Control de Calidad Plaguicidas

Plaguicidas microbianos:
control y aseguramiento
de calidad
Adriana Marcela Santos Díaz

Erika Paola Grijalba Bernal
Lissette Torres Torres
Liz Alejandra Uribe Gutiérrez
Colección Transformación del Agro

1
Plaguicidas microbianos:
control y aseguramiento de calidad

Mosquera, Colombia, 2022
Colección Transformación del Agro

Plaguicidas microbianos: control y aseguramiento de calidad. / Adriana Marcela Santos
Díaz [y otros tres]. – Mosquera (Colombia) : AGROSAVIA, 2022.
240 páginas (Colección Transformación del Agro)

Incluye gráficos y tablas
ISBN E-book: 978-958-740-512-5
1. Microorganismos 2. Agentes de control biológico 3. Control de calidad 4. Plaguicidas 5. Métodos

estadísticos. I. Santos Díaz, Adriana Marcela II. Grijalba Bernal, Erika Paola III. Torres Torres, Lis-
sette IV. Uribe Gutiérrez, Liz Alejandra.
Palabras clave normalizadas según Tesauro Multilingüe de Agricultura Agrovoc

Catalogación en la publicación – Biblioteca Agropecuaria de Colombia
Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria Citación sugerida: Santos Díaz, A. M., Grijalba Bernal,
- agrosavia E. P., Torres Torres, L., & Uribe Gutiérrez, L. A. (2021).
Plaguicidas microbianos: control y aseguramiento de
Centro de Investigación Tibaitatá, km 14 vía Mosquera- calidad. Corporación Colombiana de Investigación Agro-
Bogotá, Cundinamarca. Código postal 250047, pecuaria - agrosavia.
Colombia. https://doi.org/10.21930/agrosavia.manual.7405125
Esta publicación es resultado de la experiencia adquirida Cláusula de responsabilidad: agrosavia no es respon-

en el desarrollo de proyectos de investigación del grupo sable de las opiniones y de la información recogida en
de Control Biológico de Plagas Agrícolas y del Depar- el presente texto. Los autores asumen de manera exclu-
tamiento de Bioprodutos, y fue una iniciativa de los siva y plena toda responsabilidad sobre su contenido, ya
proyectos “Técnicas de laboratorios acreditadas y regis- sea este propio o de terceros, declarando en este último
tradas ante organismos de inspección”, “Plan de vincu- supuesto que cuentan con la debida autorización de
lación Red de Servicios de Laboratorios Fase I” y “Plan terceros para su publicación. Igualmente, expresan que
de vinculación Red de Servicios de Laboratorios Fase II”, no existe conflicto de interés alguno en relación con los
desarrollados por el Departamento de Laboratorios de resultados de la investigación propiedad de tales terceros.
Investigación y Servicios de agrosavia. En consecuencia, los autores serán responsables civil,
administrativa o penalmente, frente a cualquier reclamo
Colección: Transformación del Agro o demanda por parte de terceros, relativa a los derechos
de autor u otros derechos que se vulneren como resultado
Fecha de recepción: 15 de enero de 2021 de su contribución.
Fecha de evaluación: 10 de mayo de 2021
Fecha de aceptación: 2 de septiembre de 2021 Línea de atención al cliente: 018000121515
[email protected]
Primera edición: marzo de 2022 http://www.agrosavia.co/
Publicado en Mosquera, Cundinamarca
Editorial agrosavia
[email protected]
Líder editorial: Astrid Verónica Bermúdez Díaz
Edición: Verónica Barreto Riveros
Corrección de estilo: Amalia Tapiero Barreto y Jorge
Enrique Beltrán
Diagramación: Diego Abello Rico
Fotografía de cubierta: Banco de fotos agrosavia https://co.creativecommons.org/?page_id=13
Contenido
Las autoras 17
Agradecimientos 21
Introducción 23
Capítulo I 29
Control de calidad microbiológico de bioplaguicidas a base

de agentes de control biológico 29
Identificación del agente de control biológico 30
Cuantificación del principio activo 31

Recuento en hemocitómetro (cámara de Neubauer) 32
Caso de estudio I 36
Métodos espectrofotométricos 38
Cuantificación por PCR 40
Viabilidad de principio activo 42

Recuento en placa 43
Goteo en placa 47
Germinación de conidios 49
Contenido de contaminantes: pureza 56
Perspectivas 59
Referencias 59
Capítulo II 67
Control de calidad fisicoquímico de bioplaguicidas microbianos 67

Bioplaguicidas microbianos sólidos 68

Bioplaguicidas microbianos líquidos 76
Caso de estudio I: granulado dispersable 80
Caso de estudio II: concentrado emulsionable 84
Perspectivas 87
Referencias 89
Capítulo III 95
Control de calidad de bioinsumos recomendados para

el manejo de fitopatógenos (bacterias y hongos) 95
Criterios biológicos 96
Microorganismos patógenos 96
Agentes de control biológico 100
Tipos de formulaciones 104
Criterios para la elaboración de los controles de calidad

y evaluación de la eficacia 105
Reconstitución de los bioproductos 105
Características y mecanismos de acción de los agentes
de control biológico 106
Aplicación de los bioinsumos y microorganismos patógenos 107
Parámetros de evaluación de la actividad biológica 108
Aceptación o rechazo de bioinsumo 109
Material de referencia 109
Metodologías 110
Caso de estudio 128

Resultados del caso estudio 129
Análisis 133
Perspectivas 134
Referencias 134
Capítulo IV 143
Control de calidad de la actividad biológica contra insectos 143


Con relación al insecto plaga 144
Con relación al agente de control 148
Criterios de evaluación 154

Condiciones físicas y ambientales 155
Sistemas de aplicación 155
Montaje de la unidad experimental 161
Identificación de síntomas y signos de infección 163
Material de referencia 167
Caso de estudio 168

Criterios de evaluación 169
Criterios para el aseguramiento de los resultados 169
Criterios estadísticos 170
Perspectivas 174
Referencias 175
Capítulo V 181
Aseguramiento de resultados aplicables a metodologías

de control de calidad de bioplaguicidas 181
Adriana Marcela Santos, Lissette Torres Torres,
Liz Alejandra Uribe, Erika Paola Grijalba
Estandarización de métodos 183

Método de los rangos 187
Método de promedios y rangos 188
Interpretación de resultados: pruebas r&R 190
Criterios de calidad de resultados 191

Coeficiente de variación 192
Parámetros de aceptación para la metodología 193
Criterios estadísticos 193

Tratamientos 194
Número de réplicas 194
Unidad experimental 194
Diseño experimental 195
Variable respuesta 198
Análisis estadístico 198
Casos de estudio 199

Caso de estudio I 199
Caso de estudio II 210
Validación de metodologías analíticas 216

Etapas en el desarrollo de la validación de una
metodología analítica y criterios de aceptación 218
Parámetros de validación 219
Caso de estudio para validar un método 224
Referencias 225
Glosario 231
Referencias 233
Medios de cultivo y soluciones 234

Lista de figuras
Figura 1.1 Secciones de la cámara de Neubauer y dimensiones de

la cuadrícula del hemocitómetro 34
Figura 1.2 Introducción de la muestra (volumen de 10µl) en
la cámara de Neubauer 34
Figura 1.3 Instrucciones de lectura de la cámara de Neubauer 35
Figura 1.4 Esquema general de un sistema de turbidez
(espectrofotometría) 39
Figura 1.5 Viabilidad de principio activo (hongos y bacterias) de
bioplaguicidas. Método de recuento en placa y siembra
en superficie mediante diluciones en base 10 45
Figura 1.6 Viabilidad de principio activo (hongos y bacterias)
de bioplaguicidas. Método de goteo en placa 47
Figura 1.7 Proceso de germinación de conidios 50
Figura 1.8 Esquema representativo de tipos de conidios y de un conidio
germinado con el respectivo tubo germinal. Dimensiones
morfológicas (largo y ancho) de acuerdo con
cada tipo de conidio 51
Figura 1.9 Montaje de la prueba de germinación para el proceso de
cuantificación de conidios germinados y no germinados 53
Figura 2.1 Granulado dispersable a base de Rhodotorula mucilaginosa
(Basidiomycota: Sporidiobolales) 68
Figura 2.2 Bioplaguicidas microbianos líquidos 76
Figura 2.3 Evaluación del tiempo de humectabilidad 82
Figura 2.4 Tiempo de desintegración de un granulado 83
Figura 2.5 Determinación del tamaño de partícula por granulometría 83
Figura 2.6 Distribución de tamaño de partícula de un
granulado a base de B. bassiana Bv060 84
Figura 2.7 Determinación del índice de sedimentación a partir
de la altura del sedimento formado 85
Figura 2.8 Vista al microscopio óptico de una emulsión aceite
agua con un objetivo de 40× 88
Figura 2.9 Distribución de tamaño de partícula de una emulsión
formada a partir de la reconstitución de un concentrado
emulsionable a base de B. bassiana Bv060 88
Figura 3.1 Principales tipos de formulación e ingredientes activos de
bioinsumos registrados ante el ica hasta diciembre de 2019
para el control de fitopatógenos 105
Figura 3.2 Interacciones entre microorganismos patógenos y agentes
biocontroladores (mecanismos de acción) 107
Figura 3.3 Medidas perpendiculares del diámetro de la colonia 111
Figura 3.4 Técnica de enfrentamiento entre el agente biocontrolador
y la bacteria fitopatógena 114
Figura 3.5 Medición del halo de inhibición causado por el enfrentamiento
del agente biocontrolador y la bacteria fitopatógena 115
Figura 3.6 Halo de inhibición causado por el enfrentamiento entre
el agente biocontrolador y la bacteria fitopatógena
inoculada mediante la adición de agar semisólido 116
Figura 3.7 Inhibición del crecimiento micelial mediante la
determinación de peso seco (g) 118
Figura 3.8 Cámara húmeda de bioensayo 126
Figura 3.9 Inhibición producida por B. amyloliquefaciens
sobre Fusarium sp. 133
Figura 4.1 Hábitos de insectos plaga 145
Figura 4.2 Ciclos de vida de los insectos de acuerdo al tipo
de metamorfosis 146
Figura 4.3 Esquema del mecanismo de acción de un hongo
entomopatógeno 149
Figura 4.4 Estructura de un nucleopoliedrovirus y un granulovirus 150
Figura 4.5 Ciclo de infección de los baculovirus 151
Figura 4.6 Ciclo de infección de Bacillus thuringiensis 152
Figura 4.7 Aplicación directa por aspersión del agente
de control sobre el insecto blanco 156
Figura 4.8 Aplicación directa por inmersión de larvas de
Diatraea saccharalis de seis días de edad en una
suspensión de conidios de Metarhizium
anisopliae (Ascomycota: Clavicipitaceae) 157
Figura 4.9 Aplicación M. anisopliae sobre el pronoto de una ninfa
de R. schistocercoides 157
Figura 4.10 Ingestión de la suspensión viral de una larva
neonata de S. frugiperda 158
Figura 4.11 Aplicación del agente de control por inyección directa. 159
Figura 4.12 Aplicación por aspersión de un agente biológico 160
Figura 4.13 Tubérculos de papa - semilla 161
Figura 4.14 Montaje de la unidad experimental de un ensayo de
evaluación de la actividad biocontroladora de B.
bassiana sobre D. saccharalis 162
Figura 4.15 Montaje de la unidad experimental de un ensayo
de evaluación de la actividad biocontroladora de
M. anisopliae sobre R. schistocercoides 163
Figura 4.16 Infecciones características de hongos entomopatógenos. 164
Figura 4.17 Larva de E. ello infectada por el granulovirus de
Erinnyis ello EeGV 165
Figura 4.18 Larvas de T. solanivora de tercer ínstar, sana e infectadas
con el granulovirus de Phthorimaea operculella (PhopGV) 166
Figura 4.19 Diferencias entre larvas de T. absoluta sanas e infectadas por
baculovirus 166
Figura 4.20 Evaluación del material de referencia en el control de
calidad de una muestra a base de B. bassiana para
el control de adultos de C. tingomariana 168
Figura 4.21 Evaluación biológica de Lecanicillium lecanni
sobre mosca blanca 171
Figura 4.22 Individuos de T. vaporariorum 173
Figura 4.23 Fotografias de L. lecanii 174
Figura 5.1 Posibles escenarios de precisión y exactitud de resultados 183
Figura 5.2 Ejemplo de la distribución de seis tratamientos en tres bloques
organizados completamente al azar 197
Figura 5.3 Ubicación de los esclerocios de S. sclerotiorum sobre el suelo. 207
Figura 5.4 Evaluación de la actividad biocontroladora del
bioplaguicida a base de T. koningiopsis sobre esclerocios
de S. sclerotiorum 209
Figura 5.5 Confirmación de la actividad biocontroladora del
bioplaguicida a base de T. koningiopsis sobre
esclerocios de S. sclerotiorum 210
Figura 5.6 Determinación de la eficacia de M. anisopliae sobre
larvas de D. saccharalis 212
Figura 5.7 Montaje de la unidad experimental para determinar
la actividad biocontroladora de M. anisopliae
sobre D. saccharalis 213
Figura 5.8 Características microscópicas del aislamiento Mt004
de M. anisopliae 216
Lista de tablas
Tabla 1.1 Metodologías utilizadas para la determinación de la

viabilidad del principio activo de bioplaguicidas a base
de hongos filamentosos, levaduras y bacterias 42
Tabla 1.2 Medios de cultivos y método de siembra más utilizados
para el recuento del principio activo de bioplaguicidas
a base de bacterias, hongos filamentosos y levaduras 43
Tabla 1.3 Condiciones de temperatura y tiempo de crecimiento
de acuerdo con el principio activo del bioplaguicida,
para su recuento en placa 44
Tabla 1.4 Medios de cultivo comúnmente utilizados para evaluar la
germinación de conidios de hongos biocontroladores 54
Tabla 2.1 Sistemas de entrega de bioplaguicidas microbianos sólidos 69
Tabla 2.2 Variables fisicoquímicas para evaluar en bioplaguicidas
microbianos sólidos 70
Tabla 2.3 Metodologías y descripción de las variables evaluadas en
bioplaguicidas microbianos sólidos 73
Tabla 2.4 Sistemas de entrega de bioplaguicidas microbianos líquidos 77
Tabla 2.5 Variables fisicoquímicas para evaluar en
bioplaguicidas microbianos líquidos 78
Tabla 2.6 Metodologías y descripción de las variables evaluadas en
bioplaguicidas microbianos líquidos 79
Tabla 2.7 Caracterización fisicoquímica de un granulado a base
de B. bassiana Bv060 81
Tabla 2.8 Caracterización fisicoquímica de un concentrado
emulsionable a base de B. bassiana Bv060 84
Tabla 3.1 Principales patógenos que afectan algunos
de los cultivos más importantes en Colombia en 2019 97
Tabla 3.2 Principales agentes de control biológico de bioinsumos
registrados ante el ica hasta diciembre de 2019
para el control de fitopatógenos 101
Tabla 3.3 Determinación cualitativa de patogenicidad con
base en el número de conidióforos por lesión 127
Tabla 3.4 Datos brutos del diámetro de colonia (mm)
obtenidos con el analista 1 129
Tabla 3.5 Determinación del porcentaje de inhibición
obtenido con el analista 1 130
Tabla 3.6 Datos brutos del diámetro de colonia (mm)
obtenidos con el analista 2 131
Tabla 3.7 Determinación del porcentaje de inhibición
obtenido con el analista 2 132
Tabla 3.8 Determinación del coeficiente de reproducibilidad 133
Tabla 4.1 Porcentaje de eficacia de un bioplaguicida a
base de L. lecanii sobre ninfas de T. vaporariorum 172
Tabla 5.1 Condiciones de evaluación de estudios de repetibilidad y
reproducibilidad 185
Tabla 5.2 Tabla de anova para un sistema de medición con dos factores 187
Tabla 5.3 Valores de las constantes K1 y K2. 190
Tabla 5.4 Ejemplo de la asignación aleatoria de réplicas en un Diseño
Experimental Completamente al Azar 196
Tabla 5.5 Resultados de la determinación del porcentaje de
germinación del agente microbial a base de
T. koningiopsis obtenidos por cada analista 201
Tabla 5.6 Resultados de la prueba T pareada 202
Tabla 5.7 Porcentajes de germinación del agente microbiano a base de T.
koningiopsis transformados mediante la función arcoseno 202
Tabla 5.8 Rangos de medición obtenidos para cada analista y valores de
repetibilidad, reproducibilidad y de r&R (%) para la
determinación del porcentaje de germinación
del agente microbiano a base de T. koningiopsis 203
Tabla 5.9 Resultados de la determinación del pH del agente
microbial a base de T. koningiopsis, obtenidos
por cada analista 203
Tabla 5.10 Resultados de la prueba T 204
repetibilidad, reproducibilidad y de r&R (%) para la
determinación de pH del agente microbiano
a base de T. koningiopsis 205
Tabla 5.12 Porcentaje de parasitismo del bioplaguicida a base de
T. koningiopsis sobre esclerocios de S. sclerotiorum,
obtenidos por cada analista 207
Tabla 5.13 Porcentaje de parasitismo del bioplaguicida a base de
T. koningiopsis sobre esclerocios de S. sclerotiorum
transformados mediante la función arcoseno 208
Tabla 5.14 Rangos de medición obtenidos para cada analista y valores
de repetibilidad, reproducibilidad y de r&R (%) para
la evaluación de la actividad biocontroladora del
bioplaguicida a base de T. koningiopsis sobre esclerocios
de S. sclerotiorum 208
Tabla 5.15 Mortalidad expresada como eficacia (%) del aislamiento
Mt004 de M. anisopliae sobre larvas de D. sacchralis,
obtenidos por cada analista 214
Tabla 5.16 Resultados de la prueba T pareada 214
Tabla 5.17 Mortalidad (porcentaje de eficacia) del aislamiento
Mt004 de M. anisopliae sobre larvas de D. saccharalis,
transformados mediante la función arcoseno 215
repetibilidad (r), reproducibilidad (R) y de r&R (%)
para la evaluación de la actividad biológica (mortalidad)
del aislamiento Mt004 de M. anisopliae 215
Tabla 5.19 Guías para la validación de metodologías analíticas 218
Tabla 5.20 Pasos para tener en cuentan para la validación
de técnicas de análisis 218
Tabla 5.21 Parámetros de validación a tener en cuenta
de acuerdo con el tipo de ensayo de control de calidad 219
Tabla 5.22 Resultados normalizados obtenidos del recuento
de colonias de tres analistas 221
Tabla 5.23 Análisis de datos obtenido entre analistas 223
Tabla 5.24 Datos brutos de recuento ufc/ml 224
Tabla 5.25 Análisis de datos con prueba F 225
Las autoras

[email protected]
Orcid: https://orcid.org/0000-0002-3248-7322
Magíster en Ciencias Bioquímicas de la Universidad Nacional de Colombia y micro-

bióloga industrial de la Pontificia Universidad Javeriana. Investigadora máster sénior
de agrosavia, donde se desempeña desde 2014 como coordinadora técnica de la
Red de Laboratorios de Microbiología Agrícola. Cuenta con más de diez años de
experiencia liderando procesos de registro de laboratorios de control de calidad de
bioinsumos agrícolas (bioplaguicidas e inoculantes biológicos). Ha participado en
diferentes proyectos de investigación enfocados hacia la búsqueda, la selección y el
desarrollo de productos biológicos a base de bacterias, hongos y virus. Dentro de
sus publicaciones más recientes se destaca el artículo “Hospederos alternativos y
estandarización de métodos para evaluar la actividad biocontroladora de micoin-
secticidas” y la participación en el segundo volumen del libro Control biológico de
fitopatógenos, insectos y ácaros: aplicaciones y perspectivas (2018).

[email protected]
Magíster en Ciencias Biológicas con énfasis en Microbiología de la Universidad de

los Andes y química farmacéutica de la Universidad Nacional. Investigadora máster
sénior de agrosavia, donde se desempeña como investigadora en el Departamento
de Bioproductos. Tiene experiencia en el diseño y desarrollo de productos biológicos
a base de bacterias y hongos para el control de plagas agrícolas, biofertilizantes y
nutrición, y salud animal. Dentro de sus publicaciones de destacan “Metarhizium
rileyi biopesticide to control Spodoptera frugiperda: Stability and insecticidal activity
18 Plaguicidas microbianos: control y aseguramiento de calidad
under glasshouse conditions”, “Bacterias entomopatógenas en el control biológico de

insectos y desarrollo y escalamiento de bioplaguicidas”.

[email protected]
Bióloga con experiencia en procesos de registro ante el Instituto Colombiano

Agropecuario (ica) relacionados con la estandarización y verificación de análisis
microbiológicos, fisicoquímicos y de actividad biológica para el control de calidad
de plaguicidas microbianos. Diseño y ejecución de proyectos de investigación en
control biológico de plagas agrícolas y conservación de microorganismos. Se desem-
peñó como profesional de apoyo en el Laboratorio de Microbiología Agrícola de
agrosavia y actualmente es profesional de apoyo a la investigación de la misma
institución. Sus publicaciones más recientes son: “Hospederos alternativos y estan-
darización de métodos para evaluar la actividad biocontroladora de micoinsecti-
cidas” (Revista Colombiana de Entomología) y tres capítulos como coautora en el
libro Control biológico de fitopatógenos, insectos y ácaros (2018).

[email protected]
Microbióloga industrial de la Pontificia Universidad Javeriana y magíster en

Ciencias Agrarias de la Universidad Nacional de Colombia. Desde febrero de 2008
es investigadora máster de agrosavia, donde actualmente lidera la Colección de
Microorganismos con Interés en Control Biológico (cmicb) y participa en proyectos
de bioprospección. Su experiencia se ha enfocado en la conservación y caracteriza-
ción de microorganismos con potencial de uso en el sector agropecuario y cuenta
con experiencia como analista de microbiología para el control de calidad de bioin-
sumos de uso agrícola.
19
21
Agradecimientos
Las autoras agradecemos a la Corporación Colombiana de

Investigación Agropecuaria (agrosavia) y, en especial, al grupo
de investigación “Control Biológico de Plagas Agrícolas” por el
liderazgo y desarrollo de proyectos de investigación que a través
de los años fortalecieron el conocimiento y algunas de las meto-
dologías que se comparten en este libro.
Las autoras expresamos un especial agradecimiento a los doctores

Alba Marina Cotes, Laura Fernanda Villamizar, Martha Isabel
Gómez y Carlos Espinel Correal, quienes lideraron las primeras
investigaciones en agrosavia sobre control de calidad en biopla-
guicidas microbianos.
Asimismo, agradecemos al Departamento de Laboratorios de

Investigación y Servicios, liderado por María Angélica Pichimata,
por el apoyo continuo en el fortalecimiento del área de control de
calidad de bioinsumos de la Corporación.
23
Introducción
A diferencia de los plaguicidas de síntesis química, los cuales se

producen bajo estándares de calidad establecidos por la indus-
tria, los bioplaguicidas a base de agentes de control biológico
(acb) presentan inconvenientes en la adopción de criterios de
calidad debido, principalmente, a su forma de producción y a
la alta variación de los principios activos (Satapathy, 2018). Así
pues, uno de los aspectos más importantes a la hora de adoptar y
comercializar agentes de control biológico es la implementación
de un programa de control de calidad que garantice las carac-
terísticas microbiológicas, fisicoquímicas y biológicas en cada
etapa de producción y en el producto terminado, de manera tal
que se cumplan los requerimientos exigidos por los entes guber-
namentales y por el agricultor (Dunham & Trimmer, 2018;
Marrone, 2019).
La idea de controlar insectos plaga y enfermedades mediante

agentes de control biológico tiene más de 150 años. Sporeine,
el primer bioplaguicida comercial, fue producido en 1938 en
Francia y se fabricó a base de Bacillus thuringiensis (Bt). A partir
de esa fecha, se han creado más de 400 compañías de bioplagui-
cidas y numerosos productos se han desarrollado, registrado e
introducido en el mercado y, aunque su uso está en aumento, tan
solo corresponde a un pequeño porcentaje del total de productos
utilizados para la protección de cultivos en el mundo (Ibrahim
et al., 2010). Se estima que el mercado de bioplaguicidas oscila
entre US $ 3 y US $ 4 mil millones, lo cual corresponde, apro-
ximadamente, al 5 % y 6 % del mercado global de plaguicidas
(Marrone, 2019). Además, se proyecta que el crecimiento más
rápido corresponderá a las regiones de América Latina, América del Norte y Europa,
lo cual representa para el año 2020 el 67 % de las ventas mundiales (Dunham &
Trimmer, 2018; Marrone, 2019).
Sin embargo, entre las limitaciones y los desafíos que trae consigo la utilización de
bioinsumos se destacan la variabilidad en la calidad y la eficacia (pues en muchas
ocasiones los bioinsumos presentan un desempeño inconsistente en condiciones
de campo); la baja estabilidad en el almacenamiento; los problemas con los resul-
tados de control de calidad y los costos relativamente altos en comparación con los
plaguicidas convencionales; razones que han relegado históricamente la adopción
de esta tecnología (Arthurs & Dara, 2019; Díaz et al., 2018; Zaki et al., 2020). Con
el fin de generar cambios significativos en el mercado, uno de los grandes desa-
fíos en la implementación del uso de bioplaguicidas se centra en el diseño de una
legislación adecuada que incluya criterios de producción y de calidad, así como el
desarrollo y la ejecución de políticas de promoción y adopción de su uso. Lo ante-
rior generará cambios significativos que contribuirán a la adaptación a este tipo de
productos, ya que en diferentes países los bioplaguicidas aún están regulados por
sistemas diseñados para plaguicidas de síntesis química (Arjjumend & Koutouki,
2018; Santos et al., 2018).
En general, los bioplaguicidas a base de microorganismos pueden incluir como prin-

cipio activo células vegetativas o esporas (en el caso de las bacterias), conidios, clami-
dosporas, blastosporas o micelio (en el caso de mohos), células vegetativas (en el caso
de levaduras) o suspensión de células o virus (en el caso de baculovirus) (Arthurs &
Dara, 2019; Liu et al., 2019). Las etapas de desarrollo abarcan diversos procesos: la
selección de cepas que tengan una actividad biológica promisoria, su caracterización
microbiológica, bioquímica y molecular, el diseño del medio de cultivo, la definición del
sistema de fermentación para la producción masiva del microorganismo seleccionado
como principio activo y los estudios de preformulación para la evaluación y selección
de los excipientes finales de formulación que favorezcan la estabilidad del producto en
campo. Finalmente, se deben realizar estudios de vida útil para definir su estabilidad
en el tiempo bajo condiciones determinadas de almacenamiento, teniendo como
referente el sistema de control de calidad en el proceso interno de producción y en
el producto final, así como evaluaciones de eficacia o actividad biológica (Díaz et al.,
2018; Jenkins & Grzywacz, 2000; Ravensberg, 2011).
Por lo tanto, el control de calidad es de gran importancia para garantizar la produc-

ción y comercialización de bioplaguicidas que cumplan con las especificaciones
Introducción 25
predeterminadas y generen la eficacia dentro de las condiciones establecidas para

su uso. Ahora bien, el control de calidad no solo debe hacerse en el producto termi-
nado, también durante el proceso de producción. De acuerdo con esto, los obje-
tivos del control de calidad deben abarcar diversos aspectos, como los descritos a
continuación.
1. Las materias primas y los equipos e insumos utilizados deben cumplir con las
especificaciones definidas para la producción y con los límites de inocuidad
adecuados.
2. El control de calidad durante el proceso es un procedimiento destinado a garan-

tizar la ejecución de la producción de acuerdo con los parámetros determinados
previamente con el fin de obtener los mayores rendimientos y entregar productos
formulados de manera estándar.
3. El control de calidad del producto terminado (bioplaguicida) es un proce-

dimiento destinado a garantizar que el bioproducto cuente con las especifi-
caciones establecidas: un conjunto previamente definido de estándares que
asegure la eficacia del bioplaguicida dentro de las condiciones de uso descritas
y el cumplimiento de los criterios establecidos por las autoridades de registro.
(Ravensberg, 2011).
Dicho sistema de control de calidad en cada fase de producción asegura la máxima

eficacia en campo y el cumplimiento de los requerimientos del agricultor. Asimismo,
contribuye a la reducción de los costos de producción, maximiza los rendimientos,
garantiza la seguridad del producto y reduce los riesgos por fallas o errores, lo cual
suscita confianza en los usuarios (Lacey, 2017; Jenkins & Grzywacz, 2000).
Actualmente, la disponibilidad de metodologías estandarizadas es limitada y existen

pocos reportes en los cuales se describa de manera detallada el proceso de implemen-
tación de control de calidad de agentes de control biológico; debido a esto, se difi-
culta la comparación de resultados entre pares y grupos de investigación. La mayoría
de estas metodologías provienen del desarrollo de proyectos de investigación y de la
necesidad de obtener resultados veraces y más confiables para el agricultor.
Por lo anterior, el presente libro pretende dar a conocer los criterios que se deben
tener en cuenta, así como las metodologías que se pueden implementar para la reali-
zación eficaz del control de calidad microbiológico, fisicoquímico y de actividad
biológica de bioplaguicidas a base de agentes de control biológico.
Este libro recopila los estudios y los desarrollos más relevantes del mundo en esta
temática. A lo anterior se suma la experiencia de más de 15 años de las autoras en la
realización y diseño de este tipo de pruebas que se reflejan en los casos de estudio que
se presentan a través de los diferentes capítulos. Así pues, el presente texto constituye
una guía para aquellos interesados en mejorar o implementar metodologías para el
control de calidad rutinario de bioplaguicidas a base de agentes de control biológico.
Referencias
Arjjumend, H., & Koutouki, K. (2018). Science of biopesticides and critical analysis
of Indian legal frameworks regulating biocontrol agents. International Jour-
nal of Agriculture, Environment and Biotechnology, 11(716), 563-571. https://
doi.org/10.30954/0974-1712.06.2018.20
Arthurs, S., & Dara, S. K. (2019). Microbial biopesticides for invertebrate pests and
their markets in the United States. Journal of Invertebrate Pathology, 165(1),
13-21. https://doi.org/10.1016/j.jip.2018.01.008
Díaz, A., Gómez, M., Grijalba, E., Santos, A., Cruz, F., León, D., Alarcón, E., & Cotes,
A. (2018). Desarrollo y escalamiento de bioplaguicidas. En A. Cotes. (Ed.),
Control biológico de fitopatógenos, insectos y ácaros: aplicaciones y perspecti-
vas (pp. 628-692). agrosavia.
Dunham, W., & Trimmer, D. (2018). Biological Products Around the World, Biopro-
ducts Industry. Alliance Spring Meeting & Interna.
Ibrahim, M., Griko, N., Junker, M., & Bulla, L. (2010). Bacillus thuringiensis. A geno-
mics and proteomics perspective. Bioengineered Bugs, 1(1), 31-50. https://doi.
org/10.4161/bbug.1.1.10519
Jenkins, N., & Grzywacz, D. (2000). Quality control of fungal and viral biocontrol
agents assurance of products performance. Biocontrol Science and Technolo-
gy, 10(6), 753-777. https://doi.org/10.1080/09583150020011717
Lacey, A. L. (2017). Microbial control of insect and mite pests. Elsevier.
Liu, X., Cao, A., Yan, D., Ouyang, C., & Wang, Q. (2019). Overview of mechanisms
and uses of biopesticides. International Journal of Pest Management, 67(1),
65-72. https://doi.org/10.1080/09670874.2019.1664789
Marrone, P. G. (2019). Pesticidal natural products - status and future potential. Pers-
pective, 75(9), 2325-2340. https://doi.org/10.1002/ps.5433
Introducción 27
Ravensberg, W. (2011). Quality control. En J. Grould, K. Hoelmer, & J. Goolshy

(Eds.), A roadmap to the successful development and commercialization of
microbial pest control products for control products for control of arthropods
(pp. 129-197). Springer.
Santos, A. M., Uribe, L. A., Torres, L., Betancourt, R. A., Moreno, F., Andrea, E., &
Gómez, M. I. (2018). Marco regulatorio para el registro de bioplaguicidas. En
A. Cotes. (Ed.), Control biológico de fitopatógenos, insectos y ácaros: aplica-
ciones y perspectivas (pp. 692-716). agrosavia.
Satapathy, S. N. (2018). Regulatory norms and quality control of biopesticides in
India. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences,
7(11), 3118-3122. https://doi.org/10.20546/ijcmas.2018.711.357
Zaki, O., Weekers, F., Thonart, P., Tesch, E., Kuenemann, P., & Jacques, P. (2020).
Limiting factors of mycopesticide development. Biological Control, 144(1),
104220. https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2020.104220
29
Capítulo I
Control de calidad
microbiológico de
bioplaguicidas a base de
agentes de control biológico
En el proceso de producción de bioplaguicidas, el

control de calidad microbiológico constituye un
factor clave porque permite garantizar y predecir
la eficiencia del producto en condiciones de campo
(Miranda-Hernández et al., 2016). Dicho análisis
microbiológico consiste en la evaluación rigurosa
durante cada etapa del proceso de producción y en el
producto terminado. El objetivo principal es moni-
torear y evitar los problemas de contaminación y
garantizar la calidad del principio activo de la formu-
lación. Sin embargo, la mayoría de las metodologías
microbiológicas que son utilizadas en el proceso de
control de calidad de bioplaguicidas son el resultado
de procesos de investigación y, por esta razón, no se
cuenta con metodologías estandarizadas para este
tipo de productos (Díaz et al., 2018). El alcance de
las técnicas y los procedimientos a aplicar depende
del ingrediente activo del bioproducto. Asimismo,
su adecuada selección, implementación y análisis es
responsabilidad del productor (Ravensberg, 2011).
A continuación se describen las metodologías de

control de calidad microbiológico más utilizadas. Se
hará énfasis, principalmente, en técnicas analíticas para establecer los parámetros

de calidad en la producción y en el producto terminado de bioplaguicidas a base
de hongos, bacterias y virus de interés comercial. De acuerdo con lo anterior, este
capítulo está dividido en las siguientes secciones: identificación del agente de control
biológico, cuantificación del principio activo, viabilidad del principio activo y conte-
nido de contaminantes. En cada una de dichas secciones se profundiza en la meto-
dología y se hacen las recomendaciones pertinentes de acuerdo con el tipo de agente
de control biológico a evaluar.
En general, los parámetros de calidad microbiológica para bioplaguicidas produ-

cidos a base de hongos, bacterias y virus son similares, pues se enfocan, princi-
palmente, en la identificación, cuantificación y viabilidad del principio activo y en
la determinación del contenido de contaminantes. Sin embargo, existen aspectos
particulares que requieren más atención que otros, los cuales dependen del sistema
de producción o fermentación, de las características propias del principio activo y del
tipo de formulación a utilizar (Burges, 1998; Ibrahim et al., 2015).
Identificación del agente de control biológico
El agente de control biológico utilizado debe ser caracterizado de forma macros-

cópica, microscópica y metabólica, además de ser identificado por medio de herra-
mientas moleculares. De esta manera, se asegura que el agente utilizado sea el mismo
para todo el proceso de producción (Díaz et al., 2018). Generalmente, esta identifi-
cación se realiza desde el proceso de selección del agente de control biológico y no
como parte del procedimiento de control de calidad de cada lote.
Debido a su asequibilidad y a la facilidad de realización, actualmente, la primera

aproximación a la identificación de microorganismos se realiza por medio de
métodos convencionales basados en las características fenotípicas (Bou et al., 2011).
Esta identificación fenotípica se basa en la caracterización morfológica, bioquímica
y del crecimiento en condiciones diferenciales de temperatura, pH o atmósferas. Sin
embargo, existen numerosos sistemas bioquímicos (multipruebas) que garantizan
una mayor rapidez en la identificación de algunos microorganismos como bacte-
rias u hongos. Con el fin de garantizar el resultado, todos los sistemas bioquímicos
exigen unas condiciones muy precisas de concentración del inóculo, inoculación,
incubación y lectura (Bou et al., 2011).
Capítulo I Control de calidad microbiológico de bioplaguicidas a base de agentes de control biológico 31
Todos los agentes de control biológico se pueden identificar con base en secuen-
cias de adn mediante técnicas moleculares. Sin embargo, esta información debe ser
contrastada con información morfológica, bioquímica e imágenes macroscópicas y
microscópicas (Cotes et al., 2018).
Una vez seleccionado e identificado el agente de control biológico, se debe asegurar

la estabilidad genética, fisiológica y, especialmente, su actividad biológica durante
largos periodos de tiempo. Lo anterior se realiza a través de la conservación del
microorganismo (crioconservación o liofilización) y la generación de un banco de
trabajo a partir del cual siempre se debe iniciar el proceso de producción del biopla-
guicida. Ravensberg (2011) recomienda que cada vez que se utilice un nuevo vial
del banco de trabajo, se identifique otra vez el agente de control biológico. Es enten-
dible que durante el proceso de control de calidad rutinario no sea posible realizar
esta identificación, no obstante, es necesario contar con un sistema de identificación
de variaciones fenotípicas (fotografías o caracterización bioquímica) que permita
generar alertas en la producción del principio activo con el fin de asegurar que el
agente de control biológico utilizado mantenga las características por las cuales fue
seleccionado (Díaz et al., 2018; Ravensberg, 2011).
Cuantificación del principio activo
La concentración es la cantidad del agente biocontrolador existente en un producto

formulado. Generalmente, es un parámetro utilizado como referencia en el proceso
de fermentación y formulación, ya que permite garantizar la cantidad adecuada del
ingrediente activo en el producto final. Además, esta información es fundamental
para la aplicación del producto en campo, razón por la cual debe especificarse en la
etiqueta (Díaz et al., 2018).
Las metodologías de cuantificación del principio activo dependerán del agente

biocontrolador. Además, este parámetro no garantiza ni refleja la viabilidad ni la
virulencia del principio activo. Por esta razón, la implementación de esta meto-
dología se realiza de manera paralela a la ejecución de metodologías en las cuales
se evalúe la viabilidad o efectividad del agente biocontrolador (Glare et al., 2016).
Dentro de las más utilizadas se destacan las metodologías clásicas de enumeración
de microorganismos, tales como el recuento en placa y aquellas basadas en el uso
de hemocitómetro. Las metodologías mencionadas tienen la ventaja de ser rápidas y
económicas para ser implementadas en un programa de control de calidad. Aunque
a la fecha los métodos de cuantificación basados en herramientas moleculares no
son ampliamente utilizados, son más precisos para cierto tipo de agentes de control
biológico como, por ejemplo, los virus entomopatógenos (Inglis et al., 2012).
Dentro de las metodologías de control de calidad más utilizadas para los productos
terminados se destacan los métodos directos y los métodos indirectos. Por ejemplo,
para la enumeración de esporas fúngicas a partir de insectos, sustratos de produc-
ción, hojas o suelo se puede utilizar el método directo de recuento en hemocitómetro
o el método indirecto de turbidez o recuento en placa (Inglis et al., 2012). A conti-
nuación, se explicarán las particularidades de las metodologías más utilizadas en el
control de calidad de bioplaguicidas.
Recuento en hemocitómetro (cámara de Neubauer)
Un hemocitómetro o cámara de Neubauer es un portaobjetos diseñado especialmente

para realizar el recuento de células mediante el microscopio. Es una técnica rápida
y económica que permite cuantificar el principio activo por unidad de volumen o
peso. Dentro de las dificultades para el recuento en cámara de Neubauer se destaca
la obtención de una alta reproducibilidad, lo que influye en la selección correcta del
tamaño de la muestra, la dilución adecuada, la selección de la cámara de recuento, el
aumento del microscopio e, incluso, el llenado de la cámara (Sharga & Feketa, 2018).
El hemocitómetro es utilizado en la cuantificación del principio activo de biopla-

guicidas a base de hongos (mohos y levaduras) y virus. En el caso de suspen-
siones fúngicas, es posible cuantificar conidios, blastosporas o partes miceliales
(Ravensberg, 2011); sin embargo, no es posible distinguir las células viables de las
no viables. Para las suspensiones a base de virus, los cuerpos de inclusión (ci) que
tienen un alto grado de refracción son cuantificables en microscopios de campo
brillante mediante la cámara de Neubauer (alfabaculovirus, cypovirus y entomo-
poxvirus). Los betabaculovirus son mucho más pequeños (de 0,15 mm a 0,5 mm)
y, por lo tanto, más difíciles de cuantificar; sin embargo el conteo se puede realizar
utilizando un hemocitómetro con una profundidad de cámara más pequeña, como
una cámara de recuento Petroffe-Hausser de 0,02 mm de profundidad. En este caso,
el recuento se debe realizar bajo contraste de fases e iluminación de campo oscuro
(Eberle et al., 2012).
En términos generales, la cámara de Neubauer es una placa de vidrio gruesa del

tamaño de un portaobjetos de vidrio (30 mm x 70 mm x 4 mm), dividida en tres
secciones. La sección media, a su vez, cuenta con un rayado fino que forma una
cuadrícula de 3 mm x 3 mm y es identificable fácilmente con el microscopio. Además,
esta sección está exactamente 0,1 mm de distancia más abajo que las secciones
laterales, lo cual establece un volumen fijo una vez colocado el cubreobjetos espe-
cial (generalmente de cuarzo) (figura 1.1). El cuadrante de 3 mm2 se divide en 9
cuadrados grandes, cada uno con un área de 1 mm2. El cuadrante central (obser-
vable con el objetivo 10×), se divide en 25 cuadrantes medianos con líneas dobles
o triples. Asimismo, cada uno de estos 25 cuadrantes se divide en 16 cuadrantes
pequeños con líneas simples, de modo que cada uno de los cuadrados más pequeños
tiene un área de 1/400 mm2 (figura 1.1) (Eberle et al., 2012).
En general, el procedimiento para la cuantificación del principio activo consiste en

preparar la muestra, preparar la cámara de Neubauer, introducir la muestra en la
cámara de Neubauer, hacer el recuento del principio activo y calcular su cantidad
por área y volumen mediante el factor de corrección de la cámara.
a. Preparación de la muestra: dependiendo del tipo de muestra, se debe preparar

una dilución a una concentración adecuada para el recuento. Generalmente,
el rango de concentración para un recuento utilizando la cámara Neubauer
está entre 250.000 células/ml y 2.5 millones de células/ml. Si la muestra no se
encuentra diluida de manera correcta, es posible que la cuantificación se difi-
culte y se generen errores en el resultado. En cambio, si la muestra está muy
diluida, el tamaño de la muestra no será suficiente para realizar el recuento y
generar confianza en la concentración de la suspensión original. Se recomienda
utilizar diluciones en base 10 (Inglis et al., 2012).
b. Preparación de la cámara de Neubauer: para preparar la cámara de Neubauer

es necesario limpiar la cámara y el cubreobjetos con etanol al 70 %, pues deben
estar libres de polvo y suciedad. Adicionalmente, hay que colocar el cubreobjetos
(de cuarzo) en el área central de la cámara Neubauer. Se debe utilizar una super-
ficie plana para colocar la cámara, la cual debe ser estar nivelada con respecto al
suelo (Eberle et al., 2012).
c. Introducción de la muestra en la cámara de Neubauer: de la dilución o suspen-

sión seleccionada se deben tomar 10 µl con una micropipeta. Posteriormente,
se debe colocar la punta de la micropipeta contra el borde del cubreobjetos y
expulsar lentamente el líquido hasta que la cámara de Neubauer esté llena. La
acción capilar ayudará a asegurar que la cámara se llene de manera homogénea
y sin exceso (figura 1.2).
Figura 1.1. Secciones de la cámara de Neubauer y dimensiones de la cuadrícula del

hemocitómetro. La letra "A" corresponde a la cuadrícula de un 1 mm2 utilizada para
el recuento de agentes de control biológico.
Fuente: Elaboración propia
Figura 1.2. Introducción de la muestra (volumen de 10 µl) en la cámara de Neubauer.

Antes de realizar el recuento, la suspensión se debe estabilizar en los cuadrantes

a contar, para lo cual hay que esperar de 3 a 5 minutos, aproximadamente.
Cuando la dilución contiene como base algún tipo de aceite, se recomienda un
mayor tiempo de sedimentación, además de verificar que el aceite no infiltre
de manera excesiva la cámara de recuento, ya que el cubreobjetos se puede
levantar y aumentar el volumen de la cámara y, por lo tanto, se puede sobre-
estimar la concentración. Cuando se usa agua como base de la suspensión, se
debe garantizar que esta no se evapore antes de realizar el recuento (Inglis et
al., 2012). En caso de que aparezcan burbujas o el cubreobjetos se haya movido,
es necesario repetir la operación.
d. Recuento del principio activo: para hacer el recuento del principio activo
es necesario colocar la cámara de Neubauer en la platina del microscopio.
Posteriormente, hay que enfocar el patrón de la cuadrícula utilizando el obje-
tivo 10×. Para contar conidios, blastosporas, células (suspensiones fúngicas) o
cuerpos de inclusión (suspensiones virales) se debe utilizar el objetivo 40× y
ajustar la luz del microscopio para obtener definición y nitidez en la imagen.
Se recomienda realizar el recuento de forma organizada por cuadrante (figura
1.3a). Los valores óptimos por cuadrante deben ser mínimo 10 y máximo 100;
los valores por fuera de este rango generan una baja precisión en el resultado
final (Bioscience, 2018).
a b
Figura 1.3. Instrucciones de lectura de la cámara de Neubauer. a. Secuencia correcta para

realizar el recuento en un cuadrante de la cámara de Neubauer; b. Criterio para realizar el
recuento de principio activo en los cuadrantes internos de la cámara de Neubauer. Color
negro se puede cuantificar y color gris no se puede cuantificar.
Para evitar el doble conteo, el criterio es no contabilizar las estructuras (principio

activo) que tocan las líneas inferior y derecha que limitan el cuadrado (figura 1.3b).
Para el caso de conidios en proceso de germinación o células de levaduras en gema-
ción que tienen la mitad del tamaño de la célula matriz, estas deben contabilizarse. Se
ha establecido que existe uniformidad en el recuento cuando la desviación estándar
(s) está del 10 % al 15 % de la media (Inglis et al., 2012).
e. Cálculo del principio activo por área y volumen: para obtener una estima-
ción de la cantidad de principio activo por mililitro de la suspensión original, el
promedio del recuento obtenido en cada cuadrante se multiplica por el factor de
conversión de volumen; estos factores de corrección dependerán de la cuadrí-
cula en la cual se realizó el recuento (ecuación 1.1).
Principio activo Promedio de recuento de principio activo * factor de dilución *103

=
ml dela muestra ( )
Área mm 2 * profundidad dela cámara ( mm )
Ecuación 1.1. Ecuación para el cálculo de principio activo utilizando la cámara de Neubauer.
El área y la profundidad dependerán del cuadrante seleccionado para realizar el recuento.
El factor de dilución utilizado en la fórmula está determinado por la dilución de la

muestra utilizada en el recuento. La profundidad utilizada en la fórmula es siempre
0,1 mm. La superficie del área corresponderá al área del cuadrante utilizado en el
recuento. El factor del cuadrante principal de la cámara de Neubauer (figura 1.1)
corresponde a 0,02 cm x 0,02 cm x 0,01 cm = 4,0 x 10-6. Para los cuadrantes laterales,
el factor de la cámara corresponde a 1,0 x 104 (Eberle et al., 2012, Inglis et al., 2012).
Caso de estudio I
Una muestra de un bioplaguicida a base de Trichoderma spp. fue reconstituida en

solución de Tween 80 al 0,1 %. A partir de la dilución 10-2 se obtuvo un recuento
total de 230 conidios. El recuento se realizó en los cuadrantes laterales empleando 4
cuadros por cuadrante, para un total de 16 (ecuación 1.2).
conidios Recuento obtenido

= * factor de dilución * factor dela cámara
ml Número de cuadros contados
Ecuación 1.2. Ecuación para el cálculo de conidios de Trichoderma

spp. utilizando la cámara de Neubauer.
Con base en los datos se hace el reemplazo, tal como se muestra en la ecuación 1.3:
230
× 102 × 103 conidios
conidios 16
= = = 2,30 ×108
ml ( 0, 25 × 0, 25 ) × 0,1 ml
Ecuación 1.3. Recuento de conidios de Trichoderma spp. utilizando la cámara de Neubauer.
Los datos presentan una distribución normal, por lo tanto, la media y el error de la
muestra pueden ser utilizados para calcular los intervalos de confianza. Es impor-
tante tener en cuenta que el principio activo que se esté cuantificando mediante la
cámara de Neubauer no debe presentar agregados, de manera tal que el recuento siga
una distribución de Poisson y el error estándar de la media sea igual a lo descrito en
la ecuación 1.4:
~

SD =
N
~
Donde:  = Número de principio activo cuantificado por cuadrante
N = número de cuadrante contados
Ecuación 1.4. Ecuación para el cálculo de la desviación estándar en

recuentos de principio activo utilizando la cámara de Neubauer.
La precisión de la estimación dependerá del número de principio activo cuantifi-

cado. Siempre que el número sea superior a 50, se pueden calcular los límites de
confianza con una distribución normal de 0,975 y en un cuartil de 1,96.
Para el caso de estudio I, corresponderá la ecuación 1.5:
~ 230
= = 14,374
16
14,374
SD = = 0,947
16
Ecuación 1.5. Cálculo de la desviación estándar para el recuento
de conidios de Trichoderma spp. (caso de estudio I).
Como el número de conidios contados es mayor que 50 (caso de estudio I) y se asume

que los resultados presentan una distribución normal, los límites de confianza (95 %)
del recuento medio corresponderá a lo descrito en la ecuación 1.6):
0,9747
Límites de confianza (95 % ) = 14,374 ± 1,96 x
cuadrante
1,910
Límites de confianza (95 % ) = 14,374 ±
16
Límites de confianza (95 % ) = 14,374 ± 0,11
Ecuación 1.6. Cálculo de los límites de confianza al 95% para el recuento

de conidios de Trichoderma spp. (Caso de estudio I).
A partir de esto, se puede calcular el recuento de conidios de Trichoderma spp. con

sus respectivos límites de confianza (95 %) (ecuación 1.7).
(
Límites de confianza al 95 % = 2,30 ×108 × 100 × 0,11 × 1 × 106 = )
108 conidios
= 2,30 ± 1,10 x
ml
Ecuación 1.7. Recuento de conidios de Trichoderma spp. con
límites de confianza al 95 % (caso de estudio I).
La metodología de recuento en cámara de Neubauer se recomienda para productos a

base de hongos (mohos y levaduras) y virus, sin embargo, las suspensiones utilizadas
deben tener un bajo nivel de partículas o impurezas diferentes al principio activo, lo
que garantizará un resultado confiable y de alta precisión.
Métodos espectrofotométricos
Los métodos espectrofotométricos son métodos indirectos utilizados para cuanti-

ficar el número de colonias presentes en una muestra líquida de un microorganismo
y estimar la concentración de la población microbiana. Este método es utilizado para
estimar concentraciones de hongos y bacterias (Hernández & Acebo, 2013). La meto-
dología se basa en la transmitancia de la luz a través de la suspensión y en el hecho
de que el porcentaje de luz transmitida disminuirá en proporción a la turbidez. Sin
embargo, las lecturas de absorbancia (turbidez) deben estandarizarse mediante la
comparación de las unidades formadoras de colonia por unidad de volumen o por la

cantidad de principio activo utilizando un hemocitómetro. Aunque el método turbi-
dimétrico es relativamente simple y rápido, está sujeto a errores debido a la variación
en tamaño, forma y aglomeración de los principios activos evaluados (Caligiore-Gei
& Valdez, 2015).
El sistema de medición de turbidez cuenta con una lámpara, la muestra a analizar

y el fotodetector (figura 1.4). La fuente de emisión (lámpara) tiene la capacidad de
emitir una longitud de onda la cual se establece de acuerdo con el tipo de muestra; el
fotodetector es el receptor de los fotones y actúa como un sensor óptico. Este sensor
permite amplificar las señales en forma de impulsos eléctricos, lo cual genera un valor
de turbidez expresado como absorbancia (figura 1.4) (Hernández & Acebo, 2013).
Generalmente, esta metodología es utilizada como control de calidad en el proceso,

es decir, durante los procesos de fermentación, ya que se requiere una estimación
rápida del crecimiento microbiano (Hernández & Acebo, 2013). Para esto, se mide
la absorbancia de una muestra del caldo de fermentación mediante un espectrofo-
tómetro (Hernández & Acebo, 2013). Sin embargo, esta metodología tiene una gran
desventaja, ya que no permite diferenciar las células viables de las no viables, porque
los dos tipos de células absorben a una longitud de onda especifica. Por esta razón, la
absorbancia no se puede definir como una medida directa de la viabilidad.
Figura 1.4. Esquema general de un sistema de turbidez (espectrofotometría).

Varios autores han implementado el uso de métodos espectrofotométricos en la

cuantificación rutinaria de principios activos de bioplaguicidas. Por ejemplo, Schütz
et al. (2020) establecieron una metodología para la preparación rápida y confiable
de inóculos de Trichoderma reesei y T. atroviride, evaluando el efecto del tamaño, la
forma y la pigmentación de los conidios a diferentes longitudes de onda. Los autores
establecieron que una absorbancia entre 550 nm y 700 nm está directamente relacio-
nada con el recuento de conidios para las cepas de Trichoderma spp. y, por lo tanto,
las curvas de calibración se pueden usar como una herramienta válida y rápida para
estimar la concentración de conidios en una solución.
En el caso de levaduras, el proceso de cuantificación por espectrofotometría es utili-

zado, principalmente, para la preparación del inóculo en el montaje de pruebas de
control de calidad de actividad biológica. Por ejemplo, Magoye et al. (2020), utili-
zaron esta metodología en la estandarización del inóculo de Aureobasidium pullu-
lans para ser evaluado frente hongos como Botrytis cinerea y Fusarium spp.
Con respecto a bioplaguicidas a base de bacterias, esta metodología es utilizada

como control de calidad en el proceso (fermentación) y se han realizado aproxima-
ciones en su uso para la estimación del recuento del producto final. Para bacterias
esporoformadoras, la cuantificación de esporas viables se puede realizar mediante la
lectura de la absorbancia, debido a que estas tienen un índice de refracción más alto
que las células vegetativas y la refractividad está sujeta a disminuir durante el proceso
de germinación. De acuerdo con lo mencionado este método es más sensible, rápido
y sencillo en comparación con la metodología de recuento en placa (Zhang et al.,
2015). De igual manera, en el proceso de germinación de esporas de Bacillus subtilis,
Gorsuch & Woodruff (2019) utilizaron las lecturas de absorbancia a 600 nm como
un método altamente confiable para comparar los resultados con la implementación
de un protocolo de cuantificación mediante qPCR en el producto terminado.
Para los virus entomopatógenos, la técnica de espectrofotometría tiene una baja sensi-
bilidad y especificidad, además, no permite cuantificar el principio activo en muestras
compuestas, tales como productos de formulación o de suelo (Graham et al., 2015).
Cuantificación por PCR
La cuantificación por medio de PCR es ampliamente utilizada en el control de calidad

en el proceso de fabricación y en las formulaciones de bioplaguicidas a base de virus.
Su amplia utilización se debe a que es altamente específica y sensible. Este método
requiere el conocimiento de al menos alguna parte del genoma del virus para generar
cebadores específicos que se unan únicamente a la secuencia de interés (Miele et al.,
2011). Algunos de los protocolos utilizan “agentes intercaladores fluorescentes” de
doble cadena de adn, sin embargo, se pueden producir falsos positivos si aparecen
productos de pcr inespecíficos (Barrera et al., 2016). Las sondas marcadas con fluo-
rescencia son oligonucleótidos que se unen específicamente a la secuencia de interés y
permiten la cuantificación por fluorescencia. Se aplican principalmente tres tipos de
sondas: TagMan (Barrera et al., 2016), balizas moleculares (Tyagi & Kramer, 1996) y
sondas de hibridación (Eberle et al., 2012).
Esta metodología se ha implementado durante las etapas de producción del principio

activo (cría de insectos) y en la cuantificación del principio activo en el producto
formulado.
a. Cría de insectos para la producción de baculovirus: las crías de insectos

se realizan en condiciones controladas de laboratorio o de invernadero. En
general, los individuos que se utilizan como pie de cría provienen de campo y se
mantienen en cuarentena para garantizar la introducción de individuos libres de
infección o enfermedades. Sin embargo, este proceso consume tiempo crítico,
por lo que la implementación de la cuantificación por PCR permite detectar
la infección por baculovirus presente en una larva, con una alta sensibilidad y
especificidad (Barrera et al., 2016).
b. Cuantificación de principio activo en producto formulado: esta técnica es

especialmente utilizada para virus de tamaño (densovirus, iridovirus o virus
de arn) que no son cuantificables por medio de técnicas de microscopía óptica.
Puede ocurrir un problema si el genoma del virus está segmentado (nodavirus,
cypovirus o tetravirus). Aunque la cuantificación de virus mediante qPCR
requiere alguna optimización, la cuantificación de genomas de virus mediante
técnicas de qPCR es un método estandarizado y de una alta precisión (Eberle
et al., 2012). Un ejemplo de la utilización de esta técnica es el trabajo realizado
por Barrera et al. (2016), quienes utilizaron la técnica de qPCR para establecer la
concentración de granulovirus en un bioplaguicida formulado como un concen-
trado emulsionable.
Viabilidad de principio activo
La cuantificación de microorganismos es un elemento crítico en la caracterización

y el control de calidad de bioplaguicidas. No solo es importante identificar y cuan-
tificar al microorganismo, también es fundamental conocer el número de microor-
ganismos viables. De esta manera se podrá establecer si los mismos serán capaces de
desarrollar y causar el efecto biocontrolador deseado.
Se han diseñado distintas estrategias para cuantificar el principio activo de bioplagui-

cidas a base de hongos y bacterias (tabla 1.1). En el caso de productos a base de hongos
filamentosos, la determinación de la viabilidad se puede realizar por el método de
recuento en placa y por el método de germinación de conidios. Para productos a base
de levaduras, la viabilidad se determina por medio de recuento en placa con dife-
rentes modificaciones. Para productos a base de bacterias, se pueden utilizar varias
metodologías, tales como recuento en placa, goteo en placa y el método del Número
Más Probable (nmp) (Corral-Lugo et al., 2012).
Tabla 1.1. Metodologías utilizadas para la determinación de la viabilidad del principio activo de bio-
plaguicidas a base de hongos filamentosos, levaduras y bacterias
Principio activo de bioplaguicidas

Metodología Hongos
Levaduras Bacterias
filamentosos
Recuento en placa x x x
Goteo en placa x x
Germinación de conidios x
Número más probable x
Si bien las metodologías para la determinación de la viabilidad aumentan la preci-

sión de la cuantificación y proporcionan información sobre la distribución espacial
del microorganismo, estos métodos requieren de mucha mano de obra en compa-
ración con los métodos de recuento indirectos (por ejemplo: recuento en cámara de
Neubauer o espectrofotometría) (Inglis et al., 2012). Además, es importante esta-
blecer la metodología ideal de acuerdo con el principio activo, el tipo de formulación
(por ejemplo: granulado, polvo o concentrado emulsionable) y la cantidad de conta-
minantes, ya que este último factor puede afectar el resultado de la cuantificación
del principio activo.
Recuento en placa
La metodología de recuento en placa es una técnica ampliamente utilizada que permite

cuantificar la población en una muestra o cultivo (puro o mixto) mediante diluciones
seriadas (por ejemplo: 1:10) para, posteriormente, realizar el recuento de las unidades
formadoras de colonia (ufc) (Sieuwerts et al., 2008). Esta metodología tiene la ventaja
de tener un buen límite de detección, sin embargo, requiere una gran cantidad de
material y más tiempo durante el procesamiento y la lectura de la muestra.
Para esta técnica, dependiendo del principio activo a cuantificar, se utilizan medios
de cultivo específicos, selectivos o diferenciales (tabla 1.2). Las técnicas más utili-
zadas en el control de calidad de bioplaguicidas para el recuento de células viables
son el recuento en superficie y el recuento en profundidad. Tanto el método de super-
ficie como el de profundidad consisten en diluir la muestra original en un factor 1:10
hasta la dilución en la cual se pueda realizar un recuento de unidades formadoras de
colonia (ufc) (figura 1.6).
Tabla 1.2. Medios de cultivo y método de siembra más utilizados para el recuento del principio activo
de bioplaguicidas a base de bacterias, hongos filamentosos y levaduras
Microorganismos Suplemento del

Medio de cultivo Método de siembra
principio activo medio de cultivo
Pseudomonas spp. Agar nutritivo na Siembra en

Paenibacillus spp. Agar Luria Bertani superficie / Siembra
Serratia spp. na en profundidad
(lb)
Bacillos Agar lb na
Siembra en
esporoformadores,
Agar brain heart superficie / Siembra
(incluyendo Bacillus na
infusion (bhi) en profundidad
thuringiensis)
Agar papa dextrosa
Tritón X-100 (1 %)
(pda)
Agar Sabouraud
na Siembra en
Trichoderma spp. dextrosa
superficie
Trichoderma selec-
na
tive media (tsm)
Agar rosa de bengala na
Agar pda Tritón X-100 (1 %) Siembra en
Beauveria sp.
Agar avena na superficie
(Continúa)
(Continuación tabla 1.2)
Microorganismos Suplemento del

Medio de cultivo Método de siembra
principio activo medio de cultivo
Metarhizium
Siembra en
sp., Isaria sp., Agar pda Tritón X-100 (1 %)
superficie
Lecanicillium sp.
Agar extracto de
Siembra en
Metarhizium rileyi malta y levadura Tritón X-100 (1 %)
superficie
(ym)
Purpureocillium Siembra en
Agar pda Tritón X-100 (1 %)
lilacinum superficie
Agar extracto de
malta y levadura Cloranfenicol
(ym)
Levaduras (e.g. Agar levadura, Siembra en
Pichia onychis) peptona, dextrosa Cloranfenicol superficie
(ypd)
Agar Sabouraud
Cloranfenicol
dextrosa
*na: No aplica.
Para la cuantificación y determinación de la viabilidad de bioplaguicidas a base de

bacterias, hongos filamentosos y levaduras, el método más utilizado es el recuento en
superficie. Este método consiste en la colocación de 100 µl de cada una de las dilu-
ciones en cajas de Petri independientes que contengan el medio de cultivo gelificado.
Los 100 µl en cada caja de Petri son extendidos (plaqueada) con ayuda de un rastrillo
o con esferas de vidrio —en ambos casos el material debe estar estéril y a tempera-
tura ambiente (figura 1.5)—. Una vez se hayan sembrado los 100 µl, las cajas de Petri
se deben poner a incubar durante 3 a 7 días teniendo en cuenta las condiciones de
crecimiento que requiera el microorganismo a ser cuantificado (tabla 1.3).
Tabla 1.3. Condiciones de temperatura y tiempo de crecimiento de acuerdo con el principio activo del
bioplaguicida, para su recuento en placa
Microorganismos
Temperatura de crecimiento Tiempo de incubación
principio activo*
Bacterias 30 ºC ± 2 ºC 24-48 horas
Hongos
25 ºC ± 2 ºC 3-7 días
filamentosos
(Continúa)
Microorganismos
Temperatura de crecimiento Tiempo de incubación
principio activo*
Levaduras (por
ejemplo: Pichia 28 ºC ± 2 ºC 48 horas
onychis)
*Grupos de microorganismos más utilizados como principio activo de bioplaguicidas. Pueden existir excepciones a las condiciones descritas.
Figura 1.5. Viabilidad de principio activo (hongos y bacterias) de bioplaguicidas. Método de

recuento en placa y siembra en superficie mediante diluciones en base 10.
Con el fin de obtener una desviación estándar inferior al 10 %, se recomienda

sembrar mínimo tres cajas de Petri por dilución. Después de que las colonias hayan
crecido, se debe seleccionar la dilución en la cual las cajas de Petri contengan los
rangos establecidos para cada tipo de principio, por ejemplo, entre 30 a 300 ufc
para productos a base de bacterias (Inglis et al., 2012; Muñoz-Rojas et al., 2016). Para
calcular el número de ufc presentes en la muestra, se multiplica por 10 el número
de colonias presentes en la caja de Petri seleccionada para realizar el recuento. El
resultado obtenido es multiplicado por el factor de dilución para obtener el número
de unidades formadoras de colonia por mililitro (ufc/ml o ufc/g), como se describe

en la ecuación 1.8.
 Número de colonias contadas x1 

UFC UFC  factor de dilución 
o =
ml g volumen sembrado
Ecuación 1.8. Cálculo de unidades formadoras de colonias (UFC) por medio de

método de recuento en placa - siembra en superficie (ISO 4833-1:2013).
Caso de estudio II
Se realizó el recuento en placa de un bioplaguicida a base de Trichoderma spp. Para

dicho fin se utilizó el método de siembra en superficie en Agar pda suplementado
con Tritón X-100 al 1 %. En la dilución 10-6 se obtuvo un recuento de 156 ufc y en la
dilución 10-7 se obtuvo un recuento de 34 ufc.
Dilución 1:
 156 x1 
UFC  10 −6 
= = 1,56*109
ml 0,1 ml
Dilución 2:
 34 x1 
UFC UFC  10 −7 
o = = 3, 40*109
ml g 0,1ml
Consolidado:
UFC 1,56*109 + 3, 40*109

= = 2, 48 *109 ≈ 25*108
ml 2
Para algunos productos a base de bacterias se utiliza el método de siembra en profun-

didad. Para esto, se agrega 1 ml de cada dilución en las cajas de Petri sin medio de
cultivo, se adiciona una cantidad de medio de cultivo fundido (aproximadamente
20 ml) y se agita con suavidad, así se garantiza la homogenización de la muestra.
Este método posibilita el crecimiento de bacterias microaerófilas, ya que permite el
crecimiento de colonias a bajas concentraciones de oxígeno. El cálculo de las ufc se
realiza de la misma forma que el recuento en superficie; se realiza la corrección con

el volumen de siembra (ecuación 1.8).
Goteo en placa
La metodología de goteo en placa se utiliza en la determinación de la viabilidad de

bioplaguicidas a base de bacterias y levaduras. El goteo en placa consiste en colocar
5 gotas de un volumen de 20 µl de cada una de las diluciones seriadas en cajas de
Petri con el medio de cultivo. Posteriormente, estas cajas se incuban bajo las condi-
ciones establecidas para cada microorganismo y después del tiempo de incubación
se realiza el recuento de las ufc. En general, para esta metodología se requiere el
uso de 2 cajas de Petri para garantizar la correcta siembra de las diluciones seriadas,
lo que permite aumentar el número de repeticiones y del tamaño de las muestras
(figura 1.6) (Muñoz-Rojas et al., 2016). Con el fin de estimar el número de ufc /ml en
cada una de las muestras, se debe cuantificar el número de colonias de acuerdo con
la dilución seleccionada. Posteriormente, se correlaciona el volumen de 20 µl con 1
ml con el fin de expresar el resultado en ufc /ml (Corral-Lugo et al., 2012).
Figura 1.6. Viabilidad del principio activo (hongos y bacterias) de bioplaguici-

das. Método de goteo en placa.
En el caso de hongos, el método de goteo en placa ha sido utilizado para la cuanti-

ficación de hongos dimórficos en su fase levaduriforme, ya que permite disminuir
el tiempo y es igual de eficiente que el método de recuento en placa. Por ejemplo,
Morales-García et al. (2016) seleccionaron la metodología de goteo en placa para
ser utilizada como control de calidad en proceso para el hongo Penicillium spp., ya
que no se presentaron diferencias significativas (p≤0,05) entre esta metodología en
comparación con el método de siembra en superficie. Como recomendación para el
proceso de implementación de este método, es importante definir el tiempo correcto
de lectura con el fin de obtener resultados confiables y seguros.
Recomendaciones para la evaluación de la viabilidad de bioplaguicidas a base de

hongos filamentosos, levaduras y bacterias, mediante la metodología de recuento en
placa en superficie o goteo en placa:
• Para bioplaguicidas formulados como granulados (wg), polvo mojable (wp),

polvo para espolvoreo y concentrados emulsionables (ce), la suspensión inicial
se debe homogeneizar de manera adecuada. Se puede utilizar una licuadora de
inmersión durante máximo 20 segundos o se puede dejar la suspensión inicial en
agitación a 1500 rpm ± 25 rpm durante máximo 30 minutos.
• Para productos a base de bacterias esporoformadoras, el número de células vege-

tativas y esporas puede evaluarse realizando un choque térmico de 15 minutos
a 80 ºC ± 2 ºC. Se cuantifica el número de células (antes del choque térmico) y el
número de esporas (después del tratamiento térmico).
• Las diluciones seriadas se deben homogeneizar en vórtex durante aproximada-

mente 10 segundos.
• Para productos a base de hongos se recomienda utilizar un diluyente a base de un

tensoactivo como Tween 80 o Tween 20 entre el 0,1 % y el 1 % v/v.
• Para productos a base de bacterias se recomienda utilizar solución salina como

diluyente (0,9 % NaCl) o agua peptonada (0,1 %).
• Para expresar el resultado como ufc/g se debe realizar la corrección con la

cantidad de muestra (gramos) utilizada en la suspensión inicial.
Para el recuento de unidades formadoras de colonia ufc:
• Cuando tres cajas de Petri de una misma dilución contienen un número de

unidades de colonia características del microorganismo a evaluar, se promedian
los números y se multiplica por el inverso de la dilución.
• Cuando haya una caja de Petri con crecimiento extendido, ni esta ni su triplicado
son considerados.
• Cuando hay cajas de Petri representativas en 2 diluciones seguidas, se promedia

cada una con su triplicado, se aplica el factor de dilución a cada una y luego se
promedia nuevamente.
• Si en las cajas de Petri no hay crecimiento de ufc (o no corresponden a las carac-

terísticas del microorganismo), se debe reportar el resultado como: 10-x (dilución
más baja utilizada) y se debe informar como valor estimado.
• El rango de recuento para bioplaguicidas a base de bacterias es de 30 a 300 ufc.
• El rango de recuento para bioplaguicidas a base de hongos es de 10 a 150 ufc.
• Cuando el número de colonias por caja de Petri exceda el rango establecido, se

deben cuantificar las colonias en aquellas porciones de la caja de Petri que sean
representativas de la distribución de colonias e informar como valor estimado.
Germinación de conidios
Para productos a base de hongos filamentosos, la determinación de la germinación

de conidios es el parámetro de viabilidad más utilizado dentro del control de calidad
en el proceso y el producto terminado (Jenkins & Grzywacz, 2000). La germina-
ción es el mecanismo mediante el cual una espora o conidio inactivo o en proceso
de dormancia crece vegetativamente y es capaz de reproducirse de forma sexual o
asexual (Sephton-Clark & Voelz, 2018).
Este proceso se da bajo condiciones ambientales favorables de oxígeno y disponibi-

lidad de agua y se caracteriza por un rápido hinchamiento del conidio como resul-
tado del proceso de hidratación. La infiltración de agua en los conidios por ósmosis
aumenta su presión hidrostática interna y es seguida por la formación de un tubo
germinal de paredes delgadas (Lacey, 2017). Generalmente, este proceso ocurre en
cuatro etapas: crecimiento isotrópico o hinchazón, polarización celular, aparición
de hifas y elongación de hifas (Sephton-Clark & Voelz, 2018) (figura 1.7). En la etapa
de crecimiento isotrópico se observa el proceso de hinchazón, ya que las esporas
aumentan su contenido interno y, por lo tanto, reorganizan las paredes celulares.
Las esporas también aumentan su actividad metabólica y pueden utilizar fuentes de
energía externas o internas para iniciar procesos de transcripción y traducción de
información genética. La polarización de la pared celular después de la hinchazón
determina dónde emergerá el tubo germinal. En esta etapa, la pared celular requiere
un proceso de ajuste ya que debe permitir el crecimiento de las hifas. Cuando las
hifas emergen, crecen hasta formar lo que puede verse como una estera hifal o matriz
en la cual las hifas pueden solaparse e incluso crecer hacia fuentes de luz o nutritivas
(Sephton-Clark & Voelz, 2018).
Figura 1.7. Proceso de germinación de conidios.

Fuente: Elaboración propia con base en Sephton-Clark & Voelz (2018)
En la actualidad, los conidios son el principio activo de casi el 75 % de los bioplagui-

cidas disponibles en el mercado (Zaki et al., 2020). Debido a esto, el protocolo para
evaluar la germinación de los conidios es habitualmente la técnica más utilizada
en el proceso de control de calidad de productos a base de hongos filamentosos.
Sin embargo, existen diferencias y variaciones entre los protocolos descritos y, en
general, no hay un método estandarizado en el mundo para evaluar esta caracterís-
tica. Algunos de los factores que influyen en la germinación de conidios son el pH y
la composición de los medios de cultivo, la disponibilidad de agua, la temperatura
de incubación, el proceso de hidratación de la célula y hasta la temperatura del dilu-
yente utilizado (Lopes et al., 2013). Por esta razón, es importante establecer estos
parámetros para el montaje de la prueba.
Para la evaluación de la germinación, la muestra a evaluar se diluye en diluciones

seriadas en base 10 (1:10). Posteriormente, de las diluciones seleccionadas (una
concentración aproximada de 106 conidios/ml) se siembran 100 µl por medio de la
técnica de superficie en el medio de cultivo elegido; las cajas de Petri inoculadas se
incuban aproximadamente durante 18 a 24 horas y trascurrido el tiempo de incuba-

ción, los conidios germinados y no germinados se cuantifican mediante observación
en microscopio (Inglis et al., 2012). Se considera como conidio germinado cuando el
tubo germinal es igual o más largo que el conidio no germinado (figura 1.8) (Faria et
al., 2015; Oliveira et al., 2015).
Figura 1.8. Esquema representativo de tipos de conidios y de un conidio germinado con el respecti-
vo tubo germinal. Dimensiones morfológicas (largo y ancho) de acuerdo con cada tipo de conidio.
A continuación se describe la metodología implementada para la determinación

del porcentaje de germinación en el control de calidad de bioplaguicidas a base de
Trichoderma spp. (concentración teórica de 109 conidios/g) (Santos et al., 2012).
1. En primer lugar, hay que preparar una suspensión inicial adicionando 1 g o 1 ml

de la muestra de conidios o del bioplaguicida a evaluar en una solución de 99 ml
de Tween 80 al 0,1%.
2. En segundo lugar, hay que homogeneizar la suspensión anterior (dilución 10-2)

con una licuadora de inmersión o dejarla en agitación hasta que la dilución esté
homogénea.
3. En tercer lugar, hay que realizar diluciones seriadas en base 10 hasta la dilución
10-3. Es fundamental evitar el contacto entre la micropipeta y el diluyente.
4. En cuarto lugar, hay que sembrar por triplicado 100 µl de las tres últimas dilu-
ciones en las cajas de Petri con agar agua suplementado con benomil (0,0003 %).
Además, hay que distribuir el contenido de manera homogénea sobre el medio
de cultivo.
5. En quinto lugar, hay que incubar las cajas de Petri inoculadas a una temperatura
de 25 °C durante 24 horas en un ambiente oscuro y ubicarlas dentro de la incu-
badora de manera invertida.
6. En sexto lugar, hay que cortar con un bisturí un trozo del medio de cultivo
inoculado de aproximadamente 1 cm2 y colocarlo sobre una lámina portaob-
jetos. Si se requiere, se debe adicionar una gota del reactivo azul de lactofenol y
cubrir con una laminilla (figura 1.9).
7. En séptimo lugar, se procede a cuantificar los conidios germinados y no germi-

nados en microscopio de luz (objetivo 40×). Como mínimo se deben contar 100
conidios (germinados y no germinados) por cada caja de Petri a evaluar.
8. Para el conteo de conidios germinados y no germinados se debe partir del

extremo superior izquierdo del cuadrado (1 cm2) del medio de cultivo y avanzar
en forma de zigzag, para evitar el doble conteo de conidios.
9. Finalmente, se puede determinar el porcentaje de germinación de conidios

mediante la siguiente fórmula (ecuación 1.9):

Germinación ( % ) = 
∑conidios germinados 
 x100
∑conidios germinados + ∑conidios no germinados 
Ecuación 1.9. Cálculo del porcentaje de germinación de conidios.

Figura 1.9. Montaje de la prueba de germinación para el proceso de cuantificación

de conidios germinados y no germinados.
Recomendaciones para la determinación del porcentaje de germinación de conidios:
• Una densidad adecuada para la cuantificación de conidios está en el rango de 106

conidios. Idealmente, la caja de Petri a utilizar debe ser de un diámetro de 9 cm
(referencia 90 mm * 16 mm).
• Las condiciones de incubación (temperatura y tiempo) dependerán del microor-

ganismo a evaluar.
• El medio de cultivo debe ser seleccionado para cada microorganismo. Se sugiere

un medio de cultivo basal (agar agua); sin embargo, algunos hongos tienen reque-
rimientos nutricionales especiales. Por ejemplo, para el proceso de germinación,
Metarhizium rileyi requiere una fuente nutricional de nitrógeno y el medio de
cultivo que se utiliza es agar extracto de malta (tabla 1.4).
Tabla 1.4. Medios de cultivo comúnmente utilizados para evaluar la germinación de conidios de hon-
gos biocontroladores
Microorganismo
Medio de cultivo Referencia
principio activo
Agar agua + benomil (0,0003 %) Santos et al. (2012)
Agar agua Kobori et al. (2014)
Trichoderma spp. Agar pda Sanogo et al. (2002)
Caldo papa dextrosa Hjeljord (2000)
Caldo peptona (1 %) Jackson et al. (1991)
Agar pda Alves et al. (1996)
Agar pda + benomil (10 μl/l) Oliveira et al. (2015)
Agar pda + carbendazima (10
Oliveira et al. (2015)
μl/l).
Agar pda + extracto de levadura
Fernandes et al. (2007)
(1g /l)
Medio de cultivo esporulación Alves et al. (2002)
Beauveria spp. Agar agua (2 % p/v)
Petlamul & Prasertsan
Agar Czapeck Dox
(2012)
Agar Sabouraud dextrosa + Talaei-Hassanloui et al.
levadura (1 %) (2007)
Agar glucosa (1 %) + peptona (0,5 Horaczek & Viernstein
%) + Extracto de levadura (0,5 %) (2004)
Agar Sabouraud dextrosa Kim et al. (2019)
Agar extracto de levadura +
Faria et al. (2010)
benomil (0,005 g/l)
Agar pda + extracto de levadura
Rangel et al. (2005)
(1 g/L)
Agar pda + benomil (10 μl/L) Oliveira et al. (2015)
Agar pda + carbendazima
Oliveira et al. (2015)
(10 μl/ l).
Metarhizium spp.
Agar Sabouraud dextrosa Ibrahim et al. (2015)
Caldo medio mínimo (mm) Lazzarini et al. (2006)
Petlamul & Prasertsan
Agar Czapeck Dox
(2012)
Agar glucosa (1 %) + peptona (0,5 Horaczek & Viernstein
%) + extracto de levadura (0,5 %) (2004)
Agar extracto de malta y levadura Santos et al. (2017)
(Continúa)
Microorganismo
Medio de cultivo Referencia
principio activo
Agar extracto de malta y levadura
Metarhizium spp. Grijalba et al. (2018)
+ benomil (0,00008 %)
Agar Sabouraud Grijalba et al. (2018)
Agar agua Rivas et al. (2014)
Lecanicillium spp. Agar Sabouraud, maltosa, extracto
Feng et al. (2002)
de levadura y neopeptona (smay)
Agar glucosa (2 %) Shi et al. (2006)
• Los medios de cultivo enriquecidos, como el agar papa dextrosa, contienen todos
los nutrientes necesarios y las condiciones ideales para el proceso de germina-
ción, lo que puede generar una sobrevaloración del porcentaje de germinación.
En el caso contrario, cuando se utilizan medios de cultivo basales como el agar
agua, las condiciones son mínimas y similares a las que se pueden presentar en
condiciones de campo.
• El medio de cultivo a utilizar debe ser de un color traslúcido y debe ser agar de
capa delgada (10 ml por caja de Petri), de manera tal que facilite la visualización
de los conidios.
• Diferentes autores han sugerido la adición de fungicidas al medio de cultivo

debido a que a bajas concentraciones generan una sincronización en el proceso de
germinación y permiten realizar un recuento uniforme y en diferentes tiempos de
lectura. Además, permiten la formación de tubos germinales, aunque previenen
el desarrollo de hifas y evitan el crecimiento excesivo (Milner et al., 1991; Oliveira
et al., 2015). El fungicida más utilizado es el benomilo y las concentraciones de
uso generalmente son inferiores a 0,001 %. Sin embargo, este producto ya no tiene
aprobación en varios países. Por lo tanto, es necesario seleccionar un fungicida
registrado y disponible comercialmente que presente un efecto similar cuando se
mezcle con el medio de cultivo. Por ejemplo, Oliveira et al. (2015) demostraron
que el fungicida carbendazima (también del grupo químico benzimidazol) a una
concentración de 10 μl por litro de medio de cultivo (0,005 g de ingrediente activo
por litro de medio) puede usarse para evaluar la germinación de productos a base
de B. bassiana y M. anisopliae.
• Se recomienda la adición de antibióticos al medio de cultivo, ya que evita el creci-

miento de contaminantes bacterianos y facilita el recuento. Dentro de los antibió-
ticos más utilizados se destacan los de amplio espectro como el cloranfenicol, la

tetraciclina, la estreptomicina y la eritromicina.
• Para facilitar el recuento de conidios, se utiliza como colorante el azul de lacto-

fenol pero se debe utilizar de forma moderada ya que puede causar una sobrees-
timación de los recuentos, pues elimina los conidios no germinados de las zonas
de inoculación (Lopes et al., 2013).
• La laminilla o el cubreobjetos sobre el cuadro de agar seleccionado para el

recuento debe colocarse de manera que no haya presión hidráulica sobre el medio
de cultivo y no afecte la distribución de los conidios.
Además de la prueba de germinación, en algunas ocasiones es necesario evaluar el

parámetro definido como vigor, el cual se relaciona con la velocidad de germinación
de los conidios y el crecimiento de los tubos germinales (Faria et al., 2015). Esta
metodología es útil en estudios de estabilidad bajo condiciones de almacenamiento
o en pruebas donde se evalúen condiciones de estrés. Los conidios con un alto nivel
de vigor germinan entre las 18 y las 24 horas posteriores a la inoculación, mientras
que la germinación de conidios estresados se puede retrasar y volver asincrónica, por
lo cual puede tener lugar entre las 24 y las 72 horas (Faria et al., 2015). Sin embargo,
la implementación de este parámetro depende de las características del producto y
del interés de complementar la información y las recomendaciones del bioproducto.
La germinación de conidios se considera un indicador de la capacidad del hongo

para producir un tubo germinal y, por lo tanto, generar un efecto biocontrolador.
Una germinación rápida se relaciona con una mayor probabilidad de éxito en condi-
ciones de campo, sin embargo, la alta germinación no garantiza altos valores de
eficacia, por esta razón, las metodologías de viabilidad y actividad biológica son
complementarias (Miranda-Hernández et al., 2016).
Contenido de contaminantes: pureza
Las especificaciones en un bioplaguicida para determinar el nivel aceptable de

contaminantes dependen del método de producción masiva, formulación y emba-
laje. La producción masiva es el proceso más susceptible de verse perjudicado por
una posible contaminación debido a que los contaminantes (bacterias u hongos),
pueden crecer sin ningún tipo de restricción (Jenkins & Grzywacz, 2000). Todas las
fermentaciones microbianas tienen un alto riesgo de contaminación debido a la alta
disponibilidad nutricional del sustrato y a las condiciones ambientales. La conta-

minación en los sistemas de fermentaciones, tanto líquidas como sólidas, afectará
el rendimiento debido a la competencia por nutrientes y, en algunos casos, al efecto
inhibidor de los metabolitos secundarios (Jenkins & Grzywacz, 2000). Además, los
contaminantes bacterianos o fúngicos pueden afectar la concentración del principio
activo en el producto final, en especial si la contaminación no ha sido monitoreada
y cuantificada.
Para el caso de bioplaguicidas a base de virus, la contaminación microbiana puede

ser el resultado del proceso de producción del principio activo. Teniendo en cuenta
que su producción se realiza en condiciones in vivo, puede presentar una carga alta
de microorganismos contaminantes presentes en las dietas utilizadas y en el insecto
mismo (Caballero et al., 2001; Santos et al., 2014).
La metodología más utilizada para la cuantificación de contaminantes microbianos

es la técnica de recuento en placa en superficie (numeral 1.3) y el resultado se expresa
como ufc/g o ufc /ml de producto. Para cuantificar el total de contaminantes
microbianos se deben cuantificar individualmente las bacterias, las levaduras y los
hongos contaminantes. Posteriormente se realiza la sumatoria aplicando la ecuación
1.10. Este parámetro también se puede expresar en términos de porcentaje de pureza
(ecuación 1.11).
UFC UFC UFC * inverso dela dilución *10

o debacterias =
g ml peso dela muestra

o delevaduras =

o de hongos =
Ecuación 1.10. Cálculo de unidades formadoras de colonias (ufc) de contaminantes microbianos.
UFC de contaminantes
Pureza ( % ) = *100
UFC de principio activo + UFC de contaminantes
Ecuación 1.11. Cálculo del porcentaje de pureza para productos

a base de agentes de control biológico.
El efecto de la contaminación microbiana en un bioplaguicida fue descrito por Meikle

et al. (2012). Los autores evidenciaron que un bioplaguicida formulado a base de B.
bassiana para el control de ácaros en colonias de abejas presentó resultados contra-
dictorios en condiciones de campo. Las colmenas de abejas tratadas con el biopla-
guicida murieron a un ritmo elevado, perdieron más peso y tuvieron una densidad
de ácaros más alta en comparación con las colmenas utilizadas como control. Los
autores identificaron que el bioplaguicida estaba contaminado con bacterias del
grupo de Pseudomona fluorescens. En condiciones de laboratorio se demostró que la
cepa de P. fluorescens ralentiza o suprime el crecimiento de B. bassiana, comporta-
miento que se evidenció en condiciones de campo.
Por otro lado, patógenos para humanos como Salmonella spp. o Escherichia coli
se pueden cuantificar por medio de las metodologías usadas para el análisis de
alimentos o materias primas. Los niveles de presencia de estos patógenos deben ser
estrictos y en algunos casos se exige que estén ausentes. Este parámetro en la actua-
lidad no es obligatorio dentro de un programa de control de calidad rutinario pero
se recomienda realizarlo en el proceso de desarrollo del producto y en el proceso de
registro del mismo. Jenkins & Grzywacz (2000) recomiendan realizar un análisis
de riesgo para determinar las posibles entradas en el sistema de este tipo de conta-
minante con el fin de garantizar la seguridad del producto cuando se aplique en
condiciones de campo.
Para productos a base de virus, en algunos países solicitan la evaluación de especies

de Bacillus spp., ya que puede ser un contaminante muy común en virus producidos
in vivo, en especial cuando los insectos muertos se recolectan después de la muerte.
Todas estas especies forman esporas, que son mucho más resistentes a la destrucción
tanto por calor como por medios químicos que las células bacterianas vegetativas.
Una de las bacterias más comúnmente encontrada en productos a base de npv es
Bacillus cereus, la cual puede ser aislada en agar nutritivo. Sin embargo, si otras espe-
cies son abundantes, la detección de pequeñas cantidades (10-1 a 10-2 por ml) de B.
cereus puede resultar difícil. Para estas situaciones, se recomienda utilizar medios de
cultivo específicos para B. cereus. La identificación y confirmación se puede realizar
mediante tinción o utilizando un perfil bioquímico.
Para establecer un nivel aceptable de contaminantes, se deben determinar niveles de

referencia durante el proceso de fermentación, formulación y empaque del producto.
A partir de esta carta control se generan los límites de aceptación para el producto
final. Por esta razón y con base en los requisitos específicos para el registro comer-
cial, el productor es quien establece el límite y la pureza del producto. Sin embargo,
en el ámbito internacional se reconoce un nivel máximo de 0,1 % de contaminantes
en comparación con la concentración del principio activo (Ravensberg, 2011).
Perspectivas
El aspecto central para lograr un buen control de calidad de un bioinsumo se centra

en el establecimiento y estricto cumplimiento de los procedimientos o protocolos de
control de calidad. Para el caso de las características microbiológicas, el elemento
central consiste en que, una vez elegidos y establecidos los protocolos, estos se deben
seguir de manera estricta sin importar las presiones externas ni internas en el desa-
rrollo del producto. Si no se hace un estricto cumplimiento de estas metodologías,
el sistema de control de calidad dejará de funcionar y los resultados no podrán
garantizarse.
A pesar del uso y la proyección en el mercado que tienen los productos biológicos
a base de agentes de control biológico, existe una gran variedad de protocolos para
determinar las características microbiológicas. Por lo tanto, se requiere de un trabajo
en conjunto entre los productores de bioinsumos, los investigadores y los entes
reguladores en el establecimiento de requerimientos mínimos para los productos.
Asimismo, es imperativa la generación de lineamientos y metodologías estandari-
zadas que sean aplicables en condiciones ambientales similares, de manera que sean
repetibles y reproducibles. Otro de los desafíos está relacionado con que las metodo-
logías implementadas sean prácticas, precisas, económicas y estén siempre basadas
en desarrollos metodológicos que cumplan con los requerimientos científicos.
Referencias
Alves, S. B, Pereira, R. M., & Stimac, J. L. (1996). Delayed germination of Beauve-

ria bassiana conidia after prolonged storage at low, above-freezing tem-
peratures. Biocontrol Science and Technology, 6(1), 575-582. https://doi.
org/10.1080/09583159631217
Alves, S. B, Rossi, L. S, Lopes, R. B., Tamai, M. A, & Pereira, R. M. (2002). Beauve-
ria bassiana yeast phase on agar medium and its pathogenicity against Dia-
traea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae) and Tetranychus urticae (Acari:
Tetranychidae). Journal of Invertebrate Pathology, 81(2), 70-77. https://doi.
org/10.1016/S0022-2011(02)00147-7
Barrera, G. P., Murcia, J., Cerón, J. L., Cuartas, P. E., Guzmán, C. A., & Villamizar,
L. F. (2016). PCR en tiempo real: una metodología útil para la detección y
cuantificación de granulovirus. Revista Colombiana de Biotecnología, 18(2),
24-31. https://doi.org/10.15446/rev.colomb.biote.v18n2.61514
Bioscience. (2018). Identifying and resolving the sources of hemacytometer counting
error through automation. Bioscience.
Bou, G., Fernández-Olmos, A., García, C., Sáez-Nieto, J. A., & Valdezate, S. (2011).
Métodos de identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología.
Enfermedades Infecciosas y Microbiologia Clínica, 29(8), 601-608. https://
doi:10.1016/j.eimc.2011.03.012
Burges, H. D. (1998). Formulation of microbial biopesticides. Kluwer Academic Pub-
lishers.
Caballero, P., Williams, T., & López-Ferber, M. (2001). Los baculovirus y sus aplica-
ciones como bioinsecticidas en el control biológico de plagas. Phytoma.
Caligiore-Gei, P. F., & Valdez, J. G. (2015). Ajuste de un método rápido para la
cuantificación de suspensiones de esporas de Fusarium spp. en fitopatolo-
gía. Revista Argentina de Microbiología, 47, 152-154. https://doi:10.1016/j.
ram.2015.03.002
Corral-Lugo, A., Morales-García, Y., Pazos-Rojas, L., Ramírez-Valverde, A., Mar-
tínez-Contreras, R., & Muñoz-Rojas, J. (2012). Cuantificación de bacterias
cultivables mediante el método de “Goteo en Placa por Sellado (o estampado)
Masivo. Revista Colombiana de Biotecnología, 14(2), 147-156.
Cotes, A. M., Fargetton, X. & Köhl, J. (2018). Diseño conceptual, selección y prueba
de concepto de microorganismos biocontroladores. En A. Cotes. (Ed.), Con-
trol biológico de fitopatógenos, insectos y ácaros: aplicaciones y perspectivas
(pp. 594-628). agrosavia.
Eberle, K. E., Wennmann, J. T., Kleespies, R. G., & Jehle J. A. (2012). Basic techniques
in insect virology. En L. A. Lacey (Ed.), Manual of Techniques in Invertebrate
Pathology (pp. 15-74). Elsevier.
Faria, M., Hotchkiss, J. H., Hajek, A. E., & Wraight S. P. (2010). Debilitation in co-
nidia of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium
anisopliae and implication with respect to viability determinations and my-
copesticide quality assessments. Journal of Invertebrate Pathology, 105(1), 74-
83. https://doi:10.1016/j.jip.2010.05.011
Faria, M., Lopes, R. B., Souza, D. A., & Wraight, S. P. (2015). Conidial vigor vs. viabi-
lity as predictors of virulence of entomopathogenic fungi. Journal of Inverte-
brate Pathology 125(1), 68-72. https://doi:10.1016/j.jip.2014.12.012
Feng, K. C., Liu, B. L., & Tzeng, Y. M. (2002). Morphological characterization and
germination of aerial and submerged spores of the entomopathogenic fun-
gus Verticillium lecanii. World Journal Microbioloogy and Biotechnology,
18(1), 217-224. https://doi.org/10.1023/A:1014933229314
Fernandes, E. K., Rangel, D. E. N., Moraes, A. M. L., Bittencourt, V., & Roberts, D.
W. (2007). Variability in tolerance to UV-B radiation among Beauveria spp.
isolates. Journal of Invertebrate Pathology, 96(1), 237-243.
Glare, T., & Moran, M. (2016). Microbial-based Biopesticides: Methods and Protocols.
Humana Press.
Gorsuch, J. P. & Woodruff, P. (2019). Nutrient germination improves DNA recovery
from industrial Bacillus subtilis endospores during qPCR enumeration as-
says. Heliyon, 5(12), e02917. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2019.e02917
Graham, R. I., Tummala, Y., Rhodes, G., Cory, J. S., Shirras, A., Grzywacz, D., &
Wilson, K. (2015). Development of a real-time qPCR assay for quantification
of covert baculovirus infections in a major african crop pest. Insects, 6(3),
746-759. https://doi.org/10.3390/insects6030746
Grijalba, E. P., Espinel, C., Cuartas, P. E., Chaparro, M. L., & Villamizar, L. F. (2018).
Metarhizium rileyi biopesticide to control Spodoptera frugiperda: Stabil-
ity and insecticidal activity under glasshouse conditions. Fungal Biology,
122(11), 1069-1076. https://doi.org/10.1016/j.funbio.2018.08.010
Hernández, D., & Acebo, A. (2013). Los métodos turbidimétricos y sus aplicaciones
en las ciencias de la vida. Revista Cenic Ciencias Biológicas, 44(1), 1-18.
Hjeljord, L. (2000). Effect of temperature and nutrient stress on the capacity of com-
mercial Trichoderma products to control Botrytis cinerea and Mucor piri-
formis in greenhouse strawberries. Biological Control, 19(2), 149-160. https://
doi.org/10.1006/bcon.2000.0859
Horaczek, A., & Viernstein, H. (2004). Comparison of three commonly used dry-
ing technologies with respect to activity and longevity of aerial conidia of
Beauveria brongniartii and Metarhizium anisopliae. Biological Control 31(1),
65-71. https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2004.04.016
Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., & Ibrahim, S. (2015). Mass production, yield,
quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium aniso-
pliae conidia. British Journal of Applied Science & Technology, 9(5), 427-440.
https://doi.org/10.13140/RG.2.1.4339.2484
Inglis, G., Enkerli, J., & Goettel, M. S. (2012). Laboratory techniques used for en-
tomopathogenic fungi. Hypocreales. En L. A. Lacey (Ed.), Manual of Tech-
niques in Invertebrate Pathology (pp. 189-253). Elsevier.
Jackson, A., Whipps, J. M., Lynch, J. M., & Bazin, M. (1991). Effects of some carbon
and nitrogen sources on spore germination, production of biomass and an-
tifungal metabolites by species of Trichoderma and Gliocladium virens an-
tagonistic to Sclerotium cepivorum. Biocontrol Sciece and Technology, 1(1),
43-51. https://doi.org/10.1080/09583159109355184
gy, 10(6), 753-777. https://doi.org/10.1080/09583150020011717
Jenkins, N., & Grzywacz, D. (2003). Quality control and production of biological
control agents: theory and testing procedures. En J. C. van Lenteren (Ed.),
Quality control and production of biological control agents: Theory and Tes-
ting Procedures. cabi Publishing.
Kim, J. C., Lee, M. R., Kim, S., Lee, S. J., Park, S. E., Baek, S., Gasmi, L., Shin, T. Y., &
Kim, J. S. (2019). Long-term storage stability of Beauveria bassiana ERL836
granules as fungal biopesticide. Journal of Asia-Pacific Entomology, 22(2),
537-542. https://doi.org/10.1016/j.aspen.2019.04.001
Kobori, N. N., Mascarin, G. M., Jackson, M. A., Schisler, D. A., & Money, N. (2014).
Liquid culture production of microsclerotia and submerged conidia by Tri-
choderma harzianum active against damping-off disease caused by Rhizoc-
tonia solani. Fungal Biology, 119(4), 179-190. https://doi.org/10.1016/j.fun-
bio.2014.12.005
Lazzarini, G., Rocha, L., & Luz, C. (2006). Impact of moisture on in vitro germi-
nation of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana and their activity
on Triatoma infestans. Mycological Research, 110(4), 485-492. https://doi.or-
g/10.1016/j.mycres.2005.12.001
Lopes, R. B., Martins, I., Souza, D. A., & Faria, M. (2013). Influence of some parame-
ters on the germination assessment of mycopesticides. Journal of Invertebra-
te Pathology 112(3), 236-242. https://doi.org/10.1016/j.jip.2012.12.010
Magoye, E., Pfister, M., Hilber-Bodmer, M., & Freimoser, F. M. (2020). Competition
assays to quantify the effect of biocontrol yeasts against plant pathogenic
fungi on Fruits. Bio-Protocol, 10(3), e3518. https://doi.org/10.21769/BioPro-
toc.3518
Meikle, W. G., Mercadier, G., Guermache, F., & Bon, M. C. (2012). Pseudomonas
contamination of a fungus-based biopesticide: Implications for honey bee
(Hymenoptera: Apidae) health and Varroa mite (Acari: Varroidae) control.
Biol Control, 60(3), 312-320. https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2011.12.004
Miele, S. A., Belaich, M. N., Garavaglia, M. J., & Ghiringhelli, P. (2011). Quality con-
trol of baculoviral bioinsecticide production. En I. Akyar (Ed), Wide spectra
of quality control (pp. 411-428). IntechOpen.
Milner, R. J., Huppatz, R. J., Swaris, S. C. (1991). A new method for assessment of ger-
mination of Metarhizium conidia. Journal of Invertebrate Pathology, 57(1),
121-123.
Miranda-Hernández, F., Angel-Cuapio, A., & Loera-Corral, O. (2016). Production
of fungal spores for biological control. En A. Pandey, S. Negi & C. R. Soccol
(Eds.), Current Developments in Biotechnology and Bioengineering: Produc-
tion, Isolation and Purification of Industrial Products (pp. 757-779). Elsevier.
Morales-García, Y. E., Hernández-Canseco, J., Ramos-Castillo, G., Pérez-Terrón, R.,
& Muñoz-Rojas, J. (2016). Cuantificación de Penicillium sp. Por el método de
goteo en placa. Revista Iberoamericana de Ciencias, 3(1), 12-19.
Muñoz-Rojas, J., Morales-García, Y. E., Baez-Rogelio, A., Quintero-Hernández, V.,
Rivera-Urbalejoa, A. P. & Pérez-Terrrón, R. (2016). Métodos económicos
para la cuantificación de microorganismos. En G. Chavira (Ed.), Institucio-
nes de educación superior la labor investigadora e innovadora en México (pp.
67-84). Science Associated Editors.
Oliveira, D., Pauli, G., Mascarin, G. M., & Delalibera, I. (2015). A protocol for de-
termination of conidial viability of the fungal entomopathogens Beauveria
bassiana and Metarhizium anisopliae from commercial products. Jour-
nal of Microbiological Methods, 119(1), 44-52. https://doi.org/10.1016/j.mi-
met.2015.09.021
Petlamul, W., & Prasertsan, P. (2012). Evaluation of strains of Metarhizium anisopliae
and Beauveria bassiana against Spodoptera litura on the basis of their viru-
lence, germination rate, conidia production, radial growth and enzyme activ-
ity. Mycobiology, 40(2),111-116. https://doi.org/10.5941/MYCO.2012.40.2.111
Rangel, D., Braga, G., Anderson, A. J., & Roberts, D. W. (2005). Influence of growth
environment on tolerance to uv-b radiation, germination speed, and mor-
phology of Metarhizium anisopliae var. acridum conidia. Journal of Inverte-
brate Pathology. 90(1), 55-58. https://doi.org/10.1016/j.jip.2005.05.005
Rivas, F., Núñez, P., Jackson, T., & Altier, N. (2014). Effect of temperature and water
activity on mycelia radial growth, conidial production and germination of
Lecanicillium spp. isolates and their virulence against Trialeurodes vaporar-
iorum on tomato plants. BioControl, 59(1), 99-109, https://doi.org/10.1007/
s10526-013-9542-y
Sanogo, S., Pomella, A., Hebbar, P. K., Bailey, B., Costa, J. C. B., Samuels, G. J., &
Lumsden, R. D. (2002). Production and germination of conidia of Trichoder-
ma stromaticum, a mycoparasite of Crinipellis perniciosa on cacao. Phytopa-
thology, 92(10), 1032-1037. https://doi.org/10.1094/PHYTO.2002.92.10.1032
Santos, A., Brandão, P., & Villamizar, L. (2017). Efecto de estrés térmico y de irra-
diación con luz ultravioleta (UV-B) sobre características de Nomuraea ri-
leyi Nm006. Revista Colombiana de Biotecnología, 19(1), 81-91. https://doi.
org/10.15446/rev.colomb.biote.v19n1.55943
Santos, A., García, M., Cotes, A. M., Villamizar, L. (2012). Efecto de la formulación
sobre la vida útil de bioplaguicidas a base de dos aislamientos colombianos
de Triichoderma koningiopsis Th003 y Trichoderma asperellum Th034. Revis-
ta Iberoamericana de Micología, 29(3),150-156.
Santos, A., Grijalba, E., Zuluaga, M., Gómez, M., & Villamizar, L. (2013). Compatibi-
lidad in vitro de un bioplaguicida a base de Lecanicillium lecanii (Hypocrea-
les: Clavicipitaceae) con agroquímicos empleados en los cultivos de algodón
y berenjena. Revista Colombiana de Biotecnología, 15(2), 132-142. https://doi.
org/10.15446/rev.colomb.biote.v15n2.38025
Schütz, G., Haltrich, D., & Atanasova, L. (2020). Influence of spore morphology on
spectrophotometric quantification of Trichoderma inocula. Biotechnique,
68(5), 2-5. https://doi.org/10.2144/btn-2019-0152
Sephton-Clark, P. C. S., & Voelz, K. (2018). Spore germination of pathogenic fila-
mentous fungi. Advances in Applied Microbiology, 112(1), 117-157. https://doi.
org/10.1016/bs.aambs.2017.10.002
Sharga, B. M., & Feketa, V. (2018). The estimation of the number of cells in suspension
or culture using hemocytometer.
Shi, Z., Li, M., & Zhang, L. (2006). Effects of nutrients on germination of Verticilli-
um lecanii (=Lecanicillium sp.) conidia and infection of greenhouse whitefly
(Trialeurodes vaporariorum). Biocontrol Science Technology, 16(1), 599-606.
https://doi.org/10.1080/09583150500532832
Sieuwerts, S., De Bok, F. A. M., Mols, E., De Vos, W. M., & Van Hylckama Vlieg,
J. (2008). A simple and fast method for determining colony forming units.
Letters in Applied Microbiology, 47(4), 275-278. https://doi.org/10.1111/j.1472-
765X.2008.02417.x
Talaei-Hassanloui, R., Kharazi-Pakdel, A., Goettel, M. S., Little, S., & Mozaffari, J.
(2007). Germination polarity of Beauveria bassiana conidia and its possible
correlation with virulence. Journal of Invertebrate Pathology, 94(2), 102-107.
https://doi.org/10.1016/j.jip.2006.09.009
Tyagi, S. , & Kramer, F. R. (1996). Molecular beacons: probes that fluoresce upon
hybridization. Nature Biotechnology, 14, 303-308. https://doi.org/10.1038/
nbt0396-303
Zaki, O., Weekers, F., Thonart, P., Tesch, E., Kuenemann, P., Jacques, P. (2020). Limit-
ing factors of mycopesticide development. Biological Control, 144(1), 104220.
https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2020.104220
67
Capítulo II
Control de calidad fisicoquímico

de bioplaguicidas microbianos
Un bioplaguicida microbiano tiene dos componentes:

un ingrediente activo que corresponde al microorga-
nismo que ejerce la acción biológica y los excipientes
o sustancias inertes que, además de servir de vehí-
culo para el activo, tienen una función de protec-
ción, ya sea durante el almacenamiento o cuando
el producto es aplicado en campo. Adicionalmente,
ayudan a formar un sistema de entrega que permite
una fácil aplicación.
Con el fin de garantizar que el bioplaguicida elabo-

rado cumpla con el objetivo para el cual fue desarro-
llado y mantenga su viabilidad, actividad biológica y
características fisicoquímicas, es importante llevar a
cabo el control de las variables que pueden ser un indi-
cativo de su calidad microbiológica, biológica y fisi-
coquímica mediante el establecimiento de los límites
bajo los que se deben conservar. Generalmente, se le
da mayor importancia al control de calidad micro-
biológico y biológico, ya que proporciona informa-
ción respecto del estado del microorganismo, lo cual
incide directamente en la eficacia del producto. De
acuerdo con esto, suele prestársele menos atención al
control de calidad fisicoquímico a pesar de que este
también tiene un efecto indirecto sobre la eficacia del producto y puede aportar un
valor agregado o diferencial a un mismo tipo de bioplaguicida. Por ejemplo, pueden
existir dos granulados con el mismo ingrediente activo o microorganismo, pero uno
de ellos puede ser más eficaz por presentar una completa y más rápida desintegra-
ción del gránulo, lo cual posibilita la liberación total del ingrediente activo y garan-
tiza su aplicación en la dosis establecida.
En este sentido, el objetivo de este capítulo es identificar las variables fisicoquí-

micas más importantes de acuerdo con el sistema de entrega o tipo de formula-
ción del bioplaguicida y las metodologías existentes que suelen emplearse para su
determinación.
Bioplaguicidas microbianos sólidos
Los sistemas de entrega sólidos que suelen emplearse para la formulación de agentes
de control biológico son los polvos y granulados. En la tabla 2.1 se presentan sus
características y lo que se espera de acuerdo con el tipo de formulación en el momento
de su aplicación.
Foto: Erika Grijalba B.
Figura 2.1. Granulado dispersable a base de Rhodotorula

mucilaginosa (Basidiomycota: Sporidiobolales).
Capítulo II Control de calidad fisicoquímico de bioplaguicidas microbianos 69
Tabla 2.1. Sistemas de entrega de bioplaguicidas microbianos sólidos

Bioplaguicidas
Descripción Características en la aplicación
sólidos
Tiempo corto de humectabilidad,
Mezcla del microorganismo con un
formación de una suspensión
Polvos mojables polvo que se humecta y suspende
homogénea en la que no se
(wp) en agua en el momento de su
formen aglomerados, poca
aplicación.
formación de sedimento.
Corresponden a la mezcla de un
microorganismo con un polvo
Polvos de Facilidad de aplicación por tener
mineral fino, de un tamaño que
aplicación buena fluidez y no presentar
varía de 50 a 100 micras, que se
directa (dp) formación de aglomerados.
aplican directamente sobre el
blanco.
Mezcla de un ingrediente activo
Polvos para
y un polvo empleado como Buena adherencia cuando se logra
tratamiento de
vehículo (diluyente) para facilitar el una cobertura total de la semilla.
semilla (ds)
recubrimiento de la semilla.
Formulaciones sólidas con un
rango de tamaño de 100 a 1.000
Granulados micras, de flujo libre, diseñadas Buena humectabilidad y tiempo
dispersables para ser suspendidas en agua y corto para lograr una completa
(wg) liberar el microorganismo de forma desintegración.
homogénea en el momento en el
que el gránulo se desintegra.
Mayor estabilidad del ingrediente
activo al protegerlo de factores
bióticos y abióticos del medio
brindándole un microambiente
Sistemas de liberación controlada o benéfico. Este factor puede
sostenida en los que el ingrediente aumentar su vida útil y mantener
activo se encuentra en el interior la actividad metabólica por
Cápsulas
de una partícula, generalmente periodos prolongados de
un polímero, que puede o no estar tiempo, no solo durante el
hidratado. almacenamiento, sino después
de su aplicación, lo cual resulta
en la reducción del número de
aplicaciones o de la dosis del
producto.
Fuente: elaboración propia con base en Faria & Wraight (2007); Gansic & Brankica (2013); Vemmer & Patel (2013)
Teniendo en cuenta los principales sistemas de entrega sólidos, a continuación se

describen las pruebas fisicoquímicas más relevantes para cada tipo de formulación
(tabla 2.2) y algunas de las metodologías empleadas para su evaluación (tabla 2.3).
Tabla 2.2. Variables fisicoquímicas para evaluar en bioplaguicidas microbianos sólidos

Variable para evaluar
Humectabilidad
Suspendibilidad
Desintegración
Tipo de Formulación
Tamaño de
Humedad
partícula
pH
Polvos mojables X X X X X
Polvos de aplicación
X X X
directa
Polvos para tratamiento
X X X
de semillas
Granulados X X X X X
Cápsulas1 X X X
1
Otras variables fisicoquímicas importantes a evaluar en este tipo de formulaciones son la solubilidad, la hidrofobicidad, la higroscopicidad,
el potencial zeta, la superficie y la morfología (Zhang et al., 2020; Sung-II et al., 2019; Gray et al., 2016; Chan et al., 2011).
Humectabilidad: de acuerdo con Freudig et al. (1999), esta característica se describe

como la “facilidad que tiene un polvo de empaparse por un líquido por efecto de
las fuerzas capilares que controlan la velocidad de este” (p. 525). La velocidad con
la que un material sólido se humecta depende del tamaño de las partículas y del
tamaño de sus poros, de la cantidad de poros que tiene y del valor del ángulo de
contacto formado entre el agua y el material (Schubert, 1978; Freudig et al., 1999).
Esta característica se puede medir expresándola como el tiempo en que el mate-
rial tarda en humectarse o como el ángulo de contacto entre el agua y el material
evaluado. El primer caso se conoce como humectabilidad estática o test de Freudig
modificado (Freudig et al., 1999; Kim et al., 2000) y consiste en la determinación del
tiempo requerido para que se sumerja hasta la última partícula de polvo de la super-
ficie. Para dicho fin, una cantidad conocida del material a evaluar se coloca sobre
un volumen de agua. En el segundo caso, como lo decribe Yang et al. (2003), “una
gota de líquido con gran tensión superficial descansando sobre una superficie sólida
con baja tensión superficial, origina una gota de forma esférica, es decir, un ángulo
de contacto elevado y viceversa” (p. 199). De acuerdo con esto, para que el sólido se
humecte se necesita que la tensión superficial del sólido sea mayor a la del líquido
o que la tensión superficial del líquido sea menor a la del sólido (Gil et al., 2008).
Cuanto menor sea el ángulo de contacto, mayor será la humectabilidad del material.
Para el caso de los polvos y granulados, esta característica generalmente se expresa
como el tiempo que una cantidad conocida del material a evaluar en un volumen de
agua preestablecido tarda en humedecerse completamente.
Suspendibilidad: esta característica hace referencia a la formación de una suspen-

sión homogénea cuando el producto es reconstituido en agua. Se pueden evaluar dos
tipos de suspendibilidad de una formulación. El primero corresponde a la suspen-
dibilidad del ingrediente activo (conidios, esporas, células, cuerpos de inclusión), es
decir, la cantidad de ingrediente activo suspendido después de un tiempo dado en
una columna de líquido de altura conocida. Esta es expresada como el porcentaje de
la cantidad de ingrediente activo en la suspensión original, por lo cual este método es
adecuado para suspensiones que contienen hasta 1 % de ingrediente activo pero no
para suspensiones con una concentración mayor de ingrediente activo (Collaborative
International Pesticides Analytical Council [Cipac], 1995). El segundo corresponde
a la suspendibilidad del producto total, es decir, la suspendibilidad del producto
(ingrediente activo y sólidos en suspensión) suspendido después de un tiempo dado
en una columna de líquido de altura conocida. Esta es expresada como un porcentaje
del peso con respecto al peso en la suspensión original (Lisansky et al., 1993).
Desintegración: es un proceso en el cual una forma sólida, generalmente granulado

o tableta, se rompe en partículas más pequeñas y finalmente en sus componentes, con
lo cual libera el ingrediente activo y asegura su biodisponibilidad (Markl & Zeitler,
2017). Esta característica tiene un efecto directo en la eficacia del producto. Uno de
los mecanismos de desintegración más conocidos involucra varias etapas, la primera
corresponde a la penetración del líquido en el material poroso compacto (Nogami
et al., 1967), la segunda al hinchamiento, en el cual se agrandan las partículas que
acumulan presión y se separan en partículas adyacentes (List & Muazam, 1979) y, la
tercera, a la fuerza del líquido en el que se encuentra disperso el granulado, fuerza
que es pequeña, pero que con la presencia de un agente desintegrante se vuelve tan
apreciable como para romper las partículas compactas (Peppas & Colombo, 1989).
La evaluación de esta característica para granulados y tabletas consiste en la medi-
ción del tiempo de desintegración, es decir, el tiempo que una cantidad conocida
del material a evaluar tarda en romperse completamente y formar una suspensión
homogénea cuando se agita en un volumen determinado de agua.
Tamaño de partícula: en el caso de los polvos es una característica esencial, ya que

el porcentaje de finos (con un tamaño inferior a 5 µm) puede causar problemas en
la salud de quienes aplican este tipo de productos. Las partículas con un rango de
tamaño de 1 a 5 µm se depositan en las regiones alveolares y bronquiales por sedi-
mentación (Crowder et al., 2002). Además, esta característica puede afectar otras
propiedades de los materiales sólidos como la fluidez (Kudo et al., 2020). La determi-
nación del tamaño de las partículas generalmente se expresa como distribución del
tamaño de partícula y puede realizarse por granulometría, por medio de una batería
de tamices con diferente tamaño de malla, donde el material es retenido de acuerdo
con su tamaño y, posteriormente, pesado para calcular el porcentaje que queda en
cada tamiz (lo anterior también puede hacerse por observación directa con ayuda de
un microscopio y un micrómetro). Otros métodos incluyen el uso de analizadores
de difracción de rayos láser.
pH: desde el punto de vista operacional, el pH es la medida de la acidez o alcalinidad

de un medio acuoso (Skoog et al., 1997) y es definido como el logaritmo negativo de
la actividad de los iones hidronio (Carstensen, 1998) (generalmente se toma como
concentración, ya que en soluciones diluidas son casi iguales). Juega un papel funda-
mental en la regulación de diferentes procesos fisiológicos de los microorganismos,
por lo que su control en un bioplaguicida es crítico para asegurar la viabilidad y
actividad biológica del ingrediente activo.
Humedad: es una característica muy importante en los bioplaguicidas sólidos pues

incide en la viabilidad del microorganismo durante el almacenamiento. Productos
con humedades superiores al 10 % mantienen más activo su metabolismo (Zarate et
al., 2010), lo que puede reducir su estabilidad microbiológica, además de representar
un riesgo en el aumento de contaminantes. Por otra parte, en términos de la formu-
lación, la humedad influye en características como la fluidez y la compactación. A
mayor humedad menor fluidez y mayor formación de aglomerados en los granu-
lados (Cueva, 2018). La humedad es determinada tomando como base la pérdida de
peso de una muestra cuando el contenido de agua presente se evapora por el calor al
que se somete, el resultado obtenido se expresa como porcentaje de humedad.
Tabla 2.3. Metodologías y descripción de las variables evaluadas en bioplaguicidas microbianos sólidos
Variable Metodología Descripción
En un vaso de precipitado de 250 ml con un
ntc 439. diámetro interno de 6,5 ± 0,5 cm y una altura
Plaguicidas, de 9 ± 0,5 cm se adicionan 100 ml de agua a 30
coadyuvantes ± 1 ºC. Sobre el agua se dejan caer en un mismo
y reguladores punto 5 g del producto a evaluar, no compactado,
fisiológicos. Ensayos y se determina el tiempo que tarda en humectarse
de suspensibilidad, completamente el material. No se debe tener en
humectabilidad cuenta una película fina de partículas que pueden
Humectabilidad
y criterios de permanecer sobre la superficie. Un producto
aceptación se considera aceptable si el tiempo que tarda en
humedecerse es igual o inferior a 1 minuto.
Un peso conocido de un material se deja caer desde
una altura preestablecida, en la superficie del
Cipac, mt 53 agua que se encuentra en un vaso de precipitado y
se determina el tiempo que tarda en humedecerse
completamente.
Consiste en preparar una suspensión del producto
ntc 439. Plaguicidas,
y al cabo de cierto tiempo determinar la cantidad
coadyuvantes
del principio activo que queda en suspensión.
y reguladores
Tomar una cantidad suficiente de muestra
fisiológicos. Ensayos
para preparar 250 ml de suspensión en agua de
de suspendibilidad,
acuerdo con la concentración recomendada en las
humectabilidad
instrucciones del producto. La suspendibilidad
y criterios de
activa promedio no debe ser inferior al 60 % ni
aceptación
superior al 105 %.
Una suspensión de concentración conocida es
Cipac, mt 15 para
preparada en agua destilada, se adiciona a una
polvos mojables, mt
probeta o cilindro a temperatura constante y se
Suspendibilidad 168 para gránulos
deja en reposo durante un tiempo preestablecido.
dispersables y mt
Se toma de la parte inferior 1/10 de la suspensión.
177 para polvos
Se requiere que al menos el 60 % del ingrediente
dispersables
activo permanezca en suspensión.
Se reconstituye 1 g del producto en 1 l de agua
destilada y se distribuye en 4 probetas (250 ml en
cada una) que representan un tiempo de lectura
de 0, 1, 2 y 3 horas. En cada tiempo de evaluación
agrosavia (2019)
se toma una muestra de 1 ml de la superficie, el
medio y el fondo de la probeta y se determina la
concentración del ingrediente activo mediante
recuento en cámara de Neubauer.
(Continúa)

Lisansky et al.
(1993). Este método
Una muestra de 3 g se adiciona a 97 ml de agua
no evalúa solamente
destilada en una probeta de 100 ml, la cual se
el ingrediente
invierte 30 veces y se toma una muestra de 5 ml
activo sino la
a partir de la marca de graduación de 10 ml. Este
homogeneidad del
volumen se seca a 105 ºC hasta peso constante y
producto total.
se calcula el porcentaje al cual corresponde dicho
Es utilizado por
peso. Este tratamiento se toma como control
Suspendibilidad Aroonrat et al.
y corresponde al producto completamente
(2003), Xiangkun et
suspendido. Por otra parte, el tratamiento a
al. (2015) y Hong-
evaluar se suspende de la misma manera, pero se
Ku et al. (2018)
deja en reposo durante 1 hora, pasado este tiempo
para determinar
se toma la muestra y se seca. La suspensibilidad se
la suspensibilidad
informa como porcentaje del peso del tratamiento
de bioplaguicidas
con respecto al tratamiento control.
correspondientes a
polvos
Un vaso de precipitado de 250 ml con 100 ml de
agua destilada y una barra magnética de 3 cm
por 0,5 cm de diámetro se colocan en agitación a
agrosavia (2019) 500 rpm. Se adicionan 5 g del producto a evaluar
y se toma el tiempo que tarda en desintegrarse
completamente desde el momento en que se
humecta.
Mediante un equipo especial para la prueba de
desintegración usp, a una temperatura de 37 ºC y
Método descrito en
utilizando agua como medio de desintegración, se
Desintegración la Farmacopea usp.
determina el tiempo necesario para que todas las
Aplica para tabletas
partículas pasen a través de una malla (Takasaki
et al., 2019).
Una muestra de 0,5 g con un tamaño de partícula
en el rango de 250 µm a 1.414 µm, se adiciona a
un cilindro de medición de 100 ml con 90 ml de
Hong-Ku et al.
agua destilada a 25 ºC y se sella con un tapón. Se
(2018)
agita a 8 rpm hasta su completa desintegración.
Es considerado aceptable un tiempo inferior a 3
minutos.
(Continúa)

ntc 326. Abonos
Se elige una serie de tamices sobre los que se
o fertilizantes.
Tamaño de adicionan 200 g del producto a evaluar. Se deja en
Método de ensayo
partícula vibración durante 5 minutos, tiempo después del
de granulometría en
cual se pesa el material retenido en cada tamiz.
seco
Análisis por difracción láser. Una muestra
representativa del material a evaluar se dispersa
en un líquido o gas y se pasa a través de un haz
de luz emitido por una fuente monocromática
(láser). La luz dispersada por las partículas en
varios ángulos es medida por un detector. Los
Cipac mt 187
valores obtenidos son transformados usando
un modelo óptico y matemático apropiado que
permite obtener el volumen total para un discreto
número de rangos de tamaños de partícula, de
manera que se forma una distribución de tamaño
de partícula volumétrica.
Tamaño de Consiste en la separación cuantitativa de un
partícula polvo o granulado en fracciones con diferentes
rangos de tamaño de partícula mediante el uso de
Cipac mt 170
tamices. Quizás este es el método más conocido
y empleado gracias a su bajo costo y facilidad de
aplicación (Harris, 2018).
Se utiliza una columna de tamices cuya malla sea
de 1.000, 500, 200, 100 y 45 micras; los tamices se
organizan en orden descendente. Posteriormente,
se disponen 50 g de la muestra sobre el tamiz
agrosavia (2019)
superior y se inicia un proceso de vibración
con una amplitud de movimiento de 2 durante
10 minutos, tiempo después del cual se pesa el
material retenido en cada tamiz.
Para establecer el pH de una solución se utiliza un
Farmacopea
medidor o potenciómetro previamente calibrado.
El valor de pH de un líquido o dispersión es
pH determinado por medio de un potenciómetro y
Cipac mt 175 un electrodo que es introducido en el tratamiento
a valorar, generalmente a una concentración del
1 %.
(Continúa)

Se reconstituye 1 g de la muestra en 50 ml de
agua destilada y se determina el pH mediante un
pH agrosavia (2019)
potenciómetro calibrado. La muestra debe estar a
una temperatura de 20 ºC ± 2 ºC.
En un analizador de humedad se colocan
aproximadamente 5 g del producto a 105 ºC por
Takasaki et al. (2019)
10 minutos o hasta que no haya cambio en el peso
de la muestra durante 5 minutos.
La pérdida de peso de una muestra que es
calentada a una temperatura específica por un
Humedad
Cipac mt 17 tiempo preestablecido es determinada. Puede
ser realizada en una estufa o en un analizador de
humedad.
Se toman 0,2 g de muestra y se disponen en una
balanza halógena de humedad para su secado
agrosavia (2019)
hasta obtener un peso constante.
Bioplaguicidas microbianos líquidos

a b
Figura 2.2. Bioplaguicidas microbianos líquidos. a. Concentrado emulsio-

nable a base de Metarhizium rileyi; b. Emulsión de M. rileyi formada a partir
de la reconstitución del concentrado emulsionable en agua.
Los sistemas de entrega líquidos empleados comúnmente para la formulación de

microrganismos corresponden a suspensiones, concentrados emulsionables y, en
menor medida, emulsiones. En la tabla 2.4 se presentan sus características y lo que
se espera de acuerdo con el tipo de formulación en el momento su aplicación.
Tabla 2.4. Sistemas de entrega de bioplaguicidas microbianos líquidos

Bioplaguicidas Características en la
Descripción
líquidos aplicación
Partículas de pequeño tamaño que se Suspensión homogénea, fá-
Suspensiones
encuentran en un sistema líquido, ge- cilmente redispersable con
líquidas (sl)
neralmente de tipo acuoso. agitación manual.
Sistemas dispersos formados por dos Sistema homogéneo, no
Emulsiones
líquidos inmiscibles. hay formación de flóculos.
Suspensiones oleosas que al ser mez-
Suspensión homogénea o
Concentrado cladas con el agua producen emulsio-
que se redispersa fácilmen-
emulsionable (ce) nes de aceite en agua de forma espon-
te con agitación manual.
tánea o con agitación suave.
Sistema de tres fases: partículas sóli-
das dispersas, gotas de aceite y la fase En el momento de aplicar
Suspoemulsiones
continua, usualmente agua. Se consi- debe ser un sistema homo-
(se)
dera una mezcla de suspensión con- géneo.
centrada y emulsión aceite en agua.
Fuente: Gansic & Brankica (2013); Knowles (2008)
Teniendo en cuenta los principales sistemas de entrega líquidos, a continuación se

describen las pruebas fisicoquímicas más relevantes para cada tipo de formulación
(tabla 2.5) y algunas de las metodologías empleadas para su evaluación (tabla 2.6).
pH: esta variable fue mencionada anteriormente en la descripción de variables fisi-

coquímicas de los bioplaguicidas sólidos y lo descrito en esa sección aplica también
para los bioplaguicidas líquidos.
Viscosidad: se define como la resistencia a fluir que presenta un líquido y está rela-
cionada con la facilidad de moverse de las moléculas individuales con respecto a las
otras moléculas. Esto depende de la fuerza de atracción entre las mismas (Brown et
al., 1997). La viscosidad es un atributo de calidad crítico que influye en la estabilidad
física y la facilidad de aplicación y de liberación del ingrediente activo (Vo et al.,
2020). Su evaluación se puede hacer básicamente bajo tres principios: primero, el
tiempo que una cantidad de líquido tarda en fluir a través de un tubo delgado bajo
la fuerza gravitacional (a mayor viscosidad mayor tiempo). Segundo, determinando

la velocidad con la cual unas esferas caen a través del líquido, ya que estas caerán
más lentamente cuando se incrementa la viscosidad (Brown et al., 1997). Tercero,
midiendo la tracción viscosa ejercida sobre un disco que rota en el líquido conte-
nido en un vaso de precipitación. El disco es impulsado por un motor sincrónico
por medio de un resorte de torsión. El grado en el cual es enrollado el resorte a
una determinada velocidad (en rpm) es indicado por un señalador sobre un dial
calibrado en unidades de fuerza de rotación. Al multiplicar la lectura del dial por la
constante apropiada para el disco y la velocidad se obtiene la viscosidad aparente del
líquido en centipoises para esa velocidad (Brookfield Engineering Labs, 2000).
Tabla 2.5. Variables fisicoquímicas para evaluar en bioplaguicidas microbianos líquidos

Variable para evaluar
Tipo de Tamaño de
Formulación pH Viscosidad Densidad Sedimentación diámetro de
gota
Suspensión líquida X X X X
Emulsiones X X X
Concentrado
X X X
emulsionable
Suspoemulsión X X X
Densidad: es definida como la cantidad de masa contenida en una unidad de

volumen de una sustancia. Generalmente se expresa en unidades de g/cm3 (Brown
et al., 1997). Esta variable permite garantizar que la suspensión o emulsión posea las
mismas características en cada lote de producción.
Sedimentación: esta característica es importante en productos líquidos, tales como

suspensiones y concentrados, ya que garantiza que no se forme una torta en el fondo
del recipiente que contiene el producto. Si no se puede reconstituir con agitación
manual, esta torta o apelmazamiento de los sólidos que forman parte de la formula-
ción (excipientes o ingrediente activo), afecta completamente la calidad del producto
ya que indica que la concentración y las características fisicoquímicas no son las
mismas a las establecidas cuando se diseñó la formulación. La velocidad de sedimen-
tación de una partícula depende de la viscosidad del fluido, el radio de la partícula,
la velocidad de la caída y la fuerza de resistencia a esta, factores que se resumen en la
ley de Stokes (Salager, 1999).
Tamaño de diámetro de gota: esta característica es útil de evaluar en las emulsiones,

ya sea porque el bioplaguicida sea formulado de esta manera o porque se forme la
emulsión al reconstituir el bioplaguicida en agua, como es el caso de los concentrados
emulsionables. El tamaño promedio de gota puede calcularse de diferentes formas
dependiendo de que se quiera establecer la relación con la superficie o el volumen.
La distribución del diámetro de las gotas que forman la fase interna de la emulsión
se determina con el fin de caracterizar la emulsión como macro o microemulsión.
Además, es una variable importante para evaluar en las pruebas de estabilidad en
almacenamiento (Particle Sciences, 2011). Para determinar esta variable, la obser-
vación directa o la fotografía con microscopía óptica son los métodos más simples;
aunque son extremadamente tediosos y el límite inferior de la microscopía óptica es
de 1 µm (Salager, 1999), sin embargo otros autores reportan como ideal un mínimo
de 3 µm (Shekunov et al., 2007). Para partículas con un rango de tamaño entre 0,5 a
1000 µm la difracción láser es una buena opción que relaciona el diámetro promedio
con el volumen de la gota; su tiempo de análisis es corto, los resultados obtenidos son
robustos, precisos y reproducibles (Shekunov et al., 2007).
Tabla 2.6. Metodologías y descripción de las variables evaluadas en bioplaguicidas microbianos líquidos
Bali et al. (2010)
La viscosidad se determina utilizando un visco-
Viscosidad Shakeel et al.
símetro o reómetro u otro equipo.
(2014)
En una probeta graduada de 10 ml se coloca el
producto a evaluar durante un periodo de 30
Bostijn et al. días. El volumen de sedimentación se calcula
(2018) como el radio entre el volumen del sedimento y
el volumen total de la suspensión. Un valor de 1
indica que no hay formación de sedimento.
Sedimentación Se toman 10 ml de muestra y se colocan en un
recipiente cilíndrico, se mide la altura de los 10
ml del producto y la altura del sedimento for-
Deveswaran
mado después del tiempo de reposo. El índice
(2010)
de sedimentación es el radio entre la altura del
sedimento formado sobre la altura inicial del
producto total.
(Continúa)

Este método se utiliza para productos cuyo peso
es similar al volumen, o cuando se compara el
producto con el agua. Para esto, en un picnóme-
tro limpio y seco se coloca la muestra a evaluar
llenándolo completamente. El picnómetro se
tapa y se deja subir el líquido por el capilar y se
Cipac, mt 3.2 pesa. Previamente debe haberse pesado el picnó-
Método del metro vacío. Para calcular la densidad se utiliza
Densidad picnómetro la siguiente fórmula:
ρ = ( Pm − Ps ) ÷ V
Donde Pm es el peso del picnómetro con la

muestra, Ps es el peso del picnómetro vacío y V
es el volumen del picnómetro.
agrosavia Se determina la densidad mediante un picnóme-
(2019) tro y se toma como base la metodología Cipac.
Para determinar esta característica se sigue el
Macedo et al.
método de Ferret’s mediante un microscopio
(2006)
óptico equipado con un micrómetro calibrado.
Tamaño de
diámetro de gota Este método evalúa la distribución de tamaño
Zhang et al.
de partículas de una muestra, a partir de la dis-
(2019); Vo et al.
persión dinámica de la luz, mediante difracción
(2020)
láser
Fuente: Gansic & Brankica (2013); Knowles (2008)
La caracterización fisicoquímica que se presenta en los siguientes casos de estudio

corresponde a resultados de investigación propios del autor y fue tomada del informe
técnico final del proyecto “Prototipos de formulación optimizados para el control de
Cerotoma tingomariana” llevado a cabo por agrosavia. Para cada caso, la carac-
terización fisicoquímica se llevó a cabo con 3 lotes de producto y 3 réplicas por
tratamiento.
Caso de estudio I: granulado dispersable
Se tiene un granulado dispersable a base de los conidios del hongo Beauveria bassiana
(Ascomycota: Cordycipitaceae) aislamiento Bv060. Se analizarán diferentes varia-
bles fisicoquímicas (tabla 2.7).
Tabla 2.7. Caracterización fisicoquímica de un granulado a base de B. bassiana Bv060

Desviación
Variable Metodología Lote 1 Lote 2 Lote 3
estándar (sd)
pH Cipac mt 175 8,04 8,15 7,93 0,11
Humedad Cipac mt 17 3,37 2,80 3,06 0,28
Humectabilidad
Cipac mt 53 2,20 2,17 2,15 0,025
(minutos)
Desintegración agrosavia
1,42 1,38 1,35 0,035
(minutos) (2014)
A continuación, se describe el procedimiento mediante el cual se evaluó cada

variable:
1. Determinación del pH: se tomaron tres muestras de 1 g de cada lote y se colo-

caron en un vaso de precipitado de 250 ml con 99 ml de agua destilada. Cada
muestra se agitó vigorosamente hasta su completa desintegración y formación de
la suspensión. Con un potenciómetro Consort C931 (Consort bvba, Turnhout,
Bélgica) previamente calibrado se realizó la lectura de pH.
El pH es un parámetro importante porque puede afectar la permeabilidad de la

membrana celular o la actividad de las enzimas fúngicas (Moore, 1996). El valor
de pH obtenido debe ser comparado con el rango óptimo para el microorganismo
formulado. En este caso el rango óptimo para B. bassiana se había establecido entre
5 y 9 en estudios previos (agrosavia, 2014).
2. Determinación de la humedad: de cada lote se pesaron tres muestras de 0,5 g,

cada una se colocó en una balanza halógena de humedad Kern MLS 50-3 y se
dejó a una temperatura de 110 ºC hasta que no se presentó variación en el peso
de las muestras. Se registró el porcentaje de pérdida de agua de cada muestra, el
cual corresponde a su contenido de humedad.
La humedad establecida para los tres lotes estuvo por debajo del 5 %, lo que, posible-
mente, reducirá el metabolismo de Bv060 y permitirá obtener una mayor estabilidad
en el almacenamiento (Costa et al., 2002).
3. Determinación de la humectabilidad: en un vaso de precipitado de 250 ml con

100 ml de agua se pusieron 5 g del granulado a evaluar (tres muestras por lote)
sobre la superficie y con un cronómetro se registró el tiempo que este tardó en
humedecerse completamente.
a b
Figura 2.3. Evaluación del tiempo de humectabilidad; a. Granulado

antes de suspender en el agua; b. Granulado completamente humectado.
Esta variable se encuentra por encima de lo recomendado en la literatura, a saber,

1 minuto (Norma Técnica Colombiana [ntc 439], 2015). Con este resultado se
evidenció la necesidad de mejorar esta variable fisicoquímica. Aunque este resul-
tado no tiene un efecto directo sobre la eficacia del bioplaguicida, puede representar
un efecto desfavorable en la percepción del usuario del producto si se compara con
productos similares que se encuentran en el mercado y tienen un menor tiempo
de humectabilidad.
4. Determinación del tiempo de desintegración: a un vaso de precipitado de 250

ml con 100 ml de agua se adicionaron 5 g del granulado (tres muestras por lote)
y tan pronto este se humectó, la suspensión se puso en agitación constante a 500
rpm y se registró el tiempo en que se desintegró completamente.
a b
Figura 2.4. Tiempo de desintegración de un granulado; a. Tiempo inicial,

granulado en agua completamente humectado; b. Desintegración total del
granulado, formación de la suspensión.
La desintegración tuvo lugar en un tiempo inferior a 2 minutos, valor que está en

el límite de aceptación establecido por algunos autores (Hong-Ku et al., 2018). Sin
embargo, sería conveniente establecer si el valor obtenido es aceptable o se debe
intentar reducir (con respecto a productos similares en el mercado).
5. Tamaño de partícula: una batería de tamices fue armada en orden descendente

con los tamaños de malla de 2.000 micras, 1.000 micras, 850 micras, 500 micras,
150 micras y el colector; previamente se pesó cada tamiz.
Figura 2.5. Determinación del tamaño de partícula por gra-

nulometría. Batería de tamices ordenada de acuerdo con el ta-
maño de la abertura de malla en orden descendente.
Fuente: Elaboración p3ropia
En el tamiz de 2.000 micras se colocaron 100 g del granulado y se dejó vibrando

a una amplitud de 2 por 10 minutos, tiempo después del cual se pesó el material
retenido en cada tamiz y se calculó el porcentaje correspondiente. Los datos fueron
utilizados para hacer un histograma de distribución de frecuencias con 6 rangos de
clase (figura 2.6).
35
30
25
20
Frecuencia
15
10
0
≥ 2000 1000 - 1999 850 - 999 500 - 849 150 - 499 colector - 149
Clase
Lote 1 Lote 2 Lote 3
Figura 2.6. Distribución de tamaño de partícula de un granulado a base de B. bassiana

Bv060. 60
50
Caso de40 estudio II: concentrado emulsionable

Frecuencia
30
Esta formulación fue elaborada con los conidios del hongo B. Bassiana. Este tipo
20
de formulación corresponde a una suspensión oleosa. En la tabla 2.8 se presentan
10
los promedios correspondientes a las variables fisicoquímicas evaluadas. Además, se
determinó0el tamaño de diámetro medio de gota, como se mencionará posteriormente.
7,5-19,5 19,6 - 31,5 31,6 - 43,5 43,5-55,5 55,6 -67,5
Tabla 2.8. Caracterización fisicoquímica

Clase de un concentrado
(Tamaño de partículaemulsionable
µm) a base de B. bassiana Bv060
Lote 1 Lote 2 Lote 3 Desviación estándar
Variable Lote 1 Lote 2 Lote 3
(sd)
pH 7,89 7,79 7,84 0,05
Sedimentación 0,72 0,67 0,70 0,02
Viscosidad 1,21 1,34 1,21 0,12
A continuación, se menciona el procedimiento mediante el cual se analizó cada

variable:
1. Determinación del pH: se tomaron tres muestras de cada lote, cada una de 1 ml
y se reconstituyeron en 99 ml de agua destilada para formar la emulsión. Este
volumen se colocó en un vaso de precipitado de 250 ml y con un potenciómetro
previamente calibrado se tomó la lectura de pH.
Como se mencionó anteriormente, en el caso de estudio I, esta es una variable fisicoquí-

mica importante ya que puede afectar la permeabilidad de la membrana del microor-
ganismo y su actividad enzimática (Moore, 1996). Por este motivo debe ser considerada
para todos los tipos de formulaciones. En este caso el valor obtenido se encuentra dentro
del rango óptimo establecido en estudios anteriores (agrosavia, 2014).
2. Evaluación del índice de sedimentación: un volumen de 10 ml del concentrado

emulsionable se colocó en una probeta graduada y se dejó en reposo a 25 ºC ±
2 ºC por 7 días. El primer día se tomó la altura del volumen del concentrado
emulsionable y después del tiempo de almacenamiento se determinó el volumen
del sedimento formado. El cociente entre el volumen inicial y final correspondió
al índice de sedimentación.
a b
Figura 2.7. Determinación del índice de sedimentación a partir de la

altura del sedimento formado; a. Suspensión inicial; b. Sedimento for-
mado después de un tiempo de almacenamiento en reposo.
Los valores obtenidos en el índice de sedimentación indican que se formó sedi-

mento en el concentrado emulsionable durante el tiempo de almacenamiento, por el
contrario, valores cercanos a 1 indican que hay una menor formación de sedimento
(Bostijn et al., 2018). Sin embargo, en este tipo de productos biológicos, además del
cálculo del índice de sedimentación, es importante establecer la facilidad de redis-
persión del producto mediante agitación manual. Esto indica que en el momento de
su aplicación el sedimento formado en el producto se va a homogenizar completa-
mente, lo cual garantiza la aplicación de la dosis con la que fue diseñado.
3. Determinación de la viscosidad: la viscosidad se determinó mediante un visco-

símetro de bola utilizando una bola de acero inoxidable (SS 316) y determinando
el tiempo en que esta tardó en caer. La viscosidad se calculó mediante la ecua-
ción 2.1 (Gilmont, 1961):
k = µ ÷ ( pt − p ) ×t
Donde µ = k ( pt − p )
µ = viscosidad en centipoises (cps)
pt = densidad de la bola (g/ml); 2,53 para el vidrio; 8,03 para el acero inoxidable y
16,6 para el tantalum
p = densidad del líquido (g/ml)
t = tiempo de descenso (minutos)
k = constante del viscosímetro, la cual es obtenida por la medida de la viscosidad de

un líquido estándar
4. Tamaño de diámetro interno de gota: un volumen de 20 µl se depositó sobre

una lámina portaobjetos y se cubrió con una laminilla. Mediante un micró-
metro colocado en el objetivo de un microscopio óptico con el objetivo 40×, se
realizó la lectura del diámetro de 100 gotas por réplica. Se utilizó un total de tres
réplicas por lote (figura 2.4).
Mediante la observación a través del microscopio óptico se evidenció la formación

de gotas esféricas correspondientes a la fase interna (oleosa). Estas se encontraron
dispersas en la fase externa (agua). Para los tres lotes se observó una tendencia
similar, de acuerdo con la cual el mayor número de gotas se encontraron en el rango
de tamaño de 7,5 a 19,5 micras y de 19,6 a 31,5 micras. Una menor proporción de
gotas se encontró en el rango de 55,6 a 67,5 micras. El tamaño del diámetro de
las gotas de la fase interna de la emulsión evidenció que al reconstituir en agua el
concentrado emulsionable se formó una macroemulsión en el que las gotas tuvieron
un tamaño mayor a 0,1 micras (Salager et al., 2001). Además, la amplia variación en
el diámetro de las gotas sugiere que con el tiempo la emulsión puede mostrar signos
de inestabilidad (Salager, 1999), tales como cremado o formación de coágulos.
Perspectivas
El incremento en la demanda de productos para el control de plagas agrícolas que

tengan un menor impacto sobre la salud y el medio ambiente es un reto para los
productores de plaguicidas biológicos. Así pues, el objetivo es ofrecer productos que
mantengan la estabilidad y la eficacia con la cual fueron diseñados en cada lote de
producción y que sean competitivos por presentar características que los diferen-
cien. Estas características solo pueden lograrse si se les asigna la importancia reque-
rida a las variables fisicoquímicas de acuerdo con el tipo de formulación durante la
etapa de desarrollo y de producto terminado.
Por lo tanto, constituye un desafío para los fabricantes y los laboratorios de plagui-
cidas biológicos incluir como parte fundamental del control de calidad las variables
fisicoquímicas mas allá del pH y la humedad, que son las que generalmente se tienen
en cuenta pero no son suficientes para valorar el comportamiento del producto en
las diferentes etapas de elaboración, distribución y aplicación.
35
30
25
20
Frecuencia
15
10

5
0
≥ 2000 1000 - 1999 850 - 999 500 - 849 150 - 499 colector - 149
Figura 2.8. Vista al microscopio óptico de una emulsión aceite agua
Clase
con un objetivo de 40×; a. Gota de aceite fase interna; b. Fase externa,
Lote 1
agua; c. Escala del micrómetro. Lote 2 Lote 3
60
50
40
Frecuencia
30
20
10
0
7,5-19,5 19,6 - 31,5 31,6 - 43,5 43,5-55,5 55,6 -67,5
Clase (Tamaño de partícula µm)

Lote 1 Lote 2 Lote 3
Figura 2.9. Distribución de tamaño de partícula de una emulsión formada a partir de la

reconstitución de un concentrado emulsionable a base de B. bassiana Bv060.
Referencias
Aroonrat, T. A., Suphantharika, M., & Ketunuti, U. (2003). Preparation of spray-

dried wettable powder formulations of Bacillus thuringiensis based-biopesti-
cides. Journal of economic entomology, 96(2), 292-299. https://doi.org/10.1093/
jee/96.2.292
Bali, V., Ali, M., & Ali, J. (2010). Novel nanoemulsions for minimizing variations in
bioavailability of ezetimibe. Journal of Drug Targeting, 18(7), 506-519. ht-
tps://doi.org/ 0.3109/1061186090354836
Bostijn, N., Renterghem, J. V., Dhondt, W., Vervaet, C., & De Beer, T. (2018). A con-
tinuous manufacturing concept for a pharmaceutical oral suspension. Eu-
ropean Journal of pharmaceutical sciences; 123(1), 576-583. https://doi.or-
g/10.1016/j.ejps.2018.08.015
Brookfield Engineering Labs. (2000). More solutions to sticky problems. Brookfield
Engineering Labs.
Brown, T. L., Lemay, H. E., Bursten, B. E., Murphy, C. J., Woodward, P. M., & Stoltz-
fus, M. W. (1997). Chemistry: The central science. Pearson.
Carstensen, J. T. (1998). Pharmaceutical preformulation. crc Press.
Chan, E. S., Wong, S. L., Leen, P. P., Lee, J. S., Ti, T. B., Zhang, Z. B., Poncelet, D.,
Ravindra, P., Phan, S. H., & Yim, Z. H. (2011). Effects of starch filler of the
physical properties of lyophilized calcium-alginate beads and the viability
of encapsulated cells. Carbohydrate polymers, 83(1), 225-232. https://doi.or-
g/10.1016/j.carbpol.2010.07.044
Collaborative International Pesticides Analytical Council [Cipac]. (1995). Handbook
volumen F: Physico chemical methods for technical and formulated pesticides.
Editores Dobrat & Martijn.
Corporación Colombiana de Investigación Agropeuaria [agrosavia]. (2014). Un
bioplaguicida para el control de crisomélidos en soya [Informe técnico final].
agrosavia.
Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria [agrosavia]. (2019). Aná-
lisis fisicoquímico de bioplaguicidas sólidos. agrosavia.
Costa, E., Usall, J., Teixidó, N., Torres, R., & Viñas, I. (2002). Effect of package and
storage conditions on viability and efficacy of the freeze-dried biocontrol
agent Pantoea agglomerans strain CPA-2. Journal of Applied Microbiology,

92(5), 873-878. https://doi.org/10.1046/j.1365-2672.2002.01596.x
Crowder, T. M., Rosati, J. A., Schroeter, J. D., Hichey, A. J., & Martonen, T. B. (2002).
Fundamental effects of particle morphology on lung delivery: prediction of
Stokes´ law and the particular revelance to dry powder inhaler formulation
and development. Pharmaceutical Research, 19(3), 239-245. https://doi.or-
g/10.1023/a:1014426530935
Cueva, R. (2018). Evaluación de dos atributos de calidad críticos en la producción de
formas farmacéuticas sólidas utilizando la espectroscopía de infrarojo cer-
cano. Revista de la Sociedad Química del Perú, 84(4), 465-476
Deveswaran, R., Bharath, S., Furtado, S., Abraaham, S., Basavaraj, B. V., & Madha-
van, V. (2010). Isolation and evaluation of tamarind seed polissacharide as a
natural suspending agent. International Journal of Pharmaceutical & Biolo-
gical Archives, 1(4), 360-363.
Faria, M., & Wraight, S. (2007). Mycoinsecticides and mycoacaricides: A compre-
hensive list with worldwide coverage and international classification of for-
mulation types. Biological Control. 43(3), 237-256. https://doi.org/10.1016/j.
biocontrol.2007.08.001
Freudig, B., Hogekamp, S., & Schubert, H. (1999). Dispersion of powders in liquids in
a stirred vessel. Chemical engineering and processing, 38(1), 525-532. https://
doi.org/10.1016/S0255-2701(99)00049-5
Gansic, S., & Brankica, T. (2013). Biopesticide formulations, possibility of applica-
tions and future trends. Pesticidi i Fitomedicina, 28(2), 97-102. https://doi.
org/10.2298/pif1302097g
Gil, J., Vargas, L., Flórez, O., & Tobón, G. (2008). Efecto del solvente de recristali-
zación y del tamaño de partícula sobre la humectabilidad del ibuprofeno.
Vitae, 16(1), 49-54.
Gilmont, R., & Maurer, P. W. (1961). A generalized equation for rotameters with
spherical floats. Instruments and control systems, 34(11), 2071.
Gray, A., Egan, S., Bakalis, S., & Zhang, Z. (2016). Determination of microcapsule
physicochemical structural, and mechanical properties. Particuology, 24(1),
32-43. https://doi.org/10.1016/j.partic.2015.06.002Get
Harris, D. (2018). Particulates in semi-solid pharmaceutical products. En Merkus,
H., Meesters, G., Oostra, W. (Eds), Particles and nanoparticles in pharmaceu-
tical products. aaps advances in the pharmaceutical sciences (pp. 399-428).

Springer, Cham. https://doi.org/10.1007/978-3-319-94174-5_1
Hong-Ku, W., Li-Li, S., Fang, L., Zhi-Ying, W., & Chuan-Wang, C. (2018). Prepara-
tion of dry flowable formulations of Clonostachys rosea by spray drying and
application for Sclerotinia sclerotiorum control. Journal of integrative agricul-
ture, 17(3), 613-620. https://doi.org/10.1016/S2095-3119(17)61811-2
Kim, E. H. J., Chen, X. D., & Pearce, D. (2000). Surface characterization of four
industrial spray-dried dairy powders in relation to chemical composition,
structure and wetting property. Colloids and surfaces B: Biointerfaces, 26(3),
197-212. https://doi.org/10.1016/S0927-7765(01)00334-4
Knowles, A. (2008). Recent developments of safer formulations of agrochemicals.
Envirommentalis, 28(1), 35-44. https://doi.org/10.1007/s10669-007-9045-4
Kudo, Y., Yasuda, M., & Matsusaka, M. (2020). Effect of particle size distribution on
flowability of granulated lactose. Advanced Powder Technology, 31(1), 121-
127. https://doi.org/10.1016/j.apt.2019.10.004
Lisansky, S. G., Quinlan, R. J., & Tassoni, G. (1993). The Bacillus thuringiensis pro-
duction handbook. cpl Press.
List, P. H., & Muazzam, U. A. (1979). Quellung-die treibende Kraft beim tabletten-
zerfall. 1 Mitteilung. Pharmazeutische industrie, 41(5), 459-464.
Macedo, J., Fernandes, L., Formiga, F., Reis, M., Nagashima, T., Soares, L., Socrates,
E., & Egito, T. (2006). Micro-emultocrit technique: A valuable tool for deter-
mination of critical hlb value of emulsions. aaps PharmSciTech, 7(1), E1-E7
https://doi.org/10.1208/pt070121
Markl, D., & Zeitler, J. A. (2017). A review of disintegration mechanisms and me-
asurement techniques. Pharmaceutical Research, 34(5), 890-917. https://doi.
org/10.1007/s11095-017-2129-z
Nogami, H., Hasegawa, J., Miyamoto, M. (1967). Studies of powdered Preperations
XX disintegration of the aspirin tablets containing starches as disintegrating
agent. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 15(3), 179-89.
Norma Técnica Colombiana [ntc 439]. (2015). Plaguicidas, coadyuvantes y regula-
dores fisiológicos. Ensayos de suspensibilidad, humectabilidad y criterios de
aceptación.
Particle Sciences. (2011). Drug development services. Technical brief. Volume 2. Par-
ticle Sciences.
Peppas, N. A., & Colombo, P. (1989). Development of disintegration forces during

water penetration in porous pharmaceutical systems. Journal of Controlled
Release, 10(3), 245-250. https://doi.org/10.1016/0168-3659(89)90074-6
Rosen, M. J. & Kunjappu, J. T. (2012). Surfactants and interfacial phenomena. Wiley
Online Library.
Salager, J. L. (1999). Formulación, composición y fabricación de emulsiones para ob-
tener las propiedades deseadas. Estado del Arte. Parte B. Cuaderno firp 747-
B. Propiedades de las emulsiones y su medición. Laboratorio de formulación,
interfases, reología y procesos. Universidad de los Andes, Mérida, Venezuela.
Salager, J. L., Antón, R., Anderez, J., & Aubry, J. M. (2001). Formulación de microe-
mulsiones por el método del hld. Techniques de l’Ingénieur, Vol. Génie des
Procédés, artículo J2: 157, 1-20.
Schubert, H. (1978). Optimierung der Gro¨ße und Porosita¨t von Instantagglome-
raten in bezug auf eine schnelle Durchfeuchtung. Verfahrenstechnik, 12(1),
296-301.
Shakeel, F., Haq, N., Alanazi, F. K., & Alsarra, I. A. (2014). Effects of oils and surfac-
tants on physicochemicals characterization and in vitro dissolution of gliben-
clamide from self-emulsifying formulations. Journal of Drug Delivery Science
and Technology. 24(1), 78-85. https://doi.org/10.1016/S1773-2247(14)50011-1
Shekunov, B., Chatopadhyay, P, Tong, H., & Chow, A. (2007). Particle size analysys
in pharmaceutics: Priciples, methods and applications. Pharmaceutical re-
search, 24(2), 203-227. https://doi.org/10.1007/s11095-006-9146-7
Skoog, D. A., West, D. M., & Holler, F. J. (1997). Métodos potenciométricos. En Fun-
damentos de química analítica. Reverte.
Sunk-II, A., Yung-Kyung, L., & Hae-Soo, K. (2019). Physicochemical and sensory
properties of milk supplemented with lactase microcapsules coated with en-
teric coating materials. Journal of Dairy Science, 102(8), 6959-6970. https://
doi.org/10.3168/jds.2018-15865
Takasaki, H., Sakurai, A., Katayama, T., Matsuura, Y., Ohyagi, N., Mizoguchi, M.,
Takano, J., Wada, K., Matsui, K., Nagato, T., Ishikawa, A., & Yonemochi, E.
(2019). Importance of free water in controlling granule and tablet properties
in a novel granulation method, green fluidized bed granulation (gfbg). In-
ternational Journal of pharmaceutics, 570(1), 118647. https://doi.org/10.1016/j.
ijpharm.2019.118647
Vemmer, M., & Patel, A. (2013). Review of encapsulation methods for microbial
biological control agents. Biological control, 67(3), 380-389. https://doi.or-
g/10.1016/j.biocontrol.2013.09.003
Vo, A., Feng, X., Patel, D., Mohammad, A., Kozak, D., Choi, S., Ashraf, M., & Xu. X.
(2020). Factors affecting the particle size distribution and rheology of brin-
zolamide ophtalmic suspensions. International Journal of Pharmaceutics,
586(1), 119495. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2020.119495
Xiangkun, M., Junjie, Y., Mina, Y., Xiaole, Y., Yongfeng, L. (2015). Dry flowable for-
mulations of antagonic Bacillus subtilis strain 29 by spray drying to control
rice blast disease. Biological control, 85(1), 46-51. https://doi.org/10.1016/j.
biocontrol.2015.03.004
Yang, M. W., & Lin, S. Y. (2003). A method for correcting the contact angle from the
θ/2 method. Colloids Surfaces A, 222(1-3), 199-210. https://doi.org/10.1016/
S0927-7757(03)00064-5
Zárate, C. A., Cotes, A. M., Villamizar, L. (2010). Estudio de la estabilidad en alma-
cenamiento de tres formulaciones oleosas a base de Nomuraea rileyi. En V.
Coria, B. Lara, G. Orozco, J. Muñoz, R. Sánchez (Eds.), XXXIII Congreso
Nacional de Control Biológico. Inifap, Cirpac, Uruapan (pp. 399e403). Mi-
choacán, México.
Zhang, S., Wan, Q., Xu, X., Xing, Y., Ding, J., Yang, S, Sun, W., Lu, M., Pan, B. (2019).
A novel oil-based suspension of a micro-environmental, pH-modifying solid
dispersion for parenteral delivery: Formulation and stability evaluation. Co-
lloids and surfaces B: Biointerfaces. 179(1), 382-392. https://doi.org/10.1016/j.
colsurfb.2019.04.001
Zhang, Z. H., Peng, H., P., Woo, M., Zeng, Z., Brennan, M., Brenan, C. (2020). Pre-
paration and characterization of whey protein isolate-chlorophyll micro-
capsules by spray drying: Effect of WPI ratios on the physicochemicals and
antioxidant properties. Journal of Food Engineering, 267(1), 109729. https://
doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2019.109729
95
Capítulo III
Control de calidad de
bioinsumos recomendados para
el manejo de fitopatógenos
(bacterias y hongos)
Los bioinsumos agrícolas son productos biológicos

elaborados a partir de organismos o sus derivados,
desarrollados para la protección de los cultivos y el
medio ambiente (Parada & Muñoz, 2015). Garantizar
la eficacia de los bioinsumos que se comercializan es
un parámetro crucial para que los productores los
adopten y para el control de enfermedades tanto en
campo como duarnte la postcosecha. En ese sentido,
el control de calidad hace referencia al conjunto
de acciones destinadas a garantizar la producción
uniforme de lotes de productos terminados que
satisfagan los parámetros de identidad, pureza y
actividad biológica (eficacia) establecidos por cada
casa comercial. La evaluación de la actividad bioló-
gica se logra mediante la elaboración de pruebas
experimentales en laboratorio o invernadero, donde
el diseño, la selección y la estandarización de proto-
colos son pasos esenciales para asegurar la calidad de
los resultados. A continuación, se proponen una serie
de metodologías in vitro que pueden ser empleadas
para la evaluación de la actividad biológica de dife-
rentes agentes de control seleccionados como princi-
pios activos de bioinsumos y recomendados para el
manejo de hongos o bacterias fitopatógenas.
Criterios biológicos
Con el fin de lograr una evaluación acertada y evitar falsos positivos o falsos nega-
tivos, los aspectos relacionados con el microorganismo patógeno, el agente de control
biológico y el tipo de formulación son criterios biológicos que se deben tener en
cuenta al evaluar la efectividad de un bioplaguicida.
Microorganismos patógenos
El planeta tierra abarca alrededor de 1012 de especies de microorganismos perte-

necientes a diferentes órdenes y con capacidad de vivir en una amplia diversidad
de hábitats, incluidos ambientes extremos (Locey & Lennon, 2016). Varios de ellos
están involucrados en procesos importantes como, por ejemplo, los ciclos biogeoquí-
micos, los procesos de biorremediación, la producción de antibióticos y la produc-
ción de alimentos, entre otros (Caplice & Fitzgerald, 1999; Falkowski et al., 2008;
Harekrushna & Kumar, 2012; Rokem et al., 2007). Sin embargo, varios de ellos son
clasificados como patógenos dado que, para sobrevivir, parasitan o consumen tejidos
vegetales, asunto que constituye uno de los principales problemas para la producción
agrícola (Cotes, 2018).
Dentro de los diferentes grupos de microorganismos patógenos, los hongos son

los que causan el mayor número de enfermedades, con alrededor de 8.000 espe-
cies reportadas dentro de las que se incluyen: Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea,
varias especies de Puccinia spp., Fusarium spp., Colletotrichum spp. y Rhizoctonia
solani, entre otras (Dean et al., 2012; Ellis et al., 2008). También se reportan microor-
ganismos fitopatógenos del grupo de los Oomycetes, principalmente varias espe-
cies del género Phytophthora spp. Finalmente, también se reportan bacterias como
Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Agrobacterium tumefaciens y varias
especies del género Xanthomonas spp., entre otras (Dean et al., 2012; Kamoun et al.,
2015; Mansfield et al., 2012).
En la tabla 3.1 se relacionan los principales patógenos reportados con mayor preva-
lencia en algunos de los cultivos más importantes de Colombia durante el año 2019
(Montes, 2019). En primera instancia, Colletotrichum spp., Phytophthora spp. y
Fusarium sp. son los de mayor incidencia, seguidos de Botrytis sp., Sclerotinia spp.
y, finalmente, Erwinia sp., Oidium sp., Alternaria sp. y Cercospora sp., entre otros.
Capítulo III Control de calidad de bioinsumos recomendados para el manejo de fitopatógenos (bacterias y hongos) 97
Tabla 3.1. Principales patógenos que afectan algunos de los cultivos más importantes en Colombia en 2019
Patógeno Enfermedad Cultivo Referencia
Ralstonia
Moko o
solanacearum Banano Alarcón & Jiménez (2012)
madurabiche
Raza 2
Pudrición acuosa
Dickeya chrysanthemi del pseudotallo o Banano Alarcón & Jiménez (2012)
bacteriosis
Fusarium oxysporum f.
Mal de Panamá Banano Alarcón & Jiménez (2012)
sp. Cubense
Mycosphaerella fijiensis
Sigatoka negra Banano Alarcón & Jiménez (2012)
Morelet var. Difformis
Phytophthora
Castaño & Leal (2018); Gil et
cinnamomi Pudrición radical Aguacate
al., (2015)
var cinnamomi Rands
Colletotrichum
Antracnosis Aguacate Granada et al. (2018)
gloeosporioides
Cítricos:
Phytophthora spp. Gomosis lima y Alarcón & Jiménez 2012
naranja
C. gloeosporioides y Cítricos:
Colletotrichum. Antracnosis lima y Alarcón & Jiménez (2012)
Acutatum naranja
Agencia Española de
Cooperación Internacional
para el Desarrollo [Aecid]
Erwinia chrysanthemi Pudrición acuosa Piña
& Escuela de Agricultura de
la Región Tropical Húmeda
[Earth] (s. f.)
Phytophthora Pudrición del
Piña Aecid & Earth (s. f.)
parasitica corazón
Phytophthora Pudrición de la
Piña Aecid & Earth (s. f.)
cinnamomi raíz
Fusariosis –
Fusarium sp. Piña Ríos et al. (2019)
Pudrición
Pudrición
Dyckeya sp. Piña Ríos et al. (2019)
bacterial
Thielaviopsis sp. Pudrición negra Piña Ríos et al. (2019)
(Continúa)
Asociación Hortifruticola de
Colombia [Asohofrucol] &
C. gloeosporioides Antracnosis Mango Corporación Colombiana de
Investigación Agropecuaria
[Corpoica] (2013)
Asohofrucol & Corpoica
Fusarium subglutinans Malformación Mango
(2013)
Secamiento o Asohofrucol & Corpoica
Lasiodiplodia sp. Mango
muerte (2013)
Tomate de Cámara de Comercio de
C. gloeosporioides Antracnosis
árbol Bogotá [ccb] (2015a)
Tomate de
Sclerotinia sclerotiorum Moho blanco ccb (2015a)
árbol
Tomate de
Botrytis cinerea Moho gris ccb (2015a)
árbol
Tomate de
Oidium sp. Mildeo polvos ccb (2015a)
árbol
Tomate de
Alternaria sp. Tizón foliar ccb (2015a)
árbol
Marchitamiento y
Erwinia sp. Papaya EncuRed (s. f.)
la necrosis
Phytophthora
Damping off Papaya EncuRed (s. f.)
palmivora
Cercospora papayae
Mancha negra Papaya EncuRed (s. f.)
Hansford
C. gloeosporioides Antracosis Papaya EncuRed (s. f.)
Colletotrichum
Antracnosis Fresa Ventura et al. (2018)
fragariae
Pudrición de la
Phytophthora cactorum Fresa Cano (2013)
corona
B. cinerea Moho gris Fresa Cano (2013)
Pudrición apical
Dothiorella sp. Guayaba Castellano et al. (2003)
del fruto
Pestalotia versicolor Roña o clavo Guayaba Leiva et al. (2018)
Colletotrichum sp. Antracnosis Guayaba Leiva et al. (2018)
Pudriciones
Phytophthora sp. Guayaba Leiva et al. (2018)
radicales
(Continúa)
Tizón del lulo o

Phytophthora infestans Lulo ccb (2015b); Tamayo (2001)
gota
Moho blanco,
lama blanca,
Sclerotinia sclerotiorum Lulo ccb (2015b); Tamayo (2001)
pudrición
algodonosa
C. gloeosporioides Antracnosis Lulo ccb (2015b); Tamayo (2001)
Pudrición del
Sclerotium rolfsii Lulo ccb (2015b); Tamayo (2001)
tallo
Marchitez
F. oxysporum Lulo ccb (2015b); Tamayo (2001)
vascular
B. cinerea Moho gris Mora Arévalo et al. (2011)
C. gloeosporioides Antracnosis Mora Arévalo et al. (2011)
Oidium sp. Mildeo polvoso Mora Arévalo et al. (2011)
Peronospora sparsa
Mildeo velloso Mora Arévalo et al. (2011)
Berk.
Los microorganismos patógenos se pueden clasificar en cuatro categorías: la primera,

saprófitos obligados, correspondientes a aquellos organismos que solo pueden colo-
nizar y sobrevivir en materia orgánica muerta o en descomposición; la segunda,
parásitos obligados, que incluye a todos los microorganismos que solo pueden vivir
en un huésped vivo como, por ejemplo, mildeo polvoso, mildeo velloso, royas, entre
otros; la tercera, parásitos facultativos, los cuales generalmente viven como sapró-
fitos, pero tienen la habilidad de parasitar y causar enfermedad bajo condiciones
favorables como, por ejemplo, Pythium spp. y varias especies de bacterias fitopató-
genas y, por último, la cuarta, los saprófitos facultativos, que corresponden a aquellos
microorganismos que generalmente viven como parásitos pero tienen la capacidad
de utilizar la materia orgánica muerta o en descomposición bajo ciertas condiciones
como, por ejemplo, microorganismos del género Phytophthora spp. y Botrytis spp.
(Ellis et al., 2008).
Los microorganismos patógenos pueden infectar diversos tipos de plantas en dife-

rentes estados de desarrollo. Se pueden clasificar en patógenos foliares, patógenos
del suelo o endófitos según el tejido que infectan como, por ejemplo, los que afectan
la filósfera, la rizosfera, tejidos vasculares, semillas, etc. Pueden causar afectaciones
tanto en campo como durante la postcosecha y causar pérdidas económicas consi-
derables además de la pérdida del alimento en sí. Se estima que más de la mitad de
los alimentos producidos en el mundo se pierden a causa de la dispersión de dichos
patógenos (Ellis & Boehm, 2008; Cotes, 2018).
Agentes de control biológico
Como se mencionó anteriormente, también existen microorganismos que están invo-

lucrados en un número considerable de procesos benéficos para las plantas hospe-
deras. Gracias a su participación aumenta la disponibilidad de nutrientes esenciales
para su crecimiento, la producción de fitohormonas se ve favorecida y la resistencia a
enfermedades también incrementa (Qu et al., 2020). Varios microorganismos bené-
ficos han sido reportados por su capacidad para producir compuestos volátiles y no
volátiles o de desarrollar mecanismos de acción que contrarrestan el aumento de
otros microorganismos clasificados como patógenos (Abd-Elgawad, 2020; Fira et al.,
2018; Junior et al., 2020; Liu et al., 2013). Los microorganismos empleados para tal fin
son denominados agentes de control biológico y han sido identificados y empleados
para el desarrollo de bioproductos (bioinsumos) que puedan ser integrados dentro
de estrategias de manejo más amigables con el medio ambiente para disminuir el uso
de productos de síntesis química.
En Colombia, hasta diciembre de 2019, se encontraban registrados ante el Instituto

Colombiano Agropecuario (ica) 326 bioinsumos clasificados en: inoculantes de uso
agrícola (96), agentes de control biológico de plagas y enfermedades (226) y un bioin-
sumo registrado con los dos modos de acción. Dentro de los principales agentes de
control biológico empleados se registran varias especies de Bacillus spp., Pseudomona
aureofaciens, Streptomyces racemochromogenes, Burkholderia cepacia y diversas
especies de Trichoderma spp. Los agentes de control biológico mencionados están
recomendados para el control de Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Alternaria
solani, Mycosphaerella fijiensis, Fusarium oxysporum, Phytophthora cinnamomi,
Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum acutatum y Pseudomonas syringae,
entre otros (tabla 3.2) (ica, 2019).
Tabla 3.2. Principales agentes de control biológico de bioinsumos registrados ante el ica hasta di-
ciembre de 2019 para el control de fitopatógenos
Agente de control biológico Patógeno / Cultivo

Bacillus subtilis B. cinerea / Rosa
R. solani / Arroz
Reino: Bacteria solani / Tomate
Filum: Firmicutes P. syringae / Tomate
Clase: Bacilli Ramularia areola / Algodón
Orden: Bacillales M. fijiensis / Banano
Familia: Bacillaceae F. oxysporum / Piña
Género: Bacillus P. cinnamomi / Piña
Especie: B. subtilis (Ehrenberg 1835) P. cinnamomi / Piña
Cohn (1872) C. gloeosporioides / Aguacate
C. acutatum / Aguacate
Burkholderia cepacia B. cinerea / Pompón
Reino: Bacteria
Filum: Proteobacteria
Clase: Betaproteobacteria
Orden: Burkholderiales
Familia: Burkholderiaceae
Género: Burkholderia
Especie: B. cepacia complex
(Palleroni & Holmes 1981)
Yabuuchi et al. (1993)
Fusarium sp. / Clavel, tomate

Trichoderma harzianum
Fusarium roseum / Clavel
F. oxysporum / Clavel, hortalizas y aromáticas
Reino: Hongo
R. solani / Arroz, Pompom, soya, tomate,
División: Ascomycota
crisantemo, café
Subdivisión: Pezizomycotina
R. areola / Algodón
Clase: Sordariomycetes
B. cinerea / Tomate, pepino, uva, cítricos, haba,
Orden: Hypocreales
rosa, fresa, tomillo
Familia: Hypocreaceae
Sclerotinia sclerotiorum / Pompón, clavel
Género: Trichoderma
Phytophthora spp. / Aguacate, tomillo, romero,
Especie: T. harzianum
vainilla, estragón, oregano, café, gulupa,
Rifai (1969)
tomate, uchuva, lulo, tomate de árbol, ají,
pimentón, berenjena
A. solani / Tomate
(Continúa)
(Continuación tabla3.2)

Trichoderma lignorum F. oxysporum / Clavel
Fusarium oxysporum sp. Lycopersici / Tomate
Reino: Hongo R. solani / Arroz
Orden: Hypocreales
Especie: T. lignorum (Tode) Harz
(1871)
Trichoderma koningii R. solani / Pompon, arroz, café
Phytophtora spp. / Aguacate, tomillo, romero,
Reino: Hongo vainilla, estragon, oregano, café, gulupa,
División: Ascomycota tomate, uchuva, lulo, tomate de árbol, ají,
Subdivisión: Pezizomycotina pimentón, berenjena
Orden: Hypocreales
Especie: T. koningi Oudem (1902)
Trichoderma koningiopsis F. oxysporum / Tomate
Reino: Hongo
Orden: Hypocreales
Especie: T. koningiopsis
Samuels, Suárez & Evans (2006)
(Continúa)

Trichoderma atroviride Fitopatógenos sin especificar
R. solani / Crisantemo
Reino: Hongo
Orden: Hypocreales
Especie: T. atroviride P. Karst. (1892)
Trichoderma viride R. solani / Pompón, arroz

Phytophthora spp. / Aguacate, tomillo, romero,
Reino: Hongo vainilla, estragon, oregano, café, gulupa,
División: Ascomycota tomate, uchuva, lulo, tomate de árbol, ají,
Subdivisión: Pezizomycotina pimentón, berenjena
Clase: Sordariomycetes Scleratinia sclerotium / Lechuga
Orden: Hypocreales B. cinerea / Lechuga
Familia: Hypocreaceae Bipolaris oryzae / Arroz
Género: Trichoderma Sarocladium oryzae / Arroz
Especie: T. viride Pers. (1794) Gaeumannomyces graminis / Arroz
Helminthosporium oryzae / Arroz
Trichoderma asperellum R. solani / Crisantemo
Reino: Hongo
Orden: Hypocreales
Especie: T. asperellum Samuels, Lieckf
& Nirenberg (1999)
(Continúa)

Streptomyces racemochromogenes Burkholderia glumae / Arroz
Pseudomonas fuscavaginae / Arroz
Reino: Bacteria
Filum: Actinobacteria
Clase: Actinobacteria
Orden: Actinomycetales
Familia: Streptomycetaceae
Género: Streptomyces
Especie: S. racemochromogenes
Sugai (1956)
Saccharomyces cerevisiae Alternaria sp. / Cebolla
Reino: Hongo
Clase: Saccharomycetes
Orden: Saccharomycetales
Familia: Saccharomycetaceae
Género: Saccharomyces
Especie: S. cerevisiae
Meyen ex E.C. Hansen
Tipos de formulaciones
La formulación de los microorganismos es un paso esencial durante el desarrollo de

un bioinsumo viable y efectivo, así como la producción y obtención de las estructuras
que van a ser empleadas como ingredientes activos (Glare & Moran, 2016). En cuanto
a los bioinsumos registrados ante el ica como agentes de control, en su mayoría
corresponden a formulaciones tipo polvo mojable (wp), seguidas de suspensiones
o soluciones concentradas (sc) y concentrado soluble (sl), entre otros (figura 3.1).
Los principales ingredientes activos corresponden a: esporas o conidios, seguidos
de clamidosporas y en menor cantidad células. Es importante tener en cuenta esta
información para realizar una adecuada reconstitución de los bioinsumos y garan-
tizar una mayor recuperación de dichas estructuras viables.
Bacillus subtilis Burkholderia cepacia Streptomyces racemochromogenes

Trichoderma asperellum Trichoderma atroviride Trichoderma harzianum
Trichoderma koningii Trichoderma koningiopsis Trichoderma lignorum
Trichoderma viride
SOLUCION CONCENTRADA
(SC)
2 2 3
POLVO SOLUBLE (SP) 1
POLVO MOJABLE (WP) 2 1 2 2 19 2 1 3 4
GRANULOS DISPERSABLES
2
(WG)
GEL EMULSIONABLE (GL) 1 1
CONCENTRADO SOLUBLE (SL) 3 1 1
CONCENTRADO
2
EMULSIONABLE (EC)
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Bioinsumos (No.)
Figura 3.1. Principales tipos de formulación e ingredientes activos de bioinsumos registrados ante el
ica hasta diciembre de 2019 para el control de fitopatógenos.
Criterios para la elaboración de los controles

de calidad y evaluación de la eficacia
Saber qué criterios seguir para determinar si un bioinsumo cumple con los requi-
sitos establecidos para la obtención del registro de productor y su comercialización
es un paso clave dentro del proceso de evaluación. A continuación, se presentan
algunos aspectos que se deben tener en cuenta para llevar a cabo un correcto control
de calidad.
Reconstitución de los bioproductos
La rehidratación es un factor crítico que se debe tener en cuenta para la evalua-

ción de la eficacia de los bioproductos formulados como polvos mojables, gránulos
dispersables o los inmovilizados en matrices poliméricas. El proceso de reconsti-
tución consta de 4 pasos: humectación, inmersión, dispersión y disolución (si es
soluble). Dependiendo de la manera en que se realice la reconstitución, se garantiza
la viabilidad y reactivación de las células o estructuras formuladas (Freudig, 1999;
Morgan et al., 2006; Muller et al., 2010). Adicionalmente, durante este paso también
se deben tener en cuenta dos aspectos importantes, a saber: el vehículo de hidrata-
ción —el cual podría facilitar la reparación de posibles daños causados durante la
formulación, la restauración de las funciones fisiológicas y garantizar su actividad
biológica— y el efecto de la temperatura, el pH, la osmolaridad, el volumen y el
tiempo de rehidratación (Carbó et al., 2017; Muller et al., 2010). Dentro de las solu-
ciones empleadas para la rehidratación de productos se recomiendan las siguientes
(Aguirre et al., 2018; Carbó et al., 2017; Morgan et al., 2006):
• Agua destilada
• Solución salina 0,9 %
• Glucosa anhídrida
• Leche descremada (100 g/L)
• Tween 80
Según estudios realizados por Carbó et al. (2017), se sugiere que el tiempo de hidra-
tación sea de 10 minutos como mínimo y de 2 horas como máximo. Sin embargo,
cabe aclarar que el tiempo de hidratación puede aumentar según el tipo de formula-
ción desarrollada, que puede establecer cada productor mediante procesos de carac-
terización del producto.
Características y mecanismos de acción de

los agentes de control biológico
Como se mencionó anteriormente en este apartado, para evaluar la actividad bioló-

gica de un bioinsumo sobre un patógeno determinado es necesario tener en cuenta
las características de los diferentes tipos de microorganismos: el microorganismo
antagonista, el microorganismo patógeno y las condiciones requeridas para su desa-
rrollo e interacción. Dado que la mayoría de estas evaluaciones se realizan bajo
condiciones controladas en un laboratorio (in vitro), es indispensable conocer las
características macroscópicas y microscópicas de los microorganismos evaluados en
diferentes medios de cultivo o sustratos empelados para su evaluación.
Otro parámetro importante para la correcta evaluación de los bioinsumos es conocer

los mecanismos de control biológico empleados por los agentes de control. Los meca-
nismos de acción ejercidos por parte del biocontrolador sobre el patógeno de la planta
se dividen en directos e indirectos (figura 3.2). Dentro de los mecanismos directos
encontramos: la competencia por nutrientes y espacio, la producción de antibióticos, la
producción de enzimas líticas, la inactivación de enzimas producidas por el patógeno
y el parasitismo. Dentro de los mecanismos indirectos se incluyen todos aquellos que
tienen la capacidad de causar un cambio morfológico o bioquímico en la planta hospe-
dera como, por ejemplo, el desarrollo de tolerancia por parte de la planta hospedera,
la solubilización o captura de nutrientes inorgánicos o la activación del sistema de
resistencia inducida (De Almeida et al., 2015; Viterbo et al., 2002).
Figura 3.2. Interacciones entre microorganismos patógenos y agentes biocon-

troladores (mecanismos de acción).
Aplicación de los bioinsumos y microorganismos patógenos
Garantizar que el patógeno esté activo para evaluar la actividad biológica de un

biocontrolador es un paso indispensable que se debe garantizar al momento del
realizar el ensayo. El patógeno debe estar activo y debe evidenciar signos o caracte-
rísticas típicas de su crecimiento para su uso. Se debe emplear una dosis de inocu-
lación que garantice la producción de la enfermedad como, por ejemplo, cuando la
evaluación se realiza sobre frutos. La aplicación del bioinsumo y del patógeno se

puede realizar de las siguientes maneras:
• Aspersión: la inoculación por aspersión consiste, como su nombre lo indica, en

rociar el ingrediente activo (conidios o células) de manera homogénea sobre el
sustrato empleado para la evaluación; ya sea en el medio de cultivo o en los frutos.
Se debe tener en cuenta el volumen a inocular, la concentración final del inóculo
y verificar que la totalidad de la superficie donde se va a realizar la evaluación
quede cubierta con la muestra.
• Inoculación por gota: para que sea más precisa, la inoculación por gota se puede
realizar mediante una micropipeta. En su defecto, se puede emplear una pipeta
Pasteur. Al igual que con la inoculación por aspersión, se debe tener en cuenta el
volumen, la concentración y que la gota no se vaya a regar o expandir.
• Inmersión: la mayoría de los ensayos in vivo emplean frutos para determinar la

actividad antagónica de un biocontrolador. En estos casos la inoculación del pató-
geno o el biocontrolador se realiza mediante la inmersión de los frutos durante
unos segundos en la suspensión realizada del patógeno o en la suspensión recons-
tituida del bioproducto. Una vez se deja secar la muestra sobre el fruto se incuban
a las condiciones respectivas.
Parámetros de evaluación de la actividad biológica
La capacidad de un patógeno para desarrollar la enfermedad depende de la cepa

empleada; las condiciones del cultivo; la edad del cultivo; las dosis seleccionada o
recomendada; el sustrato de evaluación; la uniformidad de la forma de inoculación
y las condiciones ambientales como humedad, pH, temperatura, entre otras (French,
1982). La separación de los propágulos o células patogénicas a partir de un medio
sólido se puede realizar mecánicamente a partir del crecimiento superficial. Para el
caso de los hongos, si se requieren solo los conidios, se puede pasar la suspensión del
patógeno a través de muselina estéril para retener partes de micelio y dejar pasar solo
los conidios. Posteriormente, la concentración de conidios (ya filtrados) se ajusta
por recuento en cámara de Neubauer en un microscopio óptico (objetivo 40×). En
muchas ocasiones, para el caso de células bacterianas, se puede ajustar la suspen-
sión empleando una escala de referencia de McFarland o haciendo una lectura de la
absorbancia en una longitud de onda de recomendada (según el tamaño del microor-
ganismo) (Tan et al., 2013).
En las evaluaciones que implican el uso de un patosistema (frutos, hojas, tallos o

pétalos), es indispensable saber cómo diagnosticar y distinguir adecuadamente un
signo de un síntoma, así como entre incidencia y severidad. Los signos indican enfer-
medad por observación directa de un patógeno o sus partes (hifa, conidio, cuerpos
fructíferos, entre otros), mientras que los síntomas indican enfermedad por reacción
del huésped, que se evidencia por la coloración anormal de los tejidos o por pudri-
ción (Ellis & Boehm, 2008).
En cuanto a la incidencia y severidad; la incidencia hace referencia a la proporción

o número de unidades de una muestra u otra población definida (plantas, frutos,
hojas) en las que está presente una plaga o fitopatógeno (Convención Internacional
de Protección Fitosanitaria [cipf], 2016). En la mayoría de las evaluaciones la inci-
dencia es expresada como un porcentaje del total del número de muestras infectadas,
por lo cual es una variable mucho más fácil y rápida de medir comparada con la
severidad. Por otro lado, la severidad es un término utilizado para caracterizar el
impacto que tiene el proceso de la enfermedad sobre los tejidos de un individuo
(fruto u hoja, por ejemplo). En otras palabras, la severidad hace referencia al área
o volumen de tejido afectado y se determina empelando escalas de clasificación del
avance de la enfermedad (Seem, 1984).
Aceptación o rechazo de bioinsumo
Si tras una evaluación bajo las indicaciones descritas por la casa comercial o las
metodologías estandarizadas por el laboratorio encargado el bioinsumo no cumple
con las especificaciones establecidas, el producto se debe rechazar. En caso de existir
discrepancias, se debe repetir el ensayo con las muestras reservadas para tal fin
(contramuestras).
Material de referencia
Las cepas de referencia son microorganismos viables obtenidos de una colección

nacional o internacional. Si las cepas control corresponden a aislamientos propios
del investigador, estas deben estar caracterizadas morfológicamente, por pruebas
bioquímicas y debidamente identificadas molecularmente. La conservación de estos
microorganismos debe garantizar su pureza y estabilidad microbiológica porque
son los que se emplean como tratamientos control o de contraste en los ensayos de
eficacia. Es indispensable que las cepas empleadas como cepas control cuenten con
el certificado de procedencia e identidad.
Metodologías
La evaluación de la actividad antagónica de un microorganismo empleado como

ingrediente activo de un bioinsumo tiene como fin proporcionar información
confiable acerca de su eficacia. En consecuencia, la elección de un método de ensayo
adecuado es crucial, así como la selección de los materiales, los medios de cultivo, el
tipo de ensayo, las variables a evaluar y las condiciones ambientales del área donde
se va a realizar el ensayo. Se recomienda que la selección del método de evaluación y
el análisis estadístico se realice según el microorganismo en estudio.
Para la evaluación de la actividad antagónica se pueden emplear métodos nacionales

o internacionales normalizados o métodos internos desarrollados y estandarizados
por el laboratorio. Estos deben garantizar resultados confiables en cuanto a equiva-
lencia (unidades de medición) y trazabilidad.
A continuación se describen 13 metodologías —en su mayoría tomadas de biblio-

grafía especializada— que se pueden emplear como modelo para la estandariza-
ción de protocolos de evaluación de la actividad antagónica de diferentes agentes
de control biológico (bacterias y hongos). Las metodologías descritas a continua-
ción, se seleccionaron para que puedan ser llevadas a cabo bajo condiciones in vitro;
haciendo uso de cajas de Petri, tubos de ensayo o montaje de patosistemas de evalua-
ción, seleccionando frutos susceptibles (todos bajo condiciones controladas).
Metodología I
Patógeno modelo: Colletotrichum gloeosporioides
Biocontrolador: Levadura (ej: Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula glutinis,
Pichia onichys)
Técnica: Enfrentamiento
Se inocula un volumen de 0,5 ml del bioproducto reconstituido en agua y ajustado

a una concentración de 1 x 107 células/ml de la levadura en el centro de una caja
de Petri que contiene un medio de papa dextrosa agar pda. Se homogeneiza sobre
la superficie del medio con ayuda de un rastrillo estéril. La muestra se deja secar
durante aproximadamente 1 hora dentro de una cabina de flujo laminar. El patógeno
C. gloeosporioides se inocula en el centro de la caja de Petri, para lo cual se toman
0,5 ml de la suspensión ajustada a una concentración de 1 x 105 esporas/ml. Las
cajas se incuban a 25 ± 1 ºC durante 8 días, periodo después del cual se toman dos
medidas perpendiculares del diámetro de la colonia, las cuales se promedian para

determinar el porcentaje de inhibición del crecimiento diametral mediante la ecua-
ción 3.1 (figura 3.3) (Aguirre et al., 2019).
a b
Figura 3.3. Medidas perpendiculares del diámetro de la colonia. a. Enfrentamiento entre el agente bio-
controlador y el fitopatógeno; b. Crecimiento del fitopatógeno sin presencia del agente biocontrolador.
 DCP − DCE 
Inhibición ( % ) =   x100
 DCP
Ecuación 3.1. Inhibición de crecimiento diametral (%). Elaboración propia.
Donde:
DCP: Diámetro de la colonia del testigo patógeno (mm)
DCE: Diámetro de la colonia del ensayo (mm)
El diseño experimental es completamente al azar. Se debe contar con un trata-

miento control que consiste en la inoculación del patógeno sin presencia del biopro-
ducto (levadura) y la inoculación del bioproducto sin inoculación del patógeno C.
gloeosporioides.
Metodología II
Patógeno modelo: Thielaviopsis sp.
Biocontrolador: Trichoderma asperellum
Técnica: Enfrenamiento en suelo
Para evaluar la eficacia de un bioproducto formulado a base de un hongo como

Trichoderma spp., se puede emplear la metodología descrita por Wijesinghe et al.
(2011). Para la evaluación se emplean tubos de ensayo estériles de 25 mm de diámetro

por 145 mm de longitud y suelo previamente tamizado a través de una malla de 25
cm2, seco y con un pH ajustado a 4,6 (el pH puede variar según el patógeno a evaluar
y el cultivo al cual va dirigido el producto). Una muestra de 20 g de suelo se introduce
dentro de cada tubo de ensayo y se esteriliza por 2 horas seguidas a 15 psi y 120 ºC.
Finalizado el proceso, el suelo se deja secar a temperatura ambiente.
Para la evaluación de la eficacia, el suelo estéril debe ser inoculado con 2 ml de una
suspensión de 1 x 105 conidios/ml de Thielaviopsis sp., que se incuban durante 7
días a 28 ºC ± 1 ºC. Se debe verificar la presencia del patógeno en el suelo inoculado
mediante la selección de algunos tubos al azar, la evaluación de la viabilidad y la
determinación de la concentración mediante la técnica de recuento en placa. Una vez
confirmada la presencia del patógeno en el suelo, se adicionan a cada tubo del expe-
rimento 10 ml del bioproducto reconstituido siguiendo las indicaciones del fabri-
cante; al final debe verificarse la concentración final del principio activo. Los tubos
inoculados se incuban durante 8 semanas a temperatura ambiente (19 ºC a 20 ºC) y
una vez por semana (cada 8 días) se deben adicionar 5 ml de agua destilada estéril
a cada uno de los tubos bajo condiciones de esterilidad para mantener la humedad
del suelo. La eficacia del producto debe ser evaluada cada semana y expresada como
disminución de las ufc del patógeno.
El ensayo debe contar con un control absoluto (suelo inoculado solo con agua), un
control del patógeno (suelo inoculado con el patógeno y con 10 ml de agua estéril)
y un control del biocontrolador (suelo inoculado solo con el bioproducto, se debe
mantener la proporción de los volúmenes finales).
El diseño experimental es completamente al azar. La unidad experimental constará

de un tubo con 3 réplicas y todo el ensayo se repetirá 3 veces en el tiempo.
Metodología III
Patógeno modelo: Ralstonia solanacearum
Biocontrolador: Bacillus spp. o Pseudomonas spp.
Técnica: Spot Test
No son muchas las metodologías empleadas para la evaluación de la eficacia de

productos a base de bacterias bajo condiciones in vitro. Sin embargo, a continuación
se proponen dos metodologías de Spot Test para determinar la eficacia de los bioin-
sumos frente a patógenos como, por ejemplo, R. solanacearum u otros (Ge et al.,
2017; Ryan et al., 2004; Tan et al., 2013).
En la metodología descrita por Tan et al. (2013), la evaluación se realiza en un medio

de agar Luria Bertani (lb) y King B (kb). El bioinsumo, cuyo principio activo es
una bacteria, se debe reconstituir siguiendo la metodología descrita por el fabri-
cante; asimismo, el bionsumo se debe ajustar a una concentración de 1,0 (OD600=1,0)
empleando una escala de McFarland o un espectrofotómetro (600 – 630 nm).
A partir de la muestra reconstituida, se inoculan 2 µl en el centro de las cajas de
Petri que contengan el agar (lb y kb). Las cajas inoculadas con el biocontrolador se
incuban durante 36 horas a 30 ºC ± 2 ºC. Finalizado el periodo de incubación, se
debe evidenciar el crecimiento característico de la bacteria a evaluar sobre las cajas
de Petri. Posteriormente, bajo condiciones de esterilidad se adicionan 2 ml de una
suspensión de 1 x 108 células/ml del patógeno, que en este caso corresponde a R.
solanacearum. Las cajas inoculadas se dejan secar y se incuban nuevamente durante
48 horas a 30 ºC ± 1 ºC (figura 3.4).
El ensayo debe contar con un control patógeno (el cual corresponde a las cajas inocu-
ladas solo con la suspensión de R. solanacearum sin presencia del agente biocon-
trolador) y un control positivo (que corresponde a las cajas inoculadas solo con el
bioinsumo). Mediante un calibrador digital, la actividad antimicrobiana se deter-
mina midiendo el halo de inhibición (mm) formado alrededor de la colonia del
agente biocontrolador. La unidad experimental del ensayo corresponde a una caja
de Petri. Debe contar con 3 réplicas por tratamiento y 3 repeticiones en el tiempo.
Figura 3.4. Técnica de enfrentamiento entre el agente biocontrolador y la bacteria fito-

patógena.
Otra metodología propuesta para evaluar la eficacia del principio activo de un bioin-
sumo a base de bacterias es la descrita por Ge et al. (2017), con algunas modifica-
ciones. Al igual que en las metodologías anteriores, el producto debe reconstituirse
siguiendo las especificaciones de la casa comercial. Para este caso, se toman 10 µl del
bioinsumo reconstituido y se inoculan en el centro de una caja de Petri con agar lb.
Las cajas inoculadas se incuban durante 24 horas a 30 ºC. Finalizado el periodo de
incubación se debe verificar el crecimiento característico del agente biocontrolador
y, bajo condiciones de esterilidad, se debe adicionar una suspensión del patógeno
ajustado a una concentración de 1 x 102 células/ml (menor concentración en compa-
ración con la metodología anterior). Las cajas se incuban nuevamente durante 24
horas a 30 ºC ± 1 ºC. El efecto antagonista se determina midiendo el halo de inhi-
bición formado alrededor de la colonia del agente biocontrolador con ayuda de un
calibrador digital (figura 3.5).
Figura 3.5. Medición del halo de inhibición causado por el enfrentamiento

del agente biocontrolador y la bacteria fitopatógena. Se pueden tomar dos me-
didas perpendiculares y promediarlas.
La unidad experimental es una caja de Petri. El ensayo cuenta con 3 réplicas y se

realiza 3 veces en el tiempo. Como testigo patógeno se inocula R. solanacearum sin
presencia del biocontrolador. Como control positivo se inocula el biocontrolador sin
presencia del patógeno.
En la metodología descrita por Ryan et al. (2004) se propone una modificación en

la forma de inocular el microorganismo patógeno. Una vez se haya reconstituido el
bioinsumo, 10 µl de la muestra se inoculan en el centro de una caja de Petri con Agar
lb. Las cajas inoculadas se deben incubar durante 24 o 48 horas (según el agente
biocontrolador) a 30 ºC ± 1 ºC. Posteriormente, y a diferencia de las metodologías
descritas anteriormente en este apartado, se deben adicionar sobre el medio lb 15 ml
de agar agua semisólido (aass) de manera tal que cubra la totalidad de la superficie.
Una vez se haya gelificado el aass, se inocula el patógeno sobre toda la superficie
del medio mediante la aspersión de una suspensión de 1 × 106 células por ml. Las
cajas se incuban nuevamente durante 24 o 48 horas (según corresponda) a 30 ºC ±
1 ºC. Finalizado el periodo de incubación, se debe determinar el efecto antagonista
midiendo el halo de inhibición formado alrededor de la colonia del agente biocon-
trolador. El patógeno también se puede inocular mediante el ajuste de la concentra-
ción de manera directa en el aass para, posteriormente, adicionarlo sobre el medio
lb inoculado con el biocontrolador.
El diseño experimental es completamente al azar. La unidad experimental es una

caja de Petri. El ensayo debe contar con 3 réplicas y realizarse 3 veces en el tiempo.
Igualmente, se debe contar con controles que validen el crecimiento del microorga-
nismo patógeno, así como el del agente biocontrolador.
Foto: Liz Alejandra Uribe

Figura 3.6. Halo de inhibición causado por el enfrentamiento entre el agente
biocontrolador y la bacteria fitopatógena inoculada mediante la adición de
agar semisólido.
Metodología IV
Patógeno modelo: Ralstonia solanacearum
Biocontrolador: Pseudomonas aeruginosa
Técnica: Difusión en agar
La metodología de difusión en agar también puede ser empleada para la evalua-
ción de la actividad biológica de un agente de control biológico. En la metodología
descrita por Lemessa & Zeller (2007), 100 µl de la suspensión del patógeno, que en
este caso es R. solanacearum ajustado a 1 × 108 células/ml, se aplican sobre la super-
ficie del medio de cultivo lb. Una vez la muestra esté seca, se abren 4 pozos de 9 mm
cada uno sobre la superficie del medio evitando llegar hasta el fondo (se puede servir
una capa de medio que sirva como base). En cada pozo se adicionan 30 µl del bioin-
sumo reconstituido. Las cajas inoculadas se incubadan durante 48 horas a 28 ºC.
La actividad antimicrobiana se evalúa midiendo los halos de inhibición formados
alrededor de las colonias del agente biocontrolador empleando un calibrador digital

(Lemessa & Zeller, 2007).

caja de Petri. El ensayo debe contar con 3 réplicas y realizarse 3 veces en el tiempo.
Como testigo patógeno se debe inocular R. solanacearum sin presencia del biocon-
trolador. Como control positivo se debe inocular el biocontrolador sin presencia del
patógeno.
Metodología V
Patógeno modelo: Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum
Biocontrolador: Pseudomonas aeruginosa
Técnica: Inhibición del crecimiento micelial mediante la determinación de peso
seco (g)
Con la siguiente metodología se puede evaluar la eficacia de un bioinsumo a base
de bacterias para inhibir el crecimiento de un patógeno como Fusarium spp. En
este caso, en la metodología descrita por Trivedi et al. (2008), se emplea la técnica
de enfrentamiento y la eficacia se determina mediante la capacidad de la bacteria de
inhibir el crecimiento del patógeno, tomando la medida del peso seco (g) después de
un proceso de fermentación en medio líquido. Para esto, se realiza la reconstitución
del bioinsumo siguiendo las recomendaciones de la casa comercial y se ajusta a la
concentración recomendada. Erlenmeyers de 250 ml que contienen 50 ml de pda
(o el medio recomendado) son inoculados con 1 ml del bioproducto reconstituido
(ajustado a la concentración a evaluar) y un disco de agar de pda de 5 mm con el
patógeno crecido. Los Erlenmeyer inoculados son incubados durante 72 horas a 28
ºC con agitación continua de 80 rpm. Finalizado el periodo de incubación, el caldo
fermentado se pasa a través de papel filtro (No. 1 figura 3.3). Cada papel filtro es
secado durante 24 horas a 70 ºC y, posteriormente, se toma el dato del peso (g) en
una balanza analítica. El porcentaje de inhibición del crecimiento del patógeno se
determina empleando la ecuación 3.2.
 (W 1 − Wc ) − (W 2 − Wc ) 
Inhibición ( % ) =   x100
 (W 1 − Wc )
Ecuación 3.2. Inhibición (%) para la metodología de crecimiento
micelial por peso seco (Trivedi et al., 2008).
Donde:
W1: Peso seco (g) de tratamientos testigo patógeno
W2: Peso seco (g) del tratamiento inoculado con bacterias
Wc: Peso seco (g) del testigo (agua estéril)
El diseño experimental es completamente al azar. La unidad experimental consiste

en un Erlenmeyer que contiene 50 ml de pda. El ensayo debe contar con 3 réplicas
y debe realizarse 3 veces en el tiempo. Como testigo patógeno se debe inocular
Fusarium spp. (W1) sin presencia del biocontrolador. Como control positivo se debe
inocular el biocontrolador sin presencia del patógeno (para verificar viabilidad).
Como testigo absoluto (Wc) se debe emplear agua destilada estéril (sin inocular).
Fotos: Liz Alejandra Uribe Gutiérrez
a b
Figura 3.7. Inhibición del crecimiento micelial mediante la determinación
de peso seco (g). a. Filtración del medio de fermentación a través de papel
Whatman No. 1; b. Obtención de biomasa húmeda.
Metodología VI
Patógeno modelo: Geotrichum sp. – M. fructicola

Biocontrolador: Metschnikowia citriensis – Pichia membranaefaciens – Kloeckera
apiculata
Técnica: Enfrentamiento
Para evaluar la eficacia bajo condiciones in vitro de un bioinsumo cuyo ingrediente

activo sea una levadura, se pueden emplear las metodologías descritas por Wang
et al. (2020) y Zhang et al. (2017). Se debe realizar la reconstitución del bioinsumo
siguiendo las metodologías descritas por la casa comercial y ajustando la concentra-
ción final a 1 × 106 células/ml. Un volumen de 100 µl de la suspensión de levaduras es
asperjado sobre la superficie del medio pda. La muestra se deja secar durante 1 hora
y, posteriormente, un disco de agar de 5 mm de diámetro que evidencie crecimiento
micelial del patógeno se ubica en el centro de la caja. Se debe tener en cuenta que el
lado que evidencie el crecimiento debe quedar en contacto con el medio de cultivo.
Las cajas inoculadas se incuban durante 10 días a 25 ºC o 28 ºC (según el patógeno
a evaluar) y cada dos días se toman dos medidas perpendiculares del diámetro de la
colonia. Las dos medidas se promedian y se determina el dato de crecimiento radial
en el tiempo (mm/días). El porcentaje de inhibición del crecimiento diametral se
determina empleando la ecuación 3.1.
El diseño experimental es completamente al azar. La unidad experimental es una caja

de Petri con Agar pda. El ensayo debe contar con 3 réplicas y realizarse 3 veces en el
tiempo. Como testigo patógeno se inocula Geotrichum sp. en medio pda asperjado
con agua destilada estéril (sin presencia del agente biocontrolador). Como control
positivo se inocula el biocontrolador sin presencia del patógeno.
Metodología VII
Patógeno modelo: Monilinia fructicola
Biocontrolador: Pichia membranaefaciens – Kloeckera apiculata
Técnica: Inhibición de la germinación
Zhang et al. (2017) describe una metodología con modificaciones (Ren et al., 2012)
que permite determinar la eficacia de un bioinsumo a base de una levadura para
inhibir la germinación de un microorganismo patógeno como, por ejemplo, M. fruc-
ticola. Para esto, se debe realizar la reconstitución del bioinsumo siguiendo las meto-
dologías descritas por la casa comercial y se debe ajustar a la concentración indicada.
Un volumen de 1 ml de la suspensión debe ser inoculado en un Erlenmeyer de 50
ml que contenga 8 ml de caldo papa dextrosa (pdb). Asimismo, un volumen de 1
ml de la suspensión del patógeno ajustado a 5 × 106 conidios/ml debe ser inoculado
en el medio que contenga la levadura. Los Erlenmeyer inoculados deben ser incu-
bados durante 72 horas a 25 ºC ± 1 ºC a 80 rpm y cada 24 horas se debe realizar el
recuento de 100 conidios germinados y no germinados (por campo óptico) mediante
un microscopio óptico con el objetivo 40×.
El diseño experimental es completamente al azar. La unidad experimental corres-

ponde a un Erlenmeyer que contiene 50 ml de pdb. El ensayo debe contar con 3
réplicas y realizarse 3 veces en el tiempo. Como testigo patógeno se inocula Monilia
sp. en medio pda (sin presencia del agente biocontrolador). Como control positivo se
inocula el biocontrolador sin presencia del patógeno.
La eficacia del producto para inhibir la germinación del patógeno se determinará

comparando el porcentaje de germinación obtenido en el testigo patógeno con el
obtenido en el tratamiento empleando las ecuaciones 3.3 y 3.4 (Ren et al., 2012):
 Conidios germinados 
Germinación ( % ) =  x100 %
 Conidios germinados + Conidios no germinados 
Ecuación 3.3. Germinación (%) de conidios de hongos filamentosos.
 GTP ( % ) − GT ( % ) 
Inhibición ( % ) =   x100
 GTP ( % )
Ecuación 3.4. Germinación (%) de conidios de hongos filamentosos.
Donde:
GTP (%): Germinación en el tratamiento del testigo patógeno (%)
GTC (%): Germinación en el tratamiento (%)
Metodología VIII
Patógeno modelo: Sclerotinia sclerotiorium
Biocontrolador: Trichoderma koningiopsis, Trichoderma harzianum y
Trichoderma asperellum
Técnica: Antagonismo
Para determinar la actividad biocontroladora de agentes microbianos a base de T.
koningiopsis, T. harzianum y T. asperellum sobre S. sclerotiorium en condiciones
in vitro, se describe la siguiente metodología estandarizada por el Laboratorio de
Control de Calidad de Bioinsumos de agrosavia. La metodología se fundamenta
en la infección de esclerocios de S. sclerotiorum para evaluar el efecto biocontrolador
a través del micoparasitismo interno y externo de las estructuras del patógeno. Al
igual que en los procedimientos descritos en este apartado, todo el procedimiento se
realiza bajo condiciones de esterilidad.
Previo al montaje, se debe cultivar el patógeno para la obtención de esclerocios

mediante la inoculación de bandejas que contienen cebada estéril. Después de 10
a 15 días de incubación a 25 ºC ± 1 ºC se cosechan los esclerocios y se desinfectan
con alcohol al 70 % durante 1 minuto seguido de dos lavados sucesivos con agua
destilada estéril y, posteriormente, con hipoclorito de sodio al 2 % durante 20
segundos, seguido de tres lavados sucesivos con agua destilada estéril. Finalmente,
los esclerocios se dejan secar sobre toallas de papel y se dejan listos para su uso.
Simultáneamente, se humedece suelo previamente tamizado a capacidad de campo
y se distribuye en cajas de Petri con 35 g en cada una sin compactar el suelo. Las
cajas con suelo deben ser esterilizadas a una temperatura de 121 ºC y 20 psi durante
15 minutos y, posteriormente, se debe verificar que la humedad del suelo estéril se
encuentre entre el 15 % y el 40 % mediante una balanza de humedad.
Para la evaluación antagónica del agente biocontrolador se reconstituye el producto

siguiendo las indicaciones de la casa comercial y se ajusta a la concentración reco-
mendada. Un total de 5 esclerocios se ubican sobre el suelo estéril de manera equi-
distante con ayuda de una pinza. Sobre cada esclerocio se adicionan 550 µl de la
suspensión del agente microbial y se le coloca la tapa a la caja de Petri. Las cajas se
almacenan durante 8 días a 21 ºC ± 1 ºC y finalizado el periodo de incubación se
determina el número de esclerocios parasitados.
Para validar que los esclerocios hayan sido parasitados por el agente biológico, se
determina la viabilidad de los esclerocios del tratamiento control (sin inocular) y los
inoculados con el bioinsumo. Para esto, se toman los esclerocios de cada réplica (tres
por tratamiento), se desinfectan de la manera descrita anteriormente y se ubican
sobre agar agua de manera equidistante. Las cajas con los esclerocios se incuban
durante 8 días a 25 ºC ± 1 ºC. Finalmente, con ayuda de un estereoscopio se observa
el micoparasitismo producido por el agente biocontrolador y se determina el porcen-
taje de parasitismo empleando la siguiente ecuación:
 a
Parasitismo ( % ) =   x100
 b
Ecuación 3.5. Cálculo de parasitismo expresado en porcentaje (%) (agrosavia, 2019a).
Donde:
a: es el número de esclerocios parasitados por la réplica.
b: es el número total de esclerocios por réplica.

caja de Petri que contiene suelo. El ensayo debe contar con 3 réplicas y realizarse 3
veces en el tiempo. El testigo patógeno corresponde a los esclerocios desinfectados
pero sin inocular con el bioinsumo. Como control positivo se inocula el biocontro-
lador con una cepa de referencia.
Metodología IX
Patógeno modelo: Fusarium oxysporum
Biocontrolador: Bacillus amyloliquefaciens
Técnica: Antagonismo
La siguiente metodología permite determinar la actividad biocontroladora de un
bioinsumo a base de bacterias como B. amyloliquefaciens para el control de hongos
patógenos como Fusarium spp. El bioinsumo debe reconstituirse siguiendo las indi-
caciones de la casa comercial y ajustarse a la concentración deseada. Posteriormente,
un volumen de 100 µl de la muestra se inocula sobre medio pda y con ayuda de un
rastrillo estéril, la muestra se distribuye sobre toda la superficie del medio y se deja
secar bajo condiciones de esterilidad. Un disco de agar de 5 mm o 6 mm con creci-
miento del hongo de 8 a 10 días de edad se ubica en el centro de la caja. Las cajas
inoculadas se incuban durante 7 a 10 días a 25 ºC ± 1 ºC y finalizado el periodo de
incubación, se toman dos medidas del diámetro de la colonia perpendicularmente
con ayuda de un calibrador digital. Para calcular el porcentaje de inhibición se
emplea la ecuación 3.6.
 A − B
Inhibición ( % ) =  x100
 A 
Ecuación 3.6. Cálculo de inhibición expresado en porcentaje (%)

Donde:
A es el promedio del crecimiento del tratamiento del testigo patógeno.
B es el promedio de crecimiento del patógeno en interacción con el agente bio-

controlador.

caja de Petri con agar papa dextrosa. El ensayo debe contar con 3 réplicas y debe
realizarse 3 veces en el tiempo. El testigo patógeno corresponde a la inoculación solo
del microorganismo patógeno sin inocular con el bioinsumo. Como control positivo
se inocula el biocontrolador con una cepa de referencia.
Metodología X
Patógeno: Colletotrichum gloeosporioides
Biocontrolador: Meyerozyma caribbica
Patosistema: Frutos de mango
Para evaluar la eficacia de bioproductos a base de levaduras, se puede emplear la
metodología descrita por Aguirre et al. (2018). Para la evaluación in vivo se emplean
mangos sanos de tamaño y grado de madurez similar (pulpa firme y cáscara verde
con superficie amarilla). Los mangos deben desinfectarse durante 2 minutos sumer-
giéndolos en una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) al 1,5 %. Posteriormente,
se lavan con agua estéril, se retiran residuos de hipoclorito de la superficie de la
fruta y se dejan secar a temperatura ambiente. Una vez secos, a cada mango se le
realizan dos heridas de 2,5 mm de profundidad y 3 mm de ancho con ayuda de un
instrumento cortopunzante estéril. Los frutos con heridas son sumergidos durante
10 minutos en el bioproducto reconstituido en agua destilada estéril y se ajusta a la
concentración recomendada por la casa comercial.
Los mangos del tratamiento control son sumergidos únicamente en agua estéril.
Todos los mangos se dejan secar durante una hora y, posteriormente, son inoculados
adicionado 25 µl de una suspensión de C. gloeosporioides en cada herida.
Los mangos inoculados son almacenados durante 15 días dentro de cámaras

húmedas a 25 ºC ± 1 ºC y 80 % de humedad. Cada 3 días de se mide la incidencia
y severidad de la enfermedad. Para dicho fin se toma la medida del diámetro de la
colonia y se define utilizando la ecuación 3.7.
 No. de frutos con signos y síntomas 

Incidencia dela enfermedad ( % ) =   x100
 Total de frutos evaluados
Ecuación 3.7. Incidencia de C. gloeosporioides. (Aguirre et al., 2018).
El diseño experimental es completamente al azar. La unidad experimental es 1

mango con 10 réplicas (10 mangos) y 3 repeticiones en el tiempo. Los tratamientos
para evaluar deben incluir: primero, los mangos inoculados con el bioproducto y el
patógeno; segundo, los mangos inoculados con el patógeno únicamente; tercero, los
mangos inoculados solo con agua destilada (testigo) y cuarto, los mangos tratados
solo con el bioproducto. Si se cuenta con la cepa de referencia se podría incluir en el
diseño experimental.
Metodología XI
Patógeno: Penicillium digitatum
Biocontrolador: Pichia guilliermondii y Candida oleophila
Patosistema: Frutos de naranja o limón
Otros procedimientos que permiten evaluar la eficacia de bioproductos a base de
levaduras son los descritos por De Corato et al. (2018) y Wang et al. (2020). Estos
consisten en seleccionar frutos sanos de tamaño y madurez similar (preferiblemente
no tratados con fungicidas). Los frutos seleccionados deben ser lavados con agua de
la llave para retirar la suciedad o los residuos de agroquímicos (si han sido tratados).
Los frutos se desinfectan sumergiéndolos en una solución de hipoclorito de sodio
(NaClO) ajustado al 0,3 % durante 3 minutos, seguido de tres lavados sucesivos con
agua estéril y se dejan secar a temperatura ambiente (19 ºC a 20 ºC). A los frutos
desinfectados se les deben realizar dos heridas opuestas (a cada lado del fruto) de
2 mm de profundidad y 3 mm de longitud sobre el epicarpo con un instrumento
cortopunzante estéril. Los frutos secos correspondientes al tratamiento a evaluar se
sumergen durante 5 minutos en el bioproducto reconstituido y ajustado a la concen-
tración a evaluar siguiendo las especificaciones de la casa comercial. Los frutos
tratados con el bioproducto se incuban durante 72 horas a 25 ºC ± 1 ºC y a una
humedad de 90 % ± 5 % en un cuarto climatizado o cuarto designado para la elabo-
ración del bioensayo. Posteriormente, cada una de las heridas se inocula con 20 µl
de una suspensión de 1 x 105 conidios/ml del patógeno a evaluar, que en este caso
corresponde a P. digitatum.
Los frutos inoculados se almacenan durante 6 días bajo condiciones controladas, ya

sea en el cuarto climático o el cuarto de bioensayos. Finalizado el periodo de incuba-
ción se evalúa la presencia de signos o síntomas característicos del patógeno evaluado
y se determina el porcentaje de inhibición empleando la ecuación 3.8:
 X HIC − XHIT 
Inhibición ( % ) =   x100
 X HIC
Ecuación 3.8. Inhibición (%).

Donde:
X̄ HIC: Promedio del número de heridas infectadas en los frutos tratados con el pató-
geno solo.
X̄ HIT: Promedio del número de heridas infectadas en los frutos tratados con el
bioproducto.
El diseño experimental es completamente al azar. La unidad experimental consta de

un fruto con 10 réplicas (10 frutos) y 3 repeticiones en el tiempo. Los tratamientos para
evaluar deben incluir: primero, frutos inoculados con el bioproducto y el patógeno;
segundo, frutos inoculados con el patógeno únicamente; tercero, frutos inoculados
solo con agua destilada (testigo) y cuarto, frutos tratados solo con el bioproducto. Si
se cuenta con la cepa de referencia se debe incluir en el diseño experimental.
Metodología XII
Patógeno modelo: Botrytis cinerea
Biocontrolador: Trichoderma harzianum
Patosistema: Frutos de manzana
Batta (2004) describe una metodología para evaluar la eficacia de un producto a
base de T. harzianum sobre B. cinerea mediante frutos de manzana Golden. Con
esta metodología, se puede evaluar el efecto preventivo o curativo del bioproducto
variando los tiempos de inoculación del microorganismo patógeno.
Para emplear este patosistema, al igual que los anteriores, se seleccionan frutos
sanos de tamaño y madurez similar (preferiblemente manzanas maduras). A cada
manzana desinfectada se le realizan dos heridas de 2 mm de diámetro y 2 mm de
profundidad a cada lado con una herramienta cortopunzante estéril. Las heridas se
inoculan con 25 µl de los tratamientos a evaluar, que en este caso corresponderían
a: 25 µl del bioinsumo reconstituido y ajustado a la concentración indicada según
las indicaciones de la etiqueta, 25 µl de agua destilada estéril (tratamiento control
absoluto), 25 µl del patógeno B. cinerea a partir de una concentración de 1 × 106
conidios/ml y 25 µl del biocontrolador (si se cuenta con la cepa de referencia del
principio activo). Se debe tener en cuenta que en la aplicación del biocontrolador y
del patógeno se ajustan las concentraciones de 1 × 107 conidios/ml y 1 × 106 coni-
dios/ml respectivamente, pero al inocular las heridas con 25 µl la concentración baja
2 exponentes, lo cual resulta en un valor de 1 × 105 conidios/ml de T. harzianum y

1 × 104 conidios/ml de B. cinerea.
Para la evaluación del efecto curativo, la inoculación del patógeno y del bioproducto
se realiza al mismo tiempo, mientras que para la evaluación del efecto preventivo, la
inoculación del bioproducto se realiza 36 horas antes de la inoculación del patógeno.
Las manzanas inoculadas son introducidas dentro de cámaras húmedas tapadas y
se ubican en un cuarto de incubación durante 32 días a 20 ºC ± 1 ºC o se orga-
nizan dentro de un cuarto de ensayos con temperatura y humedad controlada (>80
%) (figura 3.8). Cada 8 días se toma la medida del diámetro de la lesión caracterís-
tica causada por el patógeno, formada alrededor del sitio de inoculación, y 10 días
después de la inoculación se observa la producción de esporas sobre la superficie de
la fruta.
Foto: Liz Alejandra Uribe Gutiérrez
Figura 3.8. Cámara húmeda de bioensayo. Patosistema: Manzanas inoculadas con B.

cinerea. Los frutos no están en contacto con la servilleta humedecida con agua estéril.
La eficacia del bioproducto se evalúa determinando el diámetro de la colonia a través

del tiempo y el número de conidióforos por lesión, los cuales pueden ser observados
empleando un microscópico óptimo con un objetivo 40×.
Tabla 3.3. Determinación cualitativa de patogenicidad con base en el número de conidióforos por lesión
Densidad Determinación
Conidióforos / lesión cualitativa
> 200 Alta +++
> 50-99 Media ++
< 49 Baja +
No esporulación
0 -
(Inhibición)
El diseño experimental es completamente al azar. La unidad experimental del expe-

rimento se organiza de la siguiente manera: una manzana con dos heridas. Es decir,
el ensayo cuenta con 8 réplicas correspondientes a 8 heridas (4 manzanas) y debe
repetirse 3 veces en el tiempo.
Metodología XIII
Patógeno modelo: Botrytis cinerea
Biocontrolador: Trichoderma harzianum
Patosistema: Frutos de manzana
Para evaluar la eficacia de un bioproducto a base de Trichoderma spp., Batta (2004)
reporta una metodología que permite simular las condiciones naturales de la infec-
ción. Para esto emplea el patosistema de frutos de manzana con micro-heridas hechas
con ayuda de una aguja estéril (puede ser de jeringa). En esta metodología se selec-
cionan manzanas de tamaño y madurez similar (manzanas maduras). A cada una de
las frutas se les realizan 8 pinchazos distribuidos sobre toda la superficie con ayuda
de una aguja estéril. Las frutas heridas son sumergidas durante 30 segundos en los
diferentes tratamientos a evaluar correspondientes a: el bioinsumo reconstituido
y ajustado a la concentración indicada según las indicaciones de la etiqueta, agua
destilada estéril (tratamiento control absoluto) y suspensión del biocontrolador (si
se cuenta con la cepa de referencia del principio activo ajustado a 1 × 107 células/ml).
Las frutas inoculadas se dejan secar durante 4 horas y, posteriormente, se realiza la
inoculación del patógeno B. cinerea mediante aspersión sobre la superficie del fruto
de 1,5 ml de una suspensión de 1 × 106 conidios/ml (aproximadamente 3 aspersiones

para un volumen final de 1,5 ml).
Las manzanas inoculadas son introducidas dentro de cámaras húmedas tapadas y

se ubican en un cuarto de incubación durante 32 días a 20 ºC ± 1 ºC o se organizan
dentro de un cuarto de ensayos con temperatura y humedad controlada (>80 %).
Cada 8 días se toma la medida del diámetro de la lesión característica causada por el
patógeno, formada alrededor del sitio de inoculación, y 16 días después de la inocu-
lación se observa la producción de esporas sobre la superficie de la fruta.
La eficacia del bioproducto se evalúa determinando el diámetro de la colonia a través

del tiempo y el número de conidióforos por lesión, los cuales pueden ser observados
empleando un microscópico óptico con un objetivo 40×.
El diseño experimental es completamente al azar. La unidad experimental del expe-

rimento se organiza de la siguiente manera: una manzana con 8 heridas o pinchazos.
Es decir, el ensayo cuenta con 32 réplicas correspondientes a 8 heridas (4 manzanas)
y debe repetirse 2 veces en el tiempo.
Caso de estudio
El siguiente caso de estudio corresponde a un ensayo realizado por agrosavia

(2019b). En este se estandarizó una metodología para determinar la actividad biocon-
troladora de un bioinsumo a base de bacilos esporulados mediante la técnica de
antagonismo. Los parámetros seleccionados para establecer la validez de la metodo-
logía propuesta son el de repetibilidad y reproducibilidad. Se analizaron 5 muestras.
Para esto y de manera independiente, se preparó una suspensión del bioplaguicida

a la concentración de 1×108 células/ml en una solución de agua suplementada con
Tween 80 al 0,1 %. Cada muestra se homogeneizó con un vórtex durante un minuto
y, posteriormente, se sembraron por triplicado 100 µl de la suspensión en una caja
de Petri con medio pda. Posteriormente, un fragmento de 0,7 cm de diámetro de
Fusarium sp. previamente crecido en pda se ubicó en el centro de cada caja inocu-
lada con el agente biocontrolador teniendo en cuenta que el lado que evidenciara el
crecimiento quedara en contacto con el medio de cultivo. Como testigo, se utilizaron
cajas de Petri con pda sin inoculación del agente biocontrolador, a las cuales se les
sembró un fragmento de 0,7 cm de diámetro con el hongo.
El tratamiento y el testigo se incubaron a 25 ºC ± 2 ºC durante 6 días debido a la rapidez

de crecimiento del hongo fitopatógeno. Transcurrido este tiempo se midió el diámetro
vertical y horizontal de cada colonia. Posteriormente, se promedió el diámetro de
crecimiento y se calculó el porcentaje de inhibición utilizando la ecuación 3.9:
 A − B
Inhibición ( % ) =  x100
 B 
Ecuación 3.9. Inhibición (%).

Donde: A corresponde al diámetro de crecimiento del tratamiento control y B al
diámetro de crecimiento del hongo en interacción con el agente biocontrolador.
Resultados del caso estudio
A continuación, se describirán los resultados obtenidos empleando la técnica

propuesta con dos analistas.
Analista 1
Tabla 3.4. Datos brutos del diámetro de colonia (mm) obtenidos con el analista 1
Diámetro vertical Diámetro

Tratamientos réplica Promedio (mm)
(mm) horizontal (mm)
1 15,29 13,97 7,63

Muestra 1 2 13,72 12,86 6,29
3 12,18 12,56 5,37
1 67,81 73,04 63,43
Testigo 1 2 56,27 60,78 51,53
3 57,97 53,18 48,58
1 13,17 12,52 5,85
Muestra 2 2 14,96 15,49 8,23
3 12,89 13,48 6,19
1 60,98 60,26 53,62
Testigo 2 2 62,66 61,28 54,97
3 51,87 53,95 45,91
1 13,45 13,56 6,51
Muestra 3 2 12,92 12,73 5,83
3 12,91 12,89 5,9
(Continúa)
Diámetro vertical Diámetro

Tratamientos réplica Promedio (mm)
(mm) horizontal (mm)
1 54,91 59,17 50,04

Testigo 3 2 57,56 56,48 50,02
3 63,65 60,43 55,04
1 11,37 11,56 4,47
Muestra 4 2 12,03 12,02 5,03
3 11,86 11,91 4,89
1 60,76 59,42 53,09
Testigo 4 2 60,85 61,84 54,35
3 51,57 48,19 42,88
1 11,5 12,6 5,05
Muestra 5 2 15,93 16,69 9,31
3 13,54 12,92 6,23
1 64,27 62,02 56,15
Testigo 5 2 60,67 60,84 53,76
3 60,33 62,89 54,61
Tabla 3.5. Determinación del porcentaje de inhibición obtenido con el analista 1
Muestra Réplica Inhibición

1 87,97
Muestra 1 2 87,79
3 88,94
1 89,09
Muestra 2 2 85,03
3 86,52
1 87,00
Muestra 3 2 88,35
3 89,28
1 90,48
Muestra 4 2 90,75
3 88,60
1 91,00
Muestra 5 2 82,68
3 88,59
(Continúa)

Promedio 88,14
Desviación estándar 2,19
Coeficiente de variación 2,49
Analista 2
Tabla 3.6. Datos brutos del diámetro de colonia (mm) obtenidos con el analista 2
Diámetro
Diámetro
Tratamientos réplica horizontal Promedio (mm)
vertical (mm)
(mm)
1 11,95 8,31 3,13
Muestra 1 2 9,1 8,61 1,86

3 11,02 7,96 2,49
1 53,11 58,77 48,94
Testigo 1 2 61,94 63,77 55,86
3 44,55 32,97 31,76
1 10,72 11,73 4,23
Muestra 2 2 11,37 10,71 4,04
3 11,9 12,02 4,96
1 61,28 61,27 54,28
Testigo 2 2 63,82 61,97 55,90
3 57,3 53,17 48,24
1 11,41 12,28 4,85
Muestra 3 2 10,22 10,84 3,53
3 15,27 14,12 7,70
1 64,32 64,11 57,22
Testigo 3 2 64,11 65,1 57,61
3 46,81 46,83 39,82
1 12,29 10,85 4,57
Muestra 4 2 12,43 12,09 5,26
3 13,53 13,91 6,72
1 69,21 63,24 59,23
Testigo 4 2 63,27 65,98 57,63
3 64,21 65,32 57,77
(Continúa)
Diámetro
Diámetro
Tratamientos réplica horizontal Promedio (mm)
vertical (mm)
(mm)
1 11,48 11,19 4,34
Muestra 5 2 14,39 13,62 7,01
3 12,56 12,1 5,33
1 61,74 71,65 59,70
Testigo 5 2 61,66 71,28 59,47
3 64,23 68,28 59,26
Tabla 3.7. Determinación del porcentaje de inhibición obtenido con el analista 2

1 93,6
Muestra 1 2 96,67
3 92,15
1 92,77
Muestra 2 2 92,77
3 89,71
1 91,53
Muestra 3 2 93,87
3 80,67
1 92,06
Muestra 4 2 90,87
3 88,36
1 92,73
Muestra 5 2 88,22
3 91
Promedio 91,13
Coeficiente de variación 3,96
Fotos: Lissette Torres Torres

Figura 3.9. Inhibición producida por B. amyloliquefaciens sobre Fusarium sp.
Análisis
Los resultados mostraron que en los datos obtenidos con el analista 1 hubo una
variabilidad de 2,49 %, mientras que en los datos obtenidos con el analista 2 se
registró una variabilidad de 3,96 %, lo que indica que la técnica presenta una alta
repetibilidad.
Con respecto a la reproducibilidad, se obtuvo un coeficiente de variación global

de 2,11 %, resultado que demuestra la reproducibilidad de la técnica entre los dos
analistas y con diferente tiempo de análisis (tabla 3.8).
Tabla 3.8. Determinación del coeficiente de reproducibilidad
Promedio Inhibición
Analistas Desviación (S / σ)
(%)
1 88,14 2,19
2 91,13 3,61
Desviación Sr (repetibilidad) 2,9
Desviación SR (reproducibilidad) 2,11
Límite de aceptación: como límite de aceptación se establece para el bioplaguicida a

base de Bacillus amyloquefaciens un porcentaje de inhibición mayor al 80 %.
En conclusión, las diferentes repeticiones de la técnica presentaron valores similares

con coeficientes de variación inferiores al 10 % (límite máximo de aceptación) con
todas las muestras. Por tal razón, se puede concluir que la metodología analítica para
determinar la actividad biocontroladora de bioinsumos a base de bacilos esporu-
lados mediante el método de antagonismo es repetible y reproducible en el tiempo.
Perspectivas
• Los criterios biológicos y las consideraciones descritas en este capítulo cons-

tituyen una herramienta para la definición, la estandarización y el registro de
procedimientos que pueden ser incorporados en la evaluación rutinaria de la
eficacia de bioinsumos de uso agrícola para el control de fitopatógenos.
• La selección de las metodologías recopiladas en este capítulo pretende ser una

línea base para la normalización de procedimientos que garanticen la correcta
evaluación de los bioinsumos que se comercializan en Colombia y el mundo.
• Los resultados obtenidos en cuanto a la eficacia de bioinsumos de uso agrícola

para el control de fitopatógenos con las metodologías descritas están alineados
con las consideraciones dadas sobre la obtención de resultados confiables y la
trazabilidad de estos.
Referencias
Abd-Elgawad, M. M. (2020). Optimizing biological control agents for controlling

nematodes of tomato in Egypt. Egyptian Journal of Biological Pest Control,
30(58), 1-10. https://doi.org/10.1186/s41938-020-00252-x
Agencia Española de Cooperación Internacional para el Desarrollo [Aecid] & Escue-
la de Agricultura de la Región Tropical Húmeda [Earth]. (s. f.). Manejo de
plagas y enfermedades. http://usi.earth.ac.cr/glas/sp/DocTecnicos/Promes/
Pina7.pdf
Aguirre, L., Calderón, M., Bautista, P., & Ragazzo, J. (2018). Application of pow-
der formulation of Meyerozyma caribbica for postharvest control of Col-
letotrichum gloeosporioides in mango (Mangifera indica L.). Lebensmit-
tel-Wissenschaft & Technologie, 113(1), 108-271. https://doi.org/10.1016/j.
lwt.2019.108271
Alarcón, J., & Jiménez, Y. (2012). Manejo fitosanitario del cultivo del plátano (Musa
spp.) Medidas para la temporada invernal. ica.
Amaya, C., Biotina, B., Jiménez, S., Uribe, L., Tibasosa, G., Jiménez, H., Nisbet, H.,
Hume, M., & Rodríguez, F. (2019). Actividad antimicrobiana de bacteria del
Banco de Germoplasma de Microorganismos de agrosavia. [Póster]. V Bo-
gotá Microbial Meeting BoMM, Bogotá, Colombia.
Arévalo, E., Díaz, A., Galindo, J., & Rivero, M. (2011). Manejo fitosanitario del cultivo
de mora (Rubus glaucus Benth) Medidas para la temporada invernal. ica.
Asociación Hortifruticola de Colombia [Asohofrucol] & Corporación Colombiana
de Investigación Agropecuaria [Corpoica]. (2013). Modelo tecnológico para
el cultivo del mango en el Valle del alto Magdalena en el Departamento del
Tolima.
Batta, Y. (2004). Postharvest biological control of apple gray mold by Trichoderma
harzianum Rifai formulated in an invert emulsion. Crop Protection, 23(1),
19-26. https://doi.org/10.1016/S0261-2194(03)00163-7
Cámara de Comercio de Bogotá [ccb]. (2015a). Manual de tomate de árbol [Manual].
https://www.ccb.org.co/content/download/13726/175108/version/1/file/To-
mate+de+%C3%A1rbol.pdf
Cámara de Comercio de Bogotá [ccb]. (2015b). Manual Lulo [Manual]. http://hdl.
handle.net/11520/14317
Cano, M. (2013). Estrategias biológicas para el manejo de enfermedades en el culti-
vo de fresa (Fragaria spp.). Revista Colombiana de Ciencias Hortícolas, 7(2),
263-276.
Caplice, E., & Fitzgerald, G. (1999). Food fermentations: role of microorganisms in
food production and preservation. International journal of food microbiolo-
gy, 50(1-2), 131-149.
Carbó, A., Torres, R., Usall, J., Fons, E. & Teixidó, N. (2017). Dry formulations of the
biocontrol agent Candida sake CPA‐1 using fluidised bed drying to control
the main postharvest diseases on fruits. Journal of the Science of Food and
Agriculture, 97(11), 3691-3698. https://doi: 10.1002/jsfa.8229
Castaño, J., & Leal, J. (2018). Manejo integrado de la pudrición de raíces del aguacate
(Persea americana Miller), causada por Phytophthora cinnamomi Rands. Te-
mas Agrarios, 23(2), 131-143. https://doi.org/10.21897/rta.v23i2.1297
Castellano, G., Quijada, O., Guanipa, N., Camacho, R., & Fonseca, Y. (2003). Con-
trol de la pudrición apical del fruto y secamiento del árbol mediante manejo
integral del cultivo del guayabo (Psidium guajava L.). Bioagro, 15(2), 135-142.
Convención Internacional de Protección Fitosanitaria [cipf]. (2016). Glosario de

términos fitosanitarios.https://www.ippc.int/static/media/files/publication/
es/2017/06/ISPM_05_2016_Es_2017-04-24_PostCPM12_InkAmLRG.pdf
Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria [agrosavia]. (2019a). Eva-
luación del antagonismo de agentes microbiales a base de Trichoderma konin-
giopsis, Trichoderma harzianum y Trichoderma asperellum contra Sclerotinia
sclerotiorum en condiciones “in vitro” - Código GA-R-157. agrosavia.
Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria [agrosavia]. (2019b).
Vinculación de Conocimiento y Tecnología. Determinación de la actividad
biocontroladora de bioinsumos a base de bacilos esporulados (método de an-
tagonismo). Formato de Informe de Estandarización - Código VC-F-178.
Cotes, A. (2018). El concepto de control biológico y sus premisas fundamentales. En
A. Cotes. (Ed.), Control biológico de fitopatógenos, insectos y ácaros: agentes
de control biológico (pp. 1-16). agrosavia.
De Almeida, B., Da Silva, W., Schurt, D., Ishida, A., De Souza, G., & De Lima, K.
(2015). Understanding the mechanism of biological control of passionfruit
bacterial blight promoted by autochthonous phylloplane bacteria. Biological
Control 80(1), 40-49. https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2014.09.011
Dean, R., Van Kan, J., Pretorius, Z, Hammond, K., Di Pietro, A., Spanu, P., Rudd,
J., Dickman, M., Kahmann, R., Ellis, J., & Foster, G. D. (2012). The Top 10
fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular plant pathology,
13(4), 414-430. https://doi.org/10.1111/j.1364-3703.2011.00783.x
De Corato, U., Salimbeni, R., De Pretis, A., Avella, N., & Patruno, G. (2018). Use
of alginate for extending shelf life in a lyophilized yeast-based formulate
in controlling green mould disease on citrus fruit under postharvest con-
dition. Food Packaging and Shelf Life, 15(1), 76-86. https://doi.org/10.1016/j.
fpsl.2017.11.006
EcuRed. (s. f.). Enfermedades del cultivo de la papaya. https://www.ecured.cu/Enfer-
medades_del_cultivo_de_la_papaya.
Ellis, S., & Boehm, M. (2008). Plants get sick too! An introduction to plant diseases.
Agriculture and natural resources. The Ohio State University.
Ellis, S., Boehm, M., & Mitchell, T. (2008). Fungal and fungal-like diseases of plants.
Fact Sheet (PP401. 07) Agriculture and natural resources. The Ohio State Uni-
versity.
Falkowski, P., Fenchel, T., & Delong, E. (2008). The microbial engines that drive
earth’s biogeochemical cycles. Science, 320(5879), 1034-1039. https://
doi:10.1126/science.1153213
Fira, D., Dimkić, I., Berić, T., Lozo, J., & Stanković, S. (2018). Biological control of
plant pathogens by Bacillus species. Journal of biotechnology, 285(1), 44-55.
https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2018.07.044
French, E. R. (1982). Métodos de investigación fitopatológica. ica.
Freudig, B., Hogekamp, S., & Schubert, H. (1999). Dispersion of powders in liquids in
a stirred vessel. Chemical engineering and processing, 38(1), 525-532. https://
doi.org/10.1016/S0255-2701(99)00049-5
Ge, X., Wei, W., Li, G., Sun, M., Li, H., Wu, J. & Hu, F. (2017). Isolated Pseudomonas
aeruginosa strain VIH2 and antagonistic properties against Ralstonia sola-
nacearum. Microbial pathogenesis, 111(1), 519-526. https://doi.org/10.1016/j.
micpath.2017.08.020
Gil, J., Sánchez, D., & Osorio, J. (2015). Estudios etiológicos da murcha-do-abaca-
teiro em Antioquia, Colômbia. Ceres, 61(1), 50-61. https://doi.org/10.1590/
S0034-737X2014000100007
Glare, T., & Moran, M. (2016). Microbial-based Biopesticides: Methods and Protocols.
Humana Press.
Harekrushna, S., & Kumar, D. (2012). A review on bioremediation. International
Journal of Research in Chemistry and Environment, 2(1), 13-21.
Insituto Colombiano Agropecuario [ica]. (2019). Productos bioinsumos registrados.
https://www.ica.gov.co/getdoc/2ad9e987-8f69-4358-b8a9-e6ee6dcc8132/
productos-bioinsumos-mayo-13-de-2008.aspx
Junior, W., Binati, R., Felis, G., Slaghenaufi, D., Ugliano, M., & Torriani, S. (2020).
Volatile organic compounds from Starmerella bacillaris to control gray
mold on apples and modulate cider aroma profile. Food Microbiology, 89(1),
103446. https://doi.org/10.1016/j.fm.2020.103446
Kamoun, S., Furzer, O., Jones, J., Judelson, H., Ali, G., Dalio, R. J, Guha, S, Schena, L,
Zambounis, A., Panabières, F., Cahill, D., Ruocco, M., Figueiredo, A., Chen,
X., Hulvey, J., Stam, R., Lamour, K., Gijzen, M., Tyler, B., Grünwald, N, Sha-
hid , M., Tomé, D., Tör, M., Van Den Ackerveken, G., McDowell, J., Daayf,
F., E Fry, W., Lindqvist-Kreuze, H., J. G. Meijer, H., Petre, B., Ristaino, J.,
Yoshida, K., R J Birch, P., & Govers, F. (2015). The Top 10 oomycete patho-
gens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology, 16(4), 413-

434. https://doi.org/10.1111/mpp.12190
Leiva, L. (2018). Manejo fitosanitario del cultivo de la guayaba (Psidium guajava, L.):
medidas para la temporada invernal. ica.
Lemessa, F., & Zeller, W. (2007). Screening rhizobacteria for biological control of
Ralstonia solanacearum in Ethiopia. Biological control, 42(3), 336-344.
https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2007.05.014
Liu, J., Sui, Y., Wisniewski, M., Droby, S., & Liu, Y. (2013). Utilization of antagonistic
yeasts to manage postharvest fungal diseases of fruit. International Journal of
Food Microbiology, 167(2), 153-160. https://10.1016/j.ijfoodmicro.2013.09.004
Locey, K., & Lennon, J. (2016). Scaling laws predict global microbial diversity. Pro-
ceedings of the National Academy of Sciences, 113(21), 5970-5975. https://doi.
org/10.1073/pnas.1521291113
Mansfield, J., Genin, S., Magori, S., Citovsky, V., Sriariyanum, M., Ronald, P., &
Toth, I. (2012). Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant patholo-
gy. Molecular Plant Pathology, 13(6), 614-629. https://doi.org/10.1111/j.1364-
3703.2012.00804.x
Montes, S. (2019). Los cultivos que fueron más rentables en 2019 y a los que se apos-
tará en 2020. https://www.agronegocios.co/agricultura/los-cultivos-que-
fueron-mas-rentables-en-2019-y-a-los-que-se-apostara-en-2020-2945365
Morgan, C., Herman, N., White, P., & Vesey, G. (2006). Preservation of micro-or-
ganisms by drying, a review. Journal of Microbiological Methods, 66(2), 183-
193. https://doi.org/10.1016/j.mimet.2006.02.017
Muller, J. A., Stanton, C., Sybesma, W., Fitzgerald, G. F., & Ross, R. (2010). Recon-
stitution conditions for dried probiotic powders represent a critical step in
determining cell viability. Journal of Applied Microbiology, 108(4), 1369-1379.
doi:10.1111/j.1365-2672.2009.04533.x
Parada, M., & Muñoz, C. (2015). Bioinsumo de uso agrícola: Potencialidades y De-
safío. https://agriculturers.com/bioinsumos-de-uso-agricola-potencialida-
des-y-desafios/
Pérez, J. (2018). Screening of a biological control bacterium to fight avocado diseases:
from agroecosystem to bioreactor. Biocatalysis and Agricultural Biotechnolo-
gy, 14(1), 109-115. https://doi.org/10.1016/j.bcab.2018.02.005
Ren, X., Kong, Q., Wang, H., Yu, T., Zhou, W., & Zheng, X. (2012). Biocontrol of
fungal decay of citrus fruit by Pichia pastoris recombinant strains expressing
cecropin A. Food Chemistry, 131(3), 796-801. https://doi.org/10.1016/j.food-
chem.2011.09.046
Ríos, L., Puentes, Carol., Carabalí, A., Gómez, Y., Becerra, C., & Chávez, L. F. (2019).
Prácticas de manejo sostenible para el cultivo de piña. agrosavia.
Rokem, J., Lantz, A., & Nielsen, J. (2007). Systems biology of antibiotic production
by microorganisms. Natural product reports, 24(6), 1262-1287. https://doi.
org/10.1039/b617765b
Ryan, A., Kinkel, L., & Schottel, J. (2004). Effect of pathogen isolate, potato cultivar,
and antagonist strain on potato scab severity and biological control. Biocon-
trol Science and Technology, 14(3), 301-311. https://doi.org/10.1080/09583150
410001665187
Seem, R. (1984). Disease incidence and severity relationships. Annual Re-
view of Phytopathology, 22(1), 133-150. https://doi.org/10.1146/annurev.
py.22.090184.001025
Tamayo, P. (2001). Enfermedades del cultivo del lulo en Colombia: guía de diagnóstico
y control. agrosavia.
Tan, S., Jiang, Y., Song, S., Huang, J., Ling, N., XU, Y., & Shen, Q. (2013). Two Bacillus
amyloliquefaciens strains isolated using the competitive tomato root enrich-
ment method and their effects on suppressing Ralstonia solanacearum and
promoting tomato plant growth. Crop Protection, 43(1), 134-140. https://doi.
org/10.1016/j.cropro.2012.08.003
Trivedi, P., Pandey, A., & Palni, L. M. S. (2008). In vitro evaluation of antagonistic
properties of Pseudomonas corrugata. Microbiological Research, 163(3), 329-
336. https://doi.org/10.1016/j.micres.2006.06.007
Ventura, R., Bautista, S., Flores, G., & Zavaleta, L. (2018). Impact of chitosan based
edible coatings functionalized with natural compounds on Colletotrichum
fragariae development and the quality of strawberries. Food chemistry,
262(1), 142-149. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2018.04.063
Viterbo, A., Ramot, O., Chernin, L., & Chet, I. (2002). Significance of lytic enzymes
from Trichoderma spp. in the biocontrol of fungal plant pathogens. Antonie
van Leeuwenhoek, 81(1-4), 549-556. https://doi.org/10.1023/A:1020553421740
Wang, S., Ruan, C., Yi, L., Deng, L., Yao, S., & Zeng, K. (2020). Biocontrol ability and
action mechanism of Metschnikowia citriensis against Geotrichum citri-au-
rantii causing sour rot of postharvest citrus fruit. Food Microbiology, 87(1),
103375. https://doi.org/10.1016/j.fm.2019.103375
Wijesinghe, C. J., Wijeratnam, R. W., Samarasekara, J., & Wijesundera, R. (2011).
Development of a formulation of Trichoderma asperellum to control black
rot disease on pineapple caused by (Thielaviopsis paradoxa). Crop Protection,
30(3), 300-306. https://doi.org/10.1016/j.cropro.2010.11.020
Zhang, J., Xie, J., Zhou, Y., Deng, L., Yao, S., & Zeng, K. (2017). Inhibitory effect of
Pichia membranaefaciens and Kloeckera apiculata against Monilinia fructi-
cola and their biocontrol ability of brown rot in postharvest plum. Biological
Control, 114(1), 51-58. https://doi.org/10.1016/j.biocontrol.2017.07.013
143
Capítulo IV
Control de calidad de
la actividad biológica
contra insectos
La evaluación de la actividad biológica es, quizá,

la herramienta más importante en el control de
calidad durante el desarrollo y la producción de un
bioplaguicida, la cual involucra la estandarización
de bioensayos para determinar su eficacia en condi-
ciones controladas teniendo en cuenta la definición
de ciertos criterios.
Además de los controles de calidad microbiológicos

y fisicoquímicos que se deben realizar durante las
diferentes etapas de desarrollo de un bioplaguicida
(incluidos los del producto terminado), se debe
evaluar su actividad biológica en condiciones contro-
ladas mediante el montaje de bioensayos. Debido al
gran número de especies de insectos susceptibles a
varios agentes biológicos de control, las metodolo-
gías de evaluación de su actividad varían considera-
blemente (Lacey, 2017). Por tal razón, estas se deben
diseñar y estandarizar teniendo en cuenta varios
criterios que aseguran la precisión de cada prueba.
Estos incluyen los biológicos (Rasenberg, 2011), de
evaluación, estadísticos y de aseguramiento de los
resultados.
Dentro de los criterios biológicos que se deben tener en cuenta en el control de calidad
de un bioplaguicida se encuentran varios aspectos relacionados con el insecto plaga
y con el agente de control biológico.
Con relación al insecto plaga
Los insectos constituyen el grupo más dominante de la tierra y han establecido una
relación estrecha con el hombre. En algunos casos le han aportado importantes
beneficios al ser humano e, incluso, han ocacionado afecciones en su salud y grandes
pérdidas económicas, como es el caso de las plagas con importancia agrícola (Borror
et al., 1992).
Ante esta gran diversidad es necesario conocer los hábitos de los insectos plaga, los
cuales se relacionan y se determinan por las características de su aparato bucal en
diferentes etapas de desarrollo. Es así como existen insectos con comportamiento
barrenador, los cuales penetran el ápice de la planta y desarrollan su ciclo dentro
de esta de forma total o parcial. Tal es el caso de Diatraea saccharalis (Lepidoptera:
Crambidae), la plaga de mayor importancia económica en el cultivo de la caña
de azúcar. En estado larval, este insecto se alimenta dentro de los tallos y cons-
truye galerías (Vargas & Gómez, 2005). También existen los insectos de hábitos
cortadores en estado larval, como el gusano cogollero del maíz Spodoptera frugi-
perda (Lepidoptera: Noctuidae) (López-Ávila, 1981) y el insecto polífago Erinnyis
ello (Lepidoptera: Sphingidae), conocido comúnmente como “gusano cachón”
(Bellotti et al., 1989). Asimismo, se destacan insectos como Cerotoma tingomariana
(Coleoptera: Chrysomelidae), cuyos adultos se alimentan del follaje y vainas de la
soya y sus larvas de hábitos rizófagos afectan las raíces y su nodulación (León &
Guevara, 2006). Dentro de las plagas con hábito perforador y minador, se destaca
el gusano cogollero del tomate Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae). Las larvas
son capaces de comer todo el mesófilo de la hoja, dejan solo su epidermis; las gale-
rías son superficies más o menos amplias donde a contraluz se puede observar la
larva. Adicionalmente, es capaz de perforar el tallo y generar daños en brotes, sobre
todo en las inserciones de las hojas o pedúnculos y en aquellos más tiernos. Los
frutos pueden ser afectados desde el momento en que comienza el cuajado, antes de
la maduración (Hurtado, 2012). Algunos ejemplos de insectos con hábito chupador
son las moscas blancas Bemisia tabaci y Trialeurodes vaporariorum (Hemiptera:
Aleyrodidae). Estos insectos fitófagos afectan diferentes especies de plantas, entre
Capítulo IV Control de calidad de la actividad biológica contra insectos 145
ellas, herbáceas, arbustos, árboles, plantas silvestres y cultivos de importancia econó-

mica. En ocasiones estos insectos se convierten en un serio problema debido a daños
directos que ocasionan cuando sus ninfas succionan la savia y se convierten en
transmisores de virus. También causan daños indirectos por la excreción de sustan-
cias azucaradas, que ocasiona la formación de fumagina en las hojas (Carapia-Ruiz
& Castillo-Gutiérrez, 2013) (figura 4.1).
a b
Fotos: Carlos Espinel Correal y Lissette Torres Torres
Figura 4.1. Hábitos de insectos plaga. a. S. frugiperda, insecto cortador; b. Tuta absoluta, insecto
perforador y minador; c. T. vaporariorum, insecto chupador.
Además de la identificación de los hábitos del insecto a controlar, es necesario

conocer su ciclo de vida, identificar cada estado de desarrollo, su duración y las
condiciones medioambientales requeridas. La metamorfosis es un proceso de trans-
formación que ocurre en los insectos durante su desarrollo hasta llegar al estado
adulto. Existen insectos que tienen una metamorfosis completa (holometábolos), los
cuales pasan por los estados de larva, pupa y adulto. Las larvas de diferente estadio
usualmente son iguales en forma, pero difieren en tamaño; no tienen ojos, pueden
o no tener patas torácicas y presentan apéndices bucales masticadores. Las alas,
cuando están presentes en los adultos, se desarrollan internamente durante el estado
larval y no emergen sino hasta el final de este estado para transformarse en pupa,
donde el insecto no se alimenta y permanece inactivo hasta convertirse en adulto.
Algunos ejemplos de esta clase de insectos son los lepidópteros y los coleópteros.
Por otra parte, existen los insectos con metamorfosis incompleta (hemimetábolos),
cuyos estados juveniles o iniciales se denominan ninfas y usualmente son muy simi-
lares a los adultos, como es el caso de las moscas blancas y de los ortópteros (Borror
et al., 1992) (figura 4.2).
Larva Larva
Estado 1 Estado 2
Larva
Huevo
CICLO DE VIDA Estado 3
SPODOPTERA
FRUGIPERDA
Larva
Adulto
Estado 4
Larva
Estado 5
Huevo Ninfa 1
CICLO DE VIDA
Adulto MOSCAS BLANCAS Ninfa 2
Fotos: Carlos Espinel Correal
Ninfa 4 Ninfa 3
Figura 4.2. Ciclos de vida de los insectos de acuerdo al tipo de metamorfosis. a. Ciclo
de vida de un insecto holometábolo; b. Ciclo de vida de un insecto hemimetábolo.
Una vez se conozca el ciclo de vida del insecto plaga a controlar, sus estados de desa-
rrollo y su impacto en un cultivo específico, es necesario identificar y definir aquel o
aquellos más susceptibles al agente biológico de control (hongos, bacterias o virus)
a evaluar. Para ello es necesario tener en cuenta los reportes bibliográficos, así como
las observaciones que se hagan en campo o durante el proceso experimental.
Los grupos de hongos más importantes usados para el control de plagas son los
pertenecientes a la división Entomophthoromycota y al orden Hypocreales. A este
último grupo pertenecen los géneros Lecanicillium, Aschersonia, Beauveria, Isaria y
Metarhizium. Dichos géneros afectan diferentes insectos como hemípteros, coleóp-
teros, lepidópteros, ortópteros, formícidos y dípteros en diferentes estados de desa-
rrollo (Lacey, 2017; Marín-Cruz et al., 2017; Malarvannan et al., 2010). Dentro de las
bacterias entomopatógenas se destacan el bacilo grampositivo formador de esporas
Bacillus thuringiensis (Bacillales: Bacillaceae), utilizado para el control de lepidóp-
teros y dípteros y el bacilo gramnegativo no formador de esporas Serratia entomo-
phila (Enterobacteriales: Enterobacteriaceae), utilizado para el control del coleóptero
Costelytra zealandica (Coleoptera: Scarabaeidae) (Lacey, 2017). Con respecto a los
virus entomopatógenos, se encuentran las familias Ascoviridae, Iridoviridae y
Baculoviridae. Esta última es la más numerosa y ampliamente estudiada, con casos
exitosos en el control de lepidópteros, dípteros e himenópteros (Robernann, 2011,
citado por Villamizar et al., 2018).
Otro aspecto muy importante que se debe tener en cuenta para la evaluación de la
actividad biológica de agentes de control, es la facilidad en la consecución de los
insectos blanco en los estados de desarrollo, tiempos, cantidades y frecuencias reque-
ridas. Estos pueden provenir directamente de campo o de crías masivas mantenidas
bajo condiciones controladas. En el primer caso, es necesario mantener a los insectos
recolectados bajo condiciones de cuarentena mínimo una semana antes del montaje
de los bioensayos. De esta manera se garantiza en cierta medida que estos estén libres
de patógenos y enfermedades, con lo cual se reduce el riesgo de obtener resultados
poco confiables. Por otra parte, la cría masiva de insectos ofrece grandes ventajas, no
solo garantiza que estos estén sanos, sino que presenten homogeneidad en sus carac-
terísticas morfológicas, fisiológicas y nutricionales; lo cual es ideal en procesos de
investigación y análisis rutinarios de control de calidad (Jenkins & Grzywacz, 2000).
Sin embargo, cuando la consecución de los insectos blanco es una limitante debido
a la dificultad en su recolección en campo o en el establecimiento de crías, se deben
diseñar y estandarizar metodologías que incluyan el uso de insectos alternos. Estos
deben tener ciclos cortos de desarrollo (Cohen, 2004), deben ser de fácil colecta, se
deben desarrollar en dietas artificiales y las condiciones ambientales para su desa-

rrollo y reproducción deben ser manejables (Portilla & Street, 2006; Cohen, 2004).
Adicionalmente, deben ser susceptibles al agente biocontrolador en cuestión (Sewify
et al., 2014).
Por citar un ejemplo, Cerotoma tingomariana es un insecto plaga de gran impacto

económico en el cultivo de soya. Ante esta problemática, el hongo Beauveria bassiana
(Ascomycota: Cordycipitaceae) se ha convertido en un candidato promisorio para su
control. Sin embargo, debido a que esta plaga está muy asociada al cultivo de soya,
el cual es de carácter rotacional (Valencia & Ligarreto, 2010), no se puede garan-
tizar su consecución permanente y suficiente en los momentos requeridos. Además,
debido a que no hay una dieta artificial disponible para esta especie de crisomélido
que permita su establecimiento en condiciones controladas, para agrosavia surgió
la necesidad de evaluar este agente de control sobre insectos alternos, por lo cual se
seleccionó a Chloridea virescens (Lepidoptera: Noctuidae) (Torres et al., 2020).
Con relación al agente de control
Mecanismos de acción
Los mecanismos de acción del agente de control dependen de su naturaleza, es así

como los hongos entomopatógenos actúan por contacto con su hospedero, mientras
que los virus y las bacterias actúan luego de su ingestión.
La infección natural de un hongo entomopatógeno comienza cuando este entra en

contacto con el insecto al transitar por sustratos colonizados. Posteriormente, las
unidades infectivas (conidios) se adhieren a la superficie de la cutícula del insecto.
Estas germinan y producen el tubo germinal, en cuyo extremo se forma el apresorio.
Mediante presión física y producción de enzimas, este penetra la cutícula del insecto
a través de sus orificios naturales como las partes bucales, las membranas interseg-
mentales, los espiráculos o los sitios donde exista una alta humedad (Ferron, 1978).
Una vez el hongo llega a la hemolinfa del insecto, los cuerpos hifales producen blas-
tosporas para colonizar al hospedero y aprovechar sus nutrientes. Adicionalmente,
secretan proteínas y metabolitos secundarios para evadir la respuesta inmune del
insecto, hasta que este muere por la combinación de tres factores: el daño mecá-
nico, la desnutrición y la acción de metabolitos secundarios o toxinas (Gillespie &
Claydon, 1989). El hongo termina por colonizar el insecto, posteriormente las hifas
emergen de este y se forman células conidiógenas que producen la esporulación
sobre el hospedero si las condiciones son favorables. De esta manera, el hongo se

disemina y permite la posterior infección de otros individuos (Alatorre-Rosas, 2007;
Kachatourians, 1991) (figura 4.3).
Figura 4.3. Esquema del mecanismo de acción de un hongo entomopatógeno.

Fuente: Grupo de Control Biológico de Insectos de agrosavia
Dentro de los virus patógenos de insectos se destaca la familia Baculoviridae,

que se caracteriza por tener una molécula de adn circular envuelta en una capa
de proteínas llamada nucleocápside, que junto con otros componentes proteicos
forman el virión (partícula infectiva). Los viriones tienen forma de bastón y están
inmersos en una matriz proteica que forma el cuerpo de inclusión (ci) (Erlandson,
2009). Estos últimos pueden ser de forma poliédrica o irregular y están constituidos
por una matriz proteica de poliedrina, principalmente. Asimismo, poseen múltiples
viriones que, a su vez, pueden contener una o varias nucleocápsides como los
Nucleopoliedrovirus. Por otra parte, los Granulovirus se caracterizan por su forma
granular y los cuerpos de inclusión pequeños, constituidos por una proteína mayo-
ritaria denominada granulina (Caballero et al., 2001) (figura 4.4).
NUCLEOPOLIEDROVIRUS GRANULOVIRUS
Virión
Nucleocápside
ADN
Cuerpo de inclusión
Fotos: Gloria Barrera Cubillos

Virión simple
Virión múltiple Virión simple
Figura 4.4. Estructura de un nucleopoliedrovirus y un granulovirus.

Fuente: Elaboración propia con base en Barrera (2013)
El ciclo de infección de los baculovirus inicia cuando los cuerpos de inclusión son
consumidos por las larvas del insecto blanco. Posteriormente, estos se disuelven en el
intestino medio del insecto debido a su pH alcalino, donde se solubilizan las proteínas
y se liberan los viriones que atraviesan la membrana peritrófica del intestino. Estos
se fusionan con las microvellosidades de las células epiteliales e ingresan posterior-
mente a las células, donde liberan sus nucleocápsides (infección primaria), las cuales
se dirigen hacia el núcleo donde se produce la transcripción genética y originan una
nueva progenie viral (Rohrmann, 2013; Caballero et al., 2001). Las nuevas nucleo-
cápsides atraviesan la membrana celular y adquieren de esta una envoltura, para
luego brotar al exterior de la célula en forma de viriones brotados (infección secun-
daria). Estos viriones circulan por la hemolinfa e infectan otros tejidos y órganos.
Hacia el final de la infección, se da la oclusión o encapsulación de las nucleocáp-
sides en una matriz proteica de poliedrina o granulina para formar nuevamente los
cuerpos de inclusión. Finalmente, la larva muere y se puede presentar la ruptura de
su tegumento, con lo cual se liberan los cuerpos de inclusión e inicia un nuevo ciclo
de infección (Rohrmann, 2013; Villamizar, 2018) (figura 4.5).
1 Ingestión de los
cuerpos de inclusión
(CI) por el hospedero
Disolución de los CI por el Cuerpos de inclusión

2 pH alcalino del intestino
medio. Se liberan los
viriones y atraviesan la
membrana peritrófica La larva muere y el tegumento
6 se rompe, liberando los
Membrana peritrófica Viriones nuevos CI para iniciar un
nuevo ciclo de infección
Los viriones liberan las Célula epitelial
nuclocápsides (NC), que
3 se fusionan con la
Envoltura e inclusión
membrana de las células
epiteliales del intestino y
B
las infectan (infecciónLibération de
l’ADN viral
primaria)
Liberación del
ADN viral
Cuerpos de
Bourgeonnement inclusión
Las NC se replican en el précoce
núcleo y salen de las células
Brotamiento
4 en forma de viriones brotados
para infectar otras células,
Viriones
brotados
Endocitosis
Formación de nuevos CI
transportándose a través de Célula 5 dentro del núcleo de las
las células traqueanas traqueana células invadidas
(infección secundaria)
Figura 4.5. Ciclo de infección de los baculovirus.

Fuente: Elaboración propia con base en Espinel-Correal (2010)
Dentro de las bacterias entomopatógenas, se destacan las grampositivas, las cuales

tienen la capacidad de formar esporas de resistencia frente a condiciones adversas.
Adicionalmente, son capaces de producir toxinas que destruyen el epitelio intestinal
para favorecer el paso de la bacteria a la hemolinfa, donde se divide y esporula, lo
cual provoca septicemia y la muerte del insecto. Tal es el caso de Bacillus thurin-
giensis (Bacillaceae: Bacillus), cuyas cepas, en su gran mayoría, son capaces de
producir cristales proteicos parasporales. Estos están compuestos por una o varias
toxinas (δ endotoxinas como las toxinas Cry y las Cyt) que tienen efecto letal sobre
lepidópteros, dípteros y coleópteros, así como sobre ácaros, nematodos y protozoos
(Jisha et al., 2013).
El mecanismo de acción inicia cuando el insecto ingiere el cristal, cuyas toxinas Cry
se expresan como protoxinas. Posteriormente, estas se someten a un proceso proteo-
lítico en el intestino del insecto debido a sus condiciones alcalinas, lo cual produce
la liberación de la toxina activada. Se ha reportado que tanto las protoxinas como
las toxinas activas, son capaces de interactuar con los receptores intestinales de la
membrana apical del epitelio del intestino medio, asunto que favorece el proceso
de oligomerización y la formación de poros (Soberon et al., 2016). Finalmente, se
genera la muerte celular por una interacción entre el flujo de iones de la toxina Cry
y el agua (impacto osmótico) (Endo et al., citado por Grijalba et al., 2018). La muerte
de las células del intestino produce una desintegración del epitelio, lo cual permite la
entrada de las bacterias a la hemolinfa y causa la muerte del insecto por septicemia
(Raymond et al., citado por Grijalba, 2018) (figura 4.6).
Protoxina
Espora Epitelio
Cristal
Receptor
Endotoxina Perforación de la
Toxina activada membrana
Protoxina Toxina intestinal
Figura 4.6. Ciclo de infección de Bacillus thuringiensis.

Estructuras de infección y su formulación
El desarrollo de un micoplaguicida involucra la producción masiva y la formula-

ción de propágulos infectivos que pueden incluir conidios, blastosporas, micelio
y microesclerocios, cuya selección debe tener en cuenta diferentes factores. Estos
involucran el uso que se tiene proyectado del inóculo en cuestión, su virulencia,
su tolerancia a la desecación, su tolerancia térmica, su velocidad de germinación
e infección, su estabilidad a las condiciones ambientales, su reproducción y tole-
rancia a los rayos uv, así como otros factores inherentes al hongo seleccionado que lo
produce, como es el caso de su estabilidad genética (Lacey, 2017).
Los conidios aéreos son producidos principalmente en sustratos sólidos de fermen-

tación, donde se da una colonización fúngica sobre un sustrato nutritivo sólido y
estéril (López-Pérez et al., 2015). Este, generalmente, está constituido por granos de
cereales (arroz, cebada, centeno, trigo, maíz) que favorecen el crecimiento vegetativo
y la esporulación del hongo. Otro tipo de fermentación es la líquida, la cual incluye
dos categorías: la fermentación líquida sumergida, en la cual el hongo se sumerge en
un medio líquido aireado con agitación constante para la obtención de blastosporas,

conidos sumergidos (formados por conidiación microcíclica a partir de blastos-
poras) y microesclerocios. Por otra parte, está la fermentación líquida estacionaria,
de la cual se obtienen el micelio y los conidios aéreos (Lacey, 2017).
Las formulaciones de bioplaguicidas deben cumplir con una serie de requisitos que
garanticen su eficacia. Los propágulos infectivos deben mantenerse inactivos pero
vivos durante su almacenamiento antes de su uso y luego de su aplicación sobre el
sustrato tratado (suelo, material vegetal e infraestructura). Estos deben suspenderse
fácilmente en un vehículo principalmente acuoso y su comportamiento y actividad
no deben afectarse por los adyuvantes (excipientes de formulación) ni por las condi-
ciones ambientales a las cuales están expuestos (Lacey, 2017).
Los propágulos fúngicos deben ser incorporados dentro de la formulación con agentes
humectantes y de suspensión, dispersantes, antiespumantes, emulsificantes y asper-
jantes. Teniendo en cuenta el uso del bioplaguicida, se pueden desarrollar formu-
laciones acuosas, oleosas como las suspensiones emulsificables (od) o sólidas que
incluyen granulados (g), granulados dispersables en agua (wdg), polvos de contacto
(cp), polvos humectables (wp), cebos y espumas (Lacey, 2017) (ver capítulo 2).
La producción masiva de baculovirus se realiza in vivo, principalmente, infectando

de manera artificial el insecto blanco y posteriormente aislando y purificando los
cuerpos de inclusión para su formulación. Otra metodología alterna de producción
es el uso de líneas celulares específicas de insectos, la cual es costosa, riesgosa y
no siempre exitosa (Lacey, 2012). La mayoría de los bioplaguicidas a base de bacu-
lovirus son formulaciones líquidas constituidas como suspensiones concentradas.
Sin embargo, las formulaciones sólidas pueden ser aplicadas en seco como polvos o
pueden ser asperjadas en agua como polvos humectables o granulados. La aplicación
de polvo es poco común y se usa, generalmente, para la aplicación en postcosecha o
en productos almacenados; tal es el caso del granulovirus de Phthorimaea operculella
PhopGV para el control de la polilla guatemalteca Tecia solanivora (Lepidoptera:
Gelechiidae) (Lacey, 2017; Gómez et al., 2009).
Asimismo, la producción de bacterias entomopatógenas también puede realizarse in

vivo, mediante la inoculación de insectos sanos. Tal es el caso del bacilo Paenibacillus
popilliae (Bacillales: Paenibacillaceae) para el control del escarabajo japonés Popillia
japonica (Coleoptera: Ritelidae), en el cual larvas sanas son inyectadas con una
suspensión del patógeno para la posterior obtención de esporas (Fleming, 1968;
citado por Lacey, 2017). Adicionalmente, también se pueden obtener propágulos

bacterianos (expresados como número de ufc o concentración de esporas o cris-
tales) mediante su producción sobre sustratos sólidos de fermentación o fermenta-
ción líquida. Este último es el método de producción masiva más común de bacterias
para el desarrollo de bioplaguicidas (Lacey, 2017).
Concentración de aplicación
Para el control de calidad de la actividad biológica de un agente microbiano (morta-

lidad), es necesario tener en cuenta la concentración de la aplicación recomendada
por el fabricante. Esta se determina con antelación mediante estudios de la concen-
tración y el tiempo letal medio, principalmente (CL50 y TL50).
Las concentraciones de los bioplaguicidas, generalmente, se expresan como estruc-

turas de infección (conidos, esporas, blastosporas, células, cuerpos de inclusión,
entre otros) por unidad de masa (gramo o kilogramo) o de volumen (mililitro o
litro). Es así como a partir de la concentración del producto se debe ajustar la concen-
tración de la aplicación recomendada mediante la realización de diluciones seriadas
utilizando diferentes diluyentes como agua, fosfato tampón, solución salina o Tween
(Lacey, 2012).
Generalmente, se realizan diluciones decimales (1/10). Para ello se añade 1 ml o 1 g

de la muestra (bioplaguicida) a 9 ml de diluyente (ecuación 4.1) (ver capítulo 1).
1 1 ml o g dela muestra 1
Dilución = 10 ml de dilución o10 −1
10 1 ml o g dela muestra + 9 ml de diluyente 10
Ecuación 4.1. Cálculo de la dilución 1/10 (Arana et al., s. f.)
Criterios de evaluación
Una vez reconocidos los criterios biológicos mencionados anteriormente, es nece-

sario definir las condiciones en las cuales se va a realizar el bioensayo de evaluación
de la actividad biológica del bioplaguicida, las cuales incluyen las condiciones físicas
y ambientales, los sistemas de aplicación, el montaje de la unidad experimental, la
identificación de los síntomas y signos de infección y los materiales de referencia.
Condiciones físicas y ambientales
Dependiendo de las características del ensayo, así como de los componentes a

evaluar en el control de calidad del bioplaguicida en cuestión, este se puede realizar
en condiciones de laboratorio o bajo condiciones de invernadero. En ambos casos, se
deben controlar las condiciones que puedan influir negativamente en los resultados
e identificar con antelación los riesgos potenciales.
Dentro de las condiciones que requieren especial control están la temperatura, la

humedad o el fotoperiodo, las cuales se deben ajustar de manera previa al montaje
del bioensayo. Posteriormente, se debe hacer su seguimiento durante todo el tiempo
que dure la evaluación mediante el registro diario mínimo en la mañana y en la tarde
de tales condiciones.
La definición de los rangos para cada una de las condiciones ambientales requeridas
dependerá de lo reportado en la literatura y de las observaciones experimentales
realizadas durante el proceso de estandarización de la metodología. Adicionalmente,
el cumplimiento de los rangos establecidos determinará la aceptación o el rechazo de
la evaluación, en caso de considerarse críticos.
Sistemas de aplicación
Existen dos sistemas de aplicación del agente de control sobre el insecto blanco:
el directo y el indirecto. En el primero, la aplicación se realiza sobre o dentro del
insecto y en el segundo sobre el sustrato de alimentación.
La aplicación directa se puede realizar mediante la aspersión de una suspensión del

agente de control sobre el insecto a la concentración indicada, mediante un atomi-
zador, aerógrafo o nebulizador. En este caso es necesario establecer con antelación
la distancia, la presión (si aplica), el volumen y la cobertura de la aplicación para
garantizar que esta sea suficiente, homogénea y no afecte negativamente al insecto o
incluso su alimento (figura 4.7).
Fotos: Fotos: Lissette Torres Torres

a b
Figura 4.7. Aplicación directa por aspersión del agente de control sobre el insecto blanco. a. Aspersión
con atomizador de Beauveria bassiana (Ascomycota: Cordycipitaceae) sobre adultos de Cerotoma tingo-
mariana (Coleoptera: Chrysomelidae); b. Aspersión con aerógrafo de Lecanicillium lecanii (Ascomycota:
Cordycipitaceae) sobre ninfas de Trialeurodes vaporariorum (Hemiptera: Aleyrodidae).
Por otra parte, está la aplicación por inmersión, en la cual y, como su nombre lo
indica, el insecto se sumerge en un volumen específico de la suspensión del agente de
control por un tiempo determinado, de tal manera que se garantice la adherencia de
los propágulos infectivos al cuerpo del insecto tratado, así como la supervivencia de
éste luego de su inmersión. En este tipo de aplicación, se debe definir con precisión
el estado de desarrollo indicado, de tal forma que sea susceptible al agente de control
pero no al método de aplicación (figura 4.8).
Otra forma de aplicación directa es la que se hace de manera tópica sobre una parte
específica del cuerpo del insecto. Tal es el caso de la metodología reportada por
Espinel-Correal et al. (1998) para evaluar la actividad biocontroladora de M. anisopliae
sobre ninfas y adultos de la langosta llanera Rhammatocerus schistocercoides (Rehn)
(Orthoptera: Acrididae), en la cual se aplican 20 µl de una suspensión del hongo ento-
mopatógeno sobre el pronoto del insecto con una micropipeta (figura 4.9).
Fotos: Fotos: Lissette Torres Torres

Figura 4.8. Aplicación directa por inmersión de larvas de Diatraea saccharalis
de seis días de edad en una suspensión de conidios de Metarhizium anisopliae
(Ascomycota: Clavicipitaceae).
Foto: Carlos Espinel Correal
Figura 4.9. Aplicación M. anisopliae sobre el pronoto

de una ninfa de R. schistocercoides.
Una forma directa de evaluar la actividad biológica de virus entomopatógenos es

mediante su ingestión. Según reportes de diferentes autores, una suspensión viral
se puede mezclar con una solución de sacarosa y colorante azul de alimentos; de
esta manera es posible evidenciar de manera visual la ingestión del virus debido a
la pigmentación que adquiere la larva luego de beberla. Un ejemplo de esta metodo-
logía es la reportada por Hughes & Wood (1980), cuando evaluaron tres aislamientos
del nucleopoliedrovirus de Autographa californica y uno del nucleopoliedrovirus de
Heliothis zea sobre larvas de Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae) y Helicoverpa
zea (Lepidoptera: Noctuidae). Por otra parte, Gómez et al. (2010) utilizaron esta
misma metodología para evaluar el nucleopoliedrovirus de Spodoptera frugiperda
(SfNPV) sobre larvas neonatas de Spodoptera frugiperda (figura 4.10).
Figura 4.10. Ingestión de la suspensión viral de una larva neonata de S. frugiperda.
La inyección directa del agente de control dentro del cuerpo del insecto es otra
forma de aplicación que, si bien no es muy usada en el control de calidad rutinario
de agentes biológicos de control, se lleva a cabo en la producción masiva, especial-
mente de bacterias entomopatógenas. Dutky (1942) citado por Koppenhöfer et al.
(2012), reportó un método en el cual una suspensión de esporas del bacilo P. popilliae
de concentración conocida, es inyectada en larvas de P. japonica. Para ello se usa
una jeringa hipodérmica con una aguja de calibre 27-30, acoplada a un sistema de
microinyección manual o motorizado, que inyecta la suspensión en la región dorsal
del insecto entre el segundo y tercer segmento abdominal posterior. Se debe prestar
especial atención a que la aguja entre horizontalmente para evitar perforar el intes-
tino (figura 4.11).
Figura 4.11. Aplicación del agente de control por inyección directa.

Por otra parte, esta misma metodología de aplicación se ha utilizado como alter-
nativa a los cultivos celulares de insectos en biorreactores para producir proteínas
recombinantes a partir de larvas infectadas con vectores derivados de nucleopo-
liedrovirus múltiples. Tal es el caso del nucleopoliedrovirus de Autographa cali-
fornica (AcMNPV) sobre Trichoplusia ni, cuyas larvas pueden ser inyectadas con
vectores de baculovirus negativos a la poliedrina (Polh -) debido a la falta de la infec-
tividad oral de estos virus (Guijarro-Pardo et al., 2017).
La aplicación indirecta del agente de control generalmente se hace asperjando una

suspensión o espolvoreando una formulación sólida (especialmente polvos) de este
sobre el sustrato de alimentación, que puede ser dieta natural o artificial. Por citar
algunos casos, está la aspersión con atomizador de suspensiones virales sobre hojas
de yuca para evaluar la actividad biocontroladora de un granulovirus sobre larvas
del gusano cachón E. ello (Barrera et al. 2014). Así como también la aspersión con
nebulizador del granulovirus de Phthorimaea operculella (PhopGV) sobre hojas
de tomate Solanum lycopersicum (Solanales: Solanaceae) para evaluar su actividad
biológica sobre larvas de T. absoluta (Gómez et al., 2017) (figura 4.12).
Taparrosca
Codo
Dispositivo
portador
de líquidos
Tubo

Manguera
Nebulizador
a b
Figura 4.12. Aplicación por aspersión de un agente biológico. a. Equipo de nebulización para la apli-
cación suspensiones a base de baculovirus; b. Aspersión del Granulovirus de Phthorimaea operculella
PhopGV sobre hojas de tomate.
Un método para pulverizaciones de precisión de suspensiones de agentes de control

consiste en la utilización de la torre de Potter, la cual garantiza una aplicación homo-
génea y constante por intervalos específicos de tiempo. Este mismo método también
se usa en la aplicación directa sobre el insecto o sobre lotes de estos (Paramasivam
& Selvi, 2017).
Por otra parte, la aplicación de productos sólidos sobre el sustrato de alimenta-

ción usualmente se realiza de manera directa, a través del espolvoreo y la poste-
rior mezcla hasta evidenciar su adherencia al sustrato. Un ejemplo, es la aplicación
del bioplaguicida formulado como polvo a base del granulovirus de Phthorimaea
operculella (PhopGV) para el control de la polilla guatemalteca Tecia solanivora. El
bioplaguicida se aplica sobre tubérculos de papa almacenados como semilla (figura
4.13). Según la metodología reportada por Cuartas et al. (2009), se pesaron tres
tubérculos de papa criolla, Solanum phureja (Solanales: Solanaceae) y se ubicaron
en una bolsa plástica que contenía el producto formulado según la dosis comercial
(5 g de bioplguicida/kg de papa; producto a base de baculovirus con Registro ICA
No. 5416). Posteriormente, las bolsas se cerraron y se agitaron hasta que los tubér-
culos quedaron cubiertos con el producto. Cada tubérculo se ubicó de manera indi-
vidual dentro de un recipiente y se infestó con 15 larvas neonatas de T. solanivora.
Transcurridos 20 días se determinó su mortalidad.

a b
Figura 4.13. Tubérculos de papa - semilla. a. Tubérculos de papa sin inocular; b. Tubérculos de papa
inoculados con el producto a base del granulovirus de Phthorimaea operculella (PhopGV) para el
control de la polilla guatemalteca Tecia solanivora.
Montaje de la unidad experimental
La unidad experimental es la unidad sobre la cual se aplica un tratamiento (Lacey,

2012). En el caso particular de los bioensayos en los cuales se pretende determinar la
actividad biológica de un agente de control, la unidad experimental corresponde al
individuo o grupo de individuos sometidos o no (en el caso del tratamiento corres-
pondiente al testigo absoluto) a una intervención de manera planeada para evaluar
posteriormente su respuesta.
En el momento de establecer la unidad experimental en la realización de un bioen-

sayo, se deben definir con antelación los tratamientos a evaluar, el número de
réplicas e individuos, el sistema de confinamiento (recipientes, materas, jaulas, entre
otros), así como el sustrato de alimentación y demás requerimientos para garantizar
la supervivencia de los individuos del testigo absoluto durante el tiempo que dure la
evaluación (ejemplos 1 y 2).
Ejemplo 1
En un bioensayo para determinar la actividad biocontroladora de un producto a base

de B. bassiana sobre D. saccharalis, se inoculan larvas de seis días de edad mediante
inmersión durante 20 segundos en una suspensión del hongo a la concentración
de 1 × 107 conidos.ml-1. Posteriormente, estas se ubican de manera individual en
recipientes plásticos de 0,5 oz con tapa, los cuales contienen un trozo de papel y un
grano de maíz tierno para su alimentación (unidad experimental). Se evalúan tres
réplicas por tratamiento, incluido un tratamiento control (testigo absoluto) en el cual
las larvas no se someten a ninguna inmersión. Cada réplica está conformada por 15
unidades experimentales (figura 4.14).
Diatraea saccharalis
(Larvas de seis días) Dos tratamientos:
• Testigo absoluto
• Evaluación del agente de control
Tres réplicas / Tratamiento
Réplica: 15 unidades experimentales
Unidad experimental
Una larva (inoculada/no inoculada)
Recipiente plástico de 0,5 onzas con un individuo

Inmersión/20 segundos Grano de maíz tierno
Trozo de papel
B. bassiana
Concentración: 1x 107 conidios.ml-1
Figura 4.14. Montaje de la unidad experimental de un ensayo de evaluación de la

actividad biocontroladora de B. bassiana sobre D. saccharalis.
Ejemplo 2
En un bioensayo para determinar la actividad biocontroladora de un producto a

base de Metarhizium anisopliae sobre Rhammatocerus schistocercoides, se inoculan
ninfas mediante aplicación tópica de 20 µl de una suspensión del hongo a la concen-
tración de 1 × 107 conidos.ml-1 entre el pronoto y el primer tergo. Posteriormente,
se ubican 15 insectos inoculados dentro de una jaula, la cual dispone de un plato
plástico con 30 g de algodón humedecido con agua y dos vasos plásticos, cada uno
con 165 g de pasto kikuyo y agua para mantenerlo fresco (unidad experimental).
Se evalúan tres réplicas por tratamiento, incluido un tratamiento control (testigo

absoluto). Cada réplica o unidad experimental, en este caso, está conformada por 15
individuos (figura 4.15).
Rhammatocerus schistocercoides Dos tratamientos:

(Ninfas de quinto instar) • Testigo absoluto
• Evaluación del agente de
control
Tres réplicas / Tratamiento
Réplica o unidad experimental:
Una jaula con 15 ninfas
Unidad experimental
15 ninfas (inoculadas/no inoculadas)
Jaula entomológica
Fotos: Carlos Espinel Correal

Vasos con pasto kikuyo
Plato con algodón humedecido
Aplicación tópica (20 µ𝐥𝐥𝐥𝐥)
M. anisopliae
Concentración: 1x 107 conidios.ml-1
Figura 4.15. Montaje de la unidad experimental de un ensayo de evaluación de la

actividad biocontroladora de M. anisopliae sobre R. schistocercoides.
Identificación de síntomas y signos de infección
De manera general, los síntomas ocasionados por la infección de hongos, bacterias

y virus entomopatógenos son similares y están asociados con el cese de la inges-
tión, disminución en el tamaño y peso de los insectos infectados con respecto a los
sanos, disfunción en el intestino y el tejido muscular generando vómito y diarrea,
parálisis celular que puede ser general en todo el cuerpo y la muerte (Aronson et
al., 1986; Caballero et al., 2001; Kachatourians, 1991; Lacey, 2012). Sin embargo, los
signos pueden cambiar dependiendo del agente de control, por ejemplo, los insectos
muertos por hongos entomopatógenos pueden presentar crecimiento micelial y
esporulación si las condiciones ambientales son favorables. Las hifas emergen del
insecto y ocurre la esporulación sobre su superficie, lo cual contribuye a la disemina-
ción del hongo y a la posterior infección de otros individuos (Alatorre-Rosas, 2007)
(figura 4.16).
a b
Fotos: Carlos Espinel Correal y Lissette Torres Torres

c d
Figura 4.16. Infecciones características de hongos entomopatógenos. a. B. bassiana sobre

larva de D. saccharalis; b. B. bassiana sobre Gonipterus platensis (Coleoptera: Curculionidae);
c. M. anisopliae sobre ninfa de R. schistocercoides; d. L. lecanii sobre ninfa de T. vaporariorum.
En el caso de B. thuringiensis, es posible observar la melanización defensiva a nivel

del mesenterón, que aparece ahí para tratar de contrarrestar la invasión de las bacte-
rias presentes en el intestino del insecto. Este es el caso del gusano cuerno del tabaco
Manduca sexta (Lepidoptera: Bombycoidea) (en larvas de primer estadio de desa-
rrollo) (Grijalba et al., 2018). Por otra parte, cadáveres de insectos infectados con la
bacteria gramnegativa Serratia marcescens (Enterobacteriales: Enterobacteriaceae),
se caracterizan por presentar una coloración rojiza debido a la producción del
pigmento denominado prodigiosina (Ruiz-Sánchez et al., 2003). Precisamente, los
primeros registros de Serratia sp. como patógeno de insectos se realizaron a partir
de cadáveres de gusanos de seda Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae) que
tenían una coloración de estas características (Steinhaus, 1941; citado por Grijalba
et al., 2018).
Con respecto a los insectos infectados con baculovirus, se evidencian cambios en la

coloración del tegumento y licuefacción de los tejidos, cuyos cuerpos se convierten
en bolsas llenas de virus. Tal es el caso del granulovirus de las larvas del gusano
cachón de yuca, Erinnyis ello (EeGV), plaga con amplia distribución en zonas tropi-
cales y subtropicales. Esta plaga afecta a plantas con importancia económica como
el tomate, el caucho, la yuca, el tabaco, la papaya y el algodón (Pratissoli et al., 2002
citado por Villamizar et al., 2018) (figura 4.17).
Foto: Grupo de Investigación Control Biológico de agrosavia
Figura 4.17. Larva de E. ello infectada por el granulovirus de Erinnyis ello EeGV.
Larvas de T. solanivora infectadas con el granulovirus de Phthorimaea operculella

(PhopGV) presentan una coloración blanca y pérdida de turgencia corporal debido
a la desintegración de tejidos y órganos (Caballero et al., 2001; Quiroga et al., 2011)
(figura 4.18).

Figura 4.18. Larvas de T. solanivora de tercer ínstar, sana e infecta-
das con el granulovirus de Phthorimaea operculella (PhopGV).
Por otra parte, larvas de T. absoluta infectadas con el granulovirus de Phthorimaea

operculella (PhopGV) presentan cambio en el color del tegumento de verde a blanco
brillante o amarillo, con marcación de los segmentos corporales. Las pupas presentan
deformaciones y pérdida de turgencia (Gómez et al., 2017) (figura 4.19).
a b
Fotos: Carlos Espinel Correal Y Lissette Torres Torres
Figura 4.19. Diferencias entre larvas de T. absoluta sanas e infectadas

por baculovirus. a y b. Sintomatología de larvas infectadas; c. Larva sana.
Una estrategia para el aseguramiento en la calidad de los bioensayos es la evaluación

adicional de un material de referencia. Este corresponde al agente de control bioló-
gico con el cual se establece y estandariza el protocolo de evaluación de su actividad
contra un insecto blanco o un insecto alterno. Cuando se requiere analizar una
muestra (bioplaguicida o principio activo sin formular) es necesario evaluar como
control positivo el material de referencia, al mismo tiempo y en las mismas condi-
ciones. De esta manera su comportamiento y los datos de mortalidad obtenidos se
convierten en un parámetro de aceptación o rechazo del bioensayo de evaluación.
El material de referencia debe estar debidamente identificado y caracterizado,

incluidos los aspectos de tipo morfológico, biológico, bioquímico, genético y mole-
cular. Por otra parte y para garantizar la preservación de todas estas características
en el tiempo (incluso su potencial biocontrolador), se debe mantener una colección
suficiente y debidamente conservada. Para ello se pueden implementar métodos de
conservación a largo plazo como la crioconservación a ultrabajas temperaturas y
la liofilización (Lacey, 2012). Una vez el material biológico sea conservado, se debe
definir la metodología necesaria para su reactivación, ya sea en medios de cultivo
específicos o sobre el mismo insecto. Así se garantiza que su actividad biológica
sea similar a la obtenida en el proceso de estandarización de la metodología de
evaluación.
Por citar un ejemplo, el aislamiento Bv060 de B. bassiana es utilizado como prin-

cipio activo de un bioplaguicida desarrollado como suspensión oleosa para el control
de adultos de Cerotoma tingomariana. Para la estandarización de la metodología
relacionada con la evaluación de su actividad biológica, se hizo un estudio de repe-
tibilidad (r), reproducibilidad (R) y la relación entre estos dos parámetros (r&R)
usando el aislamiento sin formular (ver capítulo 5). La metodología resultó ser repe-
tible y reproducible y permitió definir entre los parámetros de aceptación (bioen-
sayo válido) un porcentaje de eficacia superior al 80 %. De esta forma, al evaluar
otro agente de control dentro de un análisis de calidad sobre este insecto y bajo el
mismo protocolo y condiciones de estandarización, se incluye el aislamiento Bv060
como material de referencia. Es decir, el bioensayo debe incluir tres tratamientos:
un testigo absoluto, la muestra por analizar y el correspondiente a la evaluación del
material de referencia (figura 4.20).
Tratamientos
Foto: Carlos Espinel Correal, Lorena García Riaño y Lissette Torres Torres
Testigo absoluto
Insecto blanco
Muestra por analizar

Concentrado emulsionable
Aislamiento Bv060 Cerotoma tingomariana
Beauveria bassiana
Porcentaje de eficacia > 80 %

Parámetro aceptado
(validez del bioensayo)
Figura 4.20. Evaluación del material de referencia en el control de calidad de una

muestra a base de B. bassiana para el control de adultos de C. tingomariana.
Caso de estudio
El siguiente caso de estudio corresponde a los resultados del control de calidad

obtenidos de una muestra analizada por agrosavia en el Centro de Investigación
Tibaitatá. Para ello y siguiendo lo establecido en un protocolo previamente estan-
darizado, se determinó la actividad biológica (mortalidad) de un bioplaguicida a
base de Lecanicillium lecanii sobre ninfas en segundo estadio de T. vaporariorum
mediante la realización de un bioensayo bajo condiciones de invernadero con un
diseño experimental completamente al azar. En dicho bioensayo se evaluaron tres
tratamientos: uno correspondiente a un testigo absoluto y los otros dos relativos a
la aplicación del agente microbiano (material de referencia y la muestra por evaluar)
sobre ninfas en segundo estadio mantenidas en foliolos de fríjol Phaseolus vulgaris
(Fabales: Fabaceae). Las ninfas se infectaron al estar en contacto con el hongo ento-
mopatógeno; presentaron síntomas relacionados con una coloración amarilla y una
pérdida de turgencia o aplastamiento.
Para la evaluación de la actividad biológica se definieron los siguientes criterios:

• Insecto plaga: ninfas en segundo estadio de mosca blanca (Hemiptera:

Aleyrodidae), Trialeurodes vaporariorum y plantas de fríjol bola roja provenientes
de la Unidad de Crías del Laboratorio de Entomología de agrosavia del Centro
de Investigación Tibaitatá.
• Agente de control: hongo entomopatógeno Lecanicillium lecanii (Zimm.) Zare

& W. Gams (Ascomycota: Cordycipitaceae) (muestra por analizar y material de
referencia).
• Condiciones físicas y ambientales: bioensayo montado en condiciones de inver-

nadero con una temperatura entre 15 ºC y 35 ºC y una humedad relativa entre el
16 % y el 85 %.
• Sistema de aplicación: directa, mediante aspersión con aerógrafo sobre ninfas de

segundo estadio.
• Montaje de la unidad experimental: un foliolo de fríjol variedad bola roja infes-

tado con ninfas de segundo estadio.
• Síntomas y signos de la infección: se evidencian por una coloración amarilla

de las ninfas, por una pérdida de turgencia o aplastamiento y por el crecimiento
micelial y esporulación del hongo sobre el cuerpo del insecto de coloración blanca.
• Material de referencia: aislamiento Vl026 de L. lecanii.
Criterios para el aseguramiento de los resultados
• Parámetros de aceptación: la mortalidad en el testigo absoluto no debe ser

mayor al 20 %. El coeficiente de variación entre las réplicas de un mismo trata-
miento debe ser menor al 30 %. El material de referencia (aislamiento Vl026) de
L. lecanii debe alcanzar un porcentaje de eficacia superior al 80 %. El bioensayo
se debe realizar bajo las condiciones de temperatura y humedad establecidas y
descritas anteriormente.
Criterios estadísticos
• Tratamientos: la muestra por analizar (producto comercial), el material de refe-

rencia como control positivo (aislamiento Vl026) y un testigo absoluto.
• Número de réplicas: se evalúan tres réplicas por tratamiento y cada foliolo infes-
tado corresponde a una réplica.
• Unidades experimentales: un foliolo de fríjol infestado con ninfas en segundo

estadio. El número de individuos no fue el mismo por cada unidad experimental,
este se cuantificó dentro de un área determinada por el diámetro de la jaula pinza
(4cm2), según la metodología establecida.
• Diseño experimental: diseño experimental completamente al azar (dca).
• Variable respuesta: porcentaje de eficacia.
La metodología desarrollada se describe a continuación:
Semillas de fríjol de la variedad ica-Calima se sembraron en materas No. 20. Una

vez emergieron las plantas y estas tuvieron mínimo dos trifolios formados, se llevó
a cabo su infestación con adultos de T. vaporariorum. Para ello, 30 insectos se
ubicaron dentro de una jaula pinza dispuesta en un foliolo para favorecer su oviposi-
ción (figura 4.21) y trascurridas 48 horas se llevó a cabo su desinfestación mediante
la recolección de los adultos con un aspirador bucal.
Una vez se observó la presencia de ninfas de segundo instar, se realizó su conteo en

cada foliolo infestado y se llevó cabo su identificación (tres foliolos por tratamiento).
Posteriormente, se aplicó una suspensión del agente de control (muestra y material
de referencia) ajustada a la concentración de 1×107 conidios.ml-1 en Tween 80 al 0,1
%. Para ello, se hicieron aspersiones sobre el envés de cada foliolo infestado haciendo
dos disparos (600 µl) a 30 psi con ayuda de un aerógrafo a una distancia aproximada
de 20 cm. Adicionalmente, se evaluó un testigo absoluto.
Montaje general
Fotos: Carlos Espinel Correal y Lissette Torres Torre

Orificio de
entrada
Soporte
b
a
Figura 4.21. Evaluación biológica de Lecanicillium lecanii sobre mosca blanca. a. Montaje general de
la jaula pinza en la matera, para la infestación con los adultos de T. vaporariorum; b. Infestación de
foliolos de fríjol con adultos de mosca blanca.
Las ninfas se revisaron cada tres días hasta que estas alcanzaron el cuarto instar o
hasta que se evidenció la presencia de exuvias en el testigo absoluto (indicador de
la emergencia de adultos). Se realizó el conteo de estas, así como el de los insectos
vivos y muertos sobre cada foliolo de cada tratamiento. Posteriormente se calculó el
porcentaje de eficacia mediante la fórmula de Schneider-Orelli:
 (b − k ) 
Eficacia ( % ) =  *100
 (100 − k ) 
Ecuación 4.2. Cálculo del porcentaje de eficacia (Zar, 1999).

Donde:
b = % de individuos muertos en el tratamiento donde se aplicó el agente de control
k = % de individuos muertos en el testigo absoluto
Los resultados del control de calidad relacionados con la evaluación de la actividad

biológica de un bioplaguicida a base de L. lecanii se presentan en la tabla 4.1.
Tabla 4.1. Porcentaje de eficacia de un bioplaguicida a base de L. lecanii sobre ninfas de T. vapora-
riorum
Conteo Conteo Mortalidad

Tratamientos I-F Eficacia (%)
inicial (I)* final (F)** (%)
R1 120 113 7 5,83
Testigo absoluto R2 105 96 9 8,57
R3 110 103 7 6,36
Promedio 6,92
cv (%) 20,98
R1 129 5 124 96,12 95,84
Material de
R2 167 13 154 92,22 91,64
referencia
R3 208 17 191 91,83 91,22
Promedio 93,39 92,90
Desviación estándar 2,38 2,55
cv (%) 2,54 2,75
R1 78 12 66 84,62 83,47
Bioplaguicida R2 106 5 101 95,28 94,93
R3 81 9 72 88,89 88,06
Promedio 89,60 88,82
Desviación estándar 5,37 5,77
cv (%) 5,99 6,49
* Conteo inicial de ninfas. ** Conteo final de ninfas o exuvias
El promedio de mortalidad en el testigo absoluto fue inferior al 20 %, el coefi-

ciente de variación (cv) entre las réplicas de un mismo tratamiento fue inferior
al 30 % y el porcentaje de eficacia del material de referencia fue superior al 80 %.
Adicionalmente, las condiciones ambientales (temperatura y humedad) durante el
tiempo de la evaluación estuvieron entre los rangos establecidos. De esta manera se
cumplieron con todos los parámetros de aceptación, por lo cual los resultados obte-
nidos son aceptados y correctos.
Los insectos encontrados en el tratamiento correspondiente a la suspensión del

bioplaguicida y del material de referencia (aislamiento Vl026) presentaron signos
de infección relacionados con una coloración amarilla, pérdida de turgencia y aplas-
tamiento de las ninfas. También se evidenció un crecimiento micelial típico de L.
lecanii sobre ninfas y adultos que alcanzaron a emerger pero que no sobrevivieron.
En contraste, en el testigo absoluto se evidenciaron ninfas vivas turgentes y exuvias

que indicaron la emergencia de adultos (figura 4.22).
a b
Foto: Carlos Espinel Correal y Lissette Torres Torres

c d
Figura 4.22. Individuos de T. vaporariorum. a. Testigo absoluto, ninfas sanas de T. vaporariorum en

cuarto estadio; b. Ninfas de T. vaporariorum en cuarto estadio, infectadas y con crecimiento micelial
del bioplaguicida a base L. lecanii; c. Adultos de T. vaporariorum con crecimiento micelial del biopla-
guicida a base L. lecanii; d. Ninfas de T. vaporariorum de cuarto estadio, infectadas y con crecimiento
micelial del material de referencia (aislamiento Vl026).
Adicionalmente, se confirmaron las características macroscópicas y microscópicas

del hongo entomopatógeno. El aislamiento Vl026 (material de referencia) y el prin-
cipio activo del bioplaguicida analizado a base de L. lecanii se caracterizaron por
presentar micelio aéreo de aspecto algodonoso y color blanco, con fiálides alar-
gadas y estrechas organizadas de manera verticilar, a partir de las cuales se forman
los conidios, los cuales son pequeños, hialinos y cilíndricos. Estas características
concordaron con las descritas por Barnett & Hunter (1998) para esta misma especie
(figura 4.23).
Foto: Lissette Torres Torres

Figura 4.23. Fotografias de L. lecanii. a. Características microscópicas del ais-
lamiento Vl026 de L. lecanii (material de referencia); b. Características micros-
cópicas del principio activo del bioplaguicida analizado a base de L. lecanii.
Perspectivas
• Los criterios biológicos y de evaluación expuestos en el presente capítulo cons-

tituyen una herramienta importante para la definición y estandarización de
metodologías encaminadas a la evaluación de la actividad biológica de agentes de
control de insectos en condiciones controladas.
• Los criterios expuestos, aplicados en el control de calidad rutinario de agentes de

control de insectos, permiten diseñar metodologías sencillas que, acompañadas
de criterios estadísticos y de aceptación, garantizan la generación de resultados
confiables.
• Los resultados de la actividad biológica de un agente de control deben complemen-

tarse con análisis microbiológicos y fisicoquímicos para su interpretación integral.
Referencias
Alatorre-Rosas, R. (2007). Hongos entomopatógenos. En L. A. Rodríguez-Del-Bos-

que, & H. Arredondo-Bernal (Eds.), Teoría y aplicación del control biológico
(pp.127- 143). Sociedad Mexicana de Control Biológico.
Arana, I., Maite, O., & Barcina, I. (s. f.). Cómo abordar y resolver aspectos prácticos
de microbiología. Departamento Inmunología, Microbiología y Parasitología.
Universidad del País Vasco/Euskal Herriko Unibertsitatea.
Aronson, A. I., Beckman, W., & Dunn, P. (1986). Bacillus thuringiensis and related
insect pathogens. Microbiological reviews, 50(1) 1-24. https://doi.org/10.1128/
mr.50.1.1-24.1986
Barnett, H. L. & Hunter, B. B. (1998). Illustrated Genera on Imperfected Fungi. The
American Phytopaphological Society.
Barrera, G. P. (2013). Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus the basis for a
biopesticide product in Colombia [Tesis de doctorado, Universidad Pública
de Navarra]. https://academica-e.unavarra.es/xmlui/handle/2454/16983/Te-
sis-Barrera.pdf?secuence=4
Barrera, G. P., Gómez, J. A., Cuartas, P. E., León, G., & Villamizar, L. (2014). Caracte-
rización morfológica, biológica y genética de un aislamiento colombiano de
granulovirus de Erinnyis ello (L.) (Lepidoptera: Sphingidae). Revista Colom-
biana de Biotecnología, 16(2), 129-140.
Bellotti, A., Arias, B., & Reyes, J. (1989). Manejo Integrado de Erinnyis ello (L) (gusa-
no cachón de la yuca). ciat.
Borror, D. J., Triplehorn, C. A., & Johnson, N. F. (1992). Study of Insects. Harcourt
Brace College Publishers.
Caballero, P., Williams, T., & López-Ferber, M. (2001). Los baculovirus y sus aplica-
ciones como bioinsecticidas en el control biológico de plagas. Phytoma.
Carapia-Ruiz, V., & Castillo-Gutiérrez, A. (2013). Estudio comparativo sobre la mor-
fología de Trialeurodes vaporariorum (Westwood) y Bemisia tabaci (Gen-
nadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Acta Zoológica Mexicana, 29(1), 178-193.
Cohen, A. (2004). Insects diets. Science and Technology. crc Press.
Cuartas, P., Villamizar, L., Espinel, C., & Cotes, A. (2009). Infección de granulovirus
nativos sobre Tecia solanivora y Phthorimaea operculella (Lepidoptera: Gele-
chiidae). Revista Colombiana de Entomología, 35(2), 122-129.
Erlandson, M. A. (2009). Genetic variation in field populations of baculoviruses:

mechanisms for generating variation and its potential role in baculovirus
epizootiology. Virologica Sinica, 24(5), 458-469. https://doi.org/10.1007/
s12250-009-3052-1
Espinel-Correal, C. (2010). Analyse de l’évolution des populations du granulovirus
PhopGV en contact avec des hôtes alternatifs Phthorimaea operculella et Tecia
solanivora (Lepidoptera: Gelechiidae) [Tesis de doctorado, École Nationale
Supérieure des Mines de Saint-Étienne].
Espinel-Correal, C., Ebratt, E., & Cotes, A. (1998). Evaluación de cepas nativas de Metar-
hizium anisopliae para el control biológico de Rhammatocerus schistocercoides
(Orthoptera: Acrididae). Revista Colombiana de Entomología 24(1-2), 1-5.
Ferron, P. (1978). Biological control of insect pest by entomogenous fungi. Annu-
al Review of Entomology, 23(1), 409-442. https://doi.org/10.1146/annurev.
en.23.010178.002205
Guijarro-Pardo, E., Gómez-Sebatián, S., & Escribano, J. M. (2017). In vivo produc-
tion of recombinant proteins using occluded recombinant AcMNPV-derived
baculovirus vectors. Journal Virological Methods, 250(1), 17-24. https://doi.
org/10.1016/j.jviromet.2017.09.017
Gillespie, A. T., & Claydon, N. (1989). The use of entomogenous fungi for pest con-
trol and the role of toxins in pathogenesis. Pest Management Science, 27(2),
123-130. https://doi.org/10.1002/PS.2780270210
Gómez, H. (1997). Estadística experimental. Universidad Nacional de Colombia.
Gómez, J. A., Barrera, G., López-Ferber, M., Belaich, M., Ghiringhelli, P. D., & Vi-
llamizar, L. (2017). Potential of betabaculoviruses to control the tomato
leafminer Tuta absoluta (Meyrick). Journal of Applied Entomology, 142(1-2),
1-11. https://doi.org/10.1111/jen.12406
Gómez. J., Guevara, E., Barrera, G., Cotes, A., & Villamizar, L. (2010). Aislamiento,
identificación y caracterización de Nucleopoliedrovirus nativos de Spodop-
tera frugiperda en Colombia. Revista Facultad Nacional de Agronomía Me-
dellín, 63(2), 5511-5520.
Gómez, J., Villamizar, L., Espinel, C., & Cotes, A. M. (2009). Comparación de la
eficacia y la productividad de tres granulovirus nativos sobre larvas de Tecia
solanivora (Povolny) (Lepidoptera: Gelechiidae). Corpoica Ciencia y Tecnolo-
gía Agropecuaria, 10(2), 152-158.
Grijalba, E. P., Hurst, M., Ibarra, J., Jurat-Fuentes, J., & Jackson, T. (2018). Bacte-
rias entomopatógenas en el control biológico de insectos. En A. Cotes. (Ed.),
Control biológico de fitopatógenos, insectos y ácaros: agentes de control bioló-
gico (pp. 296-334). agrosavia.
Hughes, P., & Wood, H. A. (1981). A synchronous per oral technique for the bioassay
of insect viruses. Journal of Invertebrate Pathology, 37(2), 154-159. https://doi.
org/10.1016/0022-2011(81)90069-0
Hurtado, M. (2012). Tuta absoluta. Guía visual del daño causado por el minador del
tomate en frutas y hojas [Plegable informativo]. Animal and Plant Health
Inspection Service. usda.
Instituto Colombiano Agropecuario [ica]. (2011). Resolución 000698 de 2011 “Por
medio de la cual se establecen los requisitos para el registro de departamentos
técnicos de ensayos de eficacia, productores e importadores de bioinsumos de
uso agrícola y se dictan otras disposiciones”. https://www.ica.gov.co/getatta-
chment/225bd110-d1c4-47d7-9cf3-43745201e39a/2011R698.aspx
gy, 10(6), 753-777. https://doi.org/10.1080/09583150020011717
Jisha, V. N., Smitha, R. B., & Benjamin, S. (2013). An overview on the crystal toxins
from Bacillus thuringiensis. Advances in Microbiology, 3(1), 462-472. https://
doi.org/10.4236/ aim.2013.35062
Johnson, P. D., & Besselsen, D. G. (2002). Practical aspects of experimental design
in animal research. ilar Journal, 43(4), 223-232. https://doi.org/10.1093/
ilar.43.4.202
Kachatourians, G. (1991). Physiology and genetics of entomopathogenic fungi. En
D. K. Arora, L. Ajello, K. G. Mukerji (Eds.), Handbook of Applied Micology:
Humans, animals and insects (pp. 548-611). crc Press.
Koppenhöfer, A. M., Jackson, T. A., & Klein, M. G. (2012). Bacteria for use against
soil-inhabiting insects. En L. A. Lacey (Ed.), Manual of Techniques in Inver-
tebrate Pathology (pp. 129-149). Elsevier.
Lacey, A. L. (2012). Manual of techniques in invertebrate pathology. Elsevier.
León, G., & Guevara, J. (2006). Manejo integrado de insectos plagas en soya para
los Llanos Orientales. En Soya (Glicine max (L.) Merril) Alternativa para
los sistemas de producción de la Orinoquía colombiana. Plan estratégico de

investigación y desarrollo tecnológico de soya (pp. 174-205). agrosavia.
López-Ávila, A. (1981). Estudios básicos para la cría de Meteorus laphygmae Viereck
parásito de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) [Tesis de maestría, Universi-
dad Nacional de Colombia].
López-Pérez, M., Rodríguez-Gómez, D., & Loera, O. (2015). Production of conidia of
Beauveria bassiana in solid-state culture: current status and future perspec-
tives. Critical Reviews Biotechnology, 35(3), 334-341. https://doi.org/10.3109/
07388551.2013.857293
Malarvannan, S., Murali, P. H., Shanthakumar, S. P., Prabavathy, V. R., & Nair, S.
(2010). Laboratory evaluation of the entomopathogenic fungi, Beauveria
bassiana against the Tobacco caterpillar, Spodoptera litura Fabricius (Noc-
tuidae: Lepidoptera). Journal of Biopesticides, 3(1), 126-131.
Marín-Cruz, V. H., Rodríguez-Navarro, S., Barranco-Florido, J. E., & Cibrián-To-
var, D. (2017). Insectistatic and insecticide activity of Beauveria bassiana in
Bradysia impatiens (Diptera: Sciaridae). Revista Chapingo Serie Ciencias Fo-
restales y del Ambiente, 23(3), 329-340.
Paramasivam, M., & Selvi, C. (2017). Laboratory bioassay methods to assess the in-
secticide toxicity against insect pest-A review. Journal of Entomology and
Zoology Studies, 5(3), 1441-1445.
Patel, J. K., Patel, N. M., & Shyani, R. L. (2001). Coefficient of variation in field exper-
iments and yardstick thereof - An empirical study. Current Science, 81(9,10),
1163-1164.
Portilla, M., & Street, D. (2006). Nuevas técnicas de producción masiva automatiza-
da de Hypothenemus hampei sobre la dieta artificial Cenibroca modificada.
Revista Cenicafé, 57(1), 31-50.
Quiroga, G., Gómez. M., & Villamizar, L. (2011). Estabilidad de formulaciones a base
de granilovirus para controlar Tecia solanivora (Lepidoptera: Gelechiidae)
en campo. Revista Colombiana de Entomología, 37(1), 27-35.
Rey, A., Garea, M., & Lago, J. C. (2017). Glosario micológico y acepciones complemen-
tarias o afines. Agrupación Micótica A. Zarrota.
Rohrmann, G. F. (2013). Baculovirus Molecular Biology. National Library of Medi-
cine, National Centre for Biotechnology Information.
Ruiz-Sánchez, A., Cruz-Camarillo, R., Salcedo-Hernández, R., & Berbozaz-Corona,
J. (2003). Serratia marcescens: De patógeno oportunista al control de insectos
que afectan cultivos agrícolas. Biotecnología, 8(2), 31-37.
Sewify, G. H., El Shabrawy, H. A., Eweis, M. E., & Naroz, M. H. (2014). Efficacy of en-
tomopathogenic fungi, Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae for
controlling certain stored product insects. Egyptian Journal of Biological Pest
Control, 24(1), 191-196.
Sistema Potosino de Vigilancia Epidemiológica [Sipove]. (s. f.). Ficha Técnica: Barre-
nador de la Caña de Azúcar Diatraea saccharalis. Sipove.
Soberón, M., Monnerat, R., & Bravo, A. (2016). Mode of action of Cry toxins from
Bacillus thuringiensis and resistance mechanisms. En Microbial Toxins (pp.
1-13). Springer.
Torres, L., Espinel, C., & Santos, A. (2020). Hospederos alternativos y estandarización
de métodos para evaluar la actividad biocontroladora de micoinsecticias.
Revista Colombiana de Entomología, 46(2), e7678. https://doi.org/10.25100/
socolen.v46i2.7678
United States Environmental Protection Agency [us epa]. (2017). What are biope-
sticides. https://www.epa.gov/pesticide-registration/biopesticide-registra-
tion#what
Valencia, R., & Ligarreto, G. (2010). Mejoramiento genético de la soya (Glycine max
[L.] Merril) para su cultivo en la altillanura colombiana: una visión concep-
tual prospectiva. Agronomía Colombiana, 28(2), 155-163.
Vargas, G., & Gómez, L. (2005). Evaluación del daño causado por Diatraea spp. En caña
de azúcar y su manejo en el valle del río Cauca. Serie Divulgativa. Cenicaña.
Villamizar, L., Cuartas, P., Gómez, J., Barrera, G., Espinel, C., & López-Ferber, M.
(2018). Virus entomopatógenos en el control biológico de insectos. En A.
Cotes. (Ed.), Control biológico de fitopatógenos, insectos y ácaros: agentes de
control biológico (pp. 368-409). agrosavia.
Zar, J.H. (1999). Biostatistical analysis. Prentice Hall.
181
Capítulo V
Aseguramiento de resultados
aplicables a metodologías
de control de calidad
de bioplaguicidas
Adriana Marcela Santos
Liz Alejandra Uribe
Erika Paola Grijalba
Debido a los cambios que ha traído consigo la agri-

cultura verde, en la actualidad las empresas produc-
toras de bioinsumos están en proceso de expansión,
ya que buscan implementar estrategias para mejorar
la producción agrícola. Dichos procesos incluyen
la expansión a nuevas tierras, el incremento de la
producción por hectárea gracias a la utilización de
insumos adecuados, el aumento del rendimiento del
cultivo y el control de plagas y enfermedades con
productos biológicos (Altieri et al., 2012). Por esta
razón, uno de los objetivos principales de la adop-
ción y el uso de bioinsumos es asegurar sus resul-
tados en condiciones de campo.
El control de calidad de un bioproducto es una parte

esencial durante el proceso de producción comercial
y es vital para la satisfacción del cliente (Ravensberg,
2011). En los capítulos anteriores se presentó la
diversidad de metodologías que existen y pueden
desarrollarse, sin embargo, su implementación requiere un sistema de gestión de

calidad y de aseguramiento de resultados.
La regulación en algunos países se enfoca en que los laboratorios de control de

calidad implementen un sistema de gestión de calidad con base en las directrices
internacionales como las Buenas Prácticas de Laboratorio (bpl) o la norma técnica
ntc-iso/iec 17025:2017 “Requisitos generales para la competencia de los labora-
torios de ensayo y calibración”. Teniendo en cuenta lo planteado anteriormente, el
control de calidad (qc, por sus siglas en inglés) son todos los mecanismos, acciones
y herramientas que se realizan con el fin de detectar la presencia de errores en los
procedimientos utilizados para cualquier producto o servicio que se preste. Debido a
la fuerte competencia en la industria, la calidad se ha convertido en el diferenciador
de casi todos los bienes y servicios. Además, la gestión de la calidad es fundamental
para construir una organización productiva que conduzca a productos que satis-
fagan o superen las necesidades del consumidor. Lo anterior también forma la base
para un negocio productivo, pues reduce el desperdicio y fomenta los altos niveles de
productividad (Hrvat et al., 2020).
Con el fin de implementar un sistema de aseguramiento de calidad, se debe garan-

tizar un sistema de medición confiable. En general, las mediciones y los ensayos,
especialmente de actividad biológica, requieren de un material de referencia que sea
reproducible y confiable. Además, estos resultados están sujetos a la incertidumbre
propia del ensayo (Paisan & Moret, 2010). Teniendo en cuenta que existen muchas
fuentes de error en una metodología, es indispensable reducir aquellos que estén
relacionados con las variables a medir y, de esta manera, aumentar la confianza de
los resultados (Manterola et al., 2018).
En el desarrollo de las metodologías, la precisión depende de la persona que realiza

la medición (el analista), el equipo o instrumento mediante el cual se realiza la medi-
ción y el objeto de estudio o la muestra a evaluar (Manterola et al., 2018). Con el fin
de disminuir y evitar errores y sesgos en el proceso de medición, el analista debe
tener en cuenta la variabilidad de los componentes que hacen parte del sistema de
medición. Esta variabilidad se debe establecer al momento de planificar el proceso
de estandarización y ejecución de la metodología. Asimismo, es fundamental esta-
blecer la confiabilidad del analista (Paisan & Moret, 2010).
Con respecto al equipo o instrumento, se debe garantizar que genere los mismos
resultados en diferentes tiempos, muestras y escenarios si se aplica bajo las mismas
Capítulo V Aseguramiento de resultados aplicables a metodologías de control de calidad de bioplaguicidas 183
condiciones ambientales (Manterola et al., 2018). Sin embargo, el concepto de precisión

se combina con el concepto de la exactitud. Su combinación puede generar diferentes
clasificaciones de mediciones, las cuales se encuentran descritas en la figura 5.1.
Figura 5.1. Posibles escenarios de precisión y exactitud de resultados.

Para mejorar la precisión y la exactitud, se han diseñado diversas estrategias cuya

finalidad es disminuir las fuentes potenciales de error. Entre las más utilizadas se
encuentran los procesos de estandarización y validación de métodos; el entrena-
miento de los analistas; el mantenimiento y la calibración de los equipos; los procesos
de supervisión y verificación y la implementación de controles como materiales de
referencia y repeticiones.
Estandarización de métodos
Los procesos de estandarización involucran actividades de adopción de una meto-

dología a las “condiciones reales” con el objetivo de establecer que la metodología
cumpla con las condiciones iniciales en las cuales se desarrolló (Riera et al., 2008).
Ya que no existen parámetos oficiales establecidos por organismos internacionales
para hacerle seguimiento a las metodologías de control de calidad de bioinsumos, el
proceso que se debe implementar es este. Las ventajas de la estandarización incluyen
la optimización de recursos, el establecimiento de criterios de aceptación y el estable-
cimiento de límites de cuantificación, lo que se traduce en la estabilidad del sistema

de medición y en la calidad del resultado.
Las metodologías de control de calidad en el proceso y el producto terminado se

realizan con base en un resultado conocido o típico, además, el sistema de medición
(analista, equipo y muestra) debe ser estable durante un tiempo determinado. Esta
estabilidad debe garantizar que la utilización de la misma metodología, los mismos
analistas y los mismos equipos en el mismo intervalo de tiempo genere medidas en
los rangos establecidos inicialmente (González & Falcón, 2015). Cuando una meto-
dología no alcanza los controles de calidad y los resultados en los rangos de medi-
ción, es necesario que las causas que generan estas desviaciones sean estudiadas y
determinadas. La estabilidad del sistema de medición es determinada a través de
indicadores de repetibilidad y reproducibilidad, mediante los cuales se puede deter-
minar a qué se debe la variación presentada en el proceso de medición utilizado
(Paisan & Moret, 2010).
Según González & Falcón (2015), la repetitividad y reproducibilidad (r&R)

son términos estandarizados adoptados por la Organización Internacional de
Normalización (iso, por sus siglas en inglés) y están relacionados con la precisión
y estabilidad en el tiempo de las mediciones realizadas con un conjunto de instru-
mentos que cuantifican la misma magnitud (González & Falcón, 2015).
La repetibilidad (r) puede ser expresada cuantitativamente en términos de la

dispersión característica de los resultados. Según el Vocabulario Internacional de
Metrología (vim), esta se define como “la proximidad de concordancia entre los
resultados de mediciones sucesivas del mismo mensurando bajo las mismas condi-
ciones de medición” (vim, 2012) (tabla 5.1), donde:
1. Estas condiciones son llamadas condiciones de repetibilidad.
2. Las condiciones de repetibilidad incluyen: el mismo procedimiento de medición,

el mismo observador u operador, el mismo instrumento de medición utilizado
bajo las mismas condiciones, el mismo lugar, mediciones repetidas del mismo
objeto u otro similar en un período corto de tiempo.
Tabla 5.1. Condiciones de evaluación de estudios de repetibilidad y reproducibilidad
Análisis Condiciones de evaluación

Mismo analista
Mismo instrumento de medición
Mismas condiciones
Repetibilidad (r)
Mismo lugar
Repetición de la medición en un periodo de tiempo
corto
Entre analistas
Entre lugares o condiciones
Reproducibilidad (R) Instrumento de medición
Evaluación del principio de método
Tiempo de evaluación variable
Fuente: Elaboración propia con base en Betancourt & García (2018)
Por otra parte, la reproducibilidad (R) se define como “la proximidad de concor-
dancia entre los resultados de mediciones sucesivas del mismo mensurando bajo
condiciones de medición que cambian” (vim, 2012) (tabla 5.1), donde:
1. Se debe especificar la condición que cambia.
2. Las condiciones que cambian pueden incluir: principio de medición, método

de medición, observador u operador, instrumento de medición, patrón de refe-
rencia, lugar, condiciones de uso, mediciones repetidas del mismo objeto u otro
similar en un periodo amplio de tiempo.
La reproducibilidad también puede ser expresada cuantitativamente teniendo en

cuenta la dispersión característica de los resultados.
En la década de 1960, se desarrollaron diferentes metodologías para determinar y

evaluar la repetitividad y reproducibilidad en sistemas de medición de la industria
manufacturera (González & Falcón, 2015). En la actualidad, no solamente se aplica
en la estandarización de procesos, sino también en procesos de ajuste y estandariza-
ción de metodologías en condiciones de laboratorio.
Estos estudios de repetibilidad y reproducibilidad (r&R) son la combinación de los

estudios de repetibilidad (r) y los estudios de reproducibilidad (R), cuyo fundamento
es la evaluación de las dispersiones de los resultados a través de la estadística, ya
sea mediante la determinación de máximos y mínimos, varianzas o desviaciones
estándar (Paisan & Moret, 2010). El estudio tradicional de r&R emplea un diseño
combinado de dos factores como, por ejemplo, muestras y analistas. De acuerdo con
el procedimiento recomendado por iso, se deben elegir y numerar las repeticiones
que representen el rango real o esperado de variación del proceso de manera que los
números no sean visibles para los analistas. Por lo general, en el estudio se supone
que participan entre dos o tres analistas; en el primer ciclo (bloque) el analista A
mide todas las muestras en un orden aleatorio y, posteriormente, el analista B. Los
ciclos se repiten entre dos o tres veces y se aleatorizan las mediciones. Por lo general,
no se espera que los efectos de bloqueo sean significativos. El objetivo del estudio no
es expresar la diferencia entre las muestras y los analistas, sino medir la variación
entre diferentes unidades y diferentes operadores en general (Jarosova, 2020).
Según Betancourt & García (2018), los pasos para la realización de estudio de r&R
son los siguientes:
1. La calibración de instrumentos involucrados en la medición (sistemas de apoyo)
2. La selección de una muestra que cubra un rango de variación
3. El establecimiento de la metodología (paso a paso)
4. La selección de 2 o 3 analistas que realicen mínimo 10 análisis
5. Los cálculos correspondientes mediante el método seleccionado de análisis
6. La generación del informe de estandarización y el protocolo ajustado de la

técnica (documentación)
Según Paisan & Moret (2010), los métodos estadísticos más utilizados para deter-
minar el r&R son:
• Métodos de los rangos
• Método de anova (análisis de varianza)
• Métodos de los promedios y rangos

Método de los rangos
Este método permite una aproximación rápida al establecimiento de la variabilidad

de las mediciones, ya que ofrece un dato global de la variabilidad total del sistema
y no descompone de forma individual los valores de repetibilidad y reproducibi-
lidad (Jarosova, 2020). Debido a esta particularidad, el método en cuestión permite
establecer y verificar que el porcentaje de r&R no haya variado en el tiempo y que se
encuentra dentro de lo establecido inicialmente. En general, dos analistas evalúan
5 muestras; posteriormente, se calcula el promedio de los cinco rangos y se calcula
variación total (vt) teniendo en cuenta un porcentaje de confianza del 99,73 %.
La aplicación de este método tiene la desventaja de no diferenciar la variabilidad de

los componentes del sistema de medición, por lo que establecer mejoras en el proceso
se dificulta. Sin embargo, tiene como ventaja la aplicación directa de los analistas y
los pocos recursos que se requieren para su procesamiento (Jarosova, 2020).
Método de anova
Este método se diferencia del método de promedio y rangos por la forma en la cual
se procesan los datos, ya que mediante un análisis estadístico se requiere establecer
la varianza (anova). En este tipo de método la varianza se puede establecer en cuatro
componentes: analistas; muestras; interacción entre muestra y analistas y el error de
repetibilidad (Botero-Arbeláez et al., 2007). Este método tiene la ventaja de estimar
el error experimental y las varianzas de forma más exacta. Además, permite manejar
un ensayo experimental con un alto número de repeticiones y establecer de forma
individual los efectos de cada componente (Botero-Arbeláez et al., 2007).
Tabla 5.2. Tabla de anova para un sistema de medición con dos factores
Fuente variación Suma cuadrados Grados de libertad Cuadrados medios

SSA
Analista ssa ɑ—1 MSA =
a −1
SSB
Muestra ssb b—1 MSB =
b −1
SSAB
Interacción ssab (ɑ — 1) (b — 1) MSAB =
( a − 1)(b − 1)
SSE
Error sse ɑb (n — 1) MSE =
ab ( n − 1)
Total sst N—1

Fuente: Elaboración propia con base en Botero-Arbeláez et al. (2007)
Donde:
ɑ es el número de analistas
b es el número de muestras
n es el número de medidas por cada muestra por cada analista
N es el número total de datos
Método de promedios y rangos
El método del promedio y el rango permite realizar de forma separada el análisis

de la repetibilidad y la reproducibilidad de un sistema de medición. Este método
consiste en que varios analistas realicen la misma medición sobre varias muestras
(González & Falcón, 2015). Con los resultados obtenidos se pueden determinar la
repetibilidad, la reproducibilidad y la interacción ente el analista y las muestras.
En general, los estudios de r&R se pueden clasificar como “cortos” y “largos”. Los
estudios cortos corresponden al caso en que dos analistas realizan la medición de
cinco muestras. Los estudios largos corresponden al caso en que participan tres
analistas y realizan tres veces la medición en 10 muestras diferentes. La selección
de la cantidad de analistas y muestras depende del criterio del implementador, sin
embargo, en la medida en que se aumente el número de repeticiones, de muestras y
de analistas, se obtendrán mejores datos. Con los datos obtenidos se pueden estimar
los porcentajes de repetibilidad, reproducibilidad y la relación entre estos. Para dicho
fin se deben seguir las ecuaciones descritas a continuación:
El porcentaje de repetibilidad (r) se puede calcular de la siguiente manera:
K1 * R
Repetibilidad ( % ) = *100
T
Donde:
K1 = Constante que depende del número de mediciones realizadas por cada operador
y proporciona un intervalo de confianza del 99 % para estas características (tabla 5.1).
R = Rango promedio de todos los rangos.

T = Tolerancia de la característica medida (dada por el parámetro de aceptación).
Ecuación 5.1. Cálculo para determinar el porcentaje de repetibilidad (Paisan & Moret, 2010).
El rango promedio de todos los rangos () se calcula según la ecuación 5.2.
1 m
R= ∑r1
m i =1
m = Número de operadores.
r1 = Rango promedio de cada operador, el cual a su vez está dado por:
1 n
r1 = ∑r
n i =1
Donde r es el rango de medición corresponde a la diferencia entre el promedio mayor
y el promedio menor de los operadores por medio de la ecuación:
( K 2 * R)2
( K1 * xD ) 2 −
Reproducibilidad ( % ) : nr *100
T
Ecuación 5.2. Cálculo para determinar el rango promedio

de todos los rangos (Paisan & Moret, 2010).
El porcentaje de reproducibilidad se calcula mediante la ecuación 5.3.
Donde:
K2 = Constante que depende del número de operadores y proporcional un intervalo

de confianza del 99% para estas características (tabla 5.1).
xD = Diferencia entre el promedio mayor y promedio menor de los operadores.
R = Rango promedio de todos los rangos.

n = Número de ensayos por operador.
r = número de partes medidas.
T = Tolerancia de la característica medida (dada por el parámetro de aceptación).
( K 2 * R)2
( K1 * xD ) 2 −
Reproducibilidad ( % ) : nr *100
T
Ecuación 5.3. Cálculo para determinar el porcentaje de reproducibilidad (Paisan & Moret, 2010).
Tabla 5.3. Valores de las constantes K1 y K 2.
Número de ensayos 2 3 4 5
K1 4,56 3,05 2,50 2,21
Número de operadores 2 3 4 5
K2 3,65 2,70 2,30 2,08
Nota: Si el valor de K 2 dentro de la raíz es un número negativo, el valor de la reproducibilidad se considera 0.
El porcentaje de la relación entre la repetibilidad y la reproducibilidad se calcula

según la ecuación 5.4.
r & R(%) = (% Repetibilidad ) 2 + (% Reproducibilidad ) 2
Ecuación 5.4. Cálculo para determinar el porcentaje de la relación entre la

repetibilidad y reproducibilidad (r&R%) (Paisan & Moret, 2010).
Para garantizar la exactitud de los resultados se requiere que las mediciones sean
realizadas bajo las mismas condiciones, es decir, utilizando el mismo instrumento o
equipo y ejecutado por el mismo analista. Lo anterior, para que no se altere la esta-
bilidad del sistema de medición (González & Falcón, 2015).
Interpretación de resultados: pruebas r&R
Según Gutiérrez & De la Vara (2004), en todos los estudios de r&R se espera siempre
tener un porcentaje de repetibilidad y reproducibilidad lo más cercano posible a 0, ya
que esto indica que existe menor variación entre los datos obtenidos. Sin embargo, se
han establecido los siguientes criterios (Llamosa et al., 2007; Paisan & Moret, 2010;
Arango et al., 2013):
• Si r&R (%) <10 %, la metodología se aprueba.
• Si 10 % ≤ r&R (%) ˂ 30 %, puede ser aceptable según su uso y aplicación.
• Si r&R (%) >30 % la metodología no se acepta y requiere mejoras en cuanto al

analista, equipo, método, condiciones ambientales, entre otros.
En cuanto a la repetibilidad y la reproducibilidad analizadas de forma independiente

(Mosquera & López, 2007):
a. Si la repetibilidad es mayor en comparación con la reproducibilidad, se puede

deber a las siguientes situaciones:
• El sistema de medición (instrumento o equipo) requiere mantenimiento.
• Se debe revisar y establecer si las condiciones ambientales son las adecuadas

según el método.
• Existe mucha variación entre los analistas, las muestras y el equipo utilizado.
b. Si la reproducibilidad es mayor comparada con la repetibilidad, las causas posi-

bles son:
• El analista necesita entrenamiento en el uso de la metodología.
• Pueden existir errores de apreciación en la lectura.
• Las condiciones de reproducibilidad no se han mantenido, por lo tanto, se han

modificado.
Criterios de calidad de resultados
Un componente esencial durante la evaluación de un parámetro de control de

calidad es el establecimiento de criterios que aseguren la confiabilidad y calidad de
los resultados. Estos están relacionados con la definición de parámetros de acepta-
ción, coeficientes de variación, entre otros. A continuación, se encuentra un análisis
de este tipo de criterios.
Coeficiente de variación
Según Górdon-Mendoza & Camargo (2015), el coeficiente de variación de Pearson se

considera fundamental como indicador de la calidad de experimentos. En general,
se utiliza el coeficiente de variación (cv) para aceptar o rechazar la validez de los
experimentos (Bowman & Rawlings, 1995).
Por definición, el coeficiente de variación es “la desviación estándar expresada como

porcentaje de la media aritmética” (Wayne, 2006). Lo anterior permite establecer
este coeficiente como adimensional y reflejar diferentes características de la pobla-
ción (Vásquez & Caballero, 2011).
En general, los datos experimentales proveen información tanto de la variación

controlada (efecto de un tratamiento específico) como de la no controlada. Esta
última se expresa como un error experimental, el cual puede ser cuantificado como
un estimado llamado coeficiente de variación (cv). Estadísticamente el cv indica
qué tan grande es la desviación estándar en relación con la media. Este se calcula de
la siguiente forma (Patel et al., 2001) (ecuación 5.5).
S
CV = *100
X
Ecuación 5.5. Determinación del coeficiente de variación (Patel et al., 2001).
El rango aceptable del cv se debe determinar con base en reportes teóricos pero
principalmente con la evaluación de un número determinado de ensayos, con los
cuales se puede definir a su vez un valor crítico. Lo anterior debido a que los cv
varían considerablemente de acuerdo con el tipo de experimento (Patel et al., 2001).
Gómez & Gómez (1984) y Patel et al. (2001) son más específicos al indicar que los cv
varían considerablemente de acuerdo con el tipo de experimento. En el caso parti-
cular de las técnicas microbiológicas y fisicoquímicas, se ha definido que un valor
inferior al 10 % es aceptable. En el caso de los ensayos biológicos, el coeficiente de
variación aceptado debe ser inferior al 30 % entre réplicas de un mismo tratamiento
(Gómez & Gómez, 1984; Patel et al., 2001). Una gran cantidad de investigadores
(Gómez & Gómez, 1984; Patel et al., 2001) indican que, si el valor del cv supera el
30 %, los datos deben ser descartados por su baja precisión (Gordon-Mendoza &
Camargo 2015; Schmildt et al., 2017).
Sin embargo, Schmildt et al. (2017) sugieren que los rangos de clasificación de los
valores de cv dependen de la variabilidad de las técnicas y los experimentos, del
número de repeticiones por tratamiento y de la forma de recolección de los datos.
Por lo tanto, los criterios de aceptación dependerán directamente del diseño experi-
mental y de la precisión de este. En algunos casos es necesario establecer dicho rango
de aceptación.
Parámetros de aceptación para la metodología
Los parámetros de aceptación son un conjunto de requisitos que se deben cumplir

durante la realización de un ensayo y determinan que este sea válido y confiable.
Estos hacen referencia a los aspectos que se enuncian a continuación.
Evaluación de testigo absoluto: para ciertas metodologías, por ejemplo las activi-
dades biológicas, se debe evaluar un testigo absoluto (sin aplicación). En general, la
variable respuesta en este tratamiento debe estar entre el 5 % y el 10 % y nunca supe-
rior al 20 %, de lo contrario el ensayo se debe repetir (Lacey, 2012).
Material de referencia o cepa de referencia: el material o cepa de referencia corres-

ponde a los agentes de control biológico que se han caracterizado o de los cuales se
cuenta con el conocimiento de su respuesta en las diferentes evaluaciones. La cepa
de referencia se debe evaluar en metodologías microbiológicas y biológicas y es un
tratamiento adicional en el análisis de calidad de una muestra de bioplaguicida.
Condiciones físicas y ambientales: los ensayos se deben realizar bajo las condiciones
físicas y ambientales (temperatura, humedad o fotoperiodo) previamente estable-
cidas. En caso de evidenciarse alguna modificación en estas condiciones, así como
una eventualidad que ponga en riesgo los tratamientos o algunas de sus réplicas, se
debe repetir el ensayo.
Los criterios estadísticos que se deben tener en cuenta en la estandarización de una

metodología o en el control de calidad de un bioplaguicida, incluyen la definición de
tratamientos, número de réplicas, unidad experimental, diseño experimental, varia-
bles de respuesta y análisis estadístico:
Tratamientos
Los tratamientos son las condiciones experimentales que se desean comparar en un

ensayo (Johnson & Besselsen, 2002). En cada prueba se debe incluir un control posi-
tivo (a una concentración cercana al agente biológico a evaluar) y un control nega-
tivo (para conocer el porcentaje del efecto máximo) (Cuevas et al., 2012). En caso de
ser necesario, se debe incluir además un control del vehículo empleado, por ejemplo,
los excipientes de formulación.
Por ejemplo, si se desea evaluar la actividad de un bioplaguicida sobre una pobla-

ción determinada de insectos es necesario evaluar mínimo dos tratamientos, uno
correspondiente a un testigo absoluto (insectos sin ninguna aplicación del agente de
control) y el otro a la aplicación del agente de control. Algunas veces, es necesario
evaluar un tratamiento adicional cuando se quiere determinar el efecto de otras
condiciones en ausencia del principio activo sobre la población tratada. Tal es el caso
de los excipientes de formulación, el diluyente del agente de control con el cual se
ajusta la concentración requerida o, incluso, el mismo método de aplicación (testigo
tratado). Al final del ensayo se determina la variable respuesta definida y mediante la
comparación entre los tratamientos, se determina el efecto de las condiciones expe-
rimentales evaluadas.
Número de réplicas
Las réplicas son las unidades experimentales que reciben el mismo tratamiento
(Gómez, 1997), por lo cual también hacen referencia a la cantidad de observaciones
(mediciones) repetidas e independientes que se hacen a las condiciones experimen-
tales que se evalúan (Milliken & Johnson, 1992). Las réplicas permiten estimar el
error experimental y determinar una respuesta precisa al efecto que se está evaluando.
Entre mayor sea el número de réplicas, mayor es la precisión en la estimación de
las medias de los tratamientos; esto se debe a que se disminuye la varianza de las
medias de los tratamientos (Gómez, 1997; Gutiérrez & De la Vara, 2004). Para todos
los ensayos, tanto microbiológicos como biológicos, se recomienda la evaluación de
mínimo tres replicas por cada tratamiento (Cuevas et al., 2012).
Unidad experimental
Barros & Tavares (1995) definen la unidad experimental como la unidad básica que
provee la información en la cual se basa la experimentación. Es necesario tener en
cuenta la importancia de la unidad experimental, ya que es la fuente de resultado del

ensayo y, por lo tanto, su comportamiento está fuertemente relacionado con todos
los factores que son fuente de error de las metodologías (Vargas & Navarro, 2019).
Al momento de evaluar varios tratamientos, las unidades experimentales deben ser

homogéneas, de esta forma se garantiza que la diferencia en los resultados es gene-
rada por el efecto de los tratamientos y no por factores externos, a los cuales se les
conoce como “ruido” (Vargas & Navarro, 2019). Sin embargo, especialmente para
ensayos con microorganismos e insectos, establecer un conjunto de unidades expe-
rimentales homogéneas es casi imposible debido a las características propias de la
unidad experimental. Esta situación se puede corregir mediante tratamientos testigo
o control, a los cuales no se les aplica ningún tratamiento. Por ende, sus resultados
permiten establecer el comportamiento “real” de la unidad experimental (Vargas et
al., 2020).
Por ejemplo, el número de unidades experimentales en un bioensayo de control de

calidad de agentes entomopatógenos depende de su definición y establecimiento,
como se mencionó en el capítulo 4. Cuando la unidad experimental incluye un solo
insecto, se recomienda que el número de unidades experimentales sea de 10 a 15 por
réplica. Por otra parte, existen ensayos en los cuales varios insectos están confinados
en una misma unidad experimental, en este caso el número de insectos debe estar
entre 10 y 15 por unidad, la cual, a su vez, corresponde a una réplica.
En general se ha comprobado que, al aumentar el tamaño de las unidades experi-

mentales, el coeficiente de variación disminuye con respecto al error experimental
(Gómez, 1997). Sin embargo, es importante estimar de manera óptima la cantidad
de las unidades experimentales, no solo para reducir el error experimental, sino
también con base en aspectos económicos y prácticos, incluidos el espacio y la mano
de obra (Vargas & Navarro, 2019).
Diseño experimental
El diseño experimental es la forma en que se organizan las unidades experimen-

tales con el fin de uniformizar, en lo posible, los tratamientos a evaluar (Milliken
& Johnson, 1992). Cuando todas las unidades experimentales son homogéneas,
solo existe un grupo o bloque de observaciones y las unidades experimentales
pueden ser asignadas a los tratamientos de manera aleatoria, se denomina Diseño
Completamente al Azar (dca) (Milliken & Johnson, 1992; Gómez, 1997). El dca
tiene varias ventajas sobresalientes y es el más usado en ensayos de control de calidad

de bioplaguicidas. Dichas ventajas se relacionan con su flexibilidad, la cual permite
usar cualquier número de tratamientos y réplicas durante la experimentación. Los
tratamientos pueden tener diferente número de réplicas, sin embargo, se obtienen
comparaciones más precisas cuando se evalúa un mismo número. En este tipo de
bioensayos, es necesario contemplar la posibilidad de que exista pérdida de unidades
experimentales, sobre todo cuando se manipulan larvas en estado temprano de
desarrollo. Asimismo, este diseño tiene la ventaja de proporcionar el mayor número
de grados de libertad para el error.
Tabla 5.4. Ejemplo de la asignación aleatoria de réplicas en un Diseño Experimental Completamente

al Azar
Tratamientos Números
A 15,4,9,11
B 3,1,10,12
C 8,6,13,16
D 14,2,5,7
En el dca, la distribución de los tratamientos en las unidades experimentales se

puede realizar mediante tablas de números aleatorios o con otro método que permita
sortear los tratamientos de forma aleatoria (Martínez & Martínez, 1997). Tal es el
caso del uso de tarjetas o fichas numéricas que se extraen al azar de una caja o bolsa.
Por ejemplo, para la distribución de cuatro tratamientos a las unidades experimen-
tales en un dca, cada uno con cuatro réplicas, se realiza un sorteo con 16 fichas
enumeradas que se extraen al azar sin reemplazo (Gómez, 1997). En la tabla 5.4 se
presenta un ejemplo de cómo pueden quedar asignados.
Otro diseño menos usado en el control de calidad de bioplaguicidas, especialmente

para ensayos biológicos bajo condiciones de laboratorio o de invernadero pero que
resulta recomendable cuando las unidades experimentales pueden agruparse de
acuerdo con una fuente de variación, es el uso de bloques (Gómez, 1997).
Los bloques deben contener el mismo número de unidades experimentales y los

tratamientos se deben distribuir al azar dentro de cada bloque. Si el bloqueo es
correcto, la variabilidad entre las unidades de diferentes bloques debe ser mayor al
promedio de la variabilidad entre las unidades de un mismo bloque (Gómez, 1997).
Así se eliminan las diferencias del error experimental entre bloques, con lo cual
aumenta la precisión del experimento. La estructura más sencilla en bloques es el

diseño de bloques completamente aleatorizados (bca), en el cual los tratamientos se
distribuyen aleatoriamente en las unidades experimentales dentro de cada bloque,
con una aleatorización diferente en cada uno de ellos. Para esto se recomienda usar
una tabla de números aleatorios (Martínez & Martínez, 1997). Por ejemplo, en un
ensayo con seis tratamientos y tres réplicas, la distribución de los tratamientos en
tres bloques puede darse como se muestra en la figura 5.2.
Figura 5.2. Ejemplo de la distribución de seis tratamientos en tres bloques organizados completamente
al azar.
Dentro de las ventajas del diseño bca están:
• El agrupamiento de las unidades experimentales en bloques homogéneos para

controlar una fuente importante de variación (la de bloques), con lo que se obtiene
una reducción del error experimental.
• Es posible aumentar el número de réplicas dentro de cada bloque para aquellos

tratamientos que requieren más cuidado y atención.
• Si se pierden unidades experimentales, es posible estimar sus valores teniendo en

cuenta las restantes.
A pesar de sus ventajas, el diseño bca no es apropiado para un número elevado de

tratamientos (no mayor de 24) debido a que se aumenta el tamaño del bloque, lo
cual implica un aumento en la variabilidad dentro de cada bloque y, por lo tanto, un
aumento en el error experimental. Por otra parte, si los bloques se arreglan sin una
justificación clara con base en una importante fuente de variación, puede haber una
pérdida en la eficiencia al disminuirse los grados de libertad del error (Gómez, 1997).
Variable respuesta
La variable respuesta (variable de interés) es el factor a través del cual se conoce

el efecto o los resultados de cada prueba experimental (Gutiérrez & De La Vara,
2004). Es decir, los datos que se recogen en un experimento son las medidas de dicha
variable, la cual se debe definir con antelación dependiendo de los objetivos, así
como sus unidades.
Para el caso de metodologías microbiológicas se utilizan las expuestas en el capítulo

1. Estas son definidas como parámetros establecidos de acuerdo con el microorga-
nismo. En general, todos los datos o resultados de las unidades experimentales se
denominan parte de la variable respuesta. Para ensayos microbiológicos, la variable
respuesta puede ser expresada en términos de viabilidad o recuento. En la mayoría
de las pruebas de actividad biológica, la respuesta se puede medir como mortalidad,
parasitismo, crecimiento, o ciertos efectos subletales (Cuevas et al., 2012).
Análisis estadístico
El análisis estadístico de los datos relacionados con el control de calidad rutinario de

un agente de control incluye la determinación de la desviación estándar (S) y del coefi-
ciente de variación (cv) entre las réplicas de un mismo tratamiento. Posteriormente,
se determina su validez dependiendo de los parámetros de aceptación establecidos
para cada técnica.
Por otra parte, los datos resultantes de un proceso de estandarización incluyen

un análisis más riguroso. Como primera medida se debe calcular el coeficiente de
variación para cada uno de los analistas involucrados, el cual deber ser inferior al
10 % para que la metodología se considere repetible. Asimismo, se debe realizar una
prueba de T pareada para determinar si hay diferencias significativas en los datos
obtenidos. De esta manera, se contempla una hipótesis nula (H0) que establece que
no hay diferencias entre los datos obtenidos por los analistas y una hipótesis alterna-
tiva (H1) que establece que sí las hay.
Con el fin de determinar si existe diferencia significativa entre los analistas se deben
realizar pruebas estadísticas en las que se compare el valor p con el nivel de signifi-
cancia. Un nivel de significancia de 0.05 permite establecer las siguientes relaciones:
• Si el valor p ≤ α: La diferencia entre las medias es estadísticamente significativa

(Rechazar H0).
• Si el valor p > α: La diferencia entre las medias no es estadísticamente significa-

tiva (No se puede rechazar H0).
De esta forma la prueba de T pareada ayuda a determinar si la metodología evaluada

es reproducible.
Una vez se determine de manera preliminar que la metodología es repetible y repro-

ducible, se debe llevar a cabo su confirmación mediante los métodos mencionados
anteriormente, previa transformación de los datos según la variable respuesta. Por
ejemplo, variables de respuesta expresadas en porcentaje o variables de respuesta
expresadas como exponentes se transforman en arcosenos o logaritmos en base 10.
De esta manera, los datos que siguen una distribución binomial, al ser transfor-
mados, se normalizan y sus varianzas se estabilizan. Se alargan los extremos de la
distribución y se angosta la parte central y se pueden realizar los análisis estadísticos
respectivos (Gómez, 1997; Segnini, 2004).
Casos de estudio
Los siguientes casos de estudio corresponden a ensayos de estandarización reali-

zados por agrosavia, en el Centro de Investigación Tibaitatá.
Caso de estudio I
En el presente caso de estudio se estandarizaron los parámetros microbiológicos,

fisicoquímicos y de actividad biológica para las metodologías de control de calidad
de un bioplaguicida a base de Trichoderma koningiospsis cepa Th003 (Ascomycota:
Hypocreaceae) formulado como un granulado dispersable (wg).
Los parámetros de estandarización seleccionados fueron el de repetibilidad, repro-

ducibilidad y el porcentaje de relación entre estos dos (r&R); asimismo, se utilizó el
método de promedios y rangos (Llamosa et al., 2007; Paisan et al., 2010). Para ello se
contó con dos analistas, quienes evaluaron la metodología tres veces con la misma
muestra bajo las mismas condiciones, con los mismos instrumentos, en el mismo
laboratorio y durante el mismo día.
Como criterios de aceptación, se tuvo en cuenta que el coeficiente de variación de

los datos obtenidos por cada analista (repetibilidad, r) fueran inferiores al 10 %; que
la prueba T pareada no presentara diferencias significativas en los datos obtenidos
entre los dos analistas (reproducibilidad, R) y la relación entre r&R (%) obtenida al
aplicar el método de promedios y rangos fuera: r&R (%) < 10 % (se aprueba) o 10 %
≤ r&R (%) ˂ 30 % (puede ser aceptable según su uso y aplicación).
A continuación, se describe el proceso de estandarización para cada metodología:
Estandarización de la metodología para la determinación

de la germinación del principio activo
La metodología estandarizada se describe a continuación:
1. Se pesó 1 g ± 0,01g del agente microbial a base de Trichoderma koningiopsis,

aislamiento Th003.
2. Se preparó la suspensión inicial y se adicionó la muestra anterior a un vaso de

precipitado plástico de 250 ml de capacidad, con 99 ml de polisorbato 80 al 0,1 %.
3. La suspensión anterior se homogenizó (dilución 10-2) con la licuadora de inmer-

sión por 20 segundos.
4. Por medio de una micropipeta, se traspasaron 0,1 ml de la dilución 10-2 a un

tubo Eppendorf con 0,9 ml de polisorbato 80 al 0,1 %. Se evitó el contacto entre
la micropipeta y el diluyente. De esta manera se obtuvo la dilución 10-3.
5. Las diluciones (10-2 y 10-3) se homogenizaron en un agitador vórtex por 10

segundos.
6. Se sembraron 0,1 ml de las tres últimas diluciones en cajas de Petri (agar agua
suplementado con benomil al 0,0003 %). Cada dilución se sembró por triplicado
y se utilizó un rastrillo para distribuir el contenido sobre el medio de cultivo.
7. Las cajas se incubaron a una temperatura de 25 ºC ± 1 ºC durante 24 horas y se

ubicaron dentro de la incubadora de manera invertida.
8. Transcurrido el tiempo de incubación, se cortó un trozo de medio de cultivo

inoculado de aproximadamente 1 cm2 con un bisturí estéril y se colocó sobre
una lámina portaobjetos. Posteriormente, se adicionó una gota de azul de lacto-
fenol sobre el trozo de medio de cultivo y se cubrió con una laminilla.
9. Se cuantificaron los conidios germinados y no germinados mediante micros-

copio óptico (40×). Se contaron mínimo 100 conidios (germinados y no germi-
nados) por cada réplica.
10. El porcentaje de germinación se determinó utilizando la siguiente fórmula:
Conidios germinados
Germinacion (%) = *100
Conidios totales
Los resultados correspondientes a la determinación del porcentaje de germinación

del principio activo para cada uno de los analistas están relacionados en la tabla 5.5.
Tabla 5.5. Resultados de la determinación del porcentaje de germinación del agente microbial a base
de T. koningiopsis obtenidos por cada analista
Consolidado por
Analista Evaluación R1 R2 R3 x
analista
1 72,17 71,07 75,21 72,82 x 74,66
Analista 1 2 74,77 74,31 74,79 74,62 sd 1,85
3 78,00 77,57 74,00 76,52 cv (%) 2,48
1 74,51 70,19 71,15 71,95 x 74,20
Analista 2 2 75,25 75,73 74,58 75,19 sd 1,95
3 80,58 72,55 73,27 75,47 cv (%) 2,63
Para el analista 1 se obtuvieron porcentajes de germinación del 71,07 % al 78,00 %

con una media del 74,66 % ± 1,85 % y un coeficiente de variación del 2,48 %. Para el
analista 2 se obtuvieron porcentajes de germinación del 70,19 % al 80,58 % con una
media de 74,20 % ± 1,95 % y un coeficiente de variación del 2,63 %. Estos resultados
establecen que la variabilidad de las evaluaciones para cada analista fue pequeña,
lo cual se refleja en el valor de coeficiente de variación obtenido (2,48 % y 2,63 %,
respectivamente). Los coeficientes de variación obtenidos fueron inferiores al 10
%, lo cual corrobora la repetibilidad de las evaluaciones siguiendo la metodología
establecida.
Al realizar la prueba T pareada se obtuvo un valor de p del 0,5635 el cual, al ser

mayor a 0,05, permitió la aceptación de la hipótesis nula, lo que indica que no existen
diferencias significativas entre los porcentajes de germinación obtenidos por los dos
analistas (tabla 5.6).
Tabla 5.6. Resultados de la prueba T pareada
Media 0,52
Error Estándar 0,8631
Media H0 0,52
Lower 95 % ci -1,470
Upper 95 % ci 2,510
T 0,60
df 8
Valor p 0,5635
Ho: Hipótesis nula: No hay diferencias significativas entre los porcentajes de

germinación obtenidos por los dos analistas
H1: Hipótesis alterna: Hay diferencias significativas entre los porcentajes de

germinación obtenidos por los dos analistas
Luego de transformar los porcentajes de germinación mediante la función de arco-

seno, se determinó la reproducibilidad, la repetibilidad y el porcentaje de r&R (%)
mediante la metodología de promedios y rangos (tabla 5.7 y 5.8).
Tabla 5.7. Porcentajes de germinación del agente microbiano a base de T. koningiopsis transformados
mediante la función arcoseno
Analista Evaluación R1 R2 R3
1 0,85 0,84 0,87
Analista 1 2 0,86 0,86 0,86
3 0,88 0,88 0,86
1 0,86 0,84 0,84
Analista 2 2 0,87 0,87 0,86
3 0,90 0,85 0,86
Tabla 5.8. Rangos de medición obtenidos para cada analista y valores de repetibilidad, reproducibili-
dad y de r&R (%) para la determinación del porcentaje de germinación del agente microbiano a base
de T. koningiopsis
Analista 1 Analista 2
0,03 0,03
Rango por medición 0,04 0,03
0,01 0,02
Repetibilidad (%) 9,44
Reproducibilidad (%) 1,04
r&R (%) 9,50
La metodología para determinar la germinación de los conidios del agente micro-

biano a base de T. koningiopsis presentó una repetibilidad del 9,44 %, una reprodu-
cibilidad del 1,04 % y un porcentaje de relación entre estos dos parámetros (r&R %)
del 9,50 % (≤10 %). Lo anterior sugiere que la metodología analítica es repetible y
reproducible en el tiempo y se aprueba para su uso y aplicación.
Estandarización de la metodología para la determinación de pH
La metodología estandarizada fue la siguiente:
1. Se pesó 1 g de la muestra y se dispuso en 50 ml de agua destilada estéril conte-

nida en un vaso de precipitado. Se agitó hasta disolver completamente y se veri-
ficó que la temperatura de la suspensión fuera de 20 ºC.
2. Se verificó la calibración del potenciómetro mediante una de las soluciones

amortiguadoras de pH 4 y pH 7.
3. Se realizó la lectura del pH de la muestra tres veces y por triplicado por cada uno
de los analistas.
Los resultados obtenidos se encuentran registrados en la tabla 5.9.

Tabla 5.9. Resultados de la determinación del pH del agente microbial a base de T. koningiopsis, ob-
tenidos por cada analista
Consolidado por
analista
1 6,12 6,12 6,14 6,13 x 6,12
Analista 1 2 6,12 6,12 6,10 6,11 sd 0,01
3 6,11 6,12 6,12 6,12 cv (%) 0,11
1 6,14 6,14 6,15 6,14 x 6,12
Analista 2 2 6,09 6,11 6,12 6,11 sd 0,02
3 6,12 6,12 6,13 6,12 cv (%) 0,30
Para el analista 1 se obtuvieron valores de pH entre 6,10 y 6,14 con una media de 6,12
± 0,01 y un coeficiente de variación del 0,11 %. Para el analista 2 se obtuvieron valores
de pH entre 6,09 y 6,15 con una media de 6,12 ± 0,02 y un coeficiente de variación del
0,30 %. Estos resultados establecen que la variabilidad de las evaluaciones para cada
analista fue pequeña, lo cual se refleja en el valor de coeficiente de variación obtenido
(0,11 % y 0,30 %, respectivamente). Estos coeficientes de variación obtenidos fueron
inferiores al 10 %, lo cual corrobora la repetibilidad de las evaluaciones siguiendo la
metodología establecida.
Los resultados obtenidos al realizar la prueba T pareada determinaron un valor de p

del 0,3466 el cual, al ser mayor a 0,05, permitió la aceptación de la hipótesis nula, lo
que indica que no existen diferencias estadísticamente significativas entre valores de
pH obtenidos por los dos analistas (tabla 5.10).
Tabla 5.10. Resultados de la prueba T
Media -5,56 x 10-3

Error Estándar 5,56 x 10-3
Media H0 -5,56 x 10-3
Lower 95 % ci -0,0184
Upper 95 % ci 7,26 x 10-3
T -1,00
df 8
Valor p 0,3466
Ho: Hipótesis nula: No hay diferencias significativas entre los valores de pH

obtenidos por los dos analistas
H1: Hipótesis alterna: Hay diferencias significativas entre los valores de pH

obtenidos por los dos analistas
Posteriormente se determinó la reproducibilidad, la repetibilidad y el r&R (%)

mediante la metodología de promedios y rangos (tabla 5.11).
Tabla 5.11. Rangos de medición obtenidos para cada analista y valores de repetibilidad, reproducibili-
dad y de r&R (%) para la determinación de pH del agente microbiano a base de T. koningiopsis
0,01 0,05
Rango por medición
0,00 0,03
0,04 6,13
r&R (%) 1,37
La metodología para determinar el pH del agente microbiano a base de T. konin-

giopsis presentó una repetibilidad del 1,33 %, una reproducibilidad del 0,31 % y un
porcentaje de relación entre estos dos parámetros (r&R %) del 1,37 % (≤10 %). Lo
anterior sugiere que la metodología analítica es repetible y reproducible en el tiempo
y se aprueba para su uso y aplicación.
Estandarización de la actividad biológica del

bioplaguicida a base de Trichoderma koningiopsis
Para la actividad biológica se evaluó la eficacia en de Trichoderma koningiopsis contra

Sclerotinia sclerotiorum (Ascomycota: Sclerotiniaceae) en condiciones in vitro. Para
la estandarización de la metodología se definieron los siguientes criterios:
• Patógeno: esclerocios de S. sclerotiorum.

• Agente de control: bioplaguicida a base del aislamiento Th003 de T. koningiopsis y

como control positivo se evaluó la cepa de referencia Th003 (microorganismo sin
formular y cultivado en pda durante 10 días).
• Condiciones físicas y ambientales: bioensayo montado en condiciones de labora-

torio con una temperatura de 25 ºC ± 1 ºC.
• Sistema de aplicación: aspersión del agente de control sobre esclerocios de S.

sclerotiorum.
• Montaje de la unidad experimental: una caja de Petri con suelo y cinco esclero-
cios de S. sclerotiorum.
• Signos del parasitismo: se evidencia un crecimiento micelial de color blanco y

una esporulación de color verde del hongo antagonista sobre los esclerocios del
patógeno.
• Parámetros de aceptación: el testigo absoluto no debe presentar parasitismo por

el agente biocontrolador ni contaminación. El coeficiente de variación entre las
réplicas de un mismo tratamiento debe ser menor al 30 %. La cepa de referencia
(aislamiento Th003 de T. koningiospsis) debe alcanzar un parasitismo superior al
80 %. El bioensayo se debe realizar bajo las condiciones de temperatura estable-
cidas anteriormente.
• Tratamientos: la aplicación del agente de control (bioplaguicida y cepa de refe-

rencia) y un testigo absoluto. Cada analista evaluó la metodología establecida tres
veces (tres repeticiones).
• Número de réplicas: se evaluaron tres réplicas por tratamiento.
• Unidades experimentales: una caja de Petri con suelo y cinco esclerocios de S.

sclerotiorum, asperjados y no asperjados con el agente de control.
• Variable respuesta: Porcentaje de parasitismo (ver el capítulo 3).

La metodología estandarizada fue la siguiente:
Cinco esclerocios desinfectados de S. sclerotiorum se dispusieron sobre 35 g ± 0,1 g

de suelo contenidos en una cada de Petri (figura 5.3). Posteriormente, se asperjaron
550 µl de una suspensión del agente control biológico ajustado a la concentración de
1 x 107 conidios.ml-1 sobre cada uno de ellos (unidad experimental o réplica). Cada
réplica (tres por tratamiento) se incubó a 25 ºC ± 1 ºC durante siete días en completa
oscuridad. Adicionalmente, se evaluó un testigo absoluto (esclerocios no asperjados
con el agente de control).

a b
Figura 5.3. Ubicación de los esclerocios de S. sclerotiorum sobre el suelo. a. Esclerocio
de S. sclerotiorum; b. Ubicación equidistante de los esclerocios sobre el suelo estéril.
Transcurrido dicho tiempo, se observó cada uno de los tratamientos y se cosecharon

los esclerocios de cada uno de ellos. Luego de su desinfección con alcohol al 70 % e
hipoclorito de sodio al 2 % y de enjuagues con agua estéril, estos se sembraron en
Agar agua con cloranfenicol y se incubaron bajo las mismas condiciones de tempe-
ratura por siete días más. Finalmente se determinó el porcentaje de parasitismo en
cada uno de los tratamientos.
Los resultados obtenidos para cada uno de los analistas se encuentran en la tabla 5.12.
Tabla 5.12. Porcentaje de parasitismo del bioplaguicida a base de T. koningiopsis sobre esclerocios de
S. sclerotiorum, obtenidos por cada analista
Consolidado por
analista
1 100,00 100,00 100,00 100,00 x 100,00
Analista 1 2 100,00 100,00 100,00 100,00 sd 0,00
3 100,00 100,00 100,00 100,00 cv (%) 0,00
(Continúa)
Consolidado por
analista
1 100,00 100,00 100,00 100,00 x 100,00
Analista 2 2 100,00 100,00 100,00 100,00 sd 0,00
3 100,00 100,00 100,00 100,00 cv (%) 0,00
Tanto para el analista 1 como para el analista 2 se obtuvieron porcentajes de parasi-

tismo del 100 % en todas sus evaluaciones, por lo que en ambos casos el coeficiente de
variación (cv) fue de 0 %. Lo anterior corrobora la repetibilidad la metodología esta-
blecida. Luego de transformar los porcentajes de parasitismo mediante la función de
arcoseno, se determinó la reproducibilidad, repetibilidad y el r&R (%) mediante la
metodología de promedios y rangos (tabla 5.13 y 5.14).
Tabla 5.13. Porcentaje de parasitismo del bioplaguicida a base de T. koningiopsis sobre esclerocios de
S. sclerotiorum transformados mediante la función arcoseno
1 1,00 1,00 1,00
Analista 1 2 1,00 1,00 1,00
3 1,00 1,00 1,00
1 1,00 1,00 1,00
Analista 2 2 1,00 1,00 1,00
3 1,00 1,00 1,00
Tabla 5.14. Rangos de medición obtenidos para cada analista y valores de repetibilidad, reproduci-
bilidad y de r&R (%) para la evaluación de la actividad biocontroladora del bioplaguicida a base de T.
koningiopsis sobre esclerocios de S. sclerotiorum
0,00 0,00
Rango por medición
0,00 0,00
0,00 0,00
r&R (%) 0,00
La metodología para evaluar la actividad biocontroladora del bioplaguicida a base

de T. koningiopsis sobre esclerocios de S. sclerotiorum presentó una repetibilidad del
0 %, una reproducibilidad del 0 % y un porcentaje de relación entre estos dos pará-
metros (r&R %) del 0 % (10 % ≤ r&R). Lo anterior sugiere que la metodología analí-
tica es repetible y reproducible en el tiempo y se aprueba para su uso y aplicación.
Por otra parte, los esclerocios tratados con la cepa de referencia (Th003) presentaron
un parasitismo del 100 % y estos, junto con los tratados con el bioplaguicida, presen-
taron un crecimiento micelial lanoso con una esporulación típicamente de color
verde en comparación con testigo absoluto (figura 5.4). Esta misma observación se
hizo con los esclerocios mantenidos en agar agua, lo cual corrobora el parasitismo
del agente biocontrolador (figura 5.5).
a b Fotos: Lissette Torres Torres
Figura 5.4. Evaluación de la actividad biocontroladora del bioplaguicida a base de T. koningiopsis

sobre esclerocios de S. sclerotiorum. a. Esclerocios de S. sclerotiorum germinados (testigo absoluto)
sobre suelo; b. Esclerocios de S. sclerotiorum parasitados por el agente de control biológico a base de
T. koningiopsis.

a b c
Figura 5.5. Confirmación de la actividad biocontroladora del bioplaguicida a base

de T. koningiopsis sobre esclerocios de S. sclerotiorum. a. Esclerocios de S. sclero-
tiorum (testigo absoluto) crecidos en agar agua; b. Esclerocios de S. sclerotiorum
parasitados por la cepa de referencia (Th003) de T. koningiopsis; c. Esclerocios de S.
sclerotiorum parasitados por el bioplaguicida a base de T. koningiopsis.
Caso de estudio II
El presente caso tuvo como objetivo estandarizar la metodología relacionada con la

determinación de la eficacia de Metarhizium anisopliae (Ascomycota: Clavicipitaceae)
sobre larvas de Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Crambidae). Para esto, a partir de
una misma muestra homogénea (el mismo cultivo del agente de control e insectos
de la misma edad), bajo las mismas condiciones, los mismos instrumentos, en el
mismo laboratorio y durante el mismo día, dos analistas evaluaron la metodología
establecida cinco veces cada uno (repetición). Adicionalmente, se tuvieron en cuenta
tres réplicas por repetición para cada uno de los tratamientos evaluados, los cuales
correspondieron a un testigo absoluto y al aislamiento del hongo entomopatógeno
en cuestión. Luego de la evaluación, se calcularon los estimadores estadísticos para
cada grupo de bioensayos realizados independientemente para cada analista (repeti-
bilidad) y entre ellos (reproducibilidad). Finalmente, se aplicó el método de prome-
dios y rangos (Llamosa et al., 2007; Paisan et al., 2010).
Para la estandarización de la metodología se definieron los siguientes criterios:
• Insecto plaga: Larvas de D. saccharalis de seis días de edad provenientes de la

Unidad de Crías del Laboratorio de Entomología de agrosavia en el Centro de
Investigación Tibaitatá.
• Agente de control: Hongo entomopatógeno M. anisopliae (aislamiento Mt004),

cultivado en agar papa dextrosa agar (pda) durante ocho a diez días.
• Condiciones físicas y ambientales: bioensayo montado en condiciones de labo-

ratorio con una temperatura de 25 ºC ± 3 ºC y humedad relativa de 36 % ± 5 %.
• Sistema de aplicación: inmersión durante 20 segundos en una suspensión del

agente de control ajustado a una concentración de 1 x107 conidios.ml-1.
• Montaje de la unidad experimental: un recipiente plástico de 0,5 oz con un grano

de maíz tierno y una larva viva del insecto.
• Síntomas y signos de la infección: se evidencian por un crecimiento micelial de

color blanco y una esporulación de color verde del hongo entomopatógeno sobre
el cuerpo del insecto.
• Parámetros de aceptación: la mortalidad en el testigo absoluto debe ser menor al

20 %. El coeficiente de variación entre las réplicas de un mismo tratamiento debe ser
menor al 30 %. El material de referencia (aislamiento Mt004 de M. anisopliae) debe
alcanzar un porcentaje de eficacia superior al 80 %. El bioensayo se debe realizar
bajo las condiciones de temperatura y humedad establecidas anteriormente.
• Repetibilidad y reproducibilidad: el coeficiente de variación de los datos obtenidos

por cada analista (repetibilidad, r) debe ser inferior al 10 %. La prueba T pareada
no debe arrojar diferencias significativas en los datos obtenidos entre los datos
obtenidos por los dos analistas (reproducibilidad, R). La relación entre r&R (%)
obtenida al aplicar el método de promedios y rangos debe ser r&R (%) < 10 % (se
aprueba) o 10 % ≤ r&R (%) ˂ 30 % (puede ser aceptable según su uso y aplicación).
• Tratamientos: la aplicación del aislamiento Mt004 y un testigo absoluto. Cada

analista evalúa la metodología establecida cinco veces (cinco repeticiones).
• Número de réplicas: se evalúan tres réplicas por tratamiento.
• Unidades experimentales: un recipiente plástico de 0,5 oz con un grano de maíz

tierno y una larva viva del insecto.
• Variable respuesta: porcentaje de eficacia (Zar, 1999).
La metodología de estandarización fue la siguiente:
La evaluación del agente de control a base de M. anisopliae sobre larvas de D. saccha-

ralis se realizó mediante la técnica de inmersión durante 20 segundos. Para ello, 15
larvas de seis días de edad fueron sumergidas en una suspensión del hongo con una
concentración final de 1x107 conidios.ml-1 (figura 5.6).
a b
Figura 5.6. Determinación de la eficacia de M. anisopliae sobre larvas de D. saccharalis. a. Inmer-

sión de las larvas de D. saccharalis en la suspensión del agente biocontrolador; b. Montaje de las
larvas de D. saccharalis luego de su inmersión en la suspensión del agente biocontrolador.
Posteriormente, cada larva se ubicó de manera individual en recipientes plásticos

de 0,5 oz con un grano de maíz (Zea mays) como sustrato de alimentación, lo cual
constituyó una réplica (figura 5.7). Igualmente, se evaluó un testigo absoluto con sus
tres réplicas. Finalmente, se registró la mortalidad hasta el noveno día posterior a la
inmersión, se calculó la eficacia (%) y se comprobó el crecimiento y la esporulación
del hongo entomopatógeno sobre el cuerpo del insecto mediante observaciones en el
estereoscopio y el montaje del microcultivo.

Figura 5.7. Montaje de la unidad experimental para determinar la actividad biocontro-
ladora de M. anisopliae sobre D. saccharalis.
Los resultados obtenidos en la evaluación de la actividad biocontroladora (morta-

lidad) del aislamiento Mt004 de M. anisolpliae sobre larvas de D. saccharalis bajo
condiciones de laboratorio están relacionados, para cada uno de los analistas, en la
tabla 5.15.
Tabla 5.15. Mortalidad expresada como eficacia (%) del aislamiento Mt004 de M. anisopliae sobre
larvas de D. sacchralis, obtenidos por cada analista
Consolidado por
analista
Analista 1 1 86,7 93,3 100,0 93,33 x 95,56
2 93,3 100,0 100,0 97,78 sd 2,22
3 93,3 93,3 100,0 95,56 cv (%) 2,33
Analista 2 1 93,33 86,67 86,67 88,89 x 91,85
2 86,67 100,00 86,67 91,11 sd 3,39
3 86,67 100,00 100,00 95,56 cv (%) 3,70
Para el analista 1 se obtuvieron porcentajes de eficacia del 86,7 % al 100 % con una
media del 95,56 % ± 2,22 % y un coeficiente de variación del 2,33 %. Para el analista
2, se obtuvieron porcentajes de eficacia del 86,67 % al 100 % con una media de 91,85
% ± 3,39 % y un coeficiente de variación del 3,70 %. Estos resultados establecieron
que la variabilidad de las evaluaciones para cada analista fue pequeña, lo cual se
refleja en el valor del coeficiente de variación obtenido (2,33 % y 3,70 %, respecti-
vamente). Los coeficientes de variación obtenidos fueron inferiores al 10 %, lo cual
corrobora la repetibilidad de las evaluaciones siguiendo la metodología establecida.
Los resultados obtenidos al realizar la Prueba T pareada determinaron un valor de

p del 0,1796 el cual, al ser mayor a 0,05, permitió la aceptación de la hipótesis nula.
Lo anterior indicó que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los
porcentajes de eficacia obtenidos entre los dos analistas y corroboró la reproducibi-
lidad de la metodología (tabla 5.8).
Tabla 5.16. Resultados de la prueba T pareada
Media 36,911
Error Estándar 25,096
Media H0 36,911
Lower 95 % ci -4,7434 -20,961
Upper 95 % ci 2,1914 94,783
T 1,47
df 8
Valor p 0,1796
Hipótesis nula (Ho): no hay diferencias estadísticamente significativas entre los

porcentajes de eficacia obtenidos por los dos analistas.
Hipótesis alterna (H1): hay diferencias estadísticamente significativas entre los

porcentajes de eficacia obtenidos por los dos analistas.
Luego de transformar los porcentajes de eficacia mediante la función de arcoseno

se confirmó la reproducibilidad y repetibilidad de la metodología por medio de la
aplicación del método de promedios y rangos (tabla 5.16 y 5.17).
Tabla 5.17. Mortalidad (porcentaje de eficacia) del aislamiento Mt004 de M. anisopliae sobre larvas de
D. saccharalis, transformados mediante la función arcoseno
1 0,93 0,97 1,00
Analista 1 2 0,97 1,00 1,00
3 0,97 0,97 1,00
1 0,97 0,93 0,93
Analista 2 2 0,93 1,00 0,93
3 0,93 1,00 1,00
Tabla 5.18. Rangos de medición obtenidos para cada analista y valores de repetibilidad (r), reprodu-
cibilidad (R) y de r&R (%) para la evaluación de la actividad biológica (mortalidad) del aislamiento
Mt004 de M. anisopliae
Rango por medición 0,04 0,09
0,07 0,1
0,07 0,09
r&R (%) 15,71
La metodología para evaluar la actividad biocontroladora del aislamiento Mt004 de

M. anisopliae sobre larvas de D. saccharalis presentó una repetibilidad del 13,84 %,
una reproducibilidad del 7,44 % y un porcentaje de relación entre estos dos paráme-
tros (r&R %) del 15,71 % (10 % ≤ r&R (%) ˂ 30 %). Lo anterior sugirió que la meto-
dología analítica es repetible y reproducible en el tiempo y se acepta para su uso y
aplicación.
Por otra parte, se corroboró el crecimiento y esporulación del hongo entomopatógeno

sobre el cuerpo de los insectos y se confirmó su identidad mediante el montaje de
microcultivos. El entomopatógeno se caracterizó por presentar micelio blanco, hifas
septadas, ramificadas y hialinas, así como conidios alargados que forman cadenas
originadas en fiálides de color verde (figura 5.8). Estas características concordaron
con las reportadas por Barnett & Hunter (1998) para M. anisopliae.
a b
Figura 5.8. Características microscópicas del aislamiento Mt004 de M. ani-
sopliae. a. Conidios aseptados, cilíndricos u ovoides; b. Conidios en cadena,
compactados en columnas.
Validación de metodologías analíticas
El principal objetivo de un laboratorio de análisis es reportar resultados altamente

confiables, por lo tanto, se debe controlar y asegurar la calidad de estos (Valencia,
2010a). En este sentido, se deben desarrollar procedimientos internos que permitan
asegurar la calidad de los resultados que se obtienen y emiten, en síntesis, es funda-
mental validar las metodologías analíticas que se utilizan. Como se ha mencionado en
los capítulos anteriores, se recomienda usar materiales de referencia o certificados. En
este sentido, para evitar recurrir a varios métodos para el cumplimiento de un mismo
objetivo, se debe tener en cuenta que los organismos de normalización ya tienen desa-
rrollados y validados métodos de referencia armonizados (Leclercq et al., 2019).
El siguiente apartado contiene información sobre los parámetros que se deben consi-
derar cuando se vaya a validar una metodología que va a ser empleada para control
de calidad. Sin embargo, es importante recordar que para que un proceso de vali-
dación sea exitoso, es imperativo que el laboratorio involucrado en el análisis esté
equipado adecuadamente para cumplir con los requisitos de bioseguridad y traza-
bilidad (Singh & Anannd, 2020). Asimismo, es fundamental tener en cuenta que
el método analítico a validar debe estar normalizado antes de iniciar el proceso de
validación (International Council for Harmonization of Technical Requeriments for
Pharmaceuticals [ich, q2a], 1995).
La validación garantiza que los requisitos para la realización de un ensayo se

cumplen, que las posibilidades de error en los resultados disminuyen y que las
técnicas son compatibles en las condiciones en que se está trabajando. El proceso
de validación permite evaluar si un método analítico es aceptable para su propó-
sito previsto (Raposo & Ibelli-Bianco, 2020). En suma, la validación es la manera de
demostrar que, por medio de evidencia documentada, el procedimiento analítico en
cuestión producirá de manera persistente y permanente resultados confiables.
Básicamente, existen dos tipos de validación según el objetivo que se quiere alcanzar:
validación primaria y validación secundaria. La validación primaria es un proceso
exploratorio que se emplea para establecer los límites operativos y las características
de un método nuevo o que ha sido modificado (Sartory, 2005). Por otro lado, la
validación secundaria o verificación se emplea cuando se van a usar metodologías
desarrolladas y validadas por terceros, como las metodologías de los ensayos fisi-
coquímicos. En este caso se deben tener en cuenta los parámetros evaluados por
quienes desarrollaron la metodología (Sartory, 2005).
Existen diferentes guías sobre métodos de validación que han sido publicadas para
brindar orientación al respecto (Raposo & Ibelli-Bianco, 2020). Aunque algunas
están dirigidas a otras áreas, pueden ser útiles en la validación de metodologías que
se utilizan de manera similar en los ensayos de control de calidad de bioplaguicidas
(tabla 5.19).
Tabla 5.19. Guías para la validación de metodologías analíticas
Nombre de la organización Sigla Área o disciplina Año

Collaborative International Pesticides Agrochemical
Analytical Council
Cipac
formulations
2003
The United States Pharmacopeia
usp Pharmaceutical 2016
Association of Analytical
Communities aoac Foods 2002
The International Council for

Harmonization of Technical ich Pharmaceutical 2005
Requeriments for Pharmaceuticals
The Organization of Economic Co-
operation & Development
oecd Biocides 2014
Fuente: Raposo & Ibelli-Bianco (2020)
Etapas en el desarrollo de la validación de una

metodología analítica y criterios de aceptación
No existe una guía oficial que enumere los pasos a seguir; esto dependerá del método
en sí mismo (Velandia, 2008). Sin embargo, a continuación se sugieren los pasos
generales que se deben seguir para la validación de una técnica (tabla 5.20).
Tabla 5.20. Pasos para tener en cuentan para la validación de técnicas de análisis
Proceso de validación
Paso 1 Paso 2 Paso 3 Paso 4 Paso 5 Paso 6
Metodologías Identificar:
que se pue- parámetros y
den validar: variables
Cualitativos Diseñar: experi-

Semicuanti- mentos estadísti- Compara- Método vali-
Obtención Análisis
tativos Cuan- camente (dee) ción con dado
de datos estadístico
titativos requisitos
Ejecutar: ensayos
de laboratorio
Medir: observa-
ciones
Según Velandia (2008), “la validación de un procedimiento analítico establece

mediante estudios de laboratorio que las características de desempeño del procedi-
miento cumplen con los requisitos para las aplicaciones analíticas previstas” (p 42).
Son precisamente esas características o criterios los que evidencian que el método
analítico permitirá obtener resultados confiables en el tiempo. De acuerdo con el
tipo de ensayo a realizar, algunos de los parámetros a tener en cuenta para su valida-
ción se presentan en la tabla 5.21 (Valencia, 2010b).
Tabla 5.21. Parámetros de validación a tener en cuenta de acuerdo con el tipo de ensayo de control
de calidad
Parámetros a tener en cuenta en la validación
Reproducibilidad
Repetibilidad
Especificidad
Tipo de ensayo
Linealidad
Exactitud
Precisión
Robustez
Microbiológico X X X X
Fisicoquímico X X X X X X
Biológico X X X X
A continuación, se aplicarán diferentes parámetros en el proceso de validación de

una metodología de recuento en placa para microorganismos. Es necesario tener en
cuenta que la validación aplica para metodologías establecidas por entes internacio-
nales como los establecidos en la tabla 5.19.
Parámetros de validación
1. Precisión: hace referencia a la distancia o alejamiento de los datos obtenidos de una

medida media o central (dispersión). Los datos de precisión proporcionan evidencia
sobre la aceptabilidad del protocolo (Jacobs et al., 2019). El objetivo es conocer la
variabilidad debida a “errores aleatorios inherentes a todo método de ensayo que no
pueden ser siempre controlados (analista, equipo, instrumental, reactivos, tiempo,
entre otros)” (Velandia, 2008, p. 30). Este parámetro suele expresarse en la forma de
“imprecisión” como desviación estándar absoluta (s o sd), desviación estándar rela-
tiva (rsd), coeficiente de variación (cv) o varianza (s2) (Buick et al., 1990).
2. Linealidad: de acuerdo con Velandia (2008), corresponde a “la capacidad del

método para proporcionar resultados que son directamente (o por medio de trans-
formaciones matemáticas) proporcionales a la concentración del analito en la
muestra dentro del rango establecido”. La linealidad es una relación entre la concen-
tración y la medida de valoración que se puede modelar mediante una línea recta que
describe con precisión la relación de la concentración versus la respuesta (usp, 2007).
Este tipo de modelo lineal es ideal, dado que facilita el trazado, la interpolación y la
interpretación de los datos (aefi, 2001). Sin embargo, no siempre es así (usp, 2007),
entonces el uso de modelos cuadráticos o modelos de regresión superior pueden ser
necesarios para evitar “puntos altamente influyentes” y desviaciones en bajos niveles
de concentración (Rasopo & Ibelli-Bianco, 2020).
Ejemplo 5.1. Linealidad entre dos métodos utilizada para cuantificar la concentración
de un microorganismo (resultado expresado como Log10 ufc/ml)
Método de referencia Método para validar

Log10 ufc/ml Log10 ufc/ml
4,50 4,32
4,60 4,62
4,58 4,70
5,42 5,30
5,87 6,00
4,40 4,32
4,65 4,62
4,68 4,70
5,32 5,30
5,97 6,00
4,44 4,32
4,67 4,62
4,68 4,70
5,22 5,30
6,02 6,00
Empleando los datos del ejemplo 5.1. se determinó el coeficiente de correlación (r) y
el error típico (Sxy):
• r = El coeficiente de correlación mide el grado de linealidad. En este caso corres-

ponde a 0,99.
• Sxy = El error típico es de 0,09.
3. Repetibilidad: es la confiabilidad de los datos obtenidos en una prueba. Este

análisis relaciona la variabilidad entre los resultados obtenidos de mediciones suce-
sivas con el método efectuado o una serie de análisis sobre la misma muestra en las
mismas condiciones operativas (por un mismo analista, con los mismos equipos y
reactivos, en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo corto) (aefi, 2001).
Como se mostró en la primera parte de este capítulo, la repetibilidad de un ensayo se
estima con el coeficiente de variación (cv) (desviación estándar relativa) de una serie
de medidas (aefi, 2001). Sin embargo, para procesos de validaciones, el límite de
repetibilidad r se define como la diferencia absoluta entre dos resultados de prueba
individuales independientes (transformados con log10) obtenidos utilizando el
mismo método, el mismo aparato dentro del intervalo de tiempo más corto posible,
con material de prueba idéntico, en el mismo laboratorio y realizados por el mismo
operador. No se debe exceder el valor r en > 5 % de los casos. Si la diferencia entre
la repetibilidad resultante dentro de un laboratorio excede r, los resultados pueden
necesitar más investigaciones (ejemplo 5.2) (Jacobs et al., 2019).
Ejemplo 5.2. Repetibilidad entre analistas en un proceso de validación
Para la validación de un método, tres analistas evaluaron por quintuplicado un

material de referencia (valor asignado de la cepa de referencia es: 5,36 log ufc/ml).
Los resultados del recuento de ufc se transformaron a logaritmo en base 10 para
normalizar la distribución y se obtuvieron los resultados presentados en la tabla 5.22.
Tabla 5.22. Resultados normalizados obtenidos del recuento de colonias de tres analistas
Log10 (ufc /ml)
Log10 (ufc /ml)
Log10 (ufc /ml)
Log10 (ufc /ml)

Log10 (ufc/ml)
Resultado 1
Resultado 2
Resultado 3
Resultado 4
Resultado 5
Desviación
Analistas
Promedio
Sr
Analista 1 5,70 5,71 5,69 5,64 5,72 5,69 0,03

Analista 2 5,68 5,67 5,66 5,61 5,64 5,65 0,03
Analista 3 5,75 5,78 5,80 5,81 5,77 5,78 0,02
Teniendo en cuenta los datos del ejemplo 5.1, se quiere estimar:
• La desviación estándar (repetibilidad) expresada como Desvest o σ n-1.
• La desviación estándar (reproducibilidad) entre analistas
• Sesgo expresado como Promedio laboratorio - valor asignado (cepa de referencia)
Para lograr lo anterior: en primer lugar, se calculó el promedio y la desviación

estándar de los datos obtenidos con cada uno de los analistas; en segundo lugar,
se estimó la repetibilidad de cada uno de los analistas (x < 5 %) con la desviación
estándar de sus replicados y, en tercer lugar, una vez estimada la desviación estándar
de la repetibilidad de cada uno de los analistas, se calculó una estimación global de
la desviación estándar de la repetibilidad. Para dicho fin, se obtuvieron los prome-
dios de las estimaciones de la desviación estándar de la repetibilidad de los analistas
empleando la ecuación 5.3:
( Sr1) 2 + ( Sr 2) 2 + ( Sr 3) 2
S=
3
Ecuación 5.6. Cálculo para determinar la repetibilidad.
El resultado S global (log10 ufc/ml) es 0,03.
4. Reproducibilidad: a diferencia de la repetibilidad, la reproducibilidad analiza la

capacidad de un método, ensayo o experimento de ser reproducido por otros bajo
condiciones operativas diferentes y en distintos laboratorios (aefi, 2001). También
se define como la medida de la dispersión de los resultados de ensayos realizados
sobre la misma muestra homogénea pero ejecutados por diferentes analistas en días
diferentes (ejemplo 5.3, tabla 5.13) (Calpena et al., 1991). Con la desviación estándar
de los datos obtenidos entre analistas se estima la reproducibilidad de la técnica. El
límite de reproducibilidad (R) se define como la diferencia absoluta entre dos resul-
tados de prueba únicos (transformados en log10) obtenidos utilizando el mismo
método, con material de prueba idéntico, en diferentes laboratorios y con diferentes
operadores que utilizan diferentes equipos. El valor R no debe superarse en > 5% de
los casos. Si la diferencia entre la reproducibilidad de los resultados entre laborato-
rios excede R, los resultados pueden necesitar investigaciones más profundas (Jacobs
et al., 2019).
Ejemplo 5.3. Reproducibilidad entre analistas.
Tabla 5.23 Análisis de datos obtenido entre analistas
Analistas Log10 (ufc /ml) Desviación (S / σ)
Analista 1 5,69 0,03

Desviación Sr (repetibilidad) 0,03
Desviación SR (reproducibilidad) 0,07
Con los datos obtenidos se calculó el sesgo: 5,71 - 5,36 = 0,35
Conclusiones del ejercicio expuesto: Con los resultados obtenidos se evalúa la aptitud
del laboratorio para realizar el ensayo:
Sr (log ufc /ml): 0,03
SR (log ufc /ml): 0,07
Sesgo (log ufc /ml): 0,35
5. Exactitud: expresa la cercanía entre el valor que se acepta convencionalmente

como verdadero (o un valor de referencia aceptado) y el valor encontrado experi-
mentalmente. En síntesis, la exactitud permite evaluar qué tan cercano se encuentra
el valor obtenido por un ensayo, método o equipo del valor medio (ich, q2a, 1995).
6. Especificidad: es la capacidad para evaluar inequívocamente el analito en la

presencia de componentes que se espera estén presentes. En otras palabras, la espe-
cificad hace referencia a la capacidad de un método, ensayo o equipo de obtener
un resultado verdaderamente negativo o positivo. Este análisis es importante, dado
que generalmente una muestra puede incluir impurezas, productos de degradación
o componentes del vehículo, entre otros (ich, q2a, 1995). Sin embargo, la carencia
de especificidad en un método puede ser compensada por otros procedimientos
analíticos.
La especificidad tiene las siguientes implicaciones:
Identificación: para asegurar la identidad de un analito.

Prueba de pureza: para asegurar que todos los procedimientos analíticos permitan
una declaración precisa del contenido de impurezas de un analito, por ejemplo,
sustancias relacionadas con el ensayo, límite de metales pesados, residuos de
solventes o productos de degradación. En este sentido, la prueba de pureza se lleva
a cabo para proveer un resultado exacto que garantice una declaración precisa del
contenido o potencia del analito en la muestra (ich, q2a, 1995).
7. Robustez: hace referencia a la capacidad de la metodología analítica, ensayo o

equipo de medición para no afectarse por pequeñas pero deliberadas variaciones en
los parámetros del método. El análisis de robustez tiene la propiedad de indicar la
confiabilidad de un método, equipo o ensayo durante su uso normal (ich, q2a, 1995).
En otras palabras, la robustez demuestra la capacidad del procedimiento de análisis
para proporcionar resultados válidos en presencia de pequeños cambios respecto de
las condiciones descritas en el método susceptibles de producirse durante su utiliza-
ción (aefi, 2001).
Caso de estudio para validar un método
Se analizó por quintuplicado una misma utilizando el método a validar y el método

de referencia (Peñaranda, 2010) para el recuento en placa de microorganismos.
Tabla 5.24. Datos brutos de recuento ufc/ml
ufc/g Log ufc/g

Método a Método de Método a Método de
validar referencia validar referencia
2.000 2.100 3,30 3,32
1.800 2.200 3,26 3,34
1.900 2.300 3,28 3,36
1.800 2.100 3,26 3,32
2.100 2.200 3,32 3,34
Promedio 3,28 3,34
S 0,03 0,02
F 0,30
• Se evaluaron las diferencias en la precisión entre ambos métodos mediante una

prueba de F. Para dicho fin, en Excel se colocó = prueba F (los datos del método a
validar y los datos del método de referencia). F= 0,98.
Con los datos se obtuvo la siguiente información:
Tabla 5.25. Análisis de datos con prueba F
Método a validar Método de referencia

Media 3,28 3,34
Varianza 0,03 0,02
Datos 5 5
Grados de libertad 4 4
α 0,05
F 3,107 F estadístico < valor crítico
P(F<f) una cola 0,14
Valor crítico para F (una cola) 6,388 (*) Valor límite
* El valor crítico se obtiene de la tabla Fisher
En conclusión, con un α 0,05 no se observaron diferencias estadísticamente signi-

ficativas entre la varianza de los dos métodos, por lo tanto, se aceptó el método a
validar bajo las condiciones establecidas en el procesamiento de muestras.
Referencias
Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria [aefi]. (2001). Validación de

métodos analíticos [Monografía]. Comisión de normas de buena fabricación
y control de calidad. aefi.
Altieri, M. A, Koohafkan, P., Giménez, E. H., & Division, W. (2012). Agricultura ver-
de: Fundamentos agroecológicos para diseñar sistemas agrícolas biodiver-
sos, resilientes y productivos. Agroecología, 7(1), 7-18. https://revistas.um.es/
agroecologia/article/view/170961
Arango, M., Gómez M., Rodrigo A., & Zapata, J. (2013). Medición y mejoramiento
de la operación de despacho de carbón a través de modelos estadísticos r&R.
Boletín de Ciencias de la Tierra, 33(1), 135-146.
Barros, I., & Tavares, M. (1995). Estimativa do tamanho ótimo de parcelas experi-
mentais através de cálculos algébricos. Bragantia, 54(1), 209-215. https://doi.
org/10.1590/S0006-87051995000100024
Betancourt, L., & García, J. (2018). Estandarización de técnicas para la caracteriza-

ción química se los plastificantes usados en la producción de botas en pvc para
la empresa Croydon Colombia. Fundación Universidad de América.
Botero-Arbeláez, M., Mendoza-Vargas, J., & Arbeláez-Salazar, O. (2007). Método
Anova utilizado para realizar el estudio de repetibilidad y reproducibilidad
dentro del control de calidad de un sistema de medición. Science & Technol-
ogy, 13(37), 533-537, https://doi:10.22517/23447214.4181
Bowman, D. T., & Rawlings, J. O. (1995). Establishing a rejection procedure for crop
performance data. Agronomy Journal, 87(1),147-151.
Buick, A. R., Doig, M. V., Jeal, S. C., Land, G. S., & McDowall, R. D. (1990). Method
validation in the bioanalytical laboratory. Journal of Pharmaceutical and Bio-
medical Analysis, 8(12), 629-637. https://doi:10.1016/0731-7085(90)80093-5
Calpena, A. C., Escribano, E., & Fernández, E. (1991). Validación de los métodos
analíticos. Farmacología Clínica, 7(9), 749-758.
Cuevas, M. D. C., Pinette, G., López-Hidalgo, A. M., Cruz-Sanches, J. S., Nieto-Peña,
M. De L. (2012). Requerimientos de control de calidad en bioensayos. En M.
C. Cuevas, G. Espinosa, C. A. Ilizaliturri, A. Mendoza, M. Montejo (Eds.),
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hi-
drocarburos (pp. 127-135).
Gómez, K. A., & Gómez A. A. (1984). Statistical procedures for agricultural research.
Wiley-Interscience Publication.
González, G., & Falcón, C. (2015). Procedimiento para el análisis de repetibilidad y
reproducibilidad en procesos de manufactura. Revista Cubana de Ingeniería,
6(3), 53-59.
Górdon-Mendoza, R., & Camargo-Buitrago, I. (2015). Selección de estadísticos para
la estimación de la precisión experimental en ensayos de maíz. Agronomía
Mesoamericana, 26(1), 55-63.
Gutiérrez, H., & De La Vara, R. (2004). Análisis y diseño de experimentos. McGraw
Hill.
Hrvat, F., Cifric, S., Aleta, A., Dzuho, A., Pokvic, L. G., & Badnjevic, A. (2020). ISO/
IEC 15189 Implementation in Microbiology Laboratory - General Concepts.
IEEE International Workshop on Metrology for Industry 4.0 & IoT, 2020, pp.
611-616, https://doi:10.1109/MetroInd4.0Io8571.2020.9138169
International Council for Harmonization of Technical Requeriments for Pharmaceu-

ticals [ich, Q2A]. (1995). Validation of analytical procedures: Definitions and
methodology. https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guide-
line/ich-q-2-r1-validation-analytical-procedures-text-methodology-step-5_
en.pdf
Jacobs, W., Jongenburger, I., De Boer, E., & Biesta, E. (2019). Validation by interlab-
oratory trials of en iso 10272-Microbiology of the food chain-Horizontal
method for detection and enumeration of Campylobacter spp.-Part 2: Colo-
ny-count technique. International Journal of Food Microbiology, 288(1), 32-
38. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2018.05.008
Jarosova, E. (2020). The use of D-optimal design in an expanded gauge R&R study.
Quality Engineering, 33(1),1-9. https://doi.org/10.1080/08982112.2020.1745233
ilar.43.4.202
Leclercq, A., Hardouin, G., & Lombard, B. (2019). European and International vali-
dation of 15 main reference methods in the microbiology of the food chain.
International Journal of Food Microbiology. 288(1), 1-2. https://doi:10.1016/j.
ijfoodmicro.2018.10.024
Llamosa, L. E., Meza, L., & Botero, M. (2007). Estudio de repetibilidad y reproducibi-
lidad utilizando el método de promedios y rangos para el aseguramiento de
la calidad de los resultados de calibración de acuerdo con la norma técnica.
Scienthia et Technica, 1(35), 455-460. https://doi.org/10.22517/23447214.5479
Manterola, C., Grande, L, Otzen, T., García, N., Salazar, P., & Quiroz, G. (2018).
Reliability, precision or reproducibility of the measurements. Methods of as-
sessment, utility and applications in clinical practice. Revista chilena de in-
fectología, 35(6), 680-688, https://doi.org/10.4067/S0716-10182018000600680
Martínez, R. & Martínez, N. (1997). Diseño de experimentos. Análisis de datos es-
tándar y no estándar. Fondo Nacional Universitario. Universidad Nacional
de Colombia.
Milliken, G. & Johnson D. (1992). Analysis oh Messy Data. Volumen 4. Basics of Ex-
perimental Desing. Chapman & Hall/crc. Press Company.
Mosquera, C., & López, E. (2007). Comparación entre los métodos de evaluación de
incertidumbre y estudios de repetibilidad y reproducibilidad para la evalua-
ción de las mediciones.Muñoz-Rojas, J., Morales-García, Y. E., Baez-Roge-
lio, A., Quintero-Hernández, V., Rivera-Urbalejoa, A. P., & Pérez-Terrrón, R.
(2016). Métodos económicos para la cuantificación de microorganismos. En
G. Chavira-Juárez (Ed.), Instituciones de educación superior la labor investi-
gadora e innovadora en México (pp. 67-84).
Paisan, Y., & Moret, J. (2010). La repetibilidad y reproducibilidad en el aseguramien-
to de la calidad de los procesos de medición. Revista Tecnología Química
30(2), 117-121.Parada, M. & Muñoz, C. (2015). Bioinsumo de uso agrícola: po-
tencialidades y desafíos. https://agriculturers.com/bioinsumos-de-uso-agri-
cola-potencialidades-y-desafios/
Patel, J. K., Patel, N. M., & Shyani, R. L. (2001). Coefficient of variation in field exper-
iments and yardstick thereof - An empirical study. Current Science, 81(9,10),
1163-1164.
Peñaranda, S. (2010). Memorias: Validación de los métodos microbiológicos. Análisis
estadístico de los resultados. Pontificia Universidad Javeriana.
Raposo, F., & Ibelli-Bianco, C. (2020). Performace parameters for analytical method
validations: Controversies and discrepancias among numerous guidelines.
Trends in analytical chemistry, 129, 115913, 1-10. https://doi.org/10.1016/j.
trac.2020.115913Ravensberg, W. (2011). Quality control. En J. Grould, K.
Hoelmer y J. Goolshy (Eds.), A roadmap to the successful development and
commercialization of microbial pest control products for control products for
control of arthropods (pp. 129-197). Springer.
Riera, L., Lugo, S., Sosa, I., Entrena, A., Acevedo, M., Tabares, T., Llanes, H., Fer-
nández, N., Joglar, I., Otaño, A., Zamora, Z., Negrín, N., González, A., Ro-
dríguez, K., Muñoz, E., Crespo, E., Peña, M., & Chala, T. (2008). Quality
Assurance Programs in the Production of Laboratory Animals. Revista de
Salud Animal, 30(1), 12-16.
Sartory, D. P. (2005). Review Validation, verification and comparison: Adopting new
methods in water microbiology. Water Sa, 31(3), 393-396.
Schmildt, E. R., Silva, W., Ambrosio, J., Schmildt, O., Nascimento, A. L., & Fernan-
des, A. A. (2017). Coeficiente de variação como medida da precisão em ex-
perimentos de alface. Revista agro@Mbiente on-line, 11(4), 290, http://doi.
org/10.18227/1982-8470ragro.v11i4.4412
Segnini, S. (2004). Fundamentos de Bioestadística. Universidad de los Andes.
Singh, N., & Anand, A. (2020). Analytical Methods J Microbiological. Reference
Module in Food Sciences.
United States Pharmacopeial 30 edition. [usp 30]. (2007). Rockville: Mack printing.
Vargas, J. C., & Navarro, J. R. (2019). Tamaño y forma de unidad experimental para
ensayos de rendimiento de arroz (Oryza sativa), en Guanacaste, Costa Rica.
uned Research Journal, 11(3), 355-360, https://doi.org/doi:10.22458/urj.
v11i3.2653
Vargas, J. C., Vega, E. V., & Cerdas, R. (2020). Tamaño y forma de la unidad experi-
mental en ensayos de rendimiento de Brachiaria híbrido CIAT 3608. Pastos
y Forrajes, 43(2), 144-149.
Vásquez, R., & Caballero, A. (2011). Inconsistencia del Coeficiente de Variación para
expresar la variabilidad de un experimento en un modelo de Análisis de Va-
rianza. Cultivos tropicales. 32(3). 59-62.
Velandia, J. (2008). Validación del método analítico para la cuantificación de baci-
tracina en el laboratorio de control de calidad de una industria farmacéutica
verterinaria. Microbiología Industrial. Pontificia Universidad Javeriana.
Valencia, L. (2010a). Estrategias para la validación de métodos de análisis microbio-
lógicos. Colombia: Curso validación de métodos microbiológicos, Programa
de Educación Continua, Pontificia Universidad Javeriana (no publicado).
Valencia, L. (2010b). Validación de métodos de ensayos. Colombia: Curso validación
de métodos microbiológicos, Programa de Educación Continua, Pontificia
Universidad Javeriana (no publicado).
Vocabulario Internacional de Metrología (vim). (2012). Conceptos fundamentales y
generales, y términos asociados. Centro Español de Metrología.
Wayne, D. (2006). Bioestadística. Limusa.
Zar, J.H. (1999). Biostatistical analysis. Prentice Hall.
231
Glosario
Bioplaguicida: compuestos que incluyen sustancias naturales que controlan plagas

(plaguicidas bioquímicos), microorganismos que controlan plagas (plaguicidas
microbianos) y sustancias plaguicidas producidas por plantas que contienen mate-
rial genético agregado, como protectores incorporados en las plantas (pip) (United
States Environmental Protection Agency [us epa], 2019).
Blastospora: célula vegetativa (similar a una levadura) producida por diversos

hongos entomopatógenos que es capaz de germinar e infectar insectos de forma más
rápida que un conidio (Lacey, 2017).
Concentración letal media: concentración de un patógeno o agente que produce

la muerte de la mitad de los individuos evaluados. El método experimental no es
suficiente para determinar la dosis precisa a la que los individuos evaluados fueron
expuestos. Su símbolo es CL50 (difiere de la dosis letal media) (Lacey, 2012).
Conidio: espora especializada de reproducción asexual que se forma en el extremo

de una hifa a partir de un conidióforo. Permite la dispersión del hongo hacia nuevos
hábitats (Rey et al., 2017).
Conidióforo: hifa especializada sobre la cual se forman conidios externamente

(Cepero et al., 2012).
Dosis letal media: dosis con la cual se produce la mitad de la muerte de los indivi-
duos evaluados. Su símbolo es DL50) (Lacey, 2012).
Epicarpo: es la parte más externa que suele proteger al resto del fruto del exterior. El
epicarpio forma la epidermis protectora del fruto que, a menudo, contiene glándulas
con esencias y pigmentos. En muchas frutas se llama comúnmente piel (EcuRed, s. f.)
Error experimental: son aquellas variaciones o alteraciones en los resultados

debidos a factores no controlados o no conocidos. Al error se le atribuye la diferencia
que se presenta entre unidades experimentales tratadas idénticamente. Las princi-
pales fuentes de error están relacionadas con la variabilidad natural existente en el
material sobre el cual se aplican los tratamientos; la falta de uniformidad con que se
manejan las unidades experimentales; errores en la observación y en la medición y
efectos combinados de factores extraños (Gómez, 1997).
Excipiente: grupo de auxiliares de formulación, inertes y que deben proteger y

liberar al ingrediente activo (Díaz et al., 2018).
Experimento/Bioensayo: es un proceso por medio del cual se obtiene una obser-

vación o medición. Un bioensayo es un experimento aleatorio cuyos resultados no
pueden predecirse y, por lo tanto, están sujetos al azar. Asimismo, los bioensayos
incluyen tres etapas: planeación, ejecución y análisis e interpretación de resultados
(Gómez, 1997). También corresponde a una prueba experimental de control de
calidad realizada en un laboratorio o invernadero que permite verificar la actividad
biológica de un insumo de uso agrícola (ica, 2011).
Flóculo: signo de inestabilidad de una emulsión en el cual las gotas de la fase interna
se unen y forman agregados debido a las fuerzas de atracción de Van der Waals
(Aranberri et al., 2006).
Ingrediente o principio activo: componente de una formulación que ejerce la acti-

vidad biológica. Puede incluir un microorganismo, extracto vegetal, metabolito,
entre otros. (Díaz et al., 2018).
Insecto alterno: insecto sobre el cual se evalúa la actividad biológica de un agente de

control biológico el cual, en principio, está dirigido para el control de otro (insecto
blanco). Surge como una alternativa cuando la consecución del insecto blanco es una
limitación.
Líquidos inmiscibles: líquidos que no se mezclan (Brown et al., 1997).
Microesclerocio: agregados hifales compactos y pequeños, frecuentemente melani-

zados, con tolerancia a la desecación, productores de compuestos secundarios que
pueden ser antibacteriales, antifúngicos o interrumpir la alimentación en insectos
(Cooke, 1983 citado por Lacey, 2017).
Glosario 233
Surfactante: contracción del término agente de la superficie activa, es una sustancia

que cuando está presente en bajas concentraciones en un sistema tiene la propiedad
de adsorberse sobre la superficie o interfase de este y alterar la energía libre presente
en la superficie o interfase (Rosen & Kunjappu, 2012).
Testigo absoluto: corresponde a los individuos control en un bioensayo y, por lo

tanto, no reciben ningún tratamiento, ninguna aplicación y se disponen en la unidad
experimental correspondiente (Lacey, 2012).
Testigo tratado: corresponde a un tratamiento control. A los individuos de este

tratamiento se les coloca el vehículo de aplicación sin el principio activo a evaluar.
En este caso, la sustancia es generalmente inocua y se usa sola, administrada de la
misma manera que el tratamiento (Johnson & Besselsen, 2002).
Tiempo letal medio: periodo de tiempo de exposición a un patógeno en el cual se

produce la muerte en la mitad de los individuos sometidos a prueba (Lacey, 2012).
Tratamiento: los tratamientos son las condiciones experimentales que se desean

comparar en un experimento (Johnson & Besselsen, 2002).
Unidad experimental: es la unidad o individuo al cual se le aplica un tratamiento

(Gould, 2012).
Referencias
Aranberri, I., Binks, B. P., Clint, J. H., & Fletcher, P. D. I. (2006). Elaboración y carac-
terización de emulsiones estabilizadas por polímeros y agentes tensioactivos.
Revista Iberoamericana de Polímeros, 7(3), 211-231.
Brown, T. L., Lemay, H. E., Bursten, B. E., Murphy, C. J., Woodward, P. M., & Stoltz-
fus, M. W. (1997). Chemistry: The central science. Pearson.
Cepero, M., Restrepo, S., Franco-Molano, A., Toquica, M., & Estupiñán, N. (2012).
Biología de hongos. Uniandes.
EcuRed. (s. f.). Enfermedades del cultivo de la papaya. https://www.ecured.cu/Enfer-

medades_del_cultivo_de_la_papaya.
Gould, A. L. (Ed.). (2015). Statistical methods for evaluating safety in medical product
development. John Wiley & Sons.
Instituto Colombiano Agropecuario [ica]. (2011). Resolución 000698 de 2011 “Por
medio de la cual se establecen los requisitos para el registro de departamentos
técnicos de ensayos de eficacia, productores e importadores de bioinsumos de
uso agrícola y se dictan otras disposiciones”. https://www.ica.gov.co/getatta-
chment/225bd110-d1c4-47d7-9cf3-43745201e39a/2011R698.aspx
ilar.43.4.202
Rey, A., Garea, M., & Lago, J. C. (2017). Glosario micológico y acepciones complemen-
tarias o afines. Agrupación Micótica A. Zarrota.
Rosen, M. J. & Kunjappu, J. T. (2012). Surfactants and interfacial phenomena. Wiley
Online Library.
United States Pharmacopeial. 30 ed. [usp 30]. (2007). Rockville: Mack printing.
235
Medios de cultivo y soluciones
Medios de cultivo
• Agar avena
Preparación para un litro:
25 g de avena en hojuelas
18 mg de agar
Completar volumen con agua destilada a 1000 ml
• Agar agua
18 g de agar
500 g de cloranfenicol
• Agar infusión cerebro corazón (bhi)

37 g de Infusión cerebro corazón
18 g de agar
• Agar extracto de levadura (ym)

3 g de extracto de levadura
3 g de extracto de malta
10 g de sacarosa
5 g de peptona
18 g de agar
• Agar extracto de malta

5 g de extracto de malta
3 g de sacarosa
5 g de peptona
18 g de agar
• Agar extracto de levadura peptona dextrosa (ypd)

20 g de peptona
20 g de glucosa
18 g de agar
• Agar Luria Bertani (lb)

10 g de triptona
10 g de cloruro de sodio
18 g de agar
• Agar nutritivo
28 g agar nutritivo
5 g de agar
Medios de cultivo y soluciones 237
• Agar papa dextrosa (pda)

2 g de sacarosa
39 g de agar pda (papa dextrosa agar)
• Agar papa dextrosa (pda) suplementado con Tritón X 100 (1 %)

2 g de sacarosa
39 g de agar pda (papa dextrosa agar)
1 ml de Tritón X 100
1 g de cloranfenicol
• Agar rosa de bengala

5 g de peptona
10 g de glucosa
1 g de fosfato dipotásico
0,5 g de sulfato de magnesio
0,05 g de rosa de bengala
18 g de agar
• Agar Sabouraud dextrosa

65 g de agar Sabouraud
2 g de agar
• Trichoderma selective media

0,2 g de sulfato de magnesio MgSO4∙7H2O.
0,9 g de fosfato de potasio
0,15 g de cloruro de potasio
1 g de nitrato de amonio
3 g de glucosa
0,15 g de rosa de bengala
18 g de agar
03 g de ácido difenilamin-4-sulfónico
0,2 g de pentaclorobenceno
Soluciones
• Solución de agua peptonada al 0,1 %

1,85 g de agua peptona
• Solución de Tween 80 al 0,1 %

1 ml de Tween 80
Esta publicación tiene por objeto dar a conocer los estudios a nivel mundial y las experiencias
de AGROSAVIA en control de calidad de bioinsumos agrícolas, con especial énfasis en parámetros
microbiológicos, fisicoquímicos y biológicos de plaguicidas microbianos. El uso de microorga-
nismos con interés comercial implica diferentes etapas y los controles son de gran importancia
para asegurar la máxima eficacia en campo; sin embargo, actualmente existen muy pocos
reportes en los que se detallen los métodos y los procesos de aseguramiento para obtener
resultados confiables y veraces. En ese sentido, esta obra constituye un aporte que permitirá,
además, mejorar e implementar metodologías de control de calidad rutinario de bioinsumos
agrícolas.
CORREO: [email protected] www.agrosavia.co

TELÉFONO: (57 601) 422 73 00 EXT. 1257 o 1274 Distribución gratuita
SKYPE: biblioteca.agropecuaria Prohibida su venta

Control de Calidad Plaguicidas

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Control de Calidad Plaguicidas

Cargado por

Información del documento

Descripción original:

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Control de Calidad Plaguicidas

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Plaguicidas microbianos:

Adriana Marcela Santos Díaz

Colección Transformación del Agro

Adriana Marcela Santos Díaz

Mosquera, Colombia, 2022

Colección Transformación del Agro

240 páginas (Colección Transformación del Agro)

1. Microorganismos 2. Agentes de control biológico 3. Control de calidad 4. Plaguicidas 5. Métodos

Palabras clave normalizadas según Tesauro Multilingüe de Agricultura Agrovoc

Esta publicación es resultado de la experiencia adquirida Cláusula de responsabilidad: agrosavia no es respon-

Control de calidad microbiológico de bioplaguicidas a base

Identificación del agente de control biológico 30

Cuantificación del principio activo 31

Viabilidad de principio activo 42

Contenido de contaminantes: pureza 56

Control de calidad fisicoquímico de bioplaguicidas microbianos 67

Bioplaguicidas microbianos sólidos 68

Control de calidad de bioinsumos recomendados para

Criterios para la elaboración de los controles de calidad

Caso de estudio 128

Control de calidad de la actividad biológica contra insectos 143

Criterios biológicos 144

Criterios de evaluación 154

Caso de estudio 168

Aseguramiento de resultados aplicables a metodologías

Estandarización de métodos 183

Criterios de calidad de resultados 191

Criterios estadísticos 193

Casos de estudio 199

Validación de metodologías analíticas 216

Medios de cultivo y soluciones 234

Figura 1.1 Secciones de la cámara de Neubauer y dimensiones de

Tabla 1.1 Metodologías utilizadas para la determinación de la

Adriana Marcela Santos Díaz

Magíster en Ciencias Bioquímicas de la Universidad Nacional de Colombia y micro-

Erika Paola Grijalba Bernal

Magíster en Ciencias Biológicas con énfasis en Microbiología de la Universidad de

under glasshouse conditions”, “Bacterias entomopatógenas en el control biológico de

Lissette Torres Torres

Bióloga con experiencia en procesos de registro ante el Instituto Colombiano

Liz Alejandra Uribe Gutiérrez

Microbióloga industrial de la Pontificia Universidad Javeriana y magíster en

Las autoras agradecemos a la Corporación Colombiana de

Las autoras expresamos un especial agradecimiento a los doctores

Asimismo, agradecemos al Departamento de Laboratorios de

A diferencia de los plaguicidas de síntesis química, los cuales se

La idea de controlar insectos plaga y enfermedades mediante

En general, los bioplaguicidas a base de microorganismos pueden incluir como prin-

Por lo tanto, el control de calidad es de gran importancia para garantizar la produc-

predeterminadas y generen la eficacia dentro de las condiciones establecidas para

2. El control de calidad durante el proceso es un procedimiento destinado a garan-

3. El control de calidad del producto terminado (bioplaguicida) es un proce-

Dicho sistema de control de calidad en cada fase de producción asegura la máxima

Actualmente, la disponibilidad de metodologías estandarizadas es limitada y existen

Ravensberg, W. (2011). Quality control. En J. Grould, K. Hoelmer, & J. Goolshy

En el proceso de producción de bioplaguicidas, el

A continuación se describen las metodologías de

hará énfasis, principalmente, en técnicas analíticas para establecer los parámetros

En general, los parámetros de calidad microbiológica para bioplaguicidas produ-

UFC 1,56109 + 3, 40109