GUIA ÚNICA DE LABORATORIO

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SECCIONAL: BARRANQUILLA
FACULTAD: Ciencia de la Salud

PROGRAMA: Medicina
ASIGNATURA: Bioquímica

SEMESTRE: Segundo
MESA: 4
INTREGRANTES: María José Castillo, Mariana Chávez, André Domínguez,
Gladys Durán, María Alejandra Escorcia, Raissa Fernández.

NOMBRE DE LA PRACTICA DE LABORATORIO:

ENZIMAS: Transaminasas ALT/GPT y AST/GOT

LABORATORIO No. 3

“La célula viva es una especie de caldero mágico en el que se producen cientos de
reacciones químicas y de sustancias milagrosas al mismo tiempo. Si sus materiales
iniciales o sustratos, simplemente los mezclara un químico muy optimista en un tubo
de ensayo, apenas se produciría una pequeña cantidad de reacciones. El químico
posiblemente podría forzarlas incrementando la temperatura o usando un catalizador
no selectivo, como un ácido o una base fuertes, esta opción no es válida en el
cuerpo humano, ya que tiene que mantener una temperatura y un pH constantes”.

Meinsenberg & Simmons. Principios de Bioquímica Médica. 2018.

1. INTRODUCCIÓN

Las enzimas

Cualquier ser vivo depende de unos catalizadores altamente selectivos que se

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denominan enzimas. La mayoría son proteínas, aunque unos pocos ARN pueden
catalizar reacciones químicas (ribosomas). Las enzimas son proteínas que catalizan
reacciones bioquímicas si alterar el punto de equilibrio de la reacción o sin ser
consumidas en el proceso. Las enzimas pueden cambiar la cinética, pero no las
características termodinámicas de la reacción. En una reacción enzimática se
identifican tres componentes: la enzima específica de la reacción; el sustrato, que es
la molécula sobre la que actúa la enzima; y el producto, molécula o moléculas
resultantes de la acción de la enzima sobre el sustrato. Las enzimas con frecuencia
aparecen en el suero después de una lesión celular y algunas, como las que facilitan
la coagulación, son específicas para el plasma y, por tanto, están presentes en
concentraciones significativas. Las concentraciones de enzimas en plasma o suero
suelen ser útiles como marcadores para el diagnóstico de diversas enfermedades.
Muchas enzimas requieren cofactores para ejercer su función. Estos pueden ser
iones inorgánicos o complejos metalo-orgánicos, llamados coenzimas. Si el ión
metálico o la coenzima se unen firmemente a la enzima se le denomina grupo
prostético. El complejo funcional completo constituye la holoenzima.

Las transaminasas o aminotransferasas

Son enzimas que pertenecen al grupo de las Transferasa debido a que transfieren
grupos amino entre metabolitos, generalmente aminoácidos. Estas enzimas son
inducibles y sus reacciones son reversibles. Las transaminasas requieren fosfato de
piridoxal (derivado de la piridoxina o vitamina B6) como coenzima, que actúa como
transportador del grupo amino.

Transaminasas ALT/GPT y AST/GOT

La aminotransferasa de alanina o transaminasa glutámico-pirúvica (ALT/GPT)

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cataliza la transferencia del grupo amino de la alanina al 2-oxoglutarato. La ALT está

ampliamente distribuida en muchos tejidos, con concentraciones significativamente
altas en el hígado. Por esto, es considerada la enzima hepatoespecífica dentro del
grupo de las transferasas. La aminotransferasa de aspartato o transaminasa
glutámico-oxalacética (AST/GOT) participa en la transferencia de un grupo amino
entre aspartato y α-cetoácidos. Al igual que la ALT, la AST está ampliamente
distribuida en los tejidos humanos. Las concentraciones más altas se encuentran en
el tejido cardíaco, el hígado y el músculo esquelético; mientas que cantidades más
bajas son identificadas en el riñón, el páncreas y los eritrocitos.

Utilidad clínica del estudio de las transaminasas.

El estudio de las transaminasas se encuentra entre las pruebas que informan lesión
hepatocelular. En el hígado se producen múltiples reacciones de transaminación,
pero las únicas transaminasas con valor clínico son la AST/GOT cuya vida media es
de 18 horas y la ALT/GPT con una vida media de 48horas. La ALT es más
específica para daño hepático que la AST, debido a que la primera se localiza casi
exclusivamente en el citosol del hepatocito, mientras que la AST, se encuentra
además en las mitocondrias así como en otros órganos como corazón, riñón,
cerebro, músculo esquelético, páncreas, bazo, pulmón, eritrocitos y leucocitos. La
elevación sérica de transaminasas se correlaciona con la liberación a la sangre del
contenido enzimático de los hepatocitos afectados.

2. OBJETIVO

 Identificar la utilidad de las enzimas en el diagnóstico clínico.

3. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

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Equipos y Materiales Reactivos

Espectrofotómetro Micro pipeta Muestra: Suero.
(longitud de onda Beaker. Reactivo A:
340nm) Reactivo B:
Baño María Reactivo C (auxiliar):
Centrifugadora Fosfato de piridoxal
Tubo de ensayo (Vitamina B6) 10 mmol/L.
15x160 mm-1 Actúa como coenzima.
Gradilla. Reactivo A
ReactivoB

4. METODOLOGIA

MUESTRA

Se toma la muestra de sangre venosa, se deposita lentamente en un tubo de ensayo

sin golpear (evitar romper los eritrocitos), se deja coagular por 7 a 11 minutos, luego
se dejan pasar de 30 a 40 minutos para la retracción del coágulo. Se lleva el tubo
con la muestra a centrifugar de 2000 a 3000 revoluciones por minuto (rpm) por un
tiempo aproximado de 10 minutos hasta obtener la sedimentación de las células y
obtener un suero limpio y sin hemólisis.

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ENZIMAS A DETERMINAR

ALT/GPT –AST/GOT

MÉTODO

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

La alanina aminotransferasa (ALT o GPT) cataliza la transferencia del grupo amino

de la alanina al 2-oxoglutarato, formando piruvato y glutamato.

La concentración catalítica se determina, empleando la reacción acoplada de la

LDH, a partir de la velocidad de desaparición del NADH, medido a 340 nm.

La aspartato aminotransferasa (AST o GOT) cataliza la transferencia del grupo

amino del aspartato al 2-oxoglutarato, formando oxalacetato y glutamato. La
concentración catalítica se determina, empleando la reacción acoplada de la malato
deshidrogenasa (MDH), a partir de la velocidad de desaparición del NADH, medido a
340 nm.

Las variables que deben estar controladas durante las reacciones son:
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Temperatura óptima: 37°C

pH óptimo: 7,3; garantizado por la solución amortiguadora o buffer.
Cantidad suficiente de sustrato para saturar la enzima.

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Concentración de la enzima.
REACTIVOS UTILIZADOS

DETERMINACIÓN DE

ALT

Reactivo A: Tris 150 mmol/L (solución amortiguadora), L-alanina 750 mmol/L,lactato

deshidrogenasa > 1350 U/L, pH: 7,3.
ReactivoB: NADH (forma reducida)1,9 mmol/L y 2-oxoglutarato 75 mmol/L.

Reactivo C (auxiliar): Fosfato de piridoxal (Vitamina B6) 10 mmol/L. Actúa como

coenzima. Preparación del reactivo de trabajo: Se prepara la mezcla en la relación
de 4mLde reactivo A a 1 mL de reactivo B. Estable 1 mes a 2-8°C.
Reactivo de Trabajo con Fosfato de Piridoxal: Mezclar en la proporción10 mL de
Reactivo de Trabajo + 0,1 mL de Reactivo C.

DETERMINACIÓN DE AST
Reactivo A: Tris 121 mmol/L, L-aspartato 362 mmol/L, malato deshidrogenasa > 460
U/L, lactato deshidrogenasa > 660 U/L, pH 7,8.
Reactivo B: NADH (forma reducida) 1,9 mmol/L y 2-oxoglutarato 75 mmol/L.
Reactivo C (auxiliar): Fosfato de piridoxal (Vitamina B6) 10 mmol/L. Actúa como
coenzima.
El reactivo de trabajo se prepara igual que para ALT.
PROCEDIMIENTO
a. Precalentar el reactivo de trabajo y el instrumento a la temperatura de reacción.
b. Pipetear en un tubo de ensayo:

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c. Llevar al baño termorregulador a 37°C por 5 minutos.

d. Pasar la mezcla de reacción por el espectrofotómetro.

MANEJO DEL EQUIPO

a. Encienda el equipo.
b. Aparece el MENÚ PRINCIPAL
c.Elije la opción CONCENTRACIÓN. Pulse enter para continuar.
d. La pantalla presenta un listado de técnicas. Elija la opción ALT. Pulse enter para
continuar.
e. Aparece en la pantalla INTRODUZCA LÍNEA BASE. Luego el equipo le indica que
se debe colocar el tubo de ensayo que contiene el agua destilada, con el objetivo de
calibrar el espectrofotómetro a cero de absorbancia. Presione el botón de succión
para que el equipo tome la cantidad de agua necesaria para realizar la medición.
f. Pasado lo anterior, aparece en la pantalla del equipo. INTRODUZCA MUESTRA.
Coloque el tubo con la mezcla de reacción para que sea succionada por el equipo.
Aparecerá en el equipo una gráfica que muestra como decrece el valor de la
absorbancia en la medida en que se consume el NADH+ H+ y pasa a NAD+oxidado.
h. Al terminar de leer la muestra se da la orden de SALIR para continuar con la
determinación de AST.
i. El procedimiento se lleva a cabo de igual manera que con ALT.

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

VALORES DE REFERENCIA PARA ALT.

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VALORES DE REFERENCIAPARA AST

Las concentraciones en niños y recién nacidos son ligeramente superiores a las de
adultos. Se encuentran valores ligeramente más elevados en hombres que en

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mujeres. Registre los resultados en su informe de laboratorio y compare con los

valores de referencia. Escriba una discusión breve.
Relación de De Ritis
La relación de De Ritis proporciona información diagnóstica y de valor pronóstico. Se
refiere a la relación o cociente entre los niveles séricos de AST y ALT. Los niveles de
ALT suelen ser superiores a los de AST en la hepatitis viral aguda, mientras que los
de AST suelen ser mayores en la hepatitis alcohólica. Sin embargo, la hepatitis viral
aguda puede tener AST mayor de ALT y esto puede ser un signo de enfermedad
fulminante, mientras que la hepatitis alcohólica puede tener ALT mayor que AST,
cuando han transcurrido varios días desde la exposición al alcohol.
Por tanto, la relación de De Ritis representa la evolución temporal y la agresividad de
la enfermedad, que se predice teniendo en cuenta la vida media relativamente corta
de AST (18 h) en comparación con ALT (48h). En cuadros crónicos como la hepatitis
viral crónica y el alcoholismo crónico, así como la enfermedad de hígado graso no
alcohólico, una relación AST/ALT elevada es un factor predictivo que indica un alto
riesgo de complicaciones como fibrosis y cirrosis.

El valor normal de la relación es de 0,70-0,88. Los valores muy inferiores a 1 (por

debajo de 0,7) indican inflamación, mientras que los cocientes superiores a 1
sugieren necrosis, debido a que la AST se libera de las mitocondrias.

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El uso del fosfato de piridoxal durante las pruebas influye en el resultado e

interpretación de la relación de Ritis. Por esto, es ideal que el ensayo se realice con
fosfato de piridoxal en muestras provenientes de pacientes alcohólicos, ancianos y
con cáncer, quienes pueden cursar con deficiencia de esta vitamina.

 Resolución de cálculos y análisis completo del paciente:

AST/GOT: 35,3 U/L.

ALT/GPT: 34,7 U/L

Paciente masculine entre 15 y 25 años al cual se le fue realizado una prueba

de marcadores de transaminasas AST/GOT y ALT/GPT, donde como resultado
fueron obtenidos los siguientes datos, 35,3 U/L y 34,7 U/L, respectivamente,
Por ende, los valores anteriores respecto a los valores de referencia se
encuentran en un rango normal.

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 Cociente de Ritis:

U
35,3
AST L
= =1
ALT U
34,7
L❑

Preguntas de investigación

1. ¿Cuál es la utilidad clínica de la determinación de los niveles séricos de las

enzimas ALT y AST?
2. Explique la utilidad de la determinación de las siguientes enzimas:
Lactato deshidrogenasa.
Fosfatasa ácida
Fosfatasa alcalina
Creatinquinasa
3. Indique otros campos de aplicación de las enzimas.
 AST/ALT <1: Hepatitis viral aguda, hepatitis persistente crónica y lesiones hepáticas
tóxicas.
 AST/ALT 1-3: Cirrosis (de cualquier etiología), hepatitis crónico-agresiva, hepatitis
tóxico-alcohólica aguda.
 AST/ALT 3-6: Cirrosis alcohólica, ictericia obstructiva reciente.
 AST/ALT >6: Hepatitis tóxico-alcohólica crónica, ictericia obstructiva antigua,
cirrosis biliares, hígado metastático, carcinoma hepático primario.
6. BIBLIOGRAFIA NACIONAL E INTERNACIONAL

BioSystems S.A. ALT/GPT Data Sheet. Barcelona, España.BioSystems S.A.

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AST/GOT Data Sheet. Barcelona, España.Pacheco Vergara E. Prácticas de

Bioquímica: para estudiantes de Ciencias de la Salud. 2014.Meisenberg & Simmons.
Bioquímica Médica. 2018

3.1 EQUIPOS
NOMBRE DEL EQUIPO
1 Espectrofotómetro ultravioleta Biosytems 350, centrifugadora y
Baño María
Observaciones:

3.2 Materiales

Materiales Cantidad
1 Gradilla 5
2 Tubos de ensayos 20
3 micro pipetas de 1000µmL , 5
10µmL,20µmL y 50µmL
4 Beaker 1

3.3 Reactivos

REACTIVOS CANTIDAD N° DE
POR GRUPO GRUPOS TOTAL
DE TRABAJO DE
TRABAJO
1 Reactivo A: Tris 121 mmol/L, L- 4ml 5 5ml
aspartato 362 mmol/L, malato
deshidrogenasa > 460 U/L, lactato
deshidrogenasa > 660 U/L, pH 7,8.
2 Reactivo B: NADH (forma reducida) 1ml 5 5ml
1,9 mmol/L y 2-oxoglutarato 75
mmol/L.
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3 Reactivo C (auxiliar): Fosfato de

piridoxal (Vitamina B6) 10 mmol/L.
Actúa como coenzima. x x x
4 Reactivo A: Tris 150 mmol/L 4ml 5 5ml
(solución amortiguadora), L-alanina
750 mmol/L,lactato deshidrogenasa >
1350 U/L, pH: 7,3.
5 ReactivoB: NADH(forma reducida)1,9 1ml 5 5ml
mmol/L y 2-oxoglutarato 75 mmol/L.

Observaciones: Para el trabajo experimental de la asignatura de bioquímica en el

programa de Medicina se organiza las secciones por grupo 5 de 4 integrantes
máximo.

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