,266
T13 0,127 0,069 0,213 0,194 0,280 0,293 0,175
 T14 0,127 0,066 0,210 0,184 0,185 0,243 0,106
T15 0,127 0,075 0,168 0,098 0,319 0,267 0,280

En la Figura 4 y 5, se puede observar, que tanto para los experimentos cultivados con
Acetato de sodio como, Carbonato de Amonio, las menores productividades de proteínas
se presentaron en el día 2 de cultivo, mientras, que los mayores porcentajes se obtienen
en el día 15 de cultivo. Esto se debe a que durante este período de tiempo las microalgas
sufren un cambio en su composición interna debido a la adaptación al nuevo medio de
cultivo, donde pasan de ser fotoautótrofas a mixotróficas.

Estudios previos, han logrado una presencia del 54% (p/p) de la proteína en la biomasa
cultivada en medio Bol Basal al 5º día [39], esto en comparación a lo obtenido en el cultivo
en medio mixotrófico usando acetato de sodio como fuente de carbono significa un
aumento en promedio del 22,1%.

Figura 2. Composición porcentual de la biomasa de C. vulgaris durante los 15 días

de cultivo con Acetato de Sodio.

Figura 3 Composición porcentual de la biomasa de C. vulgaris durante los 15 días

de cultivo con Carbonato de Amonio.
4.1.3. Lípidos

Los lípidos transesterificables presentres en la biomasa, se midieron en base seca, con el

fin de maximizar la eficiencia de la extracción [40]. En la tabla 7 y 8, se resume la
producción de Lipidos en función del tiempo para los cultivos con acetato sodio y
carbonato de amonio, en donde se destacan las mayores productividades: T13 (con
acetato de sodio al día 10) y T13 (con carbonatao de amonio al dia 15), observandose,
que la mejor productividad de Lípidos se obtiene a los 10 días de cultivo en el tratamiento
13 (20 mM de Acetato de sodio, 0,320 mM de Nitrato de sodio y 1,147 mM de Fosfato de
Potasio) que emplea acetato de sodio como fuente de carbono, obteniéndose una
concentración de 0,169 g/L y 13,9 % de Lípidos.

Tabla 7. Productividad de Lípidos (g/L) en función del tiempo para los 15 tratamientos
cultivados con Acetato de Sodio.

TIEMPO (días)
LÍPIDOS 0 2 5 7 10 12 15
g/L
T1 0,081 0,084 0,097 0,092 0,085 0,094 0,088
T2 0,081 0,090 0,110 0,107 0,107 0,106 0,089
T3 0,081 0,098 0,126 0,118 0,112 0,113 0,098
T4 0,081 0,078 0,085 0,094 0,105 0,106 0,092
T5 0,081 0,091 0,112 0,110 0,110 0,127 0,129
T6 0,081 0,101 0,132 0,118 0,107 0,125 0,128
T7 0,081 0,105 0,139 0,119 0,102 0,121 0,124
T8 0,081 0,094 0,118 0,112 0,107 0,119 0,116
T9 0,081 0,094 0,117 0,118 0,121 0,123 0,110
T10 0,081 0,078 0,086 0,097 0,109 0,111 0,097
T11 0,081 0,074 0,078 0,108 0,140 0,113 0,070
T12 0,081 0,082 0,093 0,129 0,167 0,146 0,109
T13 0,081 0,077 0,084 0,126 0,169 0,144 0,102
T14 0,081 0,080 0,090 0,126 0,164 0,132 0,085
T15 0,081 0,078 0,086 0,121 0,158 0,136 0,098

Tabla 8. Productividad de Lípidos (g/L) en función del tiempo para los 15 tratamientos
cultivados con Carbonato de Amonio.

TIEMPO (días)
LÍPIDOS 0 2 5 7 10 12 15
g/L
T1 0,081 0,083 0,089 0,095 0,103 0,120 0,139
T2 0,081 0,091 0,105 0,102 0,101 0,107 0,115
T3 0,081 0,086 0,094 0,096 0,101 0,104 0,108
T4 0,081 0,092 0,106 0,110 0,117 0,107 0,100
T5 0,081 0,091 0,105 0,106 0,109 0,114 0,120
T6 0,081 0,081 0,084 0,098 0,114 0,106 0,100
 T7 0,081 0,105 0,132 0,122 0,113 0,116 0,120
T8 0,081 0,072 0,067 0,069 0,072 0,093 0,115
T9 0,081 0,075 0,072 0,081 0,092 0,107 0,123
T10 0,081 0,087 0,096 0,094 0,094 0,105 0,119
T11 0,081 0,077 0,076 0,092 0,109 0,112 0,116
T12 0,081 0,086 0,095 0,102 0,111 0,119 0,128
T13 0,081 0,095 0,113 0,114 0,116 0,131 0,148
T14 0,081 0,083 0,089 0,093 0,100 0,103 0,107
T15 0,081 0,081 0,084 0,098 0,114 0,115 0,118

En la Figura 4 y 5, se puede observar, que tanto para los experimentos cultivados con
Acetato de sodio y Carbonato de Amonio, las menores productividades de lípidos se
presentaron en el día 5 de cultivo (tratamiento 8: 0,067g/L y 7,7 % de Lípidos usando
carbonato de amonio como fuente de carbono), mientras, que los mayores
productividades se obtienen en el 10° día con acetato de sodio y 15° día con carbonato de
amonio como fuentes de carbono, alcanzando productividades de 0,169 g/L y 13,9 % de
Lípidos (T13, día 10) y 0,148 g/L , 9,8 % de lípidos ( T13, día 15) respectivamente. El
mayor porcentaje de lípidos en la biomasa se obtiene en el 5° día de cultivo para el
tratamiento 7 cultivado en carbonato de amonio obteniéndose un porcentaje del 17,06 % y
una productividad 0,132 g/L de proteínas. Este valor es bajo comparados con otros
estudios en los cuales se alcanzan presencias del metabolito del 21% con un medio de
cultivo Bol Basal modificado con nitrato de sodio y acetato de sodio [39]. Esto en
comparación a lo obtenido en el cultivo en medio mixotrófico usando Carbonato de
Amonio como fuente de carbono significa una disminución en promedio del 3,9%.

Microalgas con elevadas productividades lipídicas son deseables para la elaboración de

biodiesel, razón por la cual la cantidad de lípidos contenidos en la biomasa y la velocidad
de crecimiento, sumados a la eficiencia metabólica y la robustez del microorganismo, son
relevantes para su selección [4, 41]. La determinación del contenido oleaginoso de las
microalgas resulta complicada a causa de su variación ante condiciones distintas de
cultivo; el crecimiento en ambientes desfavorables o bajo situaciones de estrés,
frecuentemente conlleva al incremento de la fracción lipídica, aunque en detrimento de la
productividad lipídica del cultivo. Los lípidos comprendidos en las microalgas por lo
general constituyen del 20 al 50% de su peso seco [42].

4.1.3. Clorofilas
En la tabla 9 y 10, se resume la producción de Clorofilas en función del tiempo para los
cultivos con acetato sodio y carbonato de amonio, en donde se destacan las mayores
productividades: T3 (con acetato de sodio al día 12) y T2 (con carbonatao de amonio al
dia 12), observandose, que la mejor productividad de clorofilas se obtiene a los 12 días de
cultivo en el tratamiento 2 con carbonato de amonio (1,074 mM de Carbonato de amonio,
0,98 mM de Nitrato de sodio y 1,721 mM de Fosfato de Potasio), obteniéndose una
concentración de 0,178 g/L de Clorofilas totales.

Tabla 9. Productividad de Clorofilas (g/L) en función del tiempo para los 15

tratamientos cultivados con Acetato de Sodio.

TIEMPO (días)
CLOROFILAS 0 2 5 7 10 12 15
g/L
T1 0,040 0,107 0,248 0,236 0,306 0,303 0,427
T2 0,040 0,064 0,165 0,248 0,377 0,889 0,377
T3 0,040 0,191 0,357 0,201 0,447 0,531 0,545
T4 0,040 0,268 0,209 0,273 0,319 1,008 0,553
T5 0,040 0,113 0,233 0,297 0,497 0,327 0,529
T6 0,040 0,095 0,132 0,197 0,341 0,409 0,459
T7 0,040 0,008 0,113 0,389 0,487 0,248 0,644
T8 0,040 0,012 0,068 0,280 0,356 0,294 0,605
T9 0,040 0,225 0,266 0,394 0,581 0,797 0,412
T10 0,040 0,156 0,163 0,219 0,450 0,365 0,896
T11 0,040 0,131 0,411 0,422 0,465 0,500 0,231
T12 0,040 0,136 0,212 0,196 0,273 0,365 0,210
T13 0,040 0,115 0,339 0,219 0,745 0,542 0,326
T14 0,040 0,014 0,280 0,149 0,436 0,381 0,455
T15 0,040 0,112 0,300 0,376 0,449 0,602 0,503

Tabla 10. Productividad de Clorofilas (g/L) en función del tiempo para los 15
tratamientos cultivados con Carbonato de Amonio.

TIEMPO (días)
CLOROFILAS 0 2 5 7 10 12 15
g/L
T1 0,040 0,093 0,192 0,202 0,216 0,168 0,492
T2 0,040 0,087 0,085 0,218 0,183 0,379 0,620
T3 0,040 0,009 0,153 0,107 0,025 0,173 0,319
T4 0,040 0,006 0,062 0,108 0,094 0,092 0,247
T5 0,040 0,033 0,095 0,076 0,148 0,184 0,217
T6 0,040 0,027 0,175 0,272 0,275 0,309 0,421
T7 0,040 0,046 0,089 0,070 0,137 0,489 0,441
T8 0,040 0,023 0,043 0,075 0,052 0,129 0,189
T9 0,040 0,093 0,120 0,122 0,233 0,251 0,480
T10 0,040 0,121 0,111 0,121 0,187 0,321 0,537
T11 0,040 0,059 0,068 0,055 0,207 0,263 0,355
T12 0,040 0,081 0,138 0,157 0,275 0,266 0,249
T13 0,040 0,095 0,123 0,122 0,271 0,350 0,447
T14 0,040 0,059 0,121 0,142 0,278 0,204 0,432
T15 0,040 0,043 0,026 0,112 0,093 0,144 0,386
En la Figura 4 y 5, se puede observar, que tanto para los experimentos cultivados con
Acetato de sodio y Carbonato de Amonio, las menores productividades de Clorofilas se
presentó en el día 15 de cultivo (T13: 0,003 g/L y 0,2 % de Clorofilas) con 20 mM acetato
de sodio, 0,320 mM de Nitrato de Sodio y 1,147 mM de Fosfatos de potasio. La
disminución en la productividad se debe a que las células no solo obtuvieron energía y
carbono de la fotosíntesis del CO2 presente en el aire, sino de la fosforilación oxidativa del
acetato [43], vale la pena mencionar, que una fuente de carbono diferente a CO2 puede
causar una disminución en la tasa fotosintética de la célula afectando así la productividad
de pigmentos [44].

Tabla 11. Tratamientos que maximizan la producción de proteínas, carbohidratos

lípidos y clorofilas empleando Acetato de sodio como fuente de carbono.

ACETATO DE SODIO
TRATAM DÍ PROTEINAS CARBOHIDRATOS LIPIDOS CLOROFILAS
IENTO A Concentr Porcen Concentr Porcen Concentr Porcen Concentr Porcen
ación g/L taje g/g ación g/L taje g/g ación g/L taje g/g ación g/L taje g/g
T3 5 0,953 76% 0,357 29% 0,126 10% 0,014 1%
T4 12 0,298 21% 1,008 70% 0,106 7% 0,036 3%
T3 12 0,922 63% 0,531 36% 0,113 8% 0,14 10%
T13 10 0,105 9% 0,745 61% 0,169 14% 0,004 0%

En la Tabla 11, se presenta la composición porcentual de proteínas, carbohidratos, lípidos

y clorofilas para los cultivos con Acetato de sodio, durante el tiempo de cultivo (5, 10 y 12
días), presentando los tratamientos que maximizan la productividad de cada uno de estos
metabolitos, se observa que el tratamiento que maximiza la producción de proteínas es T3
en el día 5 de cultivo obteniéndose una concentración de 0,953 g/L y 76% de la biomasa;
para la producción de carbohidratos el mejor tratamiento fue el T4 a los 12 días de cultivo
obteniéndose una concentración de 1,008 g/L y 70% de la biomasa; para la producción de
Lípidos el mejor tratamiento fue T13 a los 10 días de cultivo, obteniéndose una
concentración de 0,169 g/L y 14% de la biomasa y para la producción de Clorofilas el
mejor tratamiento fue T3 obteniéndose una concentración de 0,14 g/L y 10% de la
biomasa .

Tabla 12. Tratamientos que maximizan la producción de proteínas, carbohidratos

lípidos y clorofilas empleando Carbonato de amonio como fuente de carbono.

CARBONATO DE AMONIO
TRATAM DÍ PROTEINAS CARBOHIDRATOS LIPIDOS CLOROFILAS
IENTO A Concentr Porcen Concentr Porcen Concentr Porcen Concentr Porcen
ación g/L taje g/g ación g/L taje g/g ación g/L taje g/g ación g/L taje g/g
T12 12 0,429 29% 0,266 18% 0,119 8% 0,071 5%
T2 15 0,181 12% 0,62 43% 0,115 8% 0,166 11%
T2 12 0,256 19% 0,379 28% 0,107 8% 0,178 13%
T13 15 0,175 12% 0,447 30% 0,148 10% 0,042 3%
En la Tabla 12, se presenta la composición porcentual de proteínas, carbohidratos, lípidos
y clorofilas para los cultivos con Carbonato de amonio, durante los mejores tiempo de
cultivo (12 y 15 días), presentando los tratamientos que maximizan la productividad de
cada uno de estos metabolitos, se observa que el tratamiento que maximiza la producción
de proteínas es T12 en el día 12 de cultivo obteniéndose una concentración de 0,429 g/L
y 29% de la biomasa; para la producción de carbohidratos el mejor tratamiento fue el T2 a
los 15 días de cultivo obteniéndose una concentración de 0,62 g/L y 43% de la biomasa;
para la producción de Lípidos el mejor tratamiento fue T13 a los 15 días de cultivo,
obteniéndose una concentración de 0,148 g/L y 10% de la biomasa y para la producción
de Clorofilas el mejor tratamiento fue T2 obteniéndose una concentración de 0,178 g/L y
13% de la biomasa.

Una de las principales ventajas de realizar modificaciones del medio de cultivo como es la
concentración de nitrógeno, fosforo, acetato de sodio y carbonato de amonio; conlleva a
modificar drásticamente la proporción de los diferentes metabolitos celulares, es por esto
que es posible separar los tratamientos propuestos y plantear escenarios de producción
de biomasa de microalgas con miras a la obtención de metabolitos de valor agregado. La
diferencia significativa entre los tratamientos nos permite escoger como mejor escenario
de producción al control.

El acoplar escenarios de cultivo de microalgas con un sistema de aprovechamiento como

la biorefinería, permite mejorar la utilización de la biomasa generada, ya que cada uno de
los escenarios planteados posee otros metabolitos en menor proporción, los cuales
pueden ser utilizados en las diferentes corrientes dentro del proceso de valorización de la
biomasa.

4.2. Análisis Estadístico

Para determinar la influencia de las variables (Tiempo, Carbonato de Amonio Carbonato
de sodio, Nitrógeno, fosforo) sobre los datos obtenidos en el diseño de experimentos, se
realizaron los diagramas de Pareto determinando la influencia significativa positiva o
negativamente de dichas variables en la producción de metabolitos (Figura 8), esta
significancia se aprecia cuando las variables cruzan el umbral (línea rojo) con un valor
p<0,05.

Para los diagramas de superficie de respuesta se realizaron 4 gráficos manteniendo

constante en cada uno, las mejores condiciones de carbonato de amonio, acetato de
sodio, nitrato de sodio y fosfato de potasio, para observar el efecto que tienen las
interacciones entre las variables que se han encontrado significativas con respecto a cada
uno de los metabolitos evaluados, donde se muestran las zonas de mayor (Rojo) y menor
(verde) productividades cuantificadas.

4.2.1. Productividad de carbohidratos

Figura 4. Diagrama de Pareto para la producción de carbohidratos. a). cultivo con
acetato de sodio, b). Cultivo con carbonato de amonio.

a). b).
En la figura 8.a. se observa que para el diseño que uso acetato de sodio como fuente de
carbono las variables tiempo, nitrato de sodio, relación tiempo/nitrato y el fosfato de sodio
son significativas, de manera, que cada una de ellas es importante en los resultados de
productividad de carbohidratos, mientras que en la figura 8.b. se observa que, para el
diseño que uso carbonato de amonio como fuente de carbono las variables significativas
fueron tiempo, carbonato de amonio y las interacciones Carbonato Amonio-Tiempo,
Nitrato de sodio-Tiempo, son las más importantes en la productividad de carbohidratos.
Además, las superficies de respuesta para la productividad de carbohidratos con acetato
de sodio (Figura 9. a y b) demuestra que la mayor productividad de carbohidratos (0,8
g/L) se obtiene a los 15 días de cultivo, con una concentración de Nitrato de sodio de 0,5
mM, fosfato de sodio de 1,1473 mM y acetato de sodio de 20 mM, mientras, que las
superficies de respuesta para la productividad de carbohidratos con Carbonato de Amonio
(Figura 9. c y d) muestra que la mayor productividad de carbohidratos (0,4847 g/L) se
obtiene a los 15 días de cultivo, a una concentración de carbonato de amonio de 0,5 mM,
Nitrato de sodio de 1,96 mM y fosfato de sodio de 1,1473.

Figura 5. Superficie de respuesta para la producción de carbohidratos, Cultivo con

Acetato de sodio: a). Tiempo-Nitrato, b). Tiempo-Fosfato; Cultivo con Carbonato de
Amonio: c). Tiempo-Nitrato, d). Tiempo-Carbonato Amonio
 a). b).

c). d).

4.2.2. Productividad de Proteínas

En diagrama de Pareto para la producción de proteínas (Figura 10.a.), se observa que en
los experimentos cultivados con acetato de sodio las variables tiempo, nitrato de sodio,
acetato de sodio y sus relaciones tiempo-nitrato, tiempo-fosfato, Acetato-nitrato y
nitrato/fosfato son significativas, de manera, que cada una de ellas es importante para
mejorar la productividad de proteínas, también, en la figura 10.b. se observó que para el
cultivo con carbonato de amonio las variables significativas fueron las mismas que para
los cultivos con acetato de sodio (tiempo, nitrato de sodio, acetato de sodio y sus
relaciones tiempo-nitrato, tiempo-fosfato, Acetato-nitrato y nitrato/fosfato), siendo las más
importantes las variables tiempo y nitrato de sodio. Estos resultados concuerdan con los
obtenidos por Fábregas et al. (1989).

Figura 6. Diagrama de Pareto para la producción de Proteínas. a). cultivo con

acetato de sodio, b). Cultivo con carbonato de amonio

a). b).
Las superficies de respuesta para la productividad de proteínas de los cultivos con acetato
de sodio (Figura 11.b) muestran, que la mayor productividad (0,3 g/L ), se obtiene a una
concentración de Nitrato de sodio de 4 mM, tiempo de cultivo 15 días, fosfato de potasio
de 1,1473 mM y Acetato de sodio de 20 mM, además, para los cultivos con Carbonato de
Amonio la productividad de proteínas fue mayor (0,3 g/L) (Figura 11.c) cuando las
condiciones de cultivo fueron de 3,5 mM Nitrato de sodio, 15 días de cultivo, 1,1473 mM
de fosfato de potasio y 2,1487 mM carbonato de amonio. Fábregas et al. (1989) demostró
que la concentración de nitrógeno en forma de nitrato afecta de manera directamente
proporcional a la producción de proteínas, lo cual concuerda con las altas productividades
de proteínas y la alta concentración de Nitrógeno observada en este estudio.

El consumo de nitrógeno juega un papel fundamental en el incremento o disminución de

la productividad de proteínas; a nivel bioquímico el deficit de éste nutriente, influye
directamente en la formación de aminoácidos y a su vez limita la traslación del mRNA,
reduciendo la síntesis de proteínas (Barsanti & Gualtieri, 2006).

Figura 7. Superficie de respuesta para la producción de proteínas, Cultivo con Acetato de

sodio: a). Tiempo-acetato, b). Tiempo-Nitrato; Cultivo con Carbonato de Amonio: c).
Tiempo-Nitrato, d). Tiempo-Carbonato Amonio b).
a).

c). d).
4.2.3. Productividad de Lípidos
En el diagrama de Pareto mostrado en la Figura 12. a., se observó que para el caso de la
producción de Lípidos en los cultivos con acetato de sodio, la variable significativa que
afecta la producción de este metabolito es el tiempo pues se observa, que a mayor tiempo
se produce la mayor cantidad de lípidos, mientras, que para los cultivos con carbonato de
amonio Figura 12.b., las variables que afectan significativamente la producción de Lípidos
fueron el tiempo y las concentraciones de nitrato de sodio y carbonato de amonio.

Figura 8. Diagrama de Pareto para la primera extracción de proteínas. a). cultivo con
acetato de sodio, b). Cultivo con carbonato de amonio

a). b).

De acuerdo a las figuras 13. a y b, la mayor productividad de lípidos posible para los
cultivos con Acetato de sodio es de 0,1073 g/L, la cual se logran entre un rango de
concentración de Acetato de sodio de 0-5 mM, tiempo de cultivo 15 días, fosfato de
potasio de 1,1473 mM, mientras que, la mayor productividad de lípidos posible para los
cultivos con Carbonato de Amonio (Figura 13. c y d) es de 0,1273 g/L a los 15 días de
cultivo, usando una concentración de Carbonato de Amonio entre 0-0,5 mM, fosfato de
potasio de 1,1473 mM y Nitrato de sodio entre 0-0,5 mM.

Figura 9. Superficie de respuesta para la producción de Lípidos, Cultivo con Acetato de

sodio: a). Tiempo-Nitrato, b). Tiempo-Acetato de sodio; Cultivo con Carbonato de Amonio:
c). Tiempo-Nitrato, d). Tiempo-Carbonato Amonio

a). b).

c). d).

La producción de determinados metabolitos depende de la cantidad y tipo de nutrientes

que se encuentran en el medio de cultivo. Estudios demostraron que la cantidad total de
lípidos presentes en la biomasa es característica de cada tipo de microalgas, además de
factores ambientales como la intensidad de luz, pH, temperatura y nitrógeno, siendo este
último uno de los de mayor influencia tiene, debido a que a valores altos de nitrógeno en
el medio disminuye la producción de lípidos en la biomasa [38] esto coincide con la baja
concentración de lípidos a causa de las altas concentraciones de nitrógeno.
4.2.4. Productividad de Clorofilas
En la figura 14.a. se observa, que en los experimentos cultivados con acetato de sodio las
variables tiempo, nitrato de sodio y la relación tiempo-fosfato son significativas, de
manera, que cada una de ellas es importante en los resultados de productividad de
Clorofilas, también, en la Figura 14.b. se observó que para el cultivo con carbonato de
amonio las variables significativas fueron tiempo, fosfato de sodio, carbonato de amonio y
las relaciones carbonato-nitrato, nitrato-fosfato, tiempo-fosfato, siendo la más importantes
la variable tiempo.

Figura 10. Diagrama de Pareto para la producción de Clorofilas. a). cultivo con
Acetato de Sodio, b). Cultivo con Carbonato de Amonio

a). b).

La superficie de respuesta de la productividad de Clorofilas de los cultivos con Acetato de

Sodio (Figura 15. a), muestran que a una concentración de Nitrato de sodio de 4 mM,
tiempo de cultivo 15 días, fosfato de sodio de 1,1473 y Acetato de sodio de 20 mM, la
productividad de proteínas es de 0,3 g/L, además, la productividad de proteínas para los
cultivos con Carbonato de Amonio (Figura 15. c) es también de 0.3 g/L (Nitrato de sodio
de 3.5 mM, tiempo de cultivo 15 días, fosfato de sodio de 1,1473 y carbonato de amonio
de 2.1487 mM).

Figura 11. Superficie de respuesta para la producción de Clorofilas; Cultivo con Acetato
de sodio: a). Tiempo-Nitrato, b). Tiempo-Fosfato; Cultivo con Carbonato de Amonio: c).
Tiempo-Fosfato, d). Tiempo-Carbonato Amonio
a). b).

c). d).
 5. CONCLUSIONES

1. A partir de los resultados, se puede concluir que el diseño de cultivo que mejora la
producción de proteínas es T3 (30 mM Acetato de sodio, 2,94 mM Nitrato de sodio
y 1,721 mM Fosfato de sodio) a los 5 días de cultivo, obteniéndose una
concentración de 0,953 g/L y 76% de la biomasa total.
2. El diseño de cultivo que mejora la producción de carbohidratos es T4 (30 mM
Acetato de sodio, 0,98 mM Nitrato de sodio y 0,574 mM Fosfato de sodio) a los 12
días de cultivo, obteniéndose una concentración de 1,008 g/L y 70% de la biomasa
total.
3. El diseño de cultivo que mejora la producción de Lípidos es T13 (20 mM Acetato
de sodio, 0,32 mM Nitrato de sodio y 1,147 mM Fosfato de sodio) a los 10 días de
cultivo, obteniéndose una concentración de 0,169 g/L y 14% de la biomasa total.
4. El diseño de cultivo que mejora la producción de Clorofilas es T2 (1,074 mM
Carbonato de amonio, 0,98 mM Nitrato de sodio y 1,721 mM Fosfato de sodio) a
los 10 días de cultivo, obteniéndose una concentración de 0,178 g/L y 13% de la
biomasa total.
 6. RECOMENDACIONES

1. Para estudios futuros se recomienda involucrar otras variables como la

concentración de Hierro y fuentes de carbono como CO2 con el fin de evaluar el
efecto que dichas variables puedan ocasionar en la producción de metabolitos.

2. Realizar los tratamientos propuestos aplicando otros métodos de extracción, con el

fin de evaluar y mejorar el rendimiento y eficiencia del proceso de extracción de
estos metabolitos.
 7. BIBLIOGRAFÍA

[1] Brennan L, Owende P. Biofuels from microalgae – a review of technologies for

production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renew. Sust. Energy
Rev. 2010; 14: 557–577.
[2] Liang Y, Sarkany N & Cui Y. Biomass and lipid productivities of Chlorella vulgaris under
autotrophic, heterotrophic and mixotrophic growth conditions. Biotechnol. Lett. 2009; 31(7):
1043-1049.
[3] Dufossé L, Galaup P, Yaron A, Arad S, Blanc P, Chidambara K & Ravishankar G.
Microorganisms and microalgae as sources of pigments for food use: a scientific oddity or
an industrial relality. Trends in Food Science and Technology. 2005; 16: 389-406.
[4] Chisti Y. Biodiesel from microalgae . Biotechnology Advances. 2007; 25: 294–306
[5] Schenk P, Thomas-Hall S, Stephens E, Marx U, Mussgnug J, Posten C, et al. Second
generation biofuels: high-efficiency microalgae for biodiesel production. Bioenerg. Res.
2008; 1:20–43
[6] Spolaore P, Joannis-Cassan C, Duran E, Isambert A. Commercial applications of
microalgae. J Biosci Bioeng. 2006; 101: 87 – 96.
[7] Scott SA, Davey MP, Dennis JS, Horst I, Howe CJ, Lea Smith DJ & Smith AG.
Biodiesel from algae: challenges and prospects. Current Opinion in Biotechnology. 2010;
21: 277-286.
[8] Heredia AT, Wei WRR & Hu B. Mixotrophic cultivation of chlorella vulgaris and its
potential application for the oil accumulation from non-sugar material. Biomass and
Bioenergy. 2011; 35: 2245-2253.
[9] Jae-Yon L, Chan Y, So-Young J, Chi-Yong A. & Hee-Mock O. Comparison of several
methods for effective lipid extraction from microalgae. Bioresource Technology. 2010; 101:
75-78.
[10] Gonzáles A. & Kafarov V. Microalgae based biorefinery: Issues to consider. Ciencia,
Tecnología y Futuro. 2011; 4: 5-22.
[11] Serive B, Kaas R, Berard JB, Pasquet V, Picot L & Cadoret JP. Selection and
optimization of a method for efficient metabolites extraction from microalgae. Bioresour.
Technol. 2012; 124: 311–320
[12] Um BH. & Kim YS. Review: A chance for Korea to advance algal.biodiesel technology.
Journal of Industrial and Engineering Chemistry. 2009; 15: 1-7.
[13] Alcántara C, García Encina PA. & Muñoz R. Evaluation of mass and energy balances
in the integrated microalgae. Chemical Engineering Journal. 2013; 221: 238-246.
[14] Borowitzka, M.A. Commercial production of microalgae: ponds, tanks, and fermenters.
Progress in Industrial Microbiology. 1999; 35: 313-321.
[15] O’Connor WA, Nell JA, Diemar JA. The evaluation of 12 algal species as food for
juvenile Sydney rock oysters Saccostrea commercialis (Iredale & Roughley). Aquaculture.
1992; 108: 277-283.
[16] Harun R, Singh M, Forde GM & Danquah MK. Bioprocess engineering of microalgae
to produce a variety of consumer products. Renewable and Sustainable Energy Reviews.
2010; 14: 1037–1047
[17] Hadj-Romdhane F, Jaouen P, Pruvost J, Grizeau D, Van Vooren G& Bourseau P.The
culture of Chlorella vulgaris in a recycled supernatant: Effects on biomass production and
medium quality. Bioresource Technology.2013; 132: 285–292
[18] Harun R, Danquah MK. Influence of acid pre-treatment on microalgal biomass for
bioethanol production. Process Biochem. 2011; 46(1): 304-309.

[19] Syrett PJ, Bocks SM & Merrett MJ. The Assimilation of Acetate by Chlorella Vulgaris.
J. Exp. Bot. 1964; 15 (1): 35-47.

[20] Becker, E.W., 2004. Microalgae in human and animal nutrition. In: Richmond, A. (Ed.),
Handbook of Microalgal Culture. Blackwell Publishing, Oxford, pp. 312– 351.

[21] Carlsson, A., Beilen, J., Möller, R., & Clayton, D. (2007). Micro-and macro-algae:
Utility for industrial applications. CPL Press.

[22] Chen Y & Vaidyanathan S. Simultaneous assay of pigments, carbohydrates, proteins

and lipids in microalgae. Analytica Chimica Acta. 2013; 776: 31– 40.

[23] Rojan, J., Anisha, G., Nampoothiri, M., & Pandey, A. (2011). Micro and macroalgal
biomass: A renewable source for bioethanol. Bioresource Technology, vol.102, 186-193.

[24] Borowitzka, M. A. (1999). Commercial production of microalgae: ponds, tanks, tubes

and fermenters. Journal of Biotechnology, vol. 70, 70:1-3:313-321.
[25] Li, Y., Horsman, M., Wang, B., Wu , N., & Lan , C. Q. (2008). Effects of nitrogen
sources on cell growth and lipid accumulation of green algae Neochloris oleabundans.
BIOTECHNOLOGICAL PRODUCTS AND PROCESS ENGINEERING, vol. 81, 629–636.
[26] Bhola, V., Desikan, R., Santosh, S. K., Subburamu, K., Sanniyasi, E., & Bux, F.
(2011). Effects of parameters affecting biomass yield and thermal behaviour of Chlorella
vulgarís. Journal of Bioscience and Bioengineering, vol. 111, 377-382.
[27] Hu, Q., Sommerfeld, M., Jarvis, E., Ghirardi, M., Posewitz, M., Seibert, M., Darzins,
A., 2008. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and
advances. Plant Journal 54, 621–639.
[28] Sánchez, S., Martínez, M. A., & Espinola, F. (2000). Biomass production and
biochemical variability of the marine microalga Isochrysis galbana in relation to culture
medium. Biochemical Engineering Journal, vol. 6, 13-18.
[29] Andersen, R.A. Algal culturing techniques. London: Elsevier Academic Press; 2005.
[30] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA & Smith F. Colorimetric method for
determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 1956; 28: 350-356.
[31] T. Rausch. The estimation of micro-algal protein content and its meaning to the
evaluation of algal biomass I. Comparisonof methods for extracting protein. Hydrobiologia.
1981; 78: 237-251.
[32] Lowry OH,Rosenbrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin
Phenol Reagent. J Biol Chem . 1951; 193: 265-275.
[33] Chen Y, Vaidyanathan S. A simple, reproducible and sensitive spectrophotometric
method to estimate microalgal lipids. Anal. Chim. Acta. 2012; 724: 67–72
[34] Wawrik B and Harriman B. Rapid, Colorimetric Quantification of Lipid from Algal
Cultures. The Journal of Microbiological Methods.2010; 80: 262-266.
[35] Illman AM, Scragg AH, Shales SW (2000) Increase in Chlorella strains calorific values
when grown in low nitrogen medium. Enz Microb Technol 27:631–635
[36] Dragone G, Fernandes BD, Abreu AP, Vicente AA, Teixeira JA. Nutrient limitation as
a strategy for increasing starch accumulation in microalgae. Appl. Energy. 2011a; 88 (10):
3331–3335.
[38] Álvarez M. Lipids in Microalgae. A review II. Environment. Grasas y Aceites. 1989;
40(3): 213-223.