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    Practica de Electroforesis

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    Marta Gallego Iglesias
    Este documento describe el protocolo para realizar una electroforesis de ADN. La electroforesis separa fragmentos de ADN basado en su tamaño mediante la aplicación de una corriente eléctrica a través de un gel de agarosa. El documento detalla los materiales, reactivos, y los pasos técnicos para preparar el gel, cargar las muestras, realizar la electroforesis, y visualizar los resultados.

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    Practica de Electroforesis

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    Marta Gallego Iglesias
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    Este documento describe el protocolo para realizar una electroforesis de ADN. La electroforesis separa fragmentos de ADN basado en su tamaño mediante la aplicación de una corriente eléctrica a través de un gel de agarosa. El documento detalla los materiales, reactivos, y los pasos técnicos para preparar el gel, cargar las muestras, realizar la electroforesis, y visualizar los resultados.

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    Este documento describe el protocolo para realizar una electroforesis de ADN. La electroforesis separa fragmentos de ADN basado en su tamaño mediante la aplicación de una corriente eléctrica a través de un gel de agarosa. El documento detalla los materiales, reactivos, y los pasos técnicos para preparar el gel, cargar las muestras, realizar la electroforesis, y visualizar los resultados.

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    Este documento describe el protocolo para realizar una electroforesis de ADN. La electroforesis separa fragmentos de ADN basado en su tamaño mediante la aplicación de una corriente eléctrica a través de un gel de agarosa. El documento detalla los materiales, reactivos, y los pasos técnicos para preparar el gel, cargar las muestras, realizar la electroforesis, y visualizar los resultados.

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    REALIZACION DE PRACTICA DE ELECTROFORESIS DÍA 9/01/2023 (protocolo

    ampliado)

    FUNDAMENTO

    La electroforesis es una técnica utilizada para la separación de fragmentos de ADN. las


    muestras se colocan en los pocillos y se someten a carga eléctrica.
    debido a que la ley dispone de una carga eléctrica negativa, se mueven hacia el electrodo
    positivo. Los fragmentos de ADN más cortos correrán más, mientras que los fragmentos más
    grandes permanecerán más cerca del lugar de partida.

    MATERIAL

    - Molde de gel
    - Material volumétrico para preparar el gel (probeta y matraz Erlenmeyer)
    - Peine
    - Micropipeta
    - Puntas de micropipeta
    - Guantes
    - Balanza
    - Tubos Eppendorf
    - Documentador de geles o transiluminador
    - Microondas
    - Fuente de alimentación
    - Cables (negativo corresponde al negro y el positivo al rojo).
    - Cubeta con electrodos
    - Papel de aluminio
    - Espatula

    REACTIVOS

    - Para preparar el gel, agarosa (normalmente se prepara a concentraciones de 2% - 5%;


    a concentraciones más elevadas las moléculas muy pesadas se moverán más
    lentamente) y el mismo tampón con el que se realice la electroforesis.
    - Para preparar la muestra, tampón de carga (solución que nos permite colocar la
    muestra dentro del pocillo normalmente presenta un colorante).
    - Agua biología molecular
    - Tampón con ph alcalino, pueden estar preparados al 5x, 10x y 20x debemos diluirlo al
    1x o 0´5x.
    - Agente intercalante, es una sustancia que se une al ADN, nos permitirá visualizar luego
    el ADN. Hay dos tipos Safe Red o Safe Green. Se puede utilizar de 4 formas:
    1. añadido a la muestra
    2. añadirlo al gel de agarosa
    3. tampón de la electroforesis
    4. después de la electroforesis para teñir el gel
    - Marcador de pesos moleculares, conocemos el ADN que está fragmentado en distintos
    pesos moleculares.

    TECNICA
    1. Preparar el material
    2. preparar el gel de agarosa al 3%.
    ¡! NECESARIO CONOCER EL VOLUMEN DE LA CUBETA EN NUESTRO CASO SON 60 ML.
    Para hallarlo simplemente verter agua en la cubeta con el peine colocado y medir un 1
    cm (el gel nunca pude sobrepasar esta medida).
    2.1. Se pesan 1´8 g de agarosa en la balanza.
    CALCULOS. 3g ------- 100 ml
    Xg ------- 60 ml => 1,8g de agarosa
    2.2. En una probeta de 100 ml, se miden 59 ml de agua destilada y se añaden al matraz
    aforado.
    2.3. Añadir al matraz aforado con la ayuda de una micropipeta 1200 µl de tampón.
    CALCULOS. 50 x X = 1 x 60 ml => 1,2 ml de tampón
    2.4. Añadir al matraz la agarosa.
    2.5. Se lleva a ebullición en el microondas. (comprobando que no quedan puntos en las
    paredes)
    2.6. Se deja enfriar a unos 50ºC y añadiremos 3 µl del agente intercalante con
    micropipeta.
    CALCULOS. 20000 x X = 1 x 60 ml => 0,003 ml de agente intercalante
    2.7. Verter en el molde del gel, teniendo ya colocado el peine.
    2.8. Identificar y tapar con papel albal.

    3. Preparar la muestra
    3.1. Se miden entre 10 y 20 µl y se añaden a un tubo Eppendorf.
    3.2. Se añade un tampón de carga al 6x que contiene glicerol para darles densidad y
    que de esta forma permanezcan en el pocillo.

    4. Preparar la cubeta de electroforesis


    4.1. Se deposita en la cubeta de electroforesis el gel de agarosa preparado
    anteriormente.
    4.2. Se vierte un tampón con ph alcalino el mismo que hemos utilizado para preparar el
    gel, asegurándonos de que cubra todo el gel.
    4.3. Se comprueba que ningún pocillo se rompa al retirar el peine

    5. Carga de la muestra en la cubeta de electroforesis.


    5.1. La cantidad que más se utiliza suele ser entre 10 y 20 µl.
    ¡! Siempre cargar menos de todo el volumen total, para no coger aire. (1 µl menos)
    En el primer pocillo o en el último siempre se coloca el marcador.

    6. efectuar la electroforesis
    6.1. conectar los cables de la fuente de corriente
    6.2. ajustar los parámetros de la fuente de corriente (Nunca más de 50 V)
    6.3. comprobar que los colorantes no se salen fuera del gel.
    6.4. el tiempo aproximado suele ser 30 minutos y depende del tipo de muestra y gel
    usado.

    7. Visualizar el resultado en un transiluminador de luz blanca.

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