Técnicas de Biología Molecular

Biología Celular | Zalazar Kevin
Técnicas de Biología molecular.
1. Amplificación de Ácidos Nucleicos – In Vitro – In  CRISPER/cas

Vivo 4. Uso de proteínas fluorescentes. Estudio y
 Recombinación del ADN. localización de Proteínas.
 qPCR - RT-qPCR.  Inmunohistoquímica – Inmunofluorescencia
 Enzimas de Restricción.  D - Westernblot.
2. Vectores de Expresión 5. Fraccionamiento Subcelular
3. Modificaciones del Genoma – Células madres con
modificaciones genéticas.
1. Amplificación de ácidos nucleicos

 Detección de ácidos nucleicos, la amplificación de ADN con la reacción en cadena de la polimerasa.
La PCR es un método alternativo para conseguir un gran numero de fragmentos de material genético a partir de una
única copia de ADN. Siempre se tiene que conocer la secuencia de nucleótidos de la molécula para llevar a cabo la
amplificación, IN VITRO. La ADN polimerasa se emplea para replicar un segmento determinado de ADN. La secuencia
deseada esta flanqueada por dos secuencias usadas para cebar la síntesis del ADN, primers (oligonucleótido de ADN
de 15 a 20 sec.). Se eleva la temperatura de la doble cadena a 95°C para desnaturalizarla y posteriormente se enfría
para permitir que los cebadores se unan a cada hebra de ADN, el fundamento de la unión es la complementariedad
de bases. La Polimerasa Taq sintetiza las nuevas hebras. También se pueden amplificar ARN mediante su retro-
transcripción a ADNc. Se distinguen: qPCR y RT qPCR. En esta reacción se utiliza un colorante fluorescente que se une
al ADN de doble hebra, y solo emite fluorescencia cuando se liga al mismo, SybrGREEN y su intensidad es indicativa de
la cantidad de material genético amplificado. Por ello es Cuantitativa, es extraordinariamente sensible y permite el
análisis de la expresión génica en células, presencia de genoma bacteriano o viral, y el diagnóstico de mutaciones.
 Recombinación del ADN. Detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos, apareamiento de bases entre
hebras complementarias de ARN o ADN. Estas son sometidas a altas alturas para su desnaturalización, se utiliza ADN
clonado complementario a la secuencia de ADN de interés y este clon de ADN es marcado con nucleótidos
radioactivos, que pueden ser detectados por fluorescencia o quimioluminiscencia. Esta técnica permite identificar la
región de un cromosoma que contiene un gen determinado, así como para detectar ARNm específicos en distintos
tipos celulares de un tejido. Se lleva a cabo IN SITU.
 Enzimas de restricción. Son endonucleasas que cortan específicamente secuencias de ADN, este ADN escindido se
une de manera covalente a través de una ligasa a otro segmento de ADN de interés y permite obtener ADN
recombinante. Entonces un fragmento de ADN puede insertarse en un ADN con capacidad autorreplicante, es decir
un VECTOR. Para su amplificación la molécula híbrida se introduce en una bacteria, y la proliferación de la misma
genera grandes copias de la misma molécula, es decir, amplificación IN VIVO.
2. Vectores de expresión. Producción de una mutación en el gen codificante de una proteína y expresión de una
proteína con un aminoácido distinto. Se fusiona el gen codificante de una proteína de interés con el gen codificante
de una proteína que se pueda identificar y posteriormente la célula hija expresaría la traducción de una proteína con
un aminoácido distinto.
3. Modificaciones del genoma. Modificar la secuencia de ADN en un gen específico podría ocasionar que su producto,
ARN y/o Proteína presente una pérdida o ganancia de función de su producto.
 Modificación mediante la tecnología CRISPR/CAS.
4. Estudio y localización de Proteínas.

 Inmunohistoquímica - Inmunofluorescencia. Estas utilizan la reacción Antígeno -. Anticuerpo para reconocer
moléculas.
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Western Blot es una variante de Southern Blot, un método habitual para detectar proteínas en extractos celulares, estas
proteínas procedentes de extractos celulares son separas por electroforesis en un gel según su tamaño. Dado que las
proteínas tienen cargas eléctricas y tamaños diferentes estas se separan a través de un gel SDS-poliacrilamida, y son
disueltas en una solución con el detergente docedil sulfato sódico, cargado negativamente. Esta proteína separada, se
desnaturaliza y resulta con una carga negativa, por ello migra hacia el electrodo positivo. Tras la electroforesis estas
proteínas se transfieren a un filtro con los anticuerpos que reaccionan con la proteína de interés. Y estas se detectan
mediante radioactividad o tinción.
5. Fraccionamiento Subcelular. Técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas de un
componente celular de interés. Es un mecanismo de disgregación de los componentes de la célula, permitiendo
conservar la mayor parte de las propiedades bioquímicas originales. El choque osmótico genera la rotura de las
membranas plasmáticas pero esta técnica deja intactas las de los diversos orgánulos, generando asi la suspensión de
células en un Homogenato. Posteriormente para separar diferentes componentes del homogenato se emplea la
ultracentrifugadora preparativa, en el cual se exponen a altas velocidades de giro. Esta, separa los componentes en
función de su tamaño y densidad: Las unidades mayores experimentan fuerzas centrífugas mayores y se desplazan
por el tubo con más rapidez; es así que entonces a una velocidad relativamente baja se precipiten organelas de mayor
peso molecular, núcleos y citoesqueleto, y a velocidades relativamente altas se precipiten las de menor peso
molecular como mitocondrias lisosomas y peroxisomas. También a velocidades más altas se podrían diferenciar
microsomas y pequeñas vesículas, y con más velocidad aun, ribosomas, virus y macromoléculas.

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