Análisis Químico Instrumental

QMC 208

PRACTICA N° 04
CALIBRACIÓN METODOLOGICA

FUNDAMENTO TEORICO

La calibración metodológica o analítica, es una operación necesaria para algunos métodos

de análisis en los cuales no basta con una calibración instrumental. Los métodos utilizados
en un laboratorio analítico se pueden clasificar en dos grandes grupos:

Métodos clásicos:
Son los métodos más antiguos utilizados para medir la cantidad de sustancia en una
muestra. La gravimetría y volumetría son ejemplos de ellos. Se caracterizan por ser
métodos de alta precisión, mayor que la de los análisis instrumentales. Son considerados
métodos absolutos porque es posible encontrar una relación directa entre la medida analítica
y la concentración analítica sin necesitar de estándares o patrones que contengan el analito
en cuestión, tan solo utilizan reacciones químicas y coeficientes estequiométricos para
calcular la concentración final de analito (Valcárcel y Ríos, 1992).

Métodos instrumentales:
Son métodos que utilizan técnicas más modernas, como son las técnicas ópticas, térmicas,
radioquímicas, másicas, etc. Suelen tener gran sensibilidad y gran capacidad de analizar, de
forma rápida, muchas muestras. Además, al usar instrumentos y técnicas más avanzadas,
los resultados de los análisis están computarizados y automatizados.

Aun así, los métodos instrumentales presentan una desventaja frente a los clásicos, son
menos precisos y esto es debido al error de calibración. Las técnicas instrumentales son
técnicas relativas, la señal obtenida de la medición de la muestra a analizar se compara con
otras medidas para determinar la concentración analítica. Los patrones utilizados ya
contienen un error de medida, y este error se arrastra y se añade al resto de errores, tanto
aleatorios como sistemáticos, que aparecen en el proceso de calibración, incrementando el
posible error de la determinación de la concentración (Valcárcel, 1999).

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A diferencia de lo que ocurre con los métodos clásicos, los métodos instrumentales requieren
el uso de estándares químico-analíticos adecuados que contengan el analito a estudiar. Y la
forma más común de determinar la concentración de una muestra usando estándares pasa
por la elaboración de gráficas de calibrado con la correspondiente recta de calibración.

El procedimiento para elaborar las gráficas de calibrado es el siguiente: se toman una serie
de patrones de calibración de los que se conoce la concentración del analito. Estos patrones
se miden en el instrumento analítico, y se representa gráficamente la concentración de cada
uno de los patrones frente a las respuestas de medición. Una vez elaborada la gráfica de
calibrado, se puede obtener mediante interpolación (menos en algún caso que se hace por
extrapolación) la concentración de la muestra a determinar midiendo ésta con el instrumental
analítico en las mismas condiciones en las que se hizo la medida de los patrones (Miller y
Miller, 2002). Para ello, es necesario encontrar la forma de obtener una curva de calibración
lo más recta posible, ajustándose a una serie de puntos experimentales, donde cada punto
se encuentra definido por una variable X (variable independiente, concentración del analito) y
una variable Y (variable dependiente, respuesta instrumental) (Riu y Boqué, 2003).

Los puntos de calibración tienen un error aleatorio causado por la respuesta instrumental, en
el valor de Y. Hay que buscar la mejor recta que pase por los puntos de calibración y calcular
la ordenada en el origen y la pendiente de la misma. El método usado para conseguir una
recta que pase por los puntos de calibración, se conoce como regresión lineal simple o
método de los mínimos cuadrados (Coello y Maspoch, 2007).

Además de las propiedades analíticas (supremas, básicas y complementarias), existen una

serie de parámetros o propiedades que se determinan a partir de la curva de calibración, que
también van a ser importantes para valorar la calidad de un método (Figura No 01). Son los
siguientes (PAHO, 2008):

- Linealidad:

Se define como la capacidad del método para proporcionar resultados que son
directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro del

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intervalo de trabajo. A partir de la curva de calibración, se puede obtener la ecuación de

la recta de la que se obtiene un coeficiente de correlación r2. Para una buena garantía
de linealidad, será conveniente medir en cinco niveles de concentración, que abarquen
el intervalo de trabajo, y repetir este proceso tres veces. Se considera que un valor de r2
representa un buen ajuste lineal, cuanto más próximo a 1 se encuentre.

- Límite de detección:

Se define como la cantidad mínima de analito en la muestra que se puede detectar,

aunque no necesariamente cuantificar bajo unas condiciones establecidas. Existen
diferentes procedimientos para determinar este límite, uno de ellos es usando la curva
de calibración mediante la relación entre tres veces la desviación estándar de la
respuesta lineal Sb, y la sensibilidad que en la ecuación de la recta corresponde a la
pendiente b. Se calcula midiendo una señal de un blanco más tres veces su desviación
estándar.

3𝑥𝑆𝑏
𝐿𝐷 = 𝑏

- Límite de cuantificación:

Es la mínima cantidad de analito presente en la muestra que se puede cuantificar, bajo

unas condiciones establecidas para dicho método, con una exactitud y precisión
adecuada. El método de determinarlo es casi idéntico al del límite de detección, se
distingue en que este requiere una relación de diez veces la desviación estándar frente
a la pendiente. Se calcula midiendo una señal de un blanco más diez veces su
desviación estándar.

10𝑥𝑆𝑏
𝐿𝐶 = 𝑏

- Rango o intervalo lineal:

Se define como el intervalo de concentración en que el analito puede ser determinado

mediante la curva de calibración. Esta comprendido entre el límite de cuantificación y el
punto en el que la curva deja de ser lineal.

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Figura No 01. Parámetros relacionados con la calibración metodológica

OBJETIVO:
Los principales objetivos de la práctica se centran en familiarizar al alumno con los
diferentes métodos de calibración metodologica y su aplicación

 Método simple, directo o del estándar externo

 Método de la adición de un estándar o adición patrón
 Método del patrón interno

1. MÉTODO SIMPLE, DIRECTO O DEL ESTÁNDAR EXTERNO

Un estándar o patrón externo, es aquel que se prepara fuera de la muestra problema. Se

aplica este método cuando se desea determinar la concentración de un analito en la que, ni
los componentes de la matriz de la muestra ni los reactivos usados en el procedimiento
interfieren en el análisis. También se puede usar en el caso en que las interferencias se
conozcan y se

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mantengan siempre constantes en las medidas, con lo cual se podrán corregir estas
posteriormente (Sánchez, 2016).

Procedimiento:
Se preparan una serie de estándares externos de concentración conocida. La cantidad
óptima de estándares debe ser como mínimo de tres a cinco, aunque en análisis rutinarios se
podrá confiar en calibraciones con dos patrones. Se mide las señales y se representan frente
a la concentración de los patrones obteniendo una línea recta. Previa a las medidas de los
estándares, se utiliza un blanco, que es una muestra idéntica al problema, pero sin el analito.
El blanco corrige la respuesta analítica original (Figura No 02) (Skogg y cols., 2005).

Señal analítica

concentración
Figura No 02. Esquema del procedimiento de una calibración directa.

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Ventajas: método simple y rápido. Usando un número necesario de patrones se puede

analizar múltiples muestras.

Inconvenientes: este método se basa en la suposición de que la respuesta instrumental del

analito en la muestra será la misma que la respuesta del analito en la muestra patrón.
Aunque se corrige con blanco, hay muchos factores que pueden hacer que esta suposición
no se cumpla. Los más comunes son: los efectos de la matriz, la contaminación de muestras
durante la preparación y la incorrecta elaboración de blancos o patrones.

Aplicación: la calibración por el método de estándar externo se ha aplicado en

la determinación de norisoprenoides en frutas y verduras. Así, en el estudio llevado a cabo
por Stinco y cols. (2014) se desarrolla y valida un método cromatográfico que permite
determinar nueve carotenoides, cuatro tocoferoles y cuatro clorofilas. Las curvas de calibrado
presentan una buena linealidad en un amplio rango de concentración (Figura 10).

Figura 10. Gráfica de determinación de isoprenoides por calibración simple.

A partir de la ecuación de la recta de calibrado se calculan las concentraciones de las

muestras problemas por interpolación en la misma.

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2.Método del patrón interno

Método utilizado para compensar errores debidos a fluctuaciones debidas a la técnica

analítica. Los patrones internos, además, se consideran muy útiles, cuando la concentración
de la muestra o la respuesta instrumental varia cada vez que se utiliza, por razones
desconocidas y difíciles de controlar. También es un método de utilidad cuando se producen
perdidas del analito durante el proceso.

Se utiliza como estándar interno, una sustancia diferente al analito pero que tengan
propiedades físico-químicas similares, provocando que se vean afectadas de forma similar
durante el análisis. Añadiendo un patrón de propiedades parecidas al analito, la relación de
concentración perdida de ambas se mantiene constante (Sánchez, 2016).

Procedimiento: se empieza por la adición de la sustancia pura a la muestra y a los patrones

en concentración fija (Figura No 03). Primero se determina la respuesta del equipo a las
disoluciones estándares (A) por separado y después con el patrón interno (PI). Se calcula el
cociente de la respuesta de ambas, y este valor es el que se representa frente a la
concentración del analito.

Figura No 03. Esquema del procedimiento de calibración con patrón interno .

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Por tanto, se representa gráficamente el cociente entre la señal del analito y la del patrón
interno en función de la concentración del analito de las disoluciones de los estándares. Si se
varía algún parámetro que afecte a las respuestas medidas, dichas respuestas deberán
afectar igual al analito y al patrón interno.

Ventajas: al compensar el efecto de los errores no controlados, se obtienen resultados muy

exactos y precisos.

Inconvenientes: se trata de un procedimiento más laborioso que cualquier otro método de

calibración convencional. Además de la dificultad de encontrar una sustancia adecuada para
que sea utilizada como patrón interno.

Aplicación: para mostrar la utilización de una calibración por la técnica del patrón interno se
ha tomado el ejemplo del estudio de Díaz (2014) sobre los compuestos responsables de los
defectos sensoriales de aceites de oliva vírgenes, principalmente el hexanal. Se utiliza para
el análisis cuantitativo la cromatografía de gases. Cualquier cromatografía presenta muchos
parámetros difíciles de controlar a la hora de realizar un análisis, entre ellos variaciones en el
gas transportador, cambios en el volumen de inyección, etc., por lo que el método adecuado
para solventar esos problemas es la calibración con un patrón interno, en el caso del estudio
fue el acetato de isobutilo (Figura No 04).

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Figura No 04. Gráfica de determinación del hexanal por el método del patrón interno.

Tomando la ecuación de la recta de calibrado se van a calcular las concentraciones de las

muestras problemas por interpolación de la misma.

3. Método de la adición estándar o adición patrón

En algunas ocasiones, al medir una sustancia, hay otros componentes en la muestra o

disolución a analizar, y estos interfieren en los resultados de medición, es lo que se conoce
como efecto matriz. Cuando esto ocurre, hay dos soluciones posibles. Una primera solución,
es lo que se conoce como aproximación a una matriz comparable, consiste en tomar una
muestra similar a la muestra problema, pero sin el analito a determinar, y añadir esta
sustancia para formar disoluciones patrón que poder comparar con la muestra problema.
Aunque no es siempre posible obtener esta aproximación.

La segunda solución es utilizar el método de las adición patrón o adición estándar (Miller y
Miller, 2002). El método consiste en añadir cantidades de concentración conocida de analito
a la muestra a determinar. Y con el aumento de la señal de respuesta, se puede determinar
la concentración de analito que había antes de la adición.

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Procedimiento: se toman volúmenes iguales de la muestra a analizar, y a todas, menos a

una de ellas, se le adiciona concentraciones conocidas y crecientes del analito, y por último
todas ellas se diluyen al mismo volumen. De esta forma se tienen disoluciones con una
misma concentración de analito problema, a las que se añaden concentraciones distintas de
patrón, que es la misma especie que el analito. Después de medir la señal de cada una de
las disoluciones se representan estas respuestas en función de la concentración de analito
patrón añadido obteniéndose una línea recta que no pasa por el origen de coordenadas tal
como se muestra en la Figura No 05.

Figura No 05. Esquema del procedimiento de calibración con adición patrón .

Una vez realizado, se determinan todas las señales para cada una de las disoluciones, y se
representaran gráficamente. Se calcula la línea de regresión, pero este método tiene una
diferencia con los anteriores, y es que la concentración de analito problema se determina
mediante extrapolación al eje X. Este valor será la concentración del analito (Miller y Miller,
2002). En la gráfica se aprecia cómo se representan las respuestas instrumentales, y como la
extrapolación de la recta lleva hasta el valor cero en el eje X. Los valores positivos del eje X,
representa la concentración de patrón añadido después de haber sido mezclado con la
muestra.

Para determinar si existen interferencias en la matriz se puede utilizar un método sencillo de

comparación entre dos pendientes de dos rectas de calibrado (Palacios, 2015). Una se
elabora por calibración externa añadiendo concentraciones crecientes de analito a un
disolvente determinado, y la segunda por adición estándar, añadiendo analito en distintas

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concentraciones a la muestra. Si las rectas son paralelas, es decir, si las pendientes son
idénticas, no existe dicho efecto matriz. En el caso en el que no sean paralelas, si hay efecto
matriz.

Ventajas: se consigue que el efecto matriz sea contrarrestado

Inconvenientes: es un proceso muy laborioso. Se necesita de un material diferente para

cada adición de patrón, y se tiene que hacer una o diversas adiciones a cada muestra
(Compaño y Rios, 2002).

Aplicación: se consultó el artículo de Saavedra y cols. (2007) en el cual se realiza un

estudio de la concentración del plomo en el polen apícola, en concreto de la especie Brassica
napus, con el objetivo de evaluar la contaminación ambiental de la zona de estudio, puesto
que ha quedado demostrado que la contaminación ambiental con metales tóxicos va a
quedar reflejado en la concentración de estos metales en el polen de las flores (el polen
es un producto que presenta mucha variedad de oligoelementos de alta calidad nutricional,
pero en bajas concentraciones). Se determinó la concentración mediante espectroscopia de
absorción atómica, y para evitar interferencias con los múltiples elementos presentes en el
polen, es necesaria la calibración por el método de la adición estándar (Figura No 06).

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Figura No 06. Gráfica de determinación de plomo por el método de la adición estándar

Fuente: Importancia de la2016
Cuadrado, Dic calibración en los laboratorios de química analítica, Manuel Espejo

5. CONCLUSIONES

De la revisión bibliográfica realizada sobre la importancia de la calibración en los laboratorios

de Química Analítica se pueden extraer las siguientes conclusiones:
- La finalidad de los laboratorios analíticos es producir información analítica que permita
adoptar decisiones para resolver problemas planteados por la sociedad, la industria o
un cliente en particular. Para asegurar la calidad en los resultados analíticos es
necesario verificar y calibrar la instrumentación, validar el método analítico y realizar
controles de calidad.

- Con la validación de los métodos analíticos se pone de manifiesto el funcionamiento

adecuado a la aplicación que se le quiere dar y se evalúa las propiedades analíticas,
como son exactitud, precisión, límites de detección y de cuantificación, el intervalo de
linealidad, sensibilidad, selectividad y la robustez, que constituyen la forma de expresar
objetivamente la calidad analítica.

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- Se han detallado los procedimientos de calibración instrumental, indicando la

metodología y los patrones utilizados, de los principales equipos empleados en los
laboratorios analíticos: balanza analítica, material volumétrico, pH-metros, y
espectrofotómetros, destacando la importancia de los dos primeros como piezas clave
para asegurar la calidad de las medidas y de los resultados.

- Se han descrito las distintas técnicas de calibración metodológica, o analítica (estándar

externo, patrón interno, y adición estándar) indicando, en cada caso, sus principales
características, procedimiento, ventajas, inconvenientes y aplicaciones, ilustrando estas
últimas con ejemplos de interés farmacéutico.

6. BIBLIOGRAFÍA
Importancia de la calibración en los laboratorios de química analítica, Manuel Espejo
Cuadrado, Dic 2016

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