Practica 7. - Efecto de La Composición de La Fase Móvil

INSTITUTO POLITECNICO
NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERIA QUIMICA E INDUSTRIAS

EXTRACTIVAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA INDUSTRIAL
ACADEMIA DE QUIMICA ANALITICA
OPTATIVA 3
LABORATORIO TECNICAS DE SEPRACION
Practica 7.- Efecto de la composición de la fase móvil

en la elución de los analitos.
Dr. Luis E. Camacho Camacho

Velazquez Aguilar Alan Ignacio
3IM78
OBJETIVOS
✓ Inyectar estándares de benceno y tolueno a diferentes composiciones de

fase móvil.
✓ Establecer la influencia de la composición de la fase móvil en la elución de

cada analito.
✓ Inyectar muestras de mezcla de benceno - tolueno para identificarlos por

comparación de tiempos de retención.
✓ Realizar las modificaciones necesarias a los métodos de análisis para

realizar el trabajo experimental de esta práctica.
INTRODUCCION TEORICA
a) Investigar la influencia de la composición de la fase móvil en la elución
de los analitos.
Consideremos la separación de dos sustancias A y B en una columna por

cromatografía de elución.
La elución implica el transporte de una especie a través de una columna por adición
sucesiva de fase móvil (eluyente). Sucesivas adiciones de fase móvil hacen
descender las moléculas de analito por la columna en una serie de transferencias
entre la fase móvil y la fase estacionaria.
Si al final de la columna se coloca un dispositivo que responda a los cambios de

composición de la fase móvil, es decir, a la presencia de los distintos solutos
(detector) se puede registrar un cromatograma, gráfico que representa la respuesta
del detector en función del tiempo de elución (o volumen de eluyente añadido).
La línea base del cromatograma corresponde a la señal del detector en ausencia de

compuestos eluidos, la aparición de un pico representa la elución de un componente
de la muestra. la separación se completa cuando el cromatograma presenta tantos
picos como compuestos formaban parte de la mezcla objeto de análisis.
Existe una estrecha relación entre el tiempo de retención o elución de los analitos
con la composición de la fase móvil como consecuencia del efecto de la polaridad.
De hecho, en la HPLC de reparto de fase inversa, el tiempo de elución de los
analitos puede ser alterado modificando la polaridad de la fase móvil, es decir,
variando el tipo de disolventes a utilizar y el porcentaje empleado de cada uno de
ellos. Esta es la manera más sencilla para intentar mejorar la resolución
cromatográfica de dos componentes de una muestra cuyos picos cromatográficos
se solapan, o para disminuir el tiempo global de separación de los componentes
cuando estos presentan tiempos de retención muy diferentes.
Un adecuado punto de partida para optimizar la separación cromatográfica sería

emplear una mezcla de agua y un disolvente orgánico polar (metanol o acetonitrilo),
con una mayor proporción de agua (p. ej.: cercano al 100%), y observar cómo varían
los tiempos de elución y la resolución de los analitos al disminuir la proporción
acuosa y aumentar la proporción del disolvente orgánico.
Por norma general, una elución isocrática —que mantiene constante la composición
de la fase móvil durante todo el proceso cromatográfico— da lugar a separaciones
cromatográficas más reproducibles que una elución en gradiente —que varía la
composición de la fase móvil durante el proceso cromatográfico—.
La elución isocrática se emplea para separaciones simples —de uno o pocos

componentes— reservando la elución en gradiente para separaciones de mezclas
más complejas, ya que permite aumentar significativamente el «poder de
separación» como consecuencia de un aumento de la eficiencia cromatográfica
(disminución de la anchura del pico), además de permitir disminuir el tiempo de la
cromatografía y reducir el consumo de los disolventes que conforman la fase móvil.
b) Investigar cómo se realizan los análisis isocráticos y los análisis de

gradiente de composición.
En cromatografía de líquidos, es posible trabajar en dos modalidades; isocrático,

cuando la fase móvil mantiene la misma composición durante la elución, y en
gradiente, cuando la composición de la fase móvil cambia según una función
dependiente del tiempo.
Para trabajar en la modalidad de gradiente, es necesario que el equipo

cromatográfico tenga un dispositivo capaz de realizar mezclas de disolventes con
un control preciso y reproducible.
Los dos principales métodos de mezclado de los componentes de la fase móvil se

conocen como mezclado a alta presión y mezclado a baja presión
Mezclado a alta presión
Este sistema de mezclado utiliza una bomba para cada

uno de los disolventes que se van a mezclar, estando
la salida de cada bomba conectada a una conexión en
"T" o a una pequeña cámara de mezcla. La
denominación de mezcla en alta presión es debida a
que la mezcla se realiza una vez que los disolventes
han pasado la bomba y, por lo tanto, han adquirido la
presión de trabajo.
El mayor inconveniente de este sistema de mezcla es

el alto coste de las bombas si se requieren mezclas con
un porcentaje inferior a un 5 % de uno de los
componentes, ya que en este caso deben utilizarse bombas de alta precisión y,
además, se necesita una bomba para cada uno de los disolventes a mezclar. Como
ventajas, se pueden señalar una buena reproducibilidad de las mezclas, una rápida
respuesta en los cambios de concentración y, además, la posibilidad de utilizar cada
una de las bombas por separado para trabajar con sistemas isocráticos
independientes.
Mezclado a baja presión
En los equipos de mezcla en baja presión, el

mezclado de los diferentes componentes se
lleva a cabo antes de éstos entren en la
bomba (en la zona de baja presión del
sistema), controlándose el caudal del sistema
cromatográfico por medio de una sola
bomba. El mezclado de los componentes se
realiza por medio de válvulas porcentuales
controladas por relés, que están calibradas
para dar la mezcla adecuada. El dispositivo
de control simplemente abre cada válvula
durante un período de tiempo adecuado, que
será función del porcentaje de cada componente que se precise en la mezcla.
La principal ventaja de este tipo de mezclado, es que el coste del equipo se reduce
considerablemente. El mezclado en baja permite la mezcla de dos o más
componentes de la fase móvil con una buena reproducibilidad, aunque con unos
tiempos de retardo algo mayores respecto a la mezcla en alta presión. Como
principal desventaja, se tiene la baja reproducibilidad que se obtiene en mezclas
donde uno de los componentes se encuentra en una proporción de menos del 5%.
c) Investigar qué tipo de compuestos se usan como fase móvil

La fase móvil juega un papel principal en la cromatografía líquida, ya que es la
variable del sistema que permite mayor variación y que, por otra parte, permite
efectuar los pequeños retoques necesarios para lograr una perfecta separación.
En cromatografía de adsorción, se utilizan como fase móvil disolventes orgánicos

de polaridad baja o media (la polaridad está en relación directa con la fuerza
eluotrópica co), pudiéndose utilizar un rango muy variado de fuerza eluotrópica, bien
por cambios de disolvente, bien por mezclas de dos o más disolventes de diferentes
polaridades.
La selección de la fase móvil en cromatografía líquida de adsorción se efectúa

convenientemente con la ayuda de la llamada escala de Hildebrand, que clasifica a
los diferentes disolventes utilizados como fase móvil de acuerdo con la fuerza
eluotrópica (co), que indica su fuerza como eluyente con relación al pentano, al que
se le asigna convencionalmente el valor cero.
d) Investigar las propiedades fisicoquímicas de los solventes, que son

importantes en cromatografía de líquidos de alta resolución
El agua es el disolvente menos fuerte para la elución de solutos en cromatografía

de fase reversa, dando origen a tiempos de retención muy elevados; por este
motivo, se tiene la necesidad de utilizar modificadores orgánicos (los más usados
son metanol y acetonitrilo) que deben de cumplir las siguientes condiciones:
• Ser compatible con el detector utilizado.

• Ser miscible con el agua en un amplio margen de proporciones.
• No reaccionar ni con la fase estacionaria ni con la muestra a separar.
• Ser poco tóxico.
• Sus vapores no deben producir mezclas inflamables con el aire.
• No deben impedir la detección de los solutos. El caso más frecuente de
interferencia se presenta cuando se utiliza un detector de UV, en el que
muchos disolventes presentan una absorción excesiva a longitudes de onda
bajas (longitud de onda de corte).
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
a) Encendido (Solamente citar la práctica donde se hizo el diagrama de
bloques)
En la practica 5: Encendido y apagado de un equipo de cromatografía de líquidos
de alta resolución, HPLC. Se describen a detalle los pasos para el encendido
correcto del equipo Flexar, Perkin Elmer.
b) Generación de un método de análisis a partir de cero

Abrir el programa “HPLC – UV (Data
Only)
Después de la realización de la purga y

la subida de flujos, se procede a realizar
la creación del método.
Se presiona el botón “método” para crear o cargar un método

En esta parte se pone el nombre y la
descripción del método nuevo creado,
al igual que con el programa de CG se
puede poner una lista de notas.
En la edición del método, se edita
primeramente el detector, en ese caso
se trabaja con Uv – vis, así como se le
asigna el tiempo de entre 5 a 6 minutos
para poder realizar el análisis así como
se coloca el dato de la longitud de onda
(254 nm).
Después se pasa a las opciones de la

bomba, donde es posible cambiar los
parámetros de acuerdo a lo requerido
para la práctica, como es el tiempo, así
como la presión en donde siempre se
debe estar cuidando para que no
sobrepase la máxima (6000),
provocando la pérdida del análisis. Así
como también se pueden generar los
pasos con los cuales trabajara el
sistema.
Se muestran una parte del programa,
que nos indica los pasos, cuando se
detienen, el flujo, así como los
reservorios que tiene el cromatógrafo
Se procede a instalar el método, para

guardarlo, y se puede instalar el
método, así que se procede a la opción
de run time, donde se selecciona
análisis simple.
En la parte inferior, se puede observar

la opción “Apply” que se selecciona
para instalar el método, y donde el
aparato comienza a modificar todo.
c) Obtención de los cromatogramas impresos
Abrir un método ya creado
Aparece ventana donde se muestran

las caracterisiticas generales del
método
Se visualiza la información del detector,

en donde seleccionamos el modulo del
detector, así como el tiempo,
igualmente se debe seleccionar un auto
cero
Se selecciona la bomba, modificando la

transición de la fase móvil, en este caso
debe ser debido al método ya sea
isocratico o gradiente, el tiempo de la
bomba y el detector debe coincidir
Pasando a la siguiente pestaña, se

pueden poner cierto tipo de datos, los
cuales son opcionales
Aunque ya este el método, se debe
volver a seleccionar
Ya seleccionado aparecerá que ya esta

seleccionado el método y se debe
presionar “Apply” para que este activo
Cuando se presiona el botón aparece la

siguiente ventana, en donde se muestra
que dispositivo esta listo para el análisis
Posteriormente, se debe esperar el

equilibrio, y a esto el programa indica
que necesita la inyección manual
Cuando se prepara la muestra, y se

inyecta la muestra, comienza el
análisis, mostrando la señal en el
diagrama
Se tiene que esperar cierto tiempo para
que comiencen a aparecer las
variaciones del detector, aunque
algunas pueden ser impurezas
Esto es aplicado para todas las muestras inyectadas, ya que es un proceso,

donde solo se modifican ciertos parámetros.
d) Apagado (Solamente citar la práctica donde se hizo el diagrama de

bloques)
En la practica 5: Encendido y apagado de un equipo de cromatografía de líquidos
de alta resolución, HPLC. Se describen a detalle los pasos para el apagado correcto
del equipo Flexar, Perkin Elmer.
RESULTADOS EXPERIMENTALES
Muestra Composición de Flujo Tr Tr T Nombre

FM mL/min benceno tolueno análisis del analito
% %H2O (min ) (min) (min)
metanol
1 80 20 1 3.411 8 BENCENO
2 3.818 TOLUENO
3 3.422 3.827 MEZCLA
4 65 35 4.494 8.5 BENCENO
5 6.245 TOLUENO
6 4.71 6.247 MEZCLA
7 50 50 7.818 16 BENCENO
8 13.323 TOLUENO
9 7.85 13.108 MEZCLA
Datos de ajuste
% tr tr
METANOL benceno tolueno
50 7.85 13.108
65 4.71 6.247
80 3.422 3.827
90 3.3 3.4
CROMATOGRAMAS
ANALISIS DE RESULTADOS
Visualizando tanto los cromatogramas como la tabla de datos experimentales
podemos observar, que para 80/20, los tiempos de retención son muy similares por
lo que los picos serian muy parecidos en su altura, pero aun podemos decir que el
mas alto es el tolueno.
Para la comparación 50/50, el pico del benceno es mucho mas alto, debido a que
en las impurezas se tiene una altura similar.
De igual manera 65/35, se puede ver claramente que el ultimo pico mas alto debido
a que el tiempo de retención es mucho mayor que el del benceno. Por último para
identificar el pico anterior podemos sustentar que es el del benceno debido a que
están bien formados en comparación a los de las impurezas que tienen cierto ruido
y no se aprecian de manera correcta
CALCULOS
Realizando el ajuste, procedimos a realizar la grafica para observar y calcular los
tiempos de retención tanto del benceno como del tolueno.
tr vs % metanol
14
12 y = 0.008x2 - 1.3508x + 60.689
10
tr(min)
8
6
4
2 y = 0.0037x2 - 0.6275x + 30.013
0
40 60 80 100
% Metanol
TOLUENO
y = 0.008x2 - 1.3508x + 60.689
𝒕𝒓 = 𝟎. 𝟎𝟎𝟖(𝟕𝟓)𝟐 − 𝟏. 𝟑𝟓𝟎𝟖 + 𝟔𝟎. 𝟔𝟖𝟗
Realizando el calculo
𝒕𝒓 = 𝟒. 𝟑𝟕𝟗 𝒎𝒊𝒏
BENCENO
y = 0.0037x2 - 0.6275x + 30.013
𝒕𝒓 = 𝟎. 𝟎𝟎𝟑𝟕(𝟕𝟓)𝟐 − 𝟎. 𝟔𝟐𝟕𝟓 + 𝟑𝟎. 𝟎𝟏𝟑
Realizando el calculo
𝒕𝒓 = 𝟑. 𝟕𝟔𝟑 𝒎𝒊𝒏
CONCLUSIONES
Para esta practica el enfoque que tomo sobre la importancia que tiene la
concentración de la fase móvil para una buena lectura de cromatogramas es muy
importante ya que, Existe una estrecha relación entre el tiempo de retención o
elución de los analitos con la composición de la fase móvil como consecuencia del
efecto de la polaridad.
De hecho, el tiempo de elución de los analitos puede ser alterado modificando la
polaridad de la fase móvil, es decir, variando el tipo de disolventes a utilizar y el
porcentaje empleado de cada uno de ellos.
Como mencione la concentración de la fase móvil es sumamente importante, ya que
nos ayuda visualizar los picos de mejor forma, debido a que la elución en gradiente(
composición variable) sirve para separaciones de mezclas más complejas, ya que
permite aumentar significativamente el «poder de separación» como consecuencia
de un aumento de la eficiencia cromatográfica (disminución de la anchura del pico),
además de permitir disminuir el tiempo de la cromatografía y reducir el consumo de
los disolventes que conforman la fase móvil.
BIBLIOGRAFIA
Práctica 8.- Influencia de la Composición de Fase Móvil en la elución del analito.
Parte 3.
(2020, 9 diciembre). [Vídeo]. YouTube.
https://www.youtube.com/watch?v=aBb1A3TZ6CI&ab_channel=luiscamacho

Parte 4.
https://www.youtube.com/watch?v=r8tRIWgJTs&ab_channel=luiscamacho
Parte 5.
https://www.youtube.com/watch?v=Yg6GjoWPgVU&ab_channel=luiscamacho

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Mezclado a baja presión

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El agua es el disolvente menos fuerte para la elución de solutos en cromatografía

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