SEM Microscopio Electrónico de Barrido

Principio básico de la técnica.

Un Microscopio Electrónico de Barrido (SEM, por sus siglas en inglés) se encuentra principalmente
compuesto por un emisor de electrones, una columna y diferentes lentes electromagnéticas. La
función del emisor es generar un haz de electrones (electrones incidentes) con una aceleración entre
200 V y 30 keV, el cual viaja a través de la columna (Vacío de 10-4 Pa). En la columna el haz de
electrones pasa a través de las diferentes lentes electromagnéticas y un sistema de deflexión que
permite manipular el haz de electrones para poder llevar a cabo un barrido superficial de la muestra.

Una vez que los electrones incidentes interaccionan con la superficie de la muestra se generan
diferentes señales: electrones secundarios, electrones retro-dispersados, rayos x, entre otras. Estas
señales son capturadas por distintos tipos de detectores, ayudando a obtener información
morfológica y de composición química superficial de la muestra.

Beneficios

Es una técnica de caracterización superficial no destructiva que proporciona información morfológica

y de composición química de los materiales. Es una herramienta ampliamente utilizada en campos
como biología, materiales, ciencias ambientales, geociencias, etc., debido al detalle y rapidez en la
adquisición de las micrografías de superficie.

Derivado de la interacción entre el haz de electrones y la superficie de la muestra se pueden obtener

señales de:

 Electrones secundarios (SE): proporcionan información sobre la morfología superficial de la

muestra.
 Electrones retro-dispersados (BSE): generan imágenes con diferente brillantez en función
de la composición química superficial.
 Espectrometría de energía dispersiva de Rayos X (EDS): detecta, cualitativamente, los rayos
X característicos de los elementos químicos presentes en la superficie de la muestra.
Muestra un análisis semi-cuantitativo de la composición química detectada.
Esta técnica de análisis permite caracterizar una amplia variedad de materiales, algunos ejemplos
son: materiales nano-estructurados, aleaciones metálicas, polímeros, minerales, fibras, películas
delgadas, biomateriales y en algunos casos muestras con alto contenido en humedad e hidrogeles.
Los materiales restrictivos para realizar análisis se refieren a aquellos con propiedades magnéticas,
a menos, que se fijen apropiadamente en alguna matriz de contención.

Microscopios Electrónicos de Barrido (SEM) Para diferentes aplicaciones.

SEM AMBIENTAL (ESEM): FEI QUANTA 200

SEM AMBIENTAL (ESEM): FEI QUANTA 250 FEG

DUAL BEAM FIB/SEM: FEI NANOLAB 600

¿Cuál es la función del microscopio de barrido?

Permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. La luz
se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen
conductoras metalizando su superficie.

¿Qué es TEM en materiales?

El microscopio de electrónico de transmisión (TEM, por sus siglas en inglés) es una herramienta
analítica que permite observar características micro y nanoestructurales de materiales sólidos.

¿Qué es el análisis SEM?

El Microscopio electrónico de barrido o SEM (Scanning Electron Microscopy), utiliza un haz de
electrones en lugar de un haz de luz para formar una imagen ampliada de la superficie de un objeto.
Es un instrumento que permite la observación y caracterización superficial de sólidos inorgánicos y
orgánicos.

¿Que generan los microscopios de transmisión TEM?

El microscopio electrónico de transmisión (TEM) es una técnica microscópica donde el haz de
electrones se transmite a través de una muestra ultra-fina, interactuando con la muestra a
medida que pasa por ella.

¿Cómo funciona el microscopio electrónico de barrido?

Es un equipo de emisión de campo (Field Emission Gun, FEG por sus siglas en inglés), es decir,
genera el haz de electrones a partir de un cristal de tungsteno (W) sometido a una diferencia de
potencial para extraer el haz de electrones por emisión de campo. Ofrece una resolución nominal de
3.0 nm.

¿Cómo funciona un microscopio electrónico de transmisión?

En el microscopio electrónico de transmisión se irradia una muestra delgada con un haz de

electrones de 200 keV. Parte de esos electrones son transmitidos, otra parte son dispersados y otra
parte da lugar a interacciones que producen distintos fenómenos como emisión de luz, electrones
secundarios y Auger, rayos X, etc.

¿Cómo se forma la imagen en microscopia electrónica de transmisión?

En especial, la microscopía electrónica de transmisión (TEM) o de transmisión barrido
(STEM) forma imágenes que resultan de la interacción de los electrones como radiación con el
objeto o muestra. En algunos casos, las imágenes son fruto de fenómenos de interferencia o de
dispersión incoherente.

Principio básico de la técnica TEM

En TEM, un haz de electrones de alta energía (300 keV) atraviesa una muestra muy delgada (menor
a los 150 nm), lo que altera varias propiedades físicas del haz de electrones que son recopiladas por
diversos detectores: Detector de amplio ángulo HAADF, CCD de alta velocidad y GIF (para EELS y
EFTEM). La iluminación con el haz se hace en dos formas: en TEM con iluminación contante sobre
la muestra y en STEM donde un haz muy pequeño (“nanoprobe”) barre la muestra en un área
rectangular. De acuerdo al funcionamiento de la lente objetiva tenemos dos modos de operación del
instrumento: en Modo Imagen y en Modo Difracción. Por otro lado, al interaccionar el haz de
electrones con la muestra, esta última emite rayos X característicos que son colectados por un
detector EDS especial.

Beneficios

La elaboración de especímenes para TEM es en sí mismo un campo de estudio. Cada tipo de

muestra se comporta de diversas maneras y por tanto cada tipo de muestra puede requerir una
preparación diferente. Así las cosas, se necesita hacer un proceso de ensayo y error, que por lo
general conduce a la elaboración de varias preparaciones por muestra y por tanto del uso de varias
rejillas por muestra, por lo que se recomienda que cada usuario adquiera su "set" de rejillas. Además,
dicho proceso de ensayo y error puede llevar varios días e incluso semanas. En general cerca del
90% de las muestras que se elaboran por primera vez, se encuentran mal preparadas y difícilmente
los usuarios pueden obtener la información que necesitan. Siempre se recomienda realizar ese
proceso de experimentación de montaje de la muestra sobre las rejillas de TEM con anticipación,
verificando su confección por medio de otros microscopios electrónicos que se encuentren más al
alcance del usuario y de ese modo garantizar el éxito en las sesiones en el TEM.

 De la técnica de Campo Claro se obtienen micrografías (en forma de un “positivo”) que

poseen una resolución mayor que la Microscopía de Barrido (SEM), pero que dificulta mucho
distinguir los materiales encimados o muy aglomerados, por lo que sólo se recomienda para
una muestra con material muy disperso o separado. Esta técnica no se recomienda para
objetos con secciones transversales al haz mayores a 1 micra (pueden tener espesores
menores a 200 nm).
 De la técnica de Contraste Z, se obtienen micrografías (en forma de un “negativo”) cuyas
zonas más brillantes corresponden a una gran cantidad de materia (mayor densidad o mayor
número atómico), que en principio se podría cuantificar. Esta técnica se recomienda para
estudios de morfología o de estadística de las nanoestructuras. Cuando la muestra está
adecuadamente preparada, la resolución que se alcanza en esta técnica es del orden 0.3
nm.
 La técnica de alta resolución (HRTEM) permite tener micrografías con resolución atómica
(1.8 Å), siempre y cuando el material tenga zonas o bordes bien aislados y delgados
 (menores a los 50 nm de espesor) y que se encuentren bien orientados en un eje de zona
“amplio”. Las micrografías así obtenidas sirven para confirmar la estructura cristalina del
objeto.
 La Difracción con electrones se puede realizar a monocristales que arrojan imágenes de
patrones de puntos, o a policristales de donde se obtienen patrones de anillos, que
analizando adecuadamente en los dos casos, sirven para confirmar la estructura cristalina
del material. Para el caso de la difracción en monocristales, estos deben tener tamaños
mayores a los 30 nm, siempre y cuando se encuentren bien aislados (separados al menos
un centenar de nanómetros de cualquier otro monocristal). En este último, es necesario
utilizar la técnica de Difracción por Precesión de Haz para poder interpretar adecuadamente
su patrón de difracción.
 Espectroscopía de Rayos X (EDS o EDX): Por medio de puntos en donde se posiciona el
haz de electrones, cuyo tamaño es menor a un nanómetro, o posicionando el haz sobre una
zona de tamaño arbitrario, se adquieren espectros de emisión de Rayos X; con los que se
puede hacer análisis elementales. El tiempo que se demora para cada adquisición es de 1
a 10 minutos, dependiendo del tipo o número de puntos que se escojan. Para tener precisión
en la obtención de este tipo de Espectroscopía es necesario utilizar la técnica de Contraste
Z.
 Espectroscopía por EELS (Electron Energy Loss Spectroscopy): En esta técnica es posible
identificar claramente elementos ligeros que no se pueden determinar por medio de la
espectroscopía EDS, medir espesores e incluso, determinar algunas moléculas. Realizar
esta técnica en una muestra, toma entre una y dos horas. Los espectros obtenidos, requieren
de un cuidadoso análisis que le corresponde realizar al Usuario.

Equipos especializados que emplean esta técnica en LINAN

TEM TECNAI F30 (300 kV) Tipo FEG marca FEI.

Resolución de 1.8 Å punto a punto en HRTEM y de 3 Å
en Contraste Z, mientras que la resolución del análisis
de EDS es de 20 nm en Campo Claro y de 1 nm en
Contraste Z. Cuenta con Cámara CCD ultra rápida modelo
Orius SC200 de GATAN y un precesor de haz
SPINNINGSTAR P020 para difracción con electrones.

Detalles más importantes

 Obtención rápida de imágenes de alta resolución

 Rápida identificación de los elementos presentes en la muestra
  Se requieren muestras compatibles con vacío
 Podría dañar la muestra para análisis posterior
 La resolución depende fuertemente de la muestra y su preparación
 La muestra no debe tener material orgánico, a menos que se encapsule de una manera
especial.
 Se pueden analizar muestras conductoras y no conductoras, en algunos casos con una
preparación especial.
 Los patrones de difracción obtenidos pueden ser bien interpretados, gracias a la precisión
del haz.

Usos y aplicaciones

Caracterización de Nanoestructuras: tamaños, morfología, características estructurales y

composición elemental y complementariamente detección de contaminantes. En aplicaciones como:
Materiales nanoestructurados: nanopartículas, nanotubos, grafenos, catalizadores, etc.

¿Cuál es la diferencia entre SEM y TEM?

La microscopía electrónica de barrido (SEM) y de transmisión (TEM) son dos técnicas que permiten
el análisis microscópico de muestras de dimensiones tan pequeñas y delgadas como las fibras para
papel.

¿Cómo funciona un microscopio de barrido y cuál es su capacidad de aumento?

En el microscopio electrónico de barrido es necesario acelerar los electrones en un campo
eléctrico, para aprovechar de esta manera su comportamiento ondulatorio, lo cual se lleva a cabo
en la columna del microscopio, donde se aceleran por una diferencia de potencial de 1,000 a 30,000
voltios.
QUÉ ES Y CÓMO FUNCIONA EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO

El Microscopio electrónico de barrido o SEM (Scanning Electron Microscope), es aquél que utiliza un
haz de electrones, en lugar de un haz de luz, para formar una imagen. Tiene una gran profundidad
de campo, la cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la muestra. También produce
imágenes de alta resolución, que significa qué características, espacialmente cercanas en la
muestra, pueden ser examinadas a una alta magnificación. La preparación de las muestras es
relativamente fácil pues la mayoría de SEMs sólo requieren que estas sean conductoras.

En el microscopio electrónico de barrido, la muestra generalmente es recubierta con una capa de

carbón o una capa delgada de un metal como el oro para darle propiedades conductoras a la
muestra. Posteriormente es barrida con los electrones acelerados que viajan a través del cañón. Un
detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra,
siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV o una
imagen digital. Su resolución está entre 4 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Inventado en 1931
por Ernst Ruska, permite una aproximación profunda al mundo atómico. Permite obtener imágenes
de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por un haz de
electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su
superficie.

ANTECEDENTES
Los primeros instrumentos desarrollados para este propósito, fueron microscopios ópticos, porque
con los ojos no se pueden ver las cosas muy pequeñas. Estos instrumentos fueron desde una simple
lupa, hasta un microscopio compuesto. Sin embargo, aún en el mejor instrumento óptico, la
resolución está limitada a la longitud de onda de la luz que se utilice, que en este caso es la luz
violeta, cuya longitud de onda es de aproximadamente 400 nanómetros; por lo tanto, los detalles
más pequeños que pueden resolverse, deberán estar separados no menos de esta longitud. En
términos de amplificación, esto quiere decir que no podemos amplificar más de 1,000 veces.

Una salida inmediata a esta limitante de resolución, es utilizar alguna radiación de longitud de onda
más corta que la de la luz violeta. Los candidatos inmediatos son los rayos X, que se caracterizan
por una longitud de onda del orden de 0.15 nanómetros; desafortunadamente éstos tienen la gran
desventaja de ser absorbidos rápidamente por lentes de vidrio y de no poder ser desviados por lentes
magnéticas (Además de las precauciones que debería tener el operador).

Otra posibilidad es aprovechar el comportamiento ondulatorio de los electrones acelerados por

alguna diferencia de potencial. Sea el caso, por ejemplo, de electrones acelerados en un campo de
100,000 voltios que presentan comportamiento ondulatorio con una longitud de onda de 0.0037 nm
(3.7 picómetros), lo que en principio permitiría tener un aparato que resolviera detalles del mismo
orden, lo cual es más de lo que se necesita para resolver detalles atómicos, puesto que los átomos
en un sólido están separados en un orden de 0.2 nm. Sin embargo, en la práctica, detalles inherentes
a la técnica de observación, o defectos en el maquinado de las piezas polares producen
aberraciones.

FUNCIONAMIENTO
En el microscopio electrónico de barrido es necesario acelerar los electrones en un campo eléctrico,
para aprovechar de esta manera su comportamiento ondulatorio, lo cual se lleva a cabo en la
columna del microscopio, donde se aceleran por una diferencia de potencial de 1,000 a 30,000
voltios. Los electrones acelerados por un voltaje pequeño son utilizados para muestras muy
sensibles, como podrían ser las muestras biológicas sin preparación adicional, o muestras muy
aislantes. Los altos voltajes se utilizan para muestras metálicas, ya que éstas en general no sufren
daños como las biológicas, y de esta manera se aprovecha la menor longitud de onda para tener
una mejor resolución. Los electrones acelerados salen del cañón, y son enfocados por las lentes
condensadora y objetiva, cuya función es reducir la imagen del filamento, de manera que incida en
la muestra un haz de electrones lo más pequeño posible (para así tener una mejor resolución). Con
las bobinas deflectoras se barre este fino haz de electrones sobre la muestra, punto por punto y línea
por línea.

Cuando el haz incide sobre la muestra, se producen muchas interacciones entre los electrones del
mismo haz, y los átomos de la muestra; puede haber, por ejemplo, electrones rebotados como las
bolas de billar. Por otra parte, la energía que pierden los electrones al "Chocar" contra la muestra
puede hacer que otros electrones salgan despedidos (electrones secundarios), y producir rayos X,
electrones Auger, etc. El más común de éstos es el que detecta electrones secundarios, y es con el
que se hacen la mayoría de las imágenes de microscopios de barrido.
Podemos también adquirir la señal de Rayos X que se produce cuando se desprenden estos mismos
de la muestra, y posteriormente hacer un análisis espectrográfico de la composición de la muestra.

UTILIZACIÓN
Son ampliamente utilizados en la biología celular. Aunque permite una menor capacidad de aumento
que el microscopio electrónico de transmisión, este permite apreciar con mayor facilidad texturas y
objetos en tres dimensiones que hayan sido pulverizados metálicamente antes de su observación.
Por esta razón solamente pueden ser observados organismos muertos, y no se puede ir más allá de
la textura externa que se quiera ver. Los microscopios electrónicos sólo pueden ofrecer imágenes
en blanco y negro puesto que no utilizan la luz.

Este instrumento permite la observación y caracterización superficial de materiales inorgánicos y

orgánicos, entregando información morfológica del material analizado. A partir de él se producen
distintos tipos de señal que se generan desde la muestra y se utilizan para examinar muchas de sus
características. Con él se pueden realizar estudios de los aspectos morfológicos de zonas
microscópicas de diversos materiales, además del procesamiento y análisis de las imágenes
obtenida.

https://www.youtube.com/watch?v=P7yOTrd0l2M
https://www.youtube.com/watch?v=Xx0PJtRTIYQ

¿Qué es el Microscopio Electrónico de Transmisión?

Han pasado más de 340 años desde que Antony Van Leeuwenhoek con la invención
de su microscopio simple realizó el descubrimiento de las células espermatozoides
en 1677, años en los que se ha ido perfeccionando el sistema de lentes del
microscopio compuesto de luz (óptico o de fotones, hasta lograr microscopios tan
sofisticados como el de contraste de fases o de fluorescencia; pero en 40 años o
un poco más, los científicos lograron perfeccionar el MET. El mundo de las ciencias
biológicas se amplió con la invención de la microscopía electrónica y la experiencia
fue excitante al lograr ver imágenes del interior de una célula o de partículas de
virus amplificadas miles de veces
Keith Porter y colaboradores en 1945 demostraron de manera contundente que el
MET podía ser utilizado para observar los detalles del interior de las células con
el descubrimiento de lo que años más tarde designaran como retículo
endoplásmico (ER).
En la actualidad el microscopio electrónico se ha convertido en una herramienta
fundamental en la investigación científica en diferentes áreas de la biología,
medicina, materiales y nanopartículas.

¿Por qué utilizar electrones en vez de luz (fotones)?

El poder de resolución es la capacidad de observar con claridad dos objetos
extremadamente cercanos, por ejemplo, dos puntos, con total nitidez. Para el ojo
humano normal, el máximo poder de resolución sería distinguir claramente dos
puntos que se encuentren separados entre sí por la décima parte de 1 mm [100
micrómetros o micras (µm)], el grosor de un cabello humano. El microscopio simple
(de una sola lente) de Van Leeuwe nhoek, producía una ampliación de hasta 275
veces (275x) con un poder de resolución de 1.4 µm, mayor al poder de resolución
de los microscopios compuestos (de varias lentes) de su época.
Para un microscopio óptico compuesto, el poder de resolución máximo e s de 0.2
µm o 200 nanómetros (nm), siendo un nanómetro la millonésima parte de 1 mm.
Con la ayuda del microscopio compuesto es posible observar células humanas,
células vegetales, levaduras, protozoarios, y bacterias logrando aumentos hasta
de 1000x. En contraste, con el MET podemos observar objetos más pequeños que
200 nm como los coronavirus. Pero existen virus aún más pequeños como el
bacteriófago (Fig. 4), que infecta bacterias. El tamaño de los fagos oscila entre 20
y 200 nm. Sin embargo, existen partí culas como los rotavirus causantes de la
gastroenteritis que miden aproximadamente entre 70 -90 nm, los cuales son aún
más pequeños que 100 nm ¡Más pequeños que la longitud de onda más corta de
la luz visible (color violeta, 400 nm) y por debajo de los 200 nm!

¿Cómo observar cosas más pequeñas por debajo de los 200 nm, de lo que se
alcanza a ver con un microscopio compuesto actual?
El Físico Ernes Abbe (1872) quien trabajaba para la compañía Carl Zeiss realizó
avances fundamentales tanto en el diseño de los microscopios de luz como en el
campo de la óptica teórica, y predijo desde aquel entonces que para mejorar el
poder de resolución de los micros copios compuestos se necesitaba de longitudes
de onda mucho más cortas que las de la luz visible.

Sin embargo, para que esto hubiese sido posible, pasaron muchos años; primero
tuvieron que existir toda una serie de conocimientos científicos fundamental es que
llevaron al descubrimiento del electrón, y de que éste tiene comportamiento de
partícula y de onda, y que al pasar a través de un campo electromagnético los
electrones desvían su trayectoria igual que los fotones lo hacen a través de una
lente de cristal para formar una imagen. Ya en la primera mitad del siglo pasado,
fue Louis De Broglie (1924) quien demostró que el electrón tenía propiedades de
onda que sustancialmente son de longitud de onda más corta que la luz visible y
Busch (1926) que demostró que un haz de electrones podía ser desviado por lentes
magnéticas al igual que la luz es desviada por una lente de vidrio. Esta serie de
hallazgos científicos permitió el desarrollo del primer tipo de microscopio
electrónico, el MET, en un principio inven tado para análisis de materiales.

¿Entonces qué es el MET y cómo funciona?

Es un instrumento científico con un peso aproximado de una tonelada y con una
columna de alrededor de 1.5 metros de altura donde se utiliza

alto voltaje para producir y enfocar u n haz de electrones acelerados en alto vacío
que al impactar en una de las caras de una muestra de tejido ultradelgada forman
una imágen al emerger por la cara contraria. Con este instrumento que alcanza
aumentos de 1000 000x hoy en día es posible ver desd e los cromosomas y las
moléculas de ADN (ácido desoxiribonucleico) hasta átomos con un poder de
resolución de 0.2 nm.

La adaptación del MET para la observación de muestras biológicas trajo consigo

el desarrollo de equipos y accesorios especiales para el p rocesamiento de las
mismas como el ultramicrotomo y la cuchilla de diamante para poder obtener cortes
de tejido ultrafinos que soporten el haz de electrones y el alto vacío, así como
procedimientos histológicos con fijadores químicos y agentes contrastante s
especiales para la preparación de las muestras.
El MET está compuesto por la columna que genera el haz de electrones, un sistema
de alto vacío, un sistema de enfriamiento, corrientes de alimentación y un sistema
de registro de la imagen. La imagen formada por los electrones es proyectada en
dos dimensiones sobre una pantalla fluorescente y puede ser obtenida finalmente
a través de una película fotográfica o de una cámara digital en una computadora..

La Unidad de Microscopía Avanzada del Clúster Científico y Tecnológico

BioMimic® del INECOL cuenta con un Microscopio Electrónico de Transmisión
JEOL JEM 1400Plus. Brinda el Servicio de Microscopía Electrónica de Transmisión
y la asesoría técnica para la preparación y estudio de muestras biológicas.

Figuras
Fig 1. Microscopio simple. Utiliza una sola lente p ara ampliar las imágenes de los
objetos observados. Se le atribuye al holandés Anton Van Leeuwenhoek haber
introducido el microscopio a la atención de los biólogos. B) Comparación del
microscopio compuesto con el MET. A) Imágenes obtenidas de internet. B) Imagen
de la Unidad de Microscopia Avanzada, INECOL (Lorena ML López Sánchez).
Fig. 2 Imágenes de bacteriófagos que son virus que infectan exclusivamente a las
bacterias. A) Representación de distintos bacteriófagos que atacan a una bacteria,
ilustración en 3D. B) Gamma-fago a través de un microscopio electrónico de
transmisión. C) Bacteriófago atacando a una bacteria. (Imágenes obtenidas de
internet).

Fig 3. Imagen de células de la levadura de pan (Saccharomyces cerevisiae) que

es un hongo unicelular obtenida de un microscopio de luz aumentada 630X. B)
Imagen de una célula de la levadura de pan ( Saccharomyces cerevisiae) obtenida
en un microscopio electrónico de transmisión aumentada 1500 X. PC= pared
celular; V= Vacuola; N= Núcleo; X= aumentos. Imágenes ob tenidas por Lorena ML
López Sánchez.

Fig 4. Esquema interno del Microscopio Electrónico de Transmisión (obtenido de

internet).
Fig. 5 (carrousel) Imágenes de partículas de rotavirus causante de gastroenteritis
o infección intestinal. Magnificación 85,000 X. Barras equivalen a 90nm. Imágenes
obtenidas por Lorena ML López Sánchez.
Fig. 6 Imágenes de partículas de rotavirus causante de gastroenteritis o infección
intestinal. Magnificación 85,000 X. Barras equivalen a 90nm. Imágenes obtenidas
por Lorena ML López Sánchez.

Palabras clave
Microscopía electrónica de Transmisión, poder de resolución, tamaño de virus.

Resumen
Gracias a los grandes avances en óptica y al descubrimiento del electrón y sus
propiedades, se pudo generar la Microscopía Electrónica de Transmisión (MET) y
con ella se ampliaron las puertas al mundo de las ciencias.