Canovas 05 de 14 Materialymetodos

__________________________________________________________Material y Métodos
2. MATERIAL Y MÉTODOS
En este apartado se describe la metodología seguida en el trabajo y los

materiales utilizados. En referencia a los reactivos empleados, la mayoría fueron
adquiridos en Sigma-Aldrich Química (Madrid, España), por lo tanto sólo se hará
mención expresa de la procedencia en caso contrario.
2.1. OBTENCIÓN DEL MATERIAL BIOLÓGICO
La recogida del material biológico utilizado se realizó a partir de diferentes

fuentes, según el tipo de material y la especie animal. Mención aparte merecen
las muestras biológicas humanas, para cual se disponía del permiso de la
Comisión Nacional de Reproducción Asistida.
2.1.1. Obtención de espermatozoides
2.1.1.1. Espermatozoides porcinos
Las muestras de espermatozoides porcinos proceden de verracos de

fertilidad, del centro de inseminación artificial de la granja Lo Navarro de Murcia,
S.A. El semen se obtuvo mediante el método manual, recogiendo la fracción rica
del eyaculado. A continuación, en el laboratorio del centro de inseminación el
semen se diluyó 1:1 en BTS (Beltsville Thawing Solution) y se trasladó, protegido
de la luz, hasta el laboratorio de la Facultad de Veterinaria de Murcia.
2.1.1.2. Espermatozoides bovinos
Los espermatozoides de toro utilizados procedían de dosis seminales

congeladas de machos adultos de fertilidad comprobada, de la raza autóctona
“Asturiana de los Valles” cedidas por la Asociación de Criadores (ASEAVA, Gijón).
El semen se conservó en nitrógeno líquido (-196ºC) en pajuelas de 0’5 ml en el
laboratorio hasta su uso.
76
2.1.1.3. Espermatozoides humanos
Las muestras de espermatozoides humanos proceden de pacientes del

centro IVI-Murcia con problemas de fertilidad (que llamaremos muestras
“paciente”). Además se obtuvieron muestras de voluntarios de fertilidad probada
(que llamaremos muestras “donante”). En ambos casos los hombres dieron
previamente su consentimiento para el uso de dichas muestras. Además la
Comisión Nacional de Reproducción Asistida, autorizó el uso de muestras de
semen humano para los fines concretos de esta investigación, de acuerdo a la
legislación vigente.
Las muestras se obtuvieron mediante masturbación, después de un

período de abstinencia sexual de entre 3 a 5 días. Tras la recogida del eyaculado
en recipiente estéril, se dejó en estufa a 37ºC entre 30 y 60 minutos para permitir
su licuefacción y a continuación se realizó la capacitación.
2.1.2. Obtención de ovocitos
2.1.2.1. Ovocitos bovinos inmaduros
Los ovarios bovinos proceden de terneras con edades comprendidas entre

9 y 18 meses de edad, sacrificadas en el matadero Merca Murcia (El Palmar,
Murcia) se transportaron en contenedor isotermo hasta el laboratorio durante la
hora siguiente al sacrificio. Una vez en el laboratorio, los ovarios se lavaron en
solución salina y los folículos mayores de 6 mm de diámetro se aspiraron y su
contenido se descartó antes de comenzar a seccionar los demás folículos.
A continuación los folículos de entre 2 y 6 mm de diámetro se seccionaron

con el uso de un bisturí, realizando incisiones paralelas en toda la superficie del
ovario. El contenido se recogió en un vaso de precipitados que previamente
contenía medio de recogida (OCM). Posteriormente se procedió al filtrado del
77
contenido mediante un sistema “Millipore” (Figura 5), que dispone de un filtro de

“nylon” de 80µm diámetro de poro que permite el paso del fluido folicular y los
restos celulares de menor tamaño, quedando retenidos los ovocitos cuyo diámetro
aproximado es de 120µm. Se realizaron dos lavados añadiendo OCM limpio y a
continuación se volcó el contenido en placas de Petri para seleccionar los
ovocitos, utilizando un estereomicroscopio Nikon (modelo SMZ-10 A). Se
seleccionaron aquellos ovocitos que estuban rodeados por varias capas
compactas de células del cumulus oophorus y que mostraban un citoplasma
homogéneo.
Figura 5. Sistema de filtrado para recogida de ovocitos bovinos.
2.1.2.2. Ovocitos porcinos inmaduros
Los ovarios porcinos proceden de cerdas prepúberes sacrificadas en el

matadero El Pozo (Alhama de Murcia) y se transportaron en contenedor isotermo
tras el sacrificio hasta el laboratorio.
78
Los ovarios se lavaron en una solución de cetrimida (Bromuro de

hexadecil-trimetailamonio)y posteriormente en solución salina atemperada. Los
ovocitos se obtuvieron seccionando con hoja de bisturí, los folículos ováricos cuyo
diámetro oscilaba entre 3 y 6 mm. El contenido se mezcló con PBS y se dejó
sedimentar en tubos cónicos. Una vez eliminado el sobrenadante, el sedimento se
diluyó de nuevo con PBS limpio. Con ayuda del esteromicroscopio se
seleccionaron los ovocitos que presentaban un citoplasma homogéneo y estaban
rodeados de varias capas de células del cumulus oophorus con aspecto compacto
y uniforme.
En ambas especies, porcino y bovino, los ovocitos seleccionados se

aspiraron con una pipeta Pasteur adelgazada, de diámetro superior al de los
complejos cúmulos-ovocito (COC´s) y se colocaron en una placa con PBS.
Posteriormente se realizaron dos lavados con el medio de maduración
correspondiente en cada caso antes de transferirlos a la placa de maduración.
2.1.2.3. Ovocitos ovulados (oviductales)
Con la finalidad de obtener ovocitos porcinos y bovinos ovulados se

recogieron de matadero genitales de estas hembras en los que se observó que
los ovarios presentaban puntos de ovulación recientes y se transportaron en un
contenedor isotermo hasta el laboratorio. Allí, se aislaron los oviductos y se
realizó un lavado de los mismos con PBS introduciéndolo con una jeringa a nivel
de la unión
útero-tubárica y recogiéndolo por el otro extremo, en la zona del infundíbulo
(Figura 6). El contenido se observó en el estereomicroscopio y se obtuvieron los
ovocitos que había. Con este método se obtuvieron ovocitos ovulados in vivo y
que habían estado en contacto con las secreciones del oviducto, desde su
ovulación hasta la recogida.
79
FIGURA 6. OBTENCIÓN OVOCITOS MADURADOS IN VIVO
80
2.1.2.4. Ovocitos madurados in vivo (foliculares)

Para obtener ovocitos madurados in vivo, sin necesidad de intervenir
quirúrgicamente a los animales para este fin, se obtuvieron ovocitos de folículos
preovulatorios, a partir de ovarios de porcino y bovino obtenidos de matadero. Se
consideraron folículos preovulatorios aquellos que presentaban un diámetro
aproximado de 15mm o superior en el caso de la vaca (Vasconcelos y cols. 1999)
y próximo a los 10mm en el caso de la cerda (Conley y cols. 1994).
Los folículos seleccionados se aspiraron mediante una jeringa con aguja de
calibre 18Ga. A continuación el contenido folicular se colocó en una placa y se
observó en el estereomicroscopio y se localizaron los ovocitos.
2.1.3. Obtención de fluido oviductal
Los oviductos se obtuvieron a partir de genitales de terneras entre 9 y 18

meses de edad sacrificadas en matadero. Los ovarios junto a los oviductos
obtenidos en matadero, fueron transportados en seco en un contenedor isotermo
hasta su llegada al laboratorio donde se colocaron en un baño de hielo.
Una vez en el laboratorio los oviductos se separaron del ovario y se

diseccionaron eliminando el mesosálpinx que los rodeaba, utilizando tijeras y
pinzas. Una vez diseccionados, se procedió a la recogida del fluido existente en la
luz del oviducto, entre dos personas, utilizando una pipeta automática de 200 µl
(Figura 7).
A continuación el fluido obtenido se depositó en tubos pequeños y se

centrifugó durante 10 minutos a 7000g. Se aspiró el sobrenadante y se congeló
inmediatamente a –20ºC.
81
FIGURA 7. OBTENCIÓN DE FLUIDO OVIDUCTAL
82
2.2. MEDIOS DE TRANSPORTE, LAVADO y RECOGIDA DE LOS

GAMETOS
2.2.1. Medio de transporte de los ovarios
El medio utilizado para el transporte de los ovarios, desde el matadero

hasta los laboratorios de Fisiología Veterinaria de la Universidad de Murcia, en
ambas especies, fue solución salina fisiológica (SSF) con 100 UI/ml de penicilina
y 100 µg/ml de estreptomicina.
2.2.2. Medio de lavado de los ovarios
En el caso de ovarios de vacas se utilizó solución salina fisiológica (SSF)

para su lavado. Para los ovarios de cerda, se utilizó solución de cetrimida al
0’04% (w/v) y SSF. En ambos casos el lavado de los ovarios se realizó
inmediatamente tras la llegada al laboratorio.
2.2.3. Medio de recogida de ovocitos de vaca (OCM)
El medio de recogida utilizado fue el TCM-199 modificado con sales de

Hanks, L-Glutamina y rojo fenol, al que se le añadió bicarbonato sódico y Hepes,
ajustando el pH a 7’4 (ver cuadro anexo). El día de su uso fue suplementado con
suero fetal bovino (SFB), glutamina y antibióticos (Edwards y Hansen, 1996). El
SFB fue suministrado por “Biological Industries” (Beitz Haemek, Israel).
83
M
MEED
DIIO
ODDE
ERRE
ECCO
OGGIID
DAA
D
DEEO
OVVO
OCCIITTO
OSSD
DEEV
VAAC
CAA ((O
OCCM
M))
COMPONENTES CONCENTRACIÓN
M199 modificado con sales de

Hanks, L-glutamina y rojo fenol 10’6 mg/L
(M-0393)
? NaHCO3 4’2 mM
? Hepes 10 mM
? Suero fetal bovino 2%
? Glutamina 2 mM
? Penicilina 10.000 UI/ml
? Estreptomicina 10.000 UI/ml
2.2.4. Medio de recogida de ovocitos de cerda
El medio utilizado fue el Tampón Fosfato Salino de Dubelcco modificado

(PBS) suplementado con 1 mg/ml de alcohol polivinílico (PVA) y 0’005 mg/l de
rojo fenol como indicador de pH. Además, este medio fue utilizado para realizar
lavados de los ovocitos y para su manejo.
2.2.5. Medios de dilución de dosis seminales
El medio utilizado para la dilución de las dosis seminales de

espermatozoides porcinos fue BTS (Beltsville Thawing Solution; Pursel y Johnson,
1975).
84
D
Diilluuyyeennttee B
BTTS
S
((B
Beellttssvviillllee TThhaaw
wiinngg S
Soolluuttiioonn))
? Glucosa 0’0002 mM
? Na2EDTA·2H2O 3’36 mM
? NaHCO3 15 mM
? Citrato-Na 3·2H2O 20 mM
? KCl 5 mM
2.3. MEDIOS DE CULTIVO (MADURACIÓN Y FIV)
Algunos de los medios de cultivo utilizados fueron elaborados en el

laboratorio tal y como se indica a continuación. En estos casos se prepararon
usando agua ultrapura (Milli-Q). A continuación, se esterilizaron por filtración
mediante filtro de membrana con diámetro de 0’22 ìm en cabina de flujo laminar y
se conservaron en frigorífico a 4ºC el tiempo indicado para cada caso.
2.3.1. Medios de maduración in vitro (MIV) de ovocitos
El medio de MIV de ovocitos bovinos utilizado fue TCM-199 modificado con

sales de Earle, L-Glutamina y rojo fenol, al que se le añadió bicarbonato y se
ajustó el pH a 7’35. Cuatro horas antes de su utilización se le adicionó
L-glutamina, piruvato de sodio, SFB, gentamicina, hCG (Chorulon, Intervet
Internacional B.V., Boxmeer, Holanda) y PMSG (Foligon, Intervet Internacional
B.V., Boxmeer, Holanda), y se equilibró en cámara de cultivo con atmósfera
humidificada a 38’5ºC y 5% de CO2 (Edwards y Hansen, 1996).
85
M
MEED
DIIO
ODDE
EMMA
ADDU
URRA
ACCIIÓ
ÓNN IIN
NVVIITTR
ROO
D
DEEO
OVVO
OCCIITTO
OSSB
BOOV
VIIN
NOOS
S ((O
OMMM
M))
? M199 con L-Glutamina y 9’5 mg/L

sales de Earle´s
? NaHCO3 26’2 mM
? L-Glutamina 2 mM
? Piruvato sódico 0’2 mM
? Suero Fetal Bovino 10 %
? Gentamicina 50 µg/ml
? FSH 10 UI/ml
? LH 10 UI/ml
Para la MIV de ovocitos porcinos se empleó el medio NCSU-37. Se preparó

una solución “stock” que se conservó en condiciones estériles a 4°C durante un
máximo de dos semanas. En el momento de su uso, se suplementó tal y como
describieron Funahashi y cols. (1997) y como se refleja a continuación.
M
MEED
DIIO
ODDE
EMMA
ADDU
URRA
ACCIIÓ
ÓNND
DEE
O
OVVO
OCCIITTO
OSSP
POOR
RCCIIN
NOOS
S ((N
NCCS
SUU--3377))
? NaCl 108’73 mM
? NaHCO3 25’07 mM
? KCl 4’78 mM
? KH2PO4 1’19 mM
? MgSO4•7H2O 1’19 mM
? CaCl2•2H2O 1’70 mM
? Glucosa 5’55 mM
? D-Sorbitol 12’00 mM
? Penicilina G sódica 0’18 mM
? Estreptomicina 39’00 UI/ml
86
S
SUUP
PLLE
EMME
ENNTTO
OAALL M
MEED
DIIO
ODDE
EMMA
ADDU
URRA
ACCIIÓ
ÓNND
DEEO
OVVO
OCCIITTO
OSS
D
DEEC
CEER
RDDA
A ((N
NCCS
SUU--3377))
? Cisteína 0’57 mM
? â-mercaptoetanol 50’00 ìM
? Insulina 5’00 mg/l
? dbAMPc 1’00 mM
? Fluido folicular porcino 10% (v/v)
? PMSG 10 UI/ml
? hCG 10 UI/ml
El fluido folicular porcino (PFF) es un fluido biológico que in vivo ocupa el

interior del folículo ovárico donde se aloja el ovocito. Este fluido se forma
mayoritariamente como un trasudado de plasma a través de la lámina basal del
folículo y se va acumulando en el antro folicular. Está compuesto por proteínas
propias del plasma y además posee esteroides y glucoproteínas sintetizadas por
las células de la pared folicular. Los folículos antrales grandes, contienen
concentraciones altas de 17β-estradiol en la fase folicular y de progesterona en
los momentos próximos a la ovulación (Hafez, 2000).
El PFF utilizado se obtuvo mediante aspiración con jeringa de los folículos

presentes en los ovarios obtenidos de matadero. Posteriormente, el fluido se
centrifugó a 4ºC durante 30 minutos a 3000g y se recogió el sobrenadante. A
continuación se filtró a través de filtros de membrana de 0’2µm y se congeló hasta
su uso a –20ºC.
87
2.3.2. Medios de FIV
El medio de FIV bovina utilizado fue el FIV-TALP. Inicialmente se preparó

el medio “FIV-stock” ajustado a un pH de 7’3, el cual se mantuvo en frigorífico a
4ºC en condiciones estériles hasta 15 días. Previo a su uso, el “FIV-stock” se
suplementó con BSA, piruvato de sodio, heparina y antibiótico como lo describen
Parrish y cols. (1988), pasando a denominarlo “FIV-TALP”. Se equilibró durante
24 horas en cámara de cultivo con atmósfera humidificada a 38’5ºC y 5% de CO2.
Para la fecundación, 30 minutos antes, se añadieron 50 µl/ml de la mezcla
epinefrina-hipotaurina-penicilamina (PHE). La solución final de PHE que se utilizó
se preparó a partir de la mezcla de las soluciones intermedias (A, B, C y D), cuya
composición de cada una de ellas se indica en la tabla correspondiente y PBS.
M
MEED
DIIO
ODDE
E FFE
ECCU
UNND
DAAC
CIIÓ
ÓNND
DEE
O
OVVO
OCCIITTO
OSSD
DEEV
VAAC
CAA ((FFIIV
V--S
STTO
OCCK
K))
? NaCl 114 mM
? KCl 3’2 mM
? NaH2PO4•H2 O 0’3 mM
? Ácido láctico 10 mM
? CaCl2•2H2O 2 mM
? NaHCO3 25 mM
? MgCl2•6H2O 0’5 mM
88
P
PHHE
E
SOLUCIÓN A (10 ml)

? Solución salina 10 ml
? Hipotaurina 1 mM
SOLUCIÓN B (10 ml)

? Solución salina 10 ml
? Penicilamina 2 mM
SOLUCIÓN C (50 ml)

? Ácido láctico 29’43 mM

? Meta bisulfito 5’29 mM
sódico
? PBS 50 ml
SOLUCIÓN D (40 ml)

? Solución C 40 ml
? Epinefrina 1’83 mg
SOLUCIÓN FINAL (40 ml)

COMPONENTES VOLUMEN
? Solución A 10 ml
? Solución B 10 ml
? Solución D 4 ml
? PBS 16 ml
89
Para la FIV en la especie porcina, se utilizó el medio TALP con las

modificaciones descritas por Rath y cols. (1999). Se preparó una solución “stock”
denominada “TALPp stock” la cual se conservó bajo condiciones estériles a 4°C
durante un máximo de dos semanas.
M
MEED
DIIO
ODDE
E FFE
ECCU
UNND
DAAC
CIIÓ
ÓNNP
POOR
RCCIIN
NAA((TTA
ALLP
Ppp ssttoocckk))
? NaCl 114’06 mM
? NaHCO3 25’07 mM
? KCl 3’20 mM
? Lactato Ca•5H2O 8’00 mM
? Lactato sódico 10’00 mM
? Glucosa 5’00 mM
? Cafeína 2’00 mM
? Sulfato de kanamicina 0’17 mM
? Rojo fenol 0’003 mM
? PVA 1 mg/ml
Previamente a su uso como medio de fecundación, el medio “TALPp stock”

se suplementó con 3 mg/ml de albúmina sérica bovina libre de ácidos grasos
(BSA-FAF) y 0’12 mg/ml de piruvato sódico. El pH se ajustó hasta 7’4 en un
incubador al 5% de CO2, 38’5°C y atmósfera saturada de humedad durante 5h
antes de su uso.
90
2.3.3. Medios de manipulación y capacitación de espermatozoides
El medio utilizado para la manipulación y capacitación de los

espermatozoides bovinos fue SPERM-TALP (Edwards y Hansen, 1996) cuyo
“stock” se preparó tal y como se indica a continuación en la tabla (SPERM-TALP
STOCK”. En el momento de usarlo, se le añadió BSA, piruvato de sodio, heparina
y antibióticos, denominándose SPERM-TALP. Para la capacitación se utilizó un
gradiente de Percoll® al 90% y 45% en SPERM-TALP.
M
MEED
DIIO
ODDE
EMMA
ANNIIP
PUULLA
ACCIIÓ
ÓNNY
YCCA
APPA
ACCIITTA
ACCIIÓ
ÓNND
DEE
E
ESSP
PEER
RMMA
ATTO
OZZO
OIID
DEES
SBBO
OVVIIN
NOOS
S
SPERM-TALP STOCK
? NaCl 100 mM
? KCl 3’2 mM
? Ácido láctico 21’5 mM
? CaCl2•2H2O 2 mM
? NaHCO3 25 mM
? Hepes 10 mM
M
MEED
DIIO
ODDE
EMMA
ANNIIP
PUULLA
ACCIIÓ
ÓNNY
YCCA
APPA
ACCIITTA
ACCIIÓ
ÓNND
DEE
E
ESSP
PEER
RMMA
ATTO
OZZO
OIID
DEES
SBBO
OVVIIN
NOOS
S
SPERM-TALP
? Sperm-TALP-Stock
? BSA 6 mg/ml
? Piruvato sódico 1 mM
? Heparina 1’75 UI/ ml
? Penicilina 10.000 UI/ml
? Estreptomicina 10.000 UI/ml
91

P
PEER
RC OLLLL
CO
10X STOCK
? NaCl 799’96 mM
? KCl 30’85 mM
? NaH2PO4•H2 O 28’98 mM
PERCOLL 90% (200 ml)

? 10 X Stock 20 ml
? NaHCO3 25 mM
? Percoll 180’0 ml
? MgCL2•6H2O 0’395 mM
? CaCl2 1’95 mM
PERCOLL 45% (10 ml)

? 90% Percoll 5 ml
? SPERM-TALP 5 ml
El medio de manipulación y capacitación de espermatozoides porcinos fue

el TALP, suplementado del mismo modo que cuando se utilizó como medio de
fecundación. Además se utilizó Percoll (Amershan Biosciences, Upsala, Suecia)
90% y 45% preparado según la composición descrita en la tabla anterior, para la
capacitación.
92
Para la manipulación y capacitación de espermatozoides humanos se utilizó “IVF

Medicult” (Sydney, Australia) y “PureSperm Nidacom” (International AB, Suecia)
cuya composición cualitativa declarada según el fabricante es la que se indica a
continuación:
M
MEED
DIIO
ODDE
ECCU
ULLTTIIV
VOOP
PAAR
RAAG
GAAM
MEETTO
OSS
H
HUUM
MAAN
NOOS
S ((IIV Meeddiiccuulltt 
VFF M ))
Componentes declarados por el fabricante
? Solución balanceada de Sales de Earle

(EBSS)
? Albúmina sérica humana (HSA)

? Glucosa
? Bicarbonato sódico
? Penicilina 50.000 UI/l
? Estreptomicina 50 mg/l
? Rojo Fenol
M
MEED
DIIO
ODDE
EMMA
ANNIIP
PUULLA
ACCIIÓ
ÓNNY
YCCA
APPA
ACCIITTA
ACCIIÓ
ÓNN D
DEE
E
ESSP
PEER
RMMA
ATTO
OZZO
OIID
DEES
SHHU
UMMA
ANNO
OSS
PureSperm
Componentes declarados por el fabricante
? Sílice recubierta de silano

? Hepes
? Cloruros de sodio, potasio y
calcio
? EDTA
? Glucosa
? Agua
93
2.4. PROCESADO DE LOS ESPERMATOZOIDES
2.4.1. Procesado de espermatozoides porcinos
Para su capacitación se utilizó gradiente de Percoll® 90% y 45% (v/v),

sobre el que se depositó un volumen de 0’5 ml del semen diluido previamente en
BTS. Se centrifugó a 700g durante 30 minutos. Las células espermáticas que
atravesaron el gradiente y se depositaron en el fondo fueron aspiradas y se
lavaron en medio TALP mediante centrifugación a 100g durante 10 minutos. Tras
la centrifugación los espermatozoides se resuspendieron de nuevo en medio
TALP. Se utilizó una alícuota de esta suspensión para comprobar la motilidad y
determinar la concentración espermática mediante recuento en hemocitómetro,
para ajustarla a una concentración final de 105 células/ml.
2.4.2. Procesado de espermatozoides bovinos
Los espermatozoides bovinos se procesaron de manera similar a la

descrita para los espermatozoides porcinos. Treinta minutos antes de la FIV se
procedió a la descongelación de la pajuela de semen (0’5 ml) en baño a 38’5ºC
durante 45 segundos y se depositó el semen de la pajuela en un gradiente de
Percoll® 90% y 45% en SPERM-TALP, previamente atemperado (Parrish y cols.,
1988). Seguidamente se centrifugó a 900g durante 10 minutos y se resuspendió
el precipitado en 10 ml de medio “SPERM-TALP”. Se centrifugó nuevamente a
300g durante 8 minutos y tras retirar el medio “SPERM-TALP”, el precipitado
obtenido se homogeneizó en 500 µl de medio FIV-TALP, previamente equilibrado.
Se utilizó una alícuota de esta suspensión para comprobar la motilidad y
determinar la concentración espermática mediante recuento en hemocitómetro. El
resto de la suspensión se mantuvo en la cámara de cultivo mientras se calculó el
volumen a utilizar de la suspensión espermática para alcanzar una concentración
de 106 espermatozoides/ml que se utilizó para la FIV bovina.
94
2.4.3. Procesado de espermatozoides humanos
Un total de 60 muestras de semen humano fueron utilizadas. Tras la

licuefacción de las muestras, se utilizó un gradiente de densidad para seleccionar
los espermatozoides mótiles. El medio utilizado fue PureSperm Nidacom
(International AB, Suecia) a 90% y 45%. Una vez depositado 1 ml del semen
sobre el gradiente se sometió a centrifugación a 300g durante 15minutos y se
recuperó el sedimento, el cual se lavó con medio de cultivo (IVF Medicult o TALP
según la experiencia) a 600g durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el
sedimento se resuspendió en un volumen pequeño del medio utilizado. Una
muestra alícuota de esta suspensión se utilizó para evaluar la motilidad y
determinar la concentración espermática mediante recuento en hemocitómetro,
mientras el resto de la suspensión se mantuvo en la cámara de cultivo mientras
se calculó el volumen a utilizar de la suspensión espermática para alcanzar la
concentración deseada en cada experiencia.
2.5. INDUCCIÓN Y VALORACIÓN DE LA RA
2.5.1. Inducción de RA con ionóforo de calcio
Para la inducción de la RA con inóforo de calcio, se utilizó el ionóforo

A23187 (Fluka, Madrid, España). Los espermatozoides humanos previamente
capacitados mediante gradientes de “PureSperm” fueron incubados con 5µM de
ionóforo de calcio durante 3 horas a 38’5ºC en medio de fecundación (TALP o IVF
Medicult, según los grupos). Finalmente, los espermatozoides fueron
centrifugados y lavados dos veces con medio limpio para eliminar los restos de
ionóforo y una alícuota de esta muestra se utilizó para valorar el estado del
acrosoma. El resto de la muestra fue utilizado en los experimentos que
correspondían.
95
2.5.2. Inducción de RA con agonistas naturales.
Como agonistas naturales de la inducción de la RA en espermatozoides

humanos se utilizaron progesterona y fluido folicular porcino. Los agonistas se
añadieron al medio de fecundación, de forma separada. Las concentraciones
utilizadas fueron 10µM de progesterona, mientras que el fluido folicular se añadió
a razón del 2% en el medio.
2.5.3. Valoración de la RA
Para la valoración del estado del acrosoma de los espermatozoides

humanos unidos a la ZP, se siguió el método descrito por Liu y Baker (1996)
utilizado para espermatozoides humanos, cuya representación esquemática
aparece en la Figura 8.
Tras la incubación con los ovocitos, los espermatozoides con una adhesión
lábil se eliminan aspirando los ovocitos varias veces con una pipeta de cristal de
diámetro amplio; posteriormente los espermatozoides que permanecen unidos de
forma son despegados de la superficie de la ZP utilizando una pipeta de diámetro
ligeramente inferior al diámetro del ovocito (aproximadamente 120 µm) en un
pequeño volumen. Para su fijación se colocan sobre una pequeña área delimitada
de un portaobjetos, dejando secar al aire y posteriormente se permeabiliza con
metanol durante 30 minutos. Finalmente se realiza la tinción con la lectina PSA
marcada con fluoresceína (FITC–PSA), a una concentración de 40µg/ml durante
20 minutos en estufa a 38’5ºC. Las muestras se montaron utilizando DABCO y
cubreobjetos, procediendo inmediatamente a su evaluación en el microscopio de
fluorescencia. Se realizó el recuento de 200 espermatozoides para cada uno de
los pocillos donde se habían incubado los espermatozoides. El resultado obtenido
se expresó como porcentaje de RA.
96
Para evaluar el estado del acrosoma tras la tinción, se siguieron los

criterios descritos por Cross y cols. (1988), Cummins y cols. (1991) y Franken y
cols. (2000). Se consideraron como espermatozoides con el acrosoma
reaccionado aquellos que presentaban algunos de los siguientes patrones: i)
presencia de una zona teñida diferencial en la region ecuatorial a modo de banda;
ii) ausencia de tinción sobre la superficie completa de la cabeza espermática y iii)
tinción a modo de parcheado sobre la región acrosomal (Figura 9).
Espermatozoides
unidos a la ZP
Pipeta
Separación
mecánica de los
espermatozoides
unidos a la ZP
Espermatozoides
atravesando la ZP Fijación y tinción de los
espermatozoides separados
Evaluación de la Evaluación de
penetración de la ZP la RA
Figura 8. Representación esquemática de la técnica para determinar la inducción de la RA con ZP

intacta. (Modificado de Liu y cols. 2004).
97
FIGURA 9. VALORACIÓN RA
98
2.6. MADURACIÓN IN VITR0 DE OVOCITOS
2.6.1. MIV de ovocitos bovinos
La MIV de los ovocitos seleccionados se efectuó en placas de intercambio

TM
gaseoso de cuatro pocillos (Nunclon , Nunc, Dinamarca), en medio de
maduración. La proporción de ovocitos/medio fue de 50/500µl. La maduración se
realizó en atmósfera humidificada a 38’5ºC y 5% de CO2. En la vaca el tiempo de
MIV de los ovocitos fue de 24 horas en OMM.
2.6.2. MIV de ovocitos porcinos
En la especie porcina, la MIV de los ovocitos se realizó en las mismas

condiciones de incubación descritas para la especie bovina. El medio utilizado fue
NCSU-37. Transcurridas las primeras 20-22 horas de maduración, los complejos
cumulus oophorus-ovocito (CCO’s) fueron transferidos a medio sin PMSG, hCG y
dbAMPc donde se lavaron dos veces y se cultivaron durante otras 20-22 horas
(Funahashi y Day, 1993).
2.6.3. Preincubación de ovocitos porcinos y bovinos en DTSP
El DTSP, o Di(N-succinimidil) 3,3'-ditiodipropionato Dithiobis(succinimidil

propionato, (Fluka), fue diluido en DMSO a razón de 25 mg/ml y congelado a
–20ºC hasta su uso.
C14H16N2O8S
2
Peso molec ular 404.42
Figura 10. Est ruc t ura molec ular de l DTSP
99
Tras la maduración, y antes del momento de la fecundación, los ovocitos

maduros se incubaron durante 30 minutos con DTSP a diferentes
concentraciones según los grupos (0’06, 0’30 y 0’60 mg/ml) en medio de
fecundación. Un grupo control con un volumen similar de DMSO se empleó como
control en uno de los replicados. Posteriormente, los ovocitos fueron lavados en
medio de fecundación limpio y se procedió a su fecundación.
2.6.4. Preincubación de ovocitos porcinos y bovinos en fluido oviductal
El fluido oviductal bovino congelado, obtenido previamente como se indicó

en el apartado 2.1.3, se descongeló antes de su uso, manteniéndolo en el
incubador para atemperarlo a 38’5ºC, antes de incubar los ovocitos en el mismo.
A continuación se colocó una gota de 50 µl de fluido en el interior de uno de los
pocillos de una placa de cultivo “Nunclon” y se cubrió con aceite mineral para
evitar su evaporación. Se aspiró una pequeña cantidad de fluido en la pipeta a
utilizar y los ovocitos, previamente lavados en PBS se introdujeron con la menor
cantidad de medio en las gotas de fluido correspondientes. La proporción entre el
volumen de fluido oviductal y el número de ovocitos incubados en el mismo fue de
1µl:1ovocito. La placa se mantuvo en el incubador a 38’5ºC con 5% de CO2 y
atmósfera saturada de humedad durante 30 minutos. Una vez finalizado el tiempo
de incubación, los ovocitos fueron lavados en PBS y utilizados para diferentes
experimentos (tiempo de digestión con pronasa o FIV).
2.7. DIGESTIÓN DE LA ZP CON PRONASA
En todos los grupos de ovocitos sometidos al proceso de digestión de la ZP

con pronasa, de forma previa a la digestión, se eliminaron las células del cumulus
oophorus con una pipeta automática, para facilitar la observación de la ZP.
100
2.7.1. Tiempo de digestión de la ZP
Los ovocitos denudados se lavaron en PBS y se distribuyeron en grupos de

10, en microgotas de 50 µl de solución de pronasa de Streptomyces griseus (4
U/mg) al 0’5 % en PBS. Una vez que se introdujeron en la microgota de pronasa
comenzó a medirse el tiempo. Se consideró como tiempo final, el momento en
que se observó la digestión completa de la ZP (Figura 11). Los ovocitos se
observaron bajo el esteromicroscopio a 20 y 40 aumentos de forma continua
durante los primeros 10 minutos de contacto con la pronasa. En los casos en que
trascurridos los 10 minutos no se observó la digestión de la ZP, se controlaron de
forma regular cada minuto. Transcurrida 1 hora sin observar la digestión de la ZP
la frecuencia con que se controlaron fue aproximadamente cada 5 minutos y
transcurridas 3 horas se controló el estado de la ZP cada 15 minutos
aproximadamente. En los casos en que la ZP fue disolviéndose muy lentamente,
para determinar el momento de la digestión completa de la ZP se observaron bajo
microscopio invertido con óptica Hoffman a 200 aumentos.
2.7.2. Obtención de ovocitos libres de ZP
La metodología seguida para este proceso fue similar a la descrita en el

apartado anterior en cuanto al enzima utilizado y distribución de los grupos. Se
prestó especial atención a retirar rápidamente de la pronasa los ovocitos en el
momento que se observó la digestión completa de dicha estructura.
Seguidamente se procedió a realizar tres lavados de los ovocitos en PBS
atemperado con abundante volumen, con la finalidad de eliminar los posibles
restos de la pronasa. A continuación se mantuvieron en PBS atemperado durante
10 minutos, antes de ser inseminados.
101
FIGURA 11. DIGESTIÓN ZP.
102
2.8. FECUNDACIÓN IN VITRO
2.8.1. FIV homóloga (porcina y bovina)
En la especie porcina, se depositaron 50 ovocitos en 250 µl de medio TALP

y se añadieron 250µl de espermatozoides procesados con Percoll® según se ha
descrito anteriormente. El tiempo de cocultivo de los ovocitos con los
espermatozoides fue de 4 horas. Después de este tiempo, los ovocitos se lavaron
muy bien mediante suscesivos pases a través de una pipeta Pasteur adelgazada
para eliminar el exceso de espermatozoides adheridos a la ZP y se introdujeron
en medio de fecundación TALP limpio hasta el día siguiente.
En la especie bovina, se retiró el medio de MIV del pocillo donde se

encontraban los 50 ovocitos y rápidamente se añadieron 500µl del medio de FIV,
donde además se añadieron 25µl de PHE y se incubó durante 30 minutos
aproximadamente antes de proceder a la inseminación. En el momento de la
inseminación, se añadió la cantidad de semen necesaria para alcanzar una
concentración de 106 espermatozoides. El cocultivo se mantuvo durante 18-20
horas en incubador.
Una vez finalizado el periodo de cocultivo se procedió a la evaluación de la

fecundación, mediante tinción y valoración en microscopio óptico de
fluorescencia.
2.8.2. FIV homóloga y heteróloga con ovocitos libres de ZP
Para la FIV de ovocitos libres de ZP (en ambos casos) se utilizaron

ovocitos porcinos de MIV, a los cuales se les eliminó la zona mediante digestión
con pronasa, según lo descrito en el apartado 2.7.
103
Posteriormente, grupos de 50 ovocitos sin ZP fueron incubados en gotas

de 40µl medio de FIV previamente equilibrado. Los espermatozoides porcinos o
humanos fueron procesados según se describe en los apartados 2.4.1 y 2.4.3. Un
volumen de 10µl del semen fue añadido a cada gota que contenía los ovocitos.
Para los espermatozoides humanos, se utilizó inducción de la RA (ver apartado
2.5) en tres grupos utilizando ionóforo de Ca2+ o agonistas naturales
(progesterona o fluido folicular), junto a un grupo de espermatozoides sin
inducción de la RA.
A las 18-20 horas postinseminación, los ovocitos se lavaron en PBS y se

sometieron a fijación y tinción según lo descrito en el apartado 2.8.5.
2.8.3. FIV heteróloga con ovocitos completos
Para la coincubación de gametos heterólogos, se utilizaron ovocitos

porcinos de MIV, según la metodología descrita anteriormente. Las muestras de
espermatozoides humanos, previamente capacitados y resuspendidos en medio
de fecundación (IVF Medicult o TALP) según se ha descrito, se incubaron en
presencia o ausencia de ovocitos porcinos. El número de ovocitos fue de 15 por
microgota de 50µl. La coincubación se mantuvo durante 2’5 horas a 38’5ºC en el
incubador. Además, se incluyó un grupo en el que los espermatozoides humanos
fueron coincubados con ovocitos porcinos madurados in vitro, a los que
previamente se les había eliminado la ZP. Transcurrido el período de
coincubación, se procedió a la valoración de la RA como se ha descrito en el
apartado 2.5.3.
2.8.4. Inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)
Los ovocitos utilizados para la ICSI, fueron ovocitos que tras 44 horas de
maduración, se denudaron eliminando las células del cumulus oophorus mediante
sucesivos pases de los COC’s a través de una pipeta automática. Posteriormente,
104
se lavaron dos veces en PBS y se colocaron de forma individual en microgotas en

las placas de microinyección.
Las placas utilizadas para realizar la ICSI fueron “Falcon petri dish
50x9mm” en las cuales se colocaron 3 gotas centrales de 4ìl de la solución de
PBS suplementado con 10% suero fetal bovino y se añadió 1ìl de semen por
gota, rodeadas por un número variable (10-14) de microgotas con un volumen de
4ìl de PBS y un ovocito por gota. Lasmicrogotas se cubrieron con aceite mineral
para evitar su evaporación.
Para la microinyección se utilizó un microscopio invertido Nikon Diaphot

300 con óptica de Hoffman con los correspondientes micromanipuladores
TransferMan NK (Eppendorf) y microinyectores CellTram Air/CellTram Oil
(Eppendorf). Dicho microscopio contaba con una placa térmica que mantiene la
temperatura a 38’5ºC. En primer lugar mediante una pipeta Eppendorf Custom Tip
sterile (diámetro interno 8ìm) se seleccionó e inmovilizó un espermatozoide. A
continuación se realizó la inmovilización del ovocito mediante la pipeta de sujeción
(Eppendorf Sterile VacuTips), colocando el ovocito maduro con el corpúsculo
polar en posición de 6 ó 12 horarias, con el fin de evitar causar daño en la placa
metafásica. A continuación, se presionó con la pipeta de microinyección en la
posición de las 3 horarias para atravesar la ZP. Para comprobar si el extremo de
la pipeta estaba en el interior se aspiró citoplasma para confirmar que se había
atravesado el oolema, y se inyectó el espermatozoide en el interior del citoplasma,
retirando la pipeta de forma cuidadosa para evitar arrastrar al espermatozoide
fuera del ovocito.
Tras la microinyección, los ovocitos se lavaron en TALP y se dejaron

en el incubador a 38’5ºC con 5% de CO2 y atmósfera saturada de humedad. La
formación pronuclear se valoró a las 18-20 horas después de la microinyección.
105
2.8.5. Valoración de los resultados
Para evaluar los resultados de FIV, a las 18-20 horas post inseminación o
post-ICSI los ovocitos se fijaron en glutaraldehído al 0’5% en PBS durante 30
minutos. A continuación los ovocitos se lavaron en PBS y se incubaron en
oscuridad con una solución de Hoechst 33342 (1mg/ml) durante 15 minutos.
Transcurrido ese tiempo, los ovocitos se lavaron otra vez en PBS, y se adicionó
sobre los mismos con la pipeta una pequeña cantidad de solución de montaje
compuesta de Hoechst 1 mg/ml en PBS y glicerol en proporción 1:1 (v/v). A
continuación, con una pipeta Pasteur se colocaron sobre un portaobjetos y sobre
éste se colocó un cubreobjetos que se selló con esmalte. En el caso de los
ovocitos sin ZP, este paso se realizó cuidadosamente para evitar la ruptura de la
membrana plasmática del ovocito. Tras la tinción, los ovocitos fueron evaluados
bajo microscopio de fluorescencia (Leica DMR) con filtro de fluorescencia para luz
ultravioleta a 200-400 aumentos.
En la evaluación (Figura 12) se observó el estadio nuclear del ovocito

(vesícula germinal, metafase, pronúcleo u otros) y la presencia/ausencia de
espermatozoides y el estado en que se encontraban (espermatozoide compacto,
descondensado, pronúcleo masculino, otros).
En el caso de la FIV heteróloga, se consideraron ovocitos no penetrados,

aquellos que mostraron signos de no activación como la presencia de la placa
metafásica, independientemente de la presencia de espermatozoides compactos
en el ovocito.
Las variables estudiadas en el caso de la FIV homológa (porcino y bovino)

fueron: porcentaje de ovocitos penetrados, número de espermatozoides por
ovocito y porcentaje de ovocitos penetrados monospérmicos (los que tenían 2
pronúcleos o 1 pronúcleo y un espermatozoide descondensado). En el
experimento de ICSI las variables analizadas fueron porcentaje de ovocitos
activados y porcentaje de formación de pronúcleos masculino y femenino.
106
FIGURA 12 EVALUACION FIV

Parte a
107
FIGURA 12 EVALUACION FIV

Parte b
108
2.9. DISEÑO EXPERIMENTAL
2.9.1. Bloque I: Modificaciones en la ZP que afectan a la interacción

espermatozoide-ovocito homóloga
2.9.1.1. Endurecimiento de la ZP porcina y bovina con agentes

químicos
2.9.1.1.1. Efecto del DTSP sobre la resistencia de la ZP a la

digestión con pronasa y sobre los resultados de FIV en la
especie porcina
Experimento 1
Para comprobar el efecto del DTSP sobre el endurecimiento de la ZP

porcina se utilizaron un total de 104 ovocitos porcinos. Un grupo de 50 ovocitos
(grupo control) se mantuvo en el medio de FIV sin ningún tratamiento, mientras
que el resto se incubó con DTSP según se ha descrito en la metodología. Se
realizaron 4 replicados con 12-14 ovocitos por grupo y replicado. Se registró para
cada ovocito el tiempo que tardó la ZP en ser digerida.
Experimento 2
Para evaluar el efecto del DTSP sobre los resultados de fecundación se

emplearon grupos de 100 ovocitos, 50 de los cuales se utilizaron como control y
los restantes fueron tratados con DTSP (0’60 mg/ml) antes de la fecundación. Se
realizaron 3 replicados y se evaluó el porcentaje de penetración, el porcentaje de
monospermia y el número medio de espermatozoides por ovocito penetrado.
109
Experimento 3
Con el fin de averiguar si el efecto del DTSP sobre los resultados de FIV
era dosis dependiente, se utilizaron 3 concentraciones distintas del producto
(0’06, 0’30 y 0’60 mg/ml) para el tratamiento de los ovocitos previo a la FIV, junto
a un grupo control (sin el producto). Se emplearon aproximadamente 80 ovocitos
por grupo, distribuidos en 4 replicados, con un total de 338 ovocitos utilizados.
Tras la FIV se evaluó el porcentaje de penetración, el porcentaje de monospermia
y el número medio de espermatozoides por ovocito penetrado.
2.9.1.1.2. Efecto del DTSP sobre la resistencia de la ZP a la

especie bovina
Experimento 4
Con el objetivo de comprobar el efecto del DTSP sobre el endurecimiento

de la ZP bovina se utilizaron un total de 144 ovocitos bovinos, distribuidos en dos
grupos. Aproximadamente la mitad de los ovocitos (n=70, grupo control) se
mantuvo en el medio de FIV sin ningún tratamiento, mientras que el resto (n=74)
se incubó con DTSP según se ha descrito en la metodología. Se realizaron 4
replicados con un total de 15-20 ovocitos por grupo y se registró para cada
ovocito el tiempo que tardó la ZP en ser digerida.
Experimento 5
Para evaluar el efecto del DTSP sobre los resultados de fecundación se

emplearon un total de 138 ovocitos, repartidos en dos grupos. Aproximadamente
la mitad se utilizaron como control y los restantes fueron tratados con DTSP
(0’60 mg/ml) antes de la fecundación. Se realizaron 3 replicados y se evaluó el
110
porcentaje de penetración, el porcentaje de monospermia y el número medio de

espermatozoides por ovocito penetrado.
2.9.1.2. Endurecimiento de la ZP porcina y bovina con agentes

biológicos
2.9.1.2.1. Efecto del fluido oviductal sobre la resistencia a la

especie porcina
Experimento 6
En este experimento se utilizaron un total de 139 ovocitos porcinos para

comprobar el efecto del fluido oviductal sobre el endurecimiento de la ZP porcina.
Para ello, se incubaron en grupos de 12-14 un total de 54 ovocitos madurados in
vitro en fluido oviductal bovino, mientras que el grupo control (52 ovocitos) se
mantuvo en TALP. Se realizaron 3 replicados y a continuación se registró para
cada ovocito el tiempo que tardó la ZP en ser digerida utilizando pronasa al 0’5%.
Además, se obtuvieron ovocitos ovulados, tal y como se describe en el

apartado 2.1.2.3 y se registró el tiempo necesario para digerir la ZP utilizando
pronasa. También se obtuvieron ovocitos madurados in vivo de origen folicular,
mediante aspiración de folículos preovulatorios.
Experimento 7
En este experimento se estudió si el efecto del fluido oviductal se mantenía

constante a lo largo del tiempo, después de finalizada la incubación de los
ovocitos en dicho fluido. Para ello se utilizaron ovocitos porcinos madurados in
vitro distribuidos en 11 grupos. Inicialmente los ovocitos se dividieron según se
incubaran o no en fluido oviductal. Los ovocitos no incubados correspondían al
grupo control, con un total de 83 ovocitos, que se incubaron en medio TALP y se
111
evaluaron para registrar el tiempo de digestión con pronasa. El resto se

incubaron en fluido oviductal durante 30 minutos. Tras la incubación, un grupo de
ovocitos se utilizó para medir el tiempo de digestión en pronasa, mientras que el
resto se incubó en medio TALP. A diferentes intervalos de tiempo de incubación
en medio TALP (15, 40, 60, 80, 100, 120, 160, 240 y 300 minutos), se fueron
tomando grupos de ovocitos y midiendo el tiempo de digestión con pronasa.
Experimento 8
Para evaluar el efecto del fluido oviductal sobre los resultados de fecundación
porcina se utilizaron 304 ovocitos, repartidos en dos grupos. Aproximadamente la
mitad se utilizaron como control y los restantes fueron incubados en fluido
oviductal antes de la fecundación. Se realizó la fecundación en 4 replicados y se
evaluaron los siguientes parámetros: porcentaje de penetración, porcentaje de
monospermia y número medio de espermatozoides por ovocito penetrado, para
cada uno de los grupos.
2.9.1.2.2. Efecto del fluido oviductal sobre la resistencia de la ZP a

la digestión con pronasa en la especie bovina
Experimento 9
Un total de 121 ovocitos fueron utilizados en este experimento con el fin de

comprobar el efecto del fluido oviductal sobre el endurecimiento de la ZP bovina.
Para ello, se incubaron un total de 25 ovocitos madurados in vitro en fluido
oviductal bovino, mientras que otro grupo (control) se mantuvieron en TALP. Se
realizaron 3 replicados y a continuación se registró para cada ovocito el tiempo
que tardó la ZP en ser digerida utilizando pronasa al 0’5%. Además, se obtuvieron
ovocitos ovulados, tal y como se describe en el apartado 2.1.2.3 y se registró el
tiempo necesario para digerir la ZP utilizando pronasa. También se obtuvieron
ovocitos madurados in vivo (foliculares), mediante aspiración de folículos
preovulatorios.
112
Experimento 10
En este experimento se estudió si el efecto del fluido oviductal se mantenía

a lo largo del tiempo después de finalizada la incubación en dicho fluido. Para ello
se utilizaron 458 ovocitos bovinos madurados in vitro distribuidos en 11 grupos.
Del total, 36 ovocitos (grupo control) se incubaron en TALP, mientras el resto se
incubó en fluido oviductal. Transcurridos los 30 minutos de incubación se registró
el tiempo de digestión con pronasa para el grupo control y uno de los grupos
incubados en fluido oviductal. Los restantes ovocitos se pasaron a medio TALP y
a diferentes intervalos de tiempo (15, 40, 60, 80, 100, 120, 160, 240 y 300
minutos) se sacaron parte de ellos y se registró el tiempo necesario para la
digestión de la ZP con pronasa.
2.9.2. Bloque II: Interacción espermatozoide-ovocito heteróloga: Diseño de

un modelo para el desarrollo de un test de funcionalidad
espermática
2.9.2.1. Estudio de la interacción espermatozoide humano-ovocito

porcino a nivel de la ZP
Experimento 11
En este experimento se estudia la capacidad de los espermatozoides

humanos de sufrir la RA tras la unión a la ZP porcina en dos medios de cultivo
diferentes (TALP y Medi-Cult ®Universal IVF). Se utilizaron 3 muestras de semen
humano que fueron incubadas utilizando los dos medios de cultivo para cada
muestra. Todas las muestras se incubaron en presencia (grupos experimentales)
de ovocitos porcinos madurados in vitro (15 ovocitos/ 50µl) y una parte alícuota de
cada muestra se incubó sin ovocitos (grupos control). La RA fue evaluada en cada
113
uno de los grupos y el porcentaje de RA inducida en los grupos experimentales se

calculó según la diferencia respecto a la RA espontánea observada en los grupos
control.
Experimento 12
Utilizando el medio de incubación Medi-Cult ®Universal IVF, que es un

medio de cultivo de uso habitual en clínicas de reproducción humana, se
emplearon 12 muestras de semen humano para estudiar la capacidad de los
espermatozoides de sufrir la RA tras la unión a la ZP porcina y observar si
existían diferencias según las muestras seminales utilizadas. Además, se incluyó
un grupo en el que las muestras de semen fueron coincubadas bajo las mismas
condiciones, pero con ovocitos sin ZP. La incubación se realizó a una
concentración de 2’5 x 106 espermatozoides/ml durante 2’5 horas. Se evaluó el
estatus acrosomal de los espermatozoides adheridos al ovocito (ZP u oolema).

porcino a nivel de la membrana plasmática
Experimento 13
En este experimento se estudió la capacidad de los espermatozoides

humanos para fusionarse con ovocitos porcinos madurados in vitro libres de ZP.
Los ovocitos porcinos (aproximadamente 1800) sin ZP se coincubaron con 33
muestras de espermatozoides humanos; en 15 de ellas una parte de la muestra
fue tratada con ionóforo de calcio (5µM), progesterona (10µM) o fluido folicular
(2%) para inducir la RA y el resto se utilizó sin inducción de RA. Se utilizaron
diferentes grupos control: i) ovocitos porcinos inseminados con espermatozoides
porcinos,
ii) ovocitos porcinos libres de ZP inseminados con espermatozoides porcinos y
114
iii) ovocitos porcinos inseminados con espermatozoides humanos. Antes de la

incubación, una cantidad alícuota de muestra de semen fue teñida con PSA-FITC
y se evaluó el estatus acrosomal de los espermatozoides. Finalmente, tras la
coincubación durante 18-20 horas, los ovocitos se fijaron y tiñeron con Hoechst
3342 para evaluar adhesión, penetración y presencia de espermatozoides
descondensados en el ooplasma y estadio nuclear del ovocito. En la figura 13
puede verse la representación esquemática de este experimento.

porcino a nivel del citoplasma
Experimento 14
El objetivo de este experimento consistió en investigar la capacidad de los

espermatozoides humanos, procedentes de muestras de pacientes o donantes de
fertilidad probada, microinyectados en un ovocito porcino madurado in vitro para
descondensarse, transformarse en pronúcleo masculino y activar al ovocito tras la
microinyección. Se emplearon 12 muestras de semen humano con las que se
inyectaron aproximadamente 10 ovocitos porcinos por muestra. Tras la
microinyección, los ovocitos se incubaron en medio TALP durante 18 horas.
Transcurrido ese tiempo, se fijaron y tiñeron como se ha descrito en la
metodología para evaluar el estado de la cabeza espermática y el estadio nuclear
del ovocito.
115
IVF Medicult
Incubación con
espermatozoides humanos con
RA inducida: ionóforo de TALP
calcio, progesterona y fluido
Ovocitos folicular
porcinos sin IVF Medicult
ZP
Incubación con
espermatozoides humanos sin
inducción de RA TALP
GRUPOS CONTROL
Incubación con
Ovocitos porcinos espermatozoides porcinos sin
sin ZP inducción de RA TALP
Incubación con
Ovocitos porcinos
espermatozoides porcinos sin TALP
inducción de RA
Figura 13. Representación esquemática del experimento 13.
116
2.10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El programa utilizado para el análisis estadístico fue SPSS versión 11.5

para Windows.
Los resultados de las variables estudiadas (tiempo de digestión en

pronasa, porcentaje penetración y de monospermia, número de espermatozoides
por ovocito y porcentaje de RA), se expresan como medias ± error estándar de la
media (SEM). Se aplicó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía. Cuando este
análisis reveló un efecto significativo los valores fueron comparados por el Test de
Tukey, considerando como diferencias significativas aquellas que alcanzaron
niveles de probabilidad p<0’05.
En las experiencias del 1 al 10, el efecto fijo fue el tratamiento a que se

sometieron los ovocitos (control, DTSP, FO) o el origen de dichos ovocitos
(inmaduros, MIV, oviductales, foliculares) y se estudiaron las variables: tiempo de
digestión en pronasa, porcentaje de penetración y de monospermia, número de
espermatozoides por ovocito.
Los resultados de la experiencia 13 no se sometieron a análisis estadístico

porque son suficientemente descriptivos, teniendo en cuenta que la penetración
fue del 0% en todos los grupos experimentales, mientras que en los dos grupos
de control de FIV la penetración fue mayor del 85%, lo cual es indicativo de que el
sistema de FIV funciona, mientras que en los grupos experimentales no hay
fecundación.
Respecto al experimento 14 tampoco fue necesario hacer análisis

estadístico de los datos, ya que los resultados aportaron información suficiente
para demostrar que la ICSI heteróloga funciona y hay formación de PN masculino
y femenino con todas las muestras (“donante” y “paciente”). A su vez se observa
que sólo en las muestras procedentes de donantes de fertilidad probada hubo
división, sin que se observe este hecho en ninguna de las muestras “paciente”.
117

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__________________________________________________________Material y Métodos

En este apartado se describe la metodología seguida en el trabajo y los

2.1. OBTENCIÓN DEL MATERIAL BIOLÓGICO

La recogida del material biológico utilizado se realizó a partir de diferentes

2.1.1. Obtención de espermatozoides

2.1.1.1. Espermatozoides porcinos

Las muestras de espermatozoides porcinos proceden de verracos de

2.1.1.2. Espermatozoides bovinos

Los espermatozoides de toro utilizados procedían de dosis seminales

2.1.1.3. Espermatozoides humanos

Las muestras de espermatozoides humanos proceden de pacientes del

Las muestras se obtuvieron mediante masturbación, después de un

2.1.2. Obtención de ovocitos

2.1.2.1. Ovocitos bovinos inmaduros

Los ovarios bovinos proceden de terneras con edades comprendidas entre

A continuación los folículos de entre 2 y 6 mm de diámetro se seccionaron

contenido mediante un sistema “Millipore” (Figura 5), que dispone de un filtro de

Figura 5. Sistema de filtrado para recogida de ovocitos bovinos.

2.1.2.2. Ovocitos porcinos inmaduros

Los ovarios porcinos proceden de cerdas prepúberes sacrificadas en el

Los ovarios se lavaron en una solución de cetrimida (Bromuro de

En ambas especies, porcino y bovino, los ovocitos seleccionados se

2.1.2.3. Ovocitos ovulados (oviductales)

Con la finalidad de obtener ovocitos porcinos y bovinos ovulados se

FIGURA 6. OBTENCIÓN OVOCITOS MADURADOS IN VIVO

2.1.2.4. Ovocitos madurados in vivo (foliculares)

2.1.3. Obtención de fluido oviductal

Los oviductos se obtuvieron a partir de genitales de terneras entre 9 y 18

Una vez en el laboratorio los oviductos se separaron del ovario y se

A continuación el fluido obtenido se depositó en tubos pequeños y se

FIGURA 7. OBTENCIÓN DE FLUIDO OVIDUCTAL

2.2. MEDIOS DE TRANSPORTE, LAVADO y RECOGIDA DE LOS

2.2.1. Medio de transporte de los ovarios

El medio utilizado para el transporte de los ovarios, desde el matadero

2.2.2. Medio de lavado de los ovarios

En el caso de ovarios de vacas se utilizó solución salina fisiológica (SSF)

2.2.3. Medio de recogida de ovocitos de vaca (OCM)

El medio de recogida utilizado fue el TCM-199 modificado con sales de

M199 modificado con sales de

2.2.4. Medio de recogida de ovocitos de cerda

El medio utilizado fue el Tampón Fosfato Salino de Dubelcco modificado

2.2.5. Medios de dilución de dosis seminales

El medio utilizado para la dilución de las dosis seminales de

2.3. MEDIOS DE CULTIVO (MADURACIÓN Y FIV)

Algunos de los medios de cultivo utilizados fueron elaborados en el

2.3.1. Medios de maduración in vitro (MIV) de ovocitos

El medio de MIV de ovocitos bovinos utilizado fue TCM-199 modificado con

? M199 con L-Glutamina y 9’5 mg/L

Para la MIV de ovocitos porcinos se empleó el medio NCSU-37. Se preparó

El fluido folicular porcino (PFF) es un fluido biológico que in vivo ocupa el

El PFF utilizado se obtuvo mediante aspiración con jeringa de los folículos

2.3.2. Medios de FIV

El medio de FIV bovina utilizado fue el FIV-TALP. Inicialmente se preparó

SOLUCIÓN A (10 ml)

SOLUCIÓN B (10 ml)

SOLUCIÓN C (50 ml)

? Ácido láctico 29’43 mM

SOLUCIÓN D (40 ml)

SOLUCIÓN FINAL (40 ml)