Bioquímica I – Universidad de El Salvador.

Doctorado en Medicina 2023.

LABORATORIO 1
1. Fundamento Teórico.

EXPERIMENTO No. 1
SISTEMAS BUFFER Y OTROS MECANISMOS DE REGULACIÓN DEL pH CORPORAL

OBJETIVOS.

1. Verificar que el pH de una

solución cambia cuando varía
la concentración de iones
hidrógeno.

2. Conocer la acción
amortiguadora de los sistemas
buffer.

3. Identificar una de las

formas en que el sistema renal
participa en mantener el
equilibrio ácido-base del
organismo eliminando el exceso
de H+.

4. Valorar la importancia de
los sistemas buffer en el
mantenimiento del equilibrio
ácido base del organismo.
 INTRODUCCIÓN

La molécula de agua tiene capacidad limitada para

ionizarse en ión hidrógeno (H+), llamado también
protón y en ión hidroxilo (OH-).

H2O H+ + OH-

Agua Protón Ión hidroxilo

Las concentraciones de protones y de

iones hidroxilo, en agua pura, son de 10- 7 M
para cada uno de ellos, como muestra la
siguiente expresión:

[H+] = [OH-] = 10-7 M

Las concentraciones de ambos iones exponen una relación recíproca; cuando la [H+]
aumenta, la [OH-] disminuye, y viceversa. El producto de sus concentraciones es una
constante conocida como “producto iónico del agua” (Kw), cuyo valor es de 1 x l0-14 M

Con el fin de facilitar los cálculos para determinar la

concentración de [H+], así como su interpretación, en 1909
el químico danés Sörensen definió el “potencial de
hidrógeno“ (pH) como el logaritmo negativo de la
concentración de los iones hidrógeno.

pH = -log[H+]
Posteriormente, en 1923, Johannes Brönsted y Thomas Lowry, propusieron en forma
independiente, los conceptos de ácido: sustancias que ceden protones en una solución
acuosa y base como aquella sustancia que puede recibir protones en solución acuosa.

Ácidos Las disoluciones acuosas se clasifican en:

Y
bases ❖ acidas si presentan un pH menor que 7.0
❖ básicas si el pH es mayor que 7.0
❖ neutras sí el pH es igual a 7.0

Por otro lado, no todos los ácidos o bases se disocian con la misma facilidad.

Los que se disocian por completo en una solución acuosa se consideran como ácidos
o bases fuertes, en tanto que a los que se disocian en forma parcial se les
denomina ácidos o bases débiles.
 Algunos ácidos o bases débiles tienen
importancia biológica, ya que evitan
cambios bruscos de pH cuando se les agrega
pequeñas cantidades de ácidos o bases.

A esta propiedad de ácidos o bases débiles y su

sal, que permite mantener la disolución en un
intervalo de pH estrecho se le conoce
como capacidad amortiguadora.
Amortiguadores

Los líquidos biológicos de interés en

clínica (suero, plasma, orina, líquido
cefalorraquídeo, etc.) son soluciones que
contienen algunas sustancias en estado
casi completo de ionización.

El conocimiento de la concentración de esos iones y de la fisicoquímica que

describen sus interrelaciones, es fundamental para poder entender muchos
problemas fisiológicos y patológicos en el hombre.

El pH de los líquidos corporales depende de la

concentración de iones H+ y es mantenido casi
constante por medio de la operación de varios
mecanismos fisiológicos. Cada persona que
trabaja en áreas relacionadas con la salud debe
conocer las formas por las cuales es mantenido el
balance ácido – básico de los fluidos corporales,
ya que una desviación de éste conlleva a un
desbalance que puede conducir a un estado
patológico e incluso producirá la muerte.
 El ion hidrógeno o protón (H+)

Tiene gran importancia bioquímica, ya que altera las cargas

de las biomoléculas y por ende, su comportamiento
fisicoquímico.

La concentración de este ion se representa por medio del pH.

Dado que el estricto control del pH es vital, el organismo lo
mantiene constante en los líquidos intracelulares y
extracelulares mediante amortiguadores, como el buffer
bicarbonato HCO3 - /H2CO3 y el buffer fosfato HPO4= /H2PO4 - .

✓ El buffer bicarbonato se regula por ventilación pulmonar y a nivel renal

✓ El buffer fosfato exclusivamente a nivel renal

Conservando el pH del líquido extracelular en 7.4.

Cuando lo anterior no se logra, se producen estados

patológicos conocidos como desequilibrios acido-base,
de los que existen cuatro tipos fundamentales:

1) acidosis respiratoria.

2) alcalosis respiratoria.

3) acidosis metabólica.

4) alcalosis metabólica.

Cada uno de ellos puede acompañarse de una

respuesta compensatoria cuyo objetivo es mantener el
pH en los límites normales.
 Soluciones buffer ó soluciones tampón
Acción de un sistema buffer.

Son mezclas de un ácido débil y una sal de

ese ácido, o de una base débil y su sal.

Este tipo de mezclas reaccionan tanto con

ácidos como con bases, por lo que la adición
de ácidos o bases fuertes a dichas mezclas
casi no produce variaciones en el valor de pH.

Un ejemplo de solución buffer es la solución

acuosa de fosfato monoácido y fosfato diácido.

Esta solución contiene gran cantidad de

moléculas de ácido débil (H2PO4-) y de su base
conjugada (HPO4=) que proviene de la segunda
disociación del ácido fosfórico.

✓ Si se añaden pequeñas cantidades de un ácido fuerte a esta solución buffer,

su mecanismo de acción es que los iones H+ provenientes del ácido
reaccionan con la base conjugada del sistema buffer, como se indica en la
siguiente reacción:

H+ + HPO4= H2PO4–

✓ Por lo tanto, la mayoría de protones agregados al medio no permanecen

como tales, sino que forman el ácido débil (H2PO4 -) y el pH varía
ligeramente. Si se agregan iones (OH-) al sistema buffer, su mecanismo de
acción es reaccionar con moléculas de fosfato diácido para formar iones
fosfato monoácido y agua, como se indica en la siguiente reacción:

OH- + H2PO4- HPO4= + H2O

El equilibrio estará desplazado a la derecha y en consecuencia la mayoría de iones
hidroxilo no se encuentran libres en la solución y el valor de pH casi no cambia.

En resumen, la adición de pequeñas cantidades de ácido fuerte o de base

fuerte a una solución buffer casi no ocasiona cambios en el valor del pH de la
solución. Por el contrario, las mismas adiciones hechas al agua producen una
notable variación en el pH, de modo que la adición de pequeñas cantidades de
un ácido fuerte, por ejemplo a soluciones que no son un buffer, produce
alteraciones importantes en el valor de pH de dichas soluciones.

2.Procedimiento.

PARTE EXPERIMENTAL
A. CAPACIDAD AMORTIGUADORA DE LAS SOLUCIONES BUFERS. VIDEO 1 y 2

Instrumentos Video 1
Buffer Fosfato 0,1 M pH 6.4
Vasos de precipitado.
Solución HCl 1M
Solución NaOH 2M
Solución NaCl 2M
Micropipetas automáticas
Medidor de pH
Agitador magnético para homogeneizar la solución.
 Instrumentos
1 Frasco lavador con agua
destilada
1 Embudo
1 Soporte con bureta de 50 mL
100 mL de HCl 1M
250 mL de NaOH
(Concentración desconocida)
1 Matraz aforado de 100 mL
Video 2 1 Matraz Erlenmeyer
Fenolftaleína
Guantes y lentes de protección.
Papel

Video 1: Capacidad amortiguadora.

a) Iniciaremos agregando 50 microlitros de HCl 1M a

ambos vasos de precipitados:

Se puede observar ver que el vaso que contiene agua ha

disminuido su pH en mayor medida que el vaso que
contiene buffer fosfato.

50 mL de HCl
1M

Agua pH=7,12 Buffer pH=6,44

Anote el pH inicial de ambas soluciones, así como el pH

obtenido después de agregar los 50 microlitros de HCl
PREGUNTAS:
1M. Se repite este procedimiento una vez más para
Escribir la reacción que ocurre
comprobar lo observado.
en el vaso de precipitado donde
se agregó HCl 1M
Cambios de pH al agregar 50 mL de HCl 1M
R/ Ocurrió una acidificación
Agua Buffer
porque bajo su pH
Primera vez 6,7 pH 6,44 pH
Segunda vez 4,4 pH 6,43 pH
b) A continuación se agregan 50 microlitros de NaOH 2M:

Se puede observar que el vaso que contiene agua ha aumentado su pH notablemente

mientras que el vaso que contiene buffer fosfato se ha mantenido alrededor del mismo
valor de pH.

50 mL de NaOH
2M

Agua pH=4,47 Buffer pH=6,43

Anote el pH inicial de ambas soluciones, así como el pH

obtenido después de agregar los 50 microlitros de NaOH
2M. Repetir este procedimiento una vez más para
comprobar lo observado.

Cambios de pH al agregar 50 mL de NaOH 2M

Agua Buffer
Primera vez 9,62 pH 6,42 pH
Segunda vez 11,33 pH 6,42 pH

PREGUNTAS:

¿Cuál es la explicación bioquímica de los resultados obtenidos al agregar a los dos vasos de
precipitados o beaker una misma cantidad de NaOH 2M?

R/ Al agregar una base fuerte la solución de agua que anteriormente se le agrego HCl hace que la
reacción cambie drásticamente a un pH alcalino. En cambio la reacción buffer no cambia
drásticamente porque en acido débil reacciona con los iones OH- de la sosa caustica (NaOH)

Escriba la reacción que ocurre en el vaso de precipitado donde se agregó NaOH 2M

R/ Ocurrió una basificación porque aumento su pH

c) Por último se agrega una sal neutra: cloruro de sodio (NaCl)

Como esta sal no aporta ni protones ni oxidrilos no debería modificarse el pH en ninguna

de las dos soluciones. Se agregan 50 microlitros de sal a cada vaso y observamos:

50 mL de NaCl
2M

Agua pH=11,33 Buffer pH=6,42

Podemos notar que en ambos casos el valor de pH se mantiene tal como estaba. Anotar
el valor de pH inicial y final en cada solución. El pH no cambia.

Cambios de pH al agregar 50 mL de NaCl 2M

Agua Buffer
Primera vez 11,33 pH 6,42 pH
Segunda vez 11,33 pH 6,42 pH

Se ha observado así la capacidad buffer de una mezcla

de sales de ácidos polipróticos (son ácidos que tienen
más de un hidrógeno ionizable).

Video 2: Titulación.

1) Agregar 100 mL de NaOH en el matraz Erlenmeyer.

Asegurar con el frasco lavador que no sobre nada de la solución 3 veces.

2) Agregar fenolftaleína (indicador) a la solución.

Con esta, la solución obtiene un tono rosa violeta, lo cual significa que esta posee un
medio básico.
 3) Agregar 50 mL de HCl 1M con la bureta.

Se tiene que dejar caer las gotas lentamente, mientras se agita la solución. Cuando se
hayan agregado los 50 mL se producirá una reacción de neutralización, que hará que
la solución tenga un color cristalino.

B. ACCIÓN AMORTIGUADORA EN LOS LÍQUIDOS CORPORALES

Los ácidos o las bases producto del catabolismo de

carbohidratos, lípidos y aminoácidos dan lugar a la producción
de una gran cantidad de compuestos que potencialmente
podrían modificar el pH fisiológico.

Sin embargo, existen sistemas amortiguadores que evitan cambios bruscos del pH.
Ejemplo de éstos es el sistema bicarbonato/ácido carbónico, que mantiene el pH del
líquido extracelular en valores próximos a 7.4.

La combustión completa de carbohidratos y lípidos genera bióxido de carbono y agua,

los cuales se combinan para producir ácido carbónico a nivel tisular. El ácido carbónico
en solución acuosa se disocia para formar su base conjugada, el bicarbonato, lo que
genera un sistema amortiguador, como se muestra en la siguiente reacción:

Anhidrasa Reacción

carbónica espontánea

CO2 + H2O H2CO3 HCO3 - + H+

Bióxido de Carbono + agua ácido carbónico ión bicarbonato + protón

pKa 6.1

Si aumenta la concentración de protones en el medio por cualquier proceso químico, el

equilibrio se desplaza a la izquierda y se elimina el exceso de CO 2 producido. Por lo
contrario, si disminuye la concentración de protones del medio, el equilibrio se desplaza
a la derecha, para lo cual se utiliza CO2 del producido constantemente por el
metabolismo.
 pH compatible con la vida
Homeostasis
Las proteínas, y en forma específica las enzimas, son sensibles
a los cambios bruscos de pH. Así, el pH sanguíneo debe
conservarse en un intervalo entre 7.35 y 7.45 con el fin de
mantener la homeostasis.

7,35 7,45

En esta parte reproduciremos una de las formas en que el

sistema renal participa en mantener el equilibrio ácido – base
del organismo, analizando el papel que juega la solución
Buffer Fosfato presente en el filtrado glomerular (pH 7.4), el
cual acepta los iones hidrógeno eliminados por el riñón
durante el proceso de formación de orina (pH 6).

El fosfato monosustituido (H2PO4-) y el fosfato disustituido (HPO4=) forman una solución

buffer; un par ácido débil – base conjugada que puede actuar como un amortiguador
de pH.

El riñón durante la formación de la orina elimina H+ los cuales reaccionan así:

H+ + HPO4 = H2PO4 –

En esta forma, al formarse la orina irá variando la relación: HPO 4 = / H2PO4 –

Por este mecanismo el riñón elimina H+ y reabsorbe HCO3 - hacia la sangre; por cada
ion H+ eliminado por las células tubulares hacia la luz del túbulo, un ion Na + es liberado
del Na2HPO4, el cual acompaña al ión HCO3- que también es devuelto a la sangre como
se explicó antes.

Video 3: Equilibrio ácido - base.

Usando un analizador de gases en sangre ABL, se puede obtener un informe de paciente

que revela la acidez, el nivel de oxígeno y el dióxido de carbono en la sangre arterial.
Es importante mantener un equilibrio de
pH en la sangre, y para ello el cuerpo
humano realiza ajustes continuos para
mantener un nivel preciso de pH, ese
proceso se llama homeostasis. El nivel de
pH puede verse afectado por alteraciones
metabólicas o respiratorias.

El cuerpo intenta mantener un equilibrio con los amortiguadores corporales con

respuestas compensatorias, respiratorias o renales. La respuesta respiratoria es mas
rápida, ya que los pulmones aumentan o disminuyen la eliminación de CO 2 que
comienzan en los primeros minutos de la alteración ácido-base y se mantiene hasta
horas después. La respuesta renal es más lenta, dado que los riñones alteran la
excreción de metabolitos ácidos o de alcalinos en cuestión de horas o días, tras una
alteración de ácido-base aguda.

Una categorización simplificada de las

alteraciones del equilibrio ácido-base es la:
✓ Alcalosis
Metabólica
Respiratoria
✓ Acidosis
Metabólica
Respiratoria

✓ Respiratoria ✓ Metabólica
Puede aparecer debido a la Aparece cuando hay un aumento de
hiperventilación alveolar. bicarbonato en el cuerpo.

CO2 = pCO2 pH HCO3- = pHCO3- pH

Respuesta compensatoria a nivel Respuestas compensatorias.

renal, con la retención de ácidos H+ y ❖ Renal: retención de ácidos y
aumentando la eliminación de excreción de HCO
amortiguadores HCO3- ❖ Respiratoria: hipoventilación
alveolar
 ✓ Respiratoria ✓ Metabólica
Puede aparecer debido a la Aparece cuando hay un aumento de
hipoventilación alveolar. ácidos en el cuerpo.

CO2 = pCO2 pH H+ = pHCO3- pH

Respuesta compensatoria a nivel Respuestas compensatorias.

renal, con la retención de ❖ Renal: retención de
amortiguadores de HCO3- y la amortiguadores y excreción de
eliminación de ácidos H+ ácidos
❖ Respiratoria: hiperventilación
alveolar

La brecha aniónica representa la concentración de

aniones no medidos como los fosfatos, sulfatos,
proteínas y ácidos orgánicos.

La determinación del anión GAP es un paso importante

en el análisis de acidosis metabólica.

Anión Gap En el caso de una acidosis metabólica pueden

ser que:

✓ Los niveles de AG están normales, lo que significa que hay un

aumento en el ion Cl-.
✓ Los niveles de AG han aumentado, que puede ser causada
por una acumulación de ácidos o toxinas.
 PARTE EXPERIMENTAL
B. ACCIÓN AMORTIGUADORA EN LOS LÍQUIDOS CORPORALES: MECANISMOS DE
COMPENSACION RENAL: ACIDIFICACION DE LA ORINA.

Instrumentos
Video 4
Buffer Fosfato 0,1 M pH 7.4
Azul de bromo timol 0.02%
Solución HCl 1N
Gradilla de pipetas
2 pipetas serológicas de 5mL
1 Tubo de ensayo
1 Aspirador de pipetas

Video 4: Acidificación de la orina.

a) Utilizando una pipeta serológica de 5.0 mL, mida 5.0 mL

de la solución buffer fosfato pH 7.4 y transferir a un tubo de
ensayo

(Este buffer fosfato en esta práctica representa el buffer del

filtrado glomerular).

b) Agregar al tubo 5 gotas de indicador azul de bromotimol y agitar.

El azul de bromotimol tiene una escala de indicación activa comprendida entre un pH

6.0 y de 7.6.

✓ A un pH del medio menor a 6.5 (ácido)

manifiesta una coloración amarilla.
✓ Cuando el pH del medio varía entre 6.5 y 7.6
(neutro), adquiere una coloración verde.
✓ A pH mayores a 7.6 su color es azul
(básico).
 (No contar gotas).
c) Utilizando para ello una pipeta serológica de 5.0 mL,
Anote el volumen gastado
titular la solución del tubo agregando gota a gota y
(mL) de HCL 0.1N en la
agitando suavemente ácido clorhídrico (HCL) 0.1N. titulación.

Hasta obtener un color amarillo, esto ocurre R/ El volumen de HCl- 0.1N

gastado es de 3.5 mL.
aproximadamente a pH 6.0 (ya no seguir agregando).

Los H+ que se agregan por medio del HCL 0.1N para

cambiar el pH del buffer fosfato desde 7.4 hasta
6, representan a los H+ que el riñón agrega al
filtrado glomerular para eliminarlos en la orina
intercambiándolos con Na+;recuperando, en esta
forma base (HCO3-).

Preguntas

1. ¿Cuál es el papel que desempeña la solución buffer fosfato y la solución HCl 0.1N
en este experimento?

El buffer fosfato hace una representación del filtrado glomerular que se da en los
riñones. El buffer fosfato participa en las formas en que el sistema renal mantiene el
equilibrio acido-base del organismo. Filtrando iones H que son eliminados por el riñón
durante el proceso de la formación de la orina. El HCl al 0.1 N representa a los ácidos que
el riñón agrega al filtrado para eliminarlos en la orina, intercambiarlos con Na+ y así
recuperar su forma base HCO3-.

2. ¿Cómo son eliminados los iones H+ por las células renales a la luz del túbulo?

Por medio de la orina que se crea en los procesos de compensación metabólicos.

3. La especie del buffer fosfato que amortigua los H+ que se eliminan en la orina es

Fosfato monosustituido (H2PO4-) y el fosfato disustituido (HPO42-).

4. Los H+ eliminados en la orina son intercambiados por el ion Na+ y la base

restaurada es HCO3-.
 5. Calcule cuántos mEq de base (NaHCO3) son
restaurados a la sangre (pH 7.4) por la
excreción de 1 litro de orina (pH 6.0)

Haciendo uso de datos obtenidos en la titulación del

buffer fosfato con la solución de HC1 0.1N, para saber
los mEq de base (NaHCO3) restaurados debe
encontrar los mEq de HCl (H+) con el volumen
gastado en la titulación utilizando la fórmula
siguiente:

𝑚𝐸𝑞
𝑁=
𝑚𝐿 (𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑔𝑎𝑠𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠)
𝑚𝐸𝑞 = (𝑁)(𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑔𝑎𝑠𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠)
𝑚𝐸𝑞 = (0.1 𝑁)(3.5 𝑚𝐿)
𝑚𝐸𝑞 = 0.35

Y tomar en cuenta que en el experimento se utilizan 5mL de Buffer fosfato pH 7.4

5 𝑚𝐿 → 0.35 𝑚𝐸𝑞
1𝐿 → ¿ 𝑥?

0.35 𝑚𝐸𝑞 1000 𝑚𝐿 𝑚𝐸𝑞

∗ = 70
5 𝑚𝐿 1𝐿 𝐿

R/ Son 70 mEq de base restaurada de NaHCO3

Fin – Laboratorio 1.

Bioquímica 2023