Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 1

INDICE
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UNIDAD I: Generalidades sobre la biotecnología 4
1. Desarrollo de la biotecnología en III etapas 5
2. Aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales 5
2.1 Investigación 5
2.2 Propagación masiva 6
2.3 Cultivo de anteras 6
2.4 Cultivo de embriones para resolver problemas de incompatibilidad 7
2.5 Cultivo de protoplastos 7
2.6 Micropropagación 7
2.7 Conservación e intercambio de germoplasma 7
2.8 Producción de metabolitos secundarios 8
3. Ventajas y desventajas de la micropropagación 8
4. Micropropagación: la alternativa adecuada? 8
UNIDAD II: Establecimiento de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales 10
1. Construcción del laboratorio 10
2. Tipos de laboratorio 11
3. Distribución de áreas del laboratorio 11
3.1 Área de preparación de medios 11
3.1.1 Equipos utilizados en el área de preparación de medios de cultivo 11
3.2 Área de operación o de transferencia 13
3.2.1 Equipos utilizados en el área de operación o transferencia 14
3.3 Área de cultivo o cuarto de crecimiento 14
3.3.1 Equipo necesario en el área de cultivo 14
Seguridad para el trabajo en el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales 15
UNIDAD III :Reguladores de crecimiento 16
1. Tipos de reguladores de crecimiento 16
1.1 Auxinas 16
1.2 Citoquininas 17
1.3 Giberalinas 18
2. Inhibidores de crecimiento 19
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UNIDAD IV: Componentes del medio de cultivo 20

1. Composición química 20
1.2 Macroelementos 21
1.2 Microelementos 21
1.3 Vitaminas 22
1.4 Aminoácidos y compuestos indefinidos 22
1.4.1 Aminoácidos 22
1.4.2 Compuestos indefinidos 23
1.4 Azúcares 23
1.7 Reguladores de crecimiento 23
1.8 Agentes gelificantes 23
1.9 Agua 25
2. Medios nutritivos básicos en el campo de la investigación 25
2.1 Cómo seleccionar el medio de cultivo adecuado? 25
UNIDAD V: Asepsia en la técnica de cultivo de tejidos 26
1. Métodos para eliminar microorganismos 26
1.1 Métodos físicos 26
1.1.1 Calor seco 26
1.1.2 Calor húmedo 26
1.1.3 Ultrafiltración 27
1.1.4 Efectos de la esterilización con calor sobre los componentes del medio 27
1.2 Métodos químicos 27
1.3 Uso de antibióticos 28
2. Esterilización del área de cultivo 29
3. Trabajo aséptico en las cámaras de flujo laminar 30
UNIDAD VI: Procesos morfogénicos 31
1. Eventos que involucran los procesos morfogénicos 32
2. Iniciación de cultivo de callo 32
3. Influencia de los reguladores de crecimiento 33
4. Formas de organogénesis 36
5. Embriogénesis somática 36
6. Características de las plantas donantes 37
6.1 Condiciones de cultivo de la planta 37
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UNIDAD VII: Adaptación de plantas cultivadas in vitro a condiciones naturales 38

1. Características de las plantas in vitro 38
2. Factores físicos que afectan la aclimatación 38
Bibliografía 39
Glosario 40
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UNIDAD 1
GENERALIDADES SOBRE LA BIOTECNOLOGÍA.

La biotecnología es hoy día es instrumento importante para diferentes

actividades. En ella se encuentran inmersos procedimientos que nos permiten
reproducir en forma masiva plantas, como el cultivo de tejidos vegetales. Se
puede alterar genéticamente una planta a través de la ingeniería genética, o
bien se puede lograr almacenar material vegetal valioso por largos períodos de
tiempo. También es posible extraer metabolitos secundarios, producir plantas
libres de virus, etc. Estas son algunas de las muchas alternativas que nos
ofrece la biotecnología en general. Es por eso que una definición puede
abarcar diferentes ciencias y conceptos y en realidad no se puede decir a
ciencia cierta cual es la mejor.
Por lo anterior sobre biotecnología existen muchas definiciones que tratan de
unificar conceptos tales como:
Biotecnología es la utilización y transformación de microorganismos y células
vegetales o animales para obtención de un producto determinado.
En forma más general es un conjunto de técnicas que permiten la utilización
de seres vivos o parte de éstos, para producir o modificar productos, mejorar
plantas, animales o desarrollar microorganismos con propósitos industriales y
comerciales.
El desarrollo de la biotecnología aplicada al cultivo de tejidos vegetales se
basa en la totipotencia de las células, lo cual se define como la capacidad de
toda célula viva, tanto somática como sexual y que dispone de la información
genética, para formar un individuo completo.
La técnica de cultivo de tejidos es aplicada tanto a células vegetales como
animales, sin embargo la de cultivo de tejidos vegetales quedó algo rezagada
debido al tardío descubrimiento de los reguladores de crecimiento en 1955.
El avance de la técnica en el cultivo de tejidos vegetales se explica debido a
que en las plantas ocurre la regeneración de tejidos en forma más acelerada y
frecuente que en los animales, además del aspecto moral que implica la
creación de seres con características no naturales o simplemente la
reproducción masiva de un mismo individuo en forma idéntica, que trae
consigo muchos cuestionamientos de tipo social. Contrariamente esta
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situación no se presenta al trabajar con plantas puesto que dentro de la

relación hombre-planta el concepto moral no juega un papel importante.
1. DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGIA EN III ETAPAS.
 Primera etapa: Proceso de fermentación de vino, cerveza, pan (2000
años antes de Cristo). Selección empírica de plantas y animales, hasta
mediados del siglo XIX.
 Segunda etapa: Se inicia con las observaciones de Darwin sobre el
origen de las especies, seguido por el descubrimiento de las leyes de
Mendel. Se incluye también el inicio de la Revolución Verde.
 Tercera etapa: Conocida como la biotecnología moderna, incluye el
descubrimiento de la estructura de la molécula de ADN (ácido
desoxirribonucléico) por Walson y Crick, 1953.

2. APLICACIONES DEL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

En la agricultura, el cultivo de plantas a través de la técnica de cultivo in vitro
consiste en sembrar secciones, órganos o tejidos de plantas de forma aséptica
en un medio de cultivo balanceado y mantenido en condiciones controladas de
luz, temperatura, humedad y fotoperíodo en un cuarto de crecimiento por el
tiempo que sea necesario, antes de salir a campo o invernadero.
El uso del cultivo in vitro se justifica a partir de una situación problemática de
reproducción que tenga un cultivo en el ámbito de campo, o bien si las
ventajas que ofrece el reproducirlo in vitro sean mucho mayores que si se
realizaran en campo o una combinación de ambas técnicas

2.1 Investigación
La técnica de cultivo de tejidos vegetales es utilizada en la investigación
botánica, básicamente en las ramas de la fisiología, patología y otros.
Los resultados obtenidos en la investigación in vitro, no siempre son
iguales a los in vivo (cultivo en ambiente natural), es por esta razón que
cuando se prueba en condiciones de campo, debe hacerse una adecuación
gradual de manera que se llegue a un punto de equilibrio donde los
resultados in vitro sean óptimos y aplicables en condiciones de campo.
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2.6 Propagación masiva

El cultivo de tejidos vegetales se emplea en la propagación masiva de
plantas, principalmente en tres situaciones:
 En plantas cuya demanda sea muy elevada, y su proceso de
propagación es muy lento o que su reproducción implique costos
muy elevados. Esta técnica resuelve dicha situación a través de la
propagación masiva de plantas in vitro, por ejemplo la producción de
orquídeas o banano.
 En la reproducción de híbridos o variedades nuevas con fines
comerciales de los cuales se tiene una población poco numerosa.
 Obtención de clones (idénticas genéticamente a la planta madre)
producto de la propagación masiva de diferentes secciones de
plantas.

2.7 Cultivo de anteras

El objetivo de cultivar anteras y polen es producir plantas haploides
mediante la inducción a la embriogénesis a partir de polen inmaduro o
microsporas. Las plantas haploides tienen un gran uso en el mejoramiento
genético de plantas.
Las plantas haploides pueden permanecer genéticamente estables y es
posible la regeneración de plantas diploides a partir de las haploides, como
tabaco ( Nicotiana tabacum).
La obtención de material homocigoto en forma convencional implica todo
un proceso en el que la autopolinización y selección juegan el papel más
importante durante aproximadamente siete u ocho generaciones, al cabo de
las cuales se obtienen padres homocigotos que al cruzarse dan origen a la
F1. Mientras que con el cultivo de anteras in vitro al ser este un material
haploide se hace un tratamiento con colchicina y ocurre inmediatamente la
duplicación cromosómica para producir dobles haploides (o sea los
homocigotos requeridos para la obtención de la F 1), con la diferencia que
éste proceso es mucho más rápido y práctico.
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Es importante señalar que antes de realizar el cruce entre los homocigotos,

éstos deben ser seleccionados, para proceder posteriormente a hacer el
cruce entre aquellos que presenten las mejores características.
El estado de desarrollo de las anteras al momento del cultivo es un factor
muy importante para el éxito de la producción de embrioides.
El cultivo aislado de polen es relativamente difícil, pero el cultivo de la
antera ha sido exitoso.

2.4 Cultivo de embriones para resolver problemas de incompatibilidad

El cultivo de embriones es otra de las opciones en cultivo de tejidos
vegetales aplicados a la agricultura para obtener plantas a partir de híbridos
no viables. Las semillas de estos no germinan en condiciones normales por
problemas de incompatibilidad, como resultado de cruces ínter específicos
ó ínter genéricos, ya sea a través del cultivo de embriones inmaduros en
fase de división temprana lo que permite incrementar el campo de crianza.

2.5 Cultivo de protoplastos:

El aislamiento y fusión de protoplastos (células desprovistas de la pared
celular, eliminada por acción enzimática), puede ser utilizados para
estudios de fitomejoramiento e hibridación somática mediante el
intercambio de material genético (ADN).

2.8 Micropropagación:
Cultivo de meristemos:
Esta técnica es muy importante para la reproducción masiva de clones y de
material vegetal genéticamente estable y para la reproducción de plantas
libres de virus.
También se utiliza la quimioterapia aplicando sustancias específicas para
alterar el mecanismo de síntesis de los virus. La técnica se complementa y
da mejores resultados si se aplica en plantas que van a ser cultivadas en
viveros donde hay un mejor control de las condiciones ambientales, lo que
disminuye el riesgo de recontaminación

2.7 Conservación e intercambio de germoplasma:

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La protección de las características en una variedad se facilita, sobre todo

si se cuenta con una reserva de información en el ámbito de genes. Si ésto
se realiza a través de semilla reproducida al nivel de campo, resulta
problemático tener un control absoluto de todas las características
deseables y el costo que representa el manejo de la plantación en términos
de mano de obra, disponibilidad de área y más aún tratándose de cultivos
de ciclo corto. Es así como la conservación del material genético o banco
de germoplasma evita la problemática antes planteada.
El material in vitro conservado a temperaturas bajas ofrece ventajas en la
utilización de intercambio de germoplasma, además es un material libre de
patógenos y presenta alto potencial de propagación.

2.8 Producción de metabolitos secundarios.

Así como se cultivan microorganismos (algas, bacterias, hongos) para
obtener productos primarios como: ácidos nucleicos, vitaminas,
aminoácidos, de igual forma se cultivan plantas en el campo con el fin de
obtener productos secundarios.
Con el cultivo in vitro se logran obtener pigmentos, esteroides, y alcaloides
entre otros, esto se realiza a través de la técnica de cultivo de células en
suspensión continúa, en la que se da renovación permanente al medio.

3. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA MICROPROPAGACION.

3.1 Ventajas:
 Se pueden reproducir especies lentas y difíciles de multiplicar in
vivo.
 Reproducción masiva de plantas en poco espacio y tiempo menor.
 Reproducción de plantas todo el año.
 Se puede tener un mejor control sanitario, obteniendo plantas de
mejor calidad.
3.1 Desventajas:
 Se requiere equipo sofisticado y mano de obra especializada.
 Alto costo de reactivos, electricidad y construcción del laboratorio.
 Riesgo de contaminación y variación somaclonal.
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4. MICROPROPAGACIÓN: LA ALTERNATIVA ADECUADA?

La micropropagación es la mejor alternativa en los siguientes casos:
 Cuando hay pocos genotipos deseables.
 Para incrementar cultivares seleccionados.
 Para especies forestales en las cuales los programas de mejoramiento
son a largo plazo.
 Para multiplicar plantas durante todo el año sin estar sujeto al ciclo
sexual o condiciones ambientales.
 Para clonar plantas y producir híbridos.
 Cuando se necesita limpiar de virus las plantas.
 Para conservación de germoplasma.
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UNIDAD II
ESTABLECIMIENTO DE UN LABORATORIO DE CULTIVO
DE TEJIDOS VEGETALES.

El laboratorio es un lugar de estudio práctico, de observación de

fenómenos, de correlación de hechos y obtención de conclusiones, es parte
importante del curso, y que a través de éste se complementan e ilustran los
conceptos teóricos.

El tamaño de un laboratorio de cultivo de tejidos que depende de algunos

aspectos como:
 Volumen de trabajo.
 Tipo de trabajo.
 Recursos financieros disponibles.
Parte del éxito del trabajo del cultivo in vitro, depende sobre todo del diseño
del laboratorio, del personal capacitado, del equipo con que se disponga y
especialmente de tener muy claro él o los objetivos por los cuales se origina la
idea de montar un laboratorio.

1. CONSTRUCCIÓN DEL LABORATORIO.

Las recomendaciones para la construcción de un laboratorio de cultivo de
tejidos vegetales van dirigidas principalmente a mantener un nivel alto de
asepsia dentro del laboratorio.
La construcción se recomienda hacerla con paredes de bloques o ladrillos. Las
superficies de las paredes y el cielo raso deben ser lisas, con el propósito de
evitar la acumulación de polvo o de insectos. El piso debe ser fácilmente
lavable y resistente a diferentes tipos de desinfectantes.
Todo el edificio debe contar con una ventilación adecuada por lo cual se debe
planear muy bien la ubicación de las ventanas, pasillos, puertas y pasos a
través de ventanas. Es importante contar con una salida de emergencia bien
ubicada y rotulada.
Las instalaciones eléctricas deben ser de 220V o de corriente trifásica 380V,
debe conocerse con anterioridad que equipo se va a utilizar en el laboratorio y
sus requerimientos
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Se deben tener extintores contra incendios ya sea para material inflamable

como para instalación eléctrica, todo el personal debe conocer su ubicación,
utilización y se debe estar pendiente de las fechas de recarga de los extintores.

2. TIPOS DE LABORATORIO
Según el equipo que se utilice se presentan los siguientes tipos de laboratorio:
 Investigación: con un equipo sofisticado y variado.
 Casero: con un equipo sencillo y de bajo costo.
 Enseñanza: con un equipo repetido y variado.
 Comercial: con equipo estandarizado y adecuado.

3. DISTRIBUCIÓN DE ÁREAS DE UN LABORATORIO

Todo laboratorio de cultivo de tejidos debe contar con tres áreas básicas.
 Área de preparación de medios.
 Área de operación o transferencia
 Área de cultivo o cuarto de crecimiento

3.1 Área de preparación de medios

Es el área donde son preparados los medios de cultivo y todos los
materiales (instrumentos, agua, frascos etc.) que van a ser esterilizados.

3.1.1 Equipos utilizados en área de preparación de medios de cultivo.

a. Equipo par determinar volumen.
 Probeta.
 Pipetas ajustables.
 Pipetas.
 Micropipetas (1000 µl).
b. Equipo para determinar peso.
Se pueden usar diferentes tipos de balanzas según las cantidades que
se requiera pesar.
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 Balanza granataria: esta es utilizada para pesar cantidades

mayores que 10 gr. hasta 11 Kg en algunos casos.
 Balanza semi-analítica: pesa cantidades pequeñas, tienen
tres dígitos después del punto del gramo.
 Balanza analítica: esta es muy sensible, se pueden pesar
gramos y miligramos, tienen cuatro dígitos después del
punto del gramo.
c. Equipo para medir la acidez o alcalinidad de una solución (pH)
El peachímetro es un aparato de medición del pH que genera datos
sobre la cantidad de iones Hidronio (H+) o Hidroxilo (OH) disueltos en
la solución. Para determinar si el valor numérico dado corresponde a
una solución ácida o básica, el rango establecido es el siguiente,
 pH 7.0 es considerado neutro
 pH mayor que 7.0 es considerado alcalino o básico
 pH menor que 7.0 es considerado como ácido.
Si la solución se desea acidificar se puede añadir a la misma ácido
sulfúrico (H2SO4 ) o ácido clorhídrico (HCl), si por el contrario se desea
alcalinizar o basificar puede agregar hidróxido de sodio (NaOH) o
hidróxido de potasio (KOH).
Pueden utilizarse también cintas indicadoras de pH donde los valores
son comparados por medio de cambios en la coloración de la banda
utilizada, en las mismas cajas se encuentran los valores otorgados a
cada color en especial.
d. Equipo para esterilización
La esterilización de los medios de cultivo, frascos de vidrio,
instrumental de trabajo y otros materiales generalmente se lleva a cabo
en una autoclave. Este instrumento esteriliza por medio de calor
húmedo siempre que el tiempo de exposición sea suficiente.
El vapor a presión puede destruir todos los microorganismos en el
medio. La autoclave tiene un rango de temperatura entre 115 y 135°C.
La temperatura más usada es 121°C.
El éxito de la esterilización depende de:
 La presión 1,2 Kg –cm2 ó 15 atm.
 Temperatura 121°C
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 Tiempo de exposición
 Volumen que se va a esterilizar
e. Equipo para destilación de agua:
El proceso de destilación produce agua con menos influencia de
elementos minerales, pero no de microorganismos, para que éste último
se dé debe pasar por el proceso de esterilización. Son más
recomendables los destiladores de vidrio que los de metal o plástico, ya
que éstos podrían desprender iones que podrían contaminar el agua.
f. Equipo de refrigeración:
La refrigeradora sirve para mantener a bajas temperaturas (0-4°C) las
soluciones madres o stock y algunos reguladores de crecimiento. Si se
usan componentes naturales como agua de pipa es necesario congelarla
para evitar que se fermente, de esta manera durará más tiempo.

3.2 Área de operación o de transferencia

Área donde se realizan las siembras, trasplante de material de manera
aséptica. El equipo de apoyo como microscopios o estereoscopios pueden
también complementar esta la operación.

3.2.1 Equipos utilizados en el área de transferencia u operación.

a. Cámara de flujo laminar.
Su funcionamiento es sencillo, consiste básicamente en el paso de flujo
de aire a través de los filtros, en dirección tanto horizontal como
vertical, provocado por la acción de una bomba, el aire es así liberado
de microorganismos al área de trabajo de la cámara.
Este sistema está compuesto de:
Prefiltro. Panel de control.
Bomba de aire. Hepafiltro o filtro final.
Área de trabajo Luz ultravioleta
Existen cámaras de transferencia menos sofisticadas y más baratas que
desempeñan la misma función en cuanto a asepsia se refiere, son
cámaras artesanales.
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b. Equipo complementario
Para la limpieza de material vegetal se utilizan los siguientes equipos:
 Lavador ultrasónico: Es un equipo que se basa en un
mecanismo de lavado por medio de ondas de alta frecuencia muy
finas. Tiene mucha utilidad cuando se trabaja con tejidos
vegetales que poseen una capa cerosa, vellosidades ó partículas
de polvo.
 Estereoscopio: Se utiliza para la observación, manipulación, y
obtención de explantes muy pequeños previo al proceso de
cultivo, posibilita el aumento óptico(2x.- 4x).
3.3 Área de cultivo o cuarto de crecimiento
Es el área donde los explantes cultivados permanecen bajo condiciones
físicas controladas de temperatura, humedad y luminosidad, durante el
tiempo que sea necesario antes de ser llevadas al invernadero.
3.3.1 Equipo necesario en el área de cultivo:
En esta área se debe contar con estantes que se utilizan para colocar los
frascos de cultivo. Deben ser construidos preferiblemente en metal.
La temperatura en el cuarto de cultivo debe estar entre 25-30 °C y se
controla con aire acondicionado y termómetros. La humedad relativa
debe estar en 60-80% y se controla por medio de un hidrómetro. La
intensidad lumínica se mide a través de un fotómetro. Se usa un timer
que controla el fotoperíodo que en general se mantiene a 16 horas luz y
8 horas oscuridad dependiendo del cultivo.
a. Cámara bioclimática:
Este equipo controla en forma programada la temperatura, la humedad
relativa y el fotoperíodo, se utiliza con fines de investigación y tiene un
alto costo.
b. Agitador orbital:
Este equipo se utiliza con cultivos en medios líquidos, las revoluciones
por minuto (r.p.m.) son programadas para proporcionar oxigenación al
explante.
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SEGURIDAD PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO DE

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES.

 Los cilindros que contengan gas deben mantenerse alejados de

cualquier fuente de calor.
 En el laboratorio debe haber extintores portátiles colocados cerca
de las cámaras de flujo laminar y el área de preparación de
medios.
 Es exigido el uso de gabachas blancas limpias, mascarillas y gorras
para el trabajo en el área de operación.
 Manejar cuidadosamente el alcohol.
 Alejar el alcohol de la llamadle mechero.
 Cuando se derraman sustancias combustibles se debe apagar
inmediatamente el mechero.
 No dejar arder el mechero sin vigilancia dentro de la cámara de
flujo láminar.
 No introducir ningún instrumento caliente en el alcohol. En caso
que se produzcan llamas en el frasco con alcohol, se debe tapar con
un beaker hasta extinguir la llama.
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UNIDAD III
REGULADORES DE CRECIMIENTO.

Los reguladores de crecimiento son sustancias químicas orgánicas (no

nutrientes) necesarios para el metabolismo de las plantas; ya que en poca
cantidad influyen en su crecimiento y desarrollo, actúan en lugares diferentes
de donde son producidas y se encuentran presentes y activas en muy pequeñas
cantidades.

1. TIPOS DE REGULADORES DE CRECIMIENTO.

Hasta el momento se conocen cinco clases de reguladores de crecimiento:
auxinas; citoquininas; giberalinas; ácido absísico y etileno. Sin embargo no
se descarta la posibilidad de que existan otras sustancias que tengan la misma
función de los reguladores de crecimiento.
El crecimiento involucra tres aspectos: división celular, elongación celular y
diferenciación celular, todo esto incluye los fenómenos de morfogénesis,
maduración, dormancia, senescencia, abscisión, tropismo, los cuales tienen
relación directa o indirecta con hormonas.
En la técnica de cultivo de tejidos un aspecto importante es el de cambiar la
dirección del proceso de morfogénesis en las plantas, para lo cual resulta
indispensable conocer la acción de los reguladores de crecimiento. Se utilizan
actualmente solo citoquininas, giberalinas y auxinas, ya que el ácido absísico
y el etileno intervienen en los procesos de maduración, senescencia, latencia y
abscisión de las hojas en la planta, por lo tanto su mayor acción es la
inhibición.
Es importante señalar que el éxito o fracaso de esta técnica no depende tanto
del tipo y nivel de nutrientes o vitaminas que se aportan sino básicamente de
las concentraciones y tipos de reguladores de crecimiento que se utilicen.

1.1 Auxinas:
Se llaman auxinas a un grupo de sustancias químicas orgánicas cuyas
funciones básicas son de alargamiento celular. Son sintetizadas en los
ápices de tallo, especialmente en meristemos y hojas jóvenes. Éstas son
transportadas de los sitios de síntesis hacia las raíces. La auxina que
encontramos naturalmente en la planta es el Ácido Indol-acético (AIA)
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1.1.1 Auxinas más utilizadas en el cultivo de tejidos

 Ácido Indol–Butírico (AIB)
 Ácido Naftalenacético (ANA)
 Ácido Diclorofenoxiacético (2,4-D)
 Ácido Triclorofenoxiacético (2,4,5–T)
 Ácido 3,6 Dicloro-anísico (Dicamba)
 Picloram (Ácido picolínico)
Efectos fisiológicos de las auxinas:
 Acción sobre el crecimiento celular.
 Efectos sobre el desarrollo. Las auxinas controlan la iniciación de
raíces (rizogénesis), el desarrollo de yemas.
 Efectos sobre dominancia apical. La auxina por su síntesis en el
ápice contribuye a mantener la dominancia apical.
Efectos en cultivo in vitro:
 Promueve el crecimiento del callo, suspensiones celulares y
órganos (meristemos y ápices).
 Regulan la morfogénesis.

1.2 Citoquininas:
Las citoquininas se asocian con los procesos de división celular. La
producida artificialmente tienen propiedades análogas a las naturales.
La Zeatina es una citoquinina natural extraída de la semilla de maíz pero
esta tiene un costo muy alto.

1.2.1 Citoquininas más utilizadas en cultivo de tejidos vegetales

 6-fusfurilamina (Kinetina)
 Bencil adenina (BA)
 Bencilaminopurina (BAP)
 2-isopentil adenina (2iP)
 Zeatina.
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Efectos fisiológicos más importantes:

 Son necesarias para la división celular.
 Suprime el efecto inhibitorio de la auxina sobre las yemas, es decir
modifican la dominancia apical.
 Retardan la senescencia de los tejidos, especialmente de las hojas.
Efectos en cultivo in vitro:
 Estimulación de la división celular.
 Influyen en la síntesis de proteínas.

1.3 Giberalinas
Controlan la elongación celular y se asocian con la respuesta de la
floración. En general, las giberalinas estimulan la división celular y el
crecimiento en longitud de las células.
Efectos físológicos más importantes:
 Estimulan la inflorescencia.
 Estimula la brotación de yemas.
 Producen el alargamiento de los entrenudos en plantas enteras.
 Rompen la dormancia de un gran número de semillas y brotes.
Efectos en cultivo in vitro:
 Impiden la formación de callo y estimulan el crecimiento de
explantes organizados: meristemos yemas apicales brotes, embriones
somáticos.

1.4 Etileno:
Es producido por toda la planta, es un hidrocarburo gaseoso, actualmente
se le agrupa dentro de reguladores de crecimiento.
Efectos fisiológicos:
 Favorecen la maduración de frutos.
 Aceleran la senescencia de las flores.
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 19

2. INHIBIDORES DE CRECIMIENTO:
Son reductores de crecimiento, causando un efecto contrario al de las
giberalinas en los procesos morfogénicos.
El principal uso de éstos inhibidores es la conservación de germoplasma in
vitro a corto y mediano plazo.
Entre estas sustancias más usadas está el ácido abscísico (ABA) que en
condiciones in vitro pueden actuar de la siguiente manera:
 Disminuyen la susceptibilidad de la célula al frío, esto puede permitir
almacenar cultivos a bajas temperaturas por un período mayor.
 Inducen directamente la latencia de órgano, al reducir el metabolismo
celular y prevenir la división celular
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 20

UNIDAD IV
COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO

Anteriormente cuando se cultivaban plantas se pensaba en el aporte de

nutrientes minerales (inorgánicos), ahora que también se cultivan células, se
habla de un medio de cultivo en el que además de nutrientes minerales se
necesitan otras sustancias nutritivas de origen orgánico.

Un medio de cultivo es una mezcla de determinadas sustancias nutritivas,

con o sin gelificante, sobre o dentro del cual, crecen los explantes

1. COMPOSICIÓN QUÍMICA
Es importante resaltar que cuando se trata de cultivo en condiciones naturales
de suelo resulta más difícil controlar el nivel de nutrientes para aportar a las
plantas. Se debe considerar el hecho de que todos los elementos nutritivos son
igualmente importantes y que no son los elementos primarios los de mayor
importancia, ni los que la planta necesita en mayor cantidad, sino de los que
en el suelo casi siempre hay deficiencia.
Cuando se refiere a un medio de cultivo artificial se presenta otra situación, se
parte de un nivel cero de nutrientes hasta llegar al nivel óptimo requerido por
la planta a cultivar.
Los elementos tienen diferentes formas para ser asimilados por la planta, unas
son mejores que otras en términos de concentración, éstos pueden provocar
problemas de toxicidad, por lo que algunos elementos en su forma asimilable
deben controlarse en su concentración a través del pH.
El medio de cultivo puede ser químicamente definido dependiendo de si se
conoce o no la composición completa y la estructura química de cada
componente.
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 21

Generalmente el medio de cultivo está compuesto por:

a. Macroelementos: e. Reguladores de crecimiento.
 Sales inorgánicas
b. Microelementos f. Gelificante
c. Fuentes de energía y carbono: g. Agua
 Azúcares
d. Complementos orgánicos f. Otros componentes
 Vitaminas
 Fuentes de nitrógeno.

1.1 Macroelementos
Se incluyen los seis elementos mayores indispensables para el
crecimiento de las plantas superiores:
 Nitrógeno (N)  Calcio (Ca)
 Fósforo (P)  Magnesio (Mg)
 Potasio (K)  Azufre (S)

La adición de nitrógeno en los medios se hace principalmente en forma

de nitrato de amonio ( NH4NO3 ).

1.2 Microelementos
Los microelementos requeridos para el crecimiento de las
plantas son:
 Hierro (Fe)  Cobalto (Co)
 Zinc (Zn)  Molibdeno (Mo)
 Manganeso (Mn)  Cobre (Cu)
 Boro (B)

Estos elementos tienen importancia a nivel fisiológico y metabólico,

muchos de estos minerales son indispensables para la síntesis de
clorofila y el funcionamiento de los cloroplastos.
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 22

El hierro forma parte de la ferredoxina, importante en el transporte de

electrones durante la fotosíntesis. El hierro se añade en forma de
quelatos ( Fe- EDTA ), ya que en forma de sulfato se precipita y no es
disponible para los tejidos.

1.3 Vitaminas
En el cultivo de tejidos las vitaminas más utilizadas son las del
complejo B:
 Tiamina (B1)
 Piridoxina (B6)
 Ácido nicotínico (B3)
 Pantotenato de calcio (B5)
 Cobalamina (B12)
Se utiliza también un producto llamado Myo-inositol el cual es un
carbohidrato, pero se considera una vitamina con frecuencia, no es
indispensable en el medio de cultivo pero si se agrega estimula el
crecimiento.

1.4 Aminoácidos y compuestos indefinidos

1.4.1 Aminoácidos
Proveen a las células vegetales de nitrógeno inmediatamente
disponible pero éste no sustituye el nitrógeno inorgánico del
mismo medio.
Ningún aminoácido es esencial para el crecimiento de tejidos in
vitro, sin embargo existen varios que se han utilizado
experimentalmente.
Algunos aminoácidos de uso frecuente:
 Glutamina y asparagina: son transportadores de nitrógeno.
 L – arginina: estimula raíces.
 L – cisteína: es un agente reductor.
 L – serina: es empleada en cultivo de microsporas.
 Bacto peptona, Triptona
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 23

1.4.2 Compuestos indefinidos

Existen muchos complejos nutritivos que se usan en medio de
cultivo que tienen gran variedad en su efecto, por ejemplo el agua
de coco es muy usada por su contenido de citoquininas pero su
composición es compleja, también se usa el extracto de malta,
jugo de manzana, banano, papa, jugo de tomate, para
reproducción de orquídeas.

1.6 Azúcares
Las plantas cultivadas in vitro son heterótrofas y requieren de una
fuente de carbohidratos para obtener la energía necesaria para su
crecimiento y desarrollo.
La fuente de carbohidratos más usada es la sacarosa aunque en algunos
casos se utilizan otros azúcares como la glucosa, o la fructuosa.
Los azúcares actúan en los procesos de diferenciación celular, tienen
influencia sobre la organogénesis, cuando se aumenta la concentración
en el medio actúa como regulador de crecimiento.

1.7 Reguladores de crecimiento

Los reguladores de crecimiento más usados en cultivo in vitro son:
 Auxinas
 Citoquininas
 Giberalinas

1.8 Agentes gelificantes

Los medios de cultivo pueden ser líquidos o semisólidos, generalmente
se usa para gelificar el agar. Para reemplazar se puede usar como
soporte el “Gel rite” o el “Phytagel”, éstos tienen la ventaja de dar al
medio una apariencia transparente y así es más visible cualquier tipo de
contaminación.
Seguidamente se presenta un cuadro para comparar 3 gelificantes que
son utilizados en cultivo in vitro
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 24

CUADRO COMPARATIVO DE TRES AGENTES GELIFICANTES

USADOS EN CULTIVO IN VITRO.

Característica Agar Phytagel Gel rite

Natural (derivado Sintético Sintético

Origen de algas Polisacárido Polisacárido
marinas).

Apariencia Turbio-Opaco Transparente Transparente

del medio Cristalino Cristalino

Debe calentarse Se puede disolver Se puede disolver

Preparación para disolver. en frío. Agitar al en frío. Agitar al
distribuir distribuir
Cantidad
utilizada 7 - 8 gr 2,3 - 3 gr 2,3 - 3 gr
por litro (gr)
Ayuda a Se prefiere utilizar por el costo,
Otros controlar el apariencia cristalina que permite
inicio de visualizar mejor la contaminación,
problemas de además puede ser teñido con
vitrificación colorantes naturales para ser utilizado
como codificador
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 25

1.9 Agua
Los medios de cultivo se preparan con agua destilada, bidestilada o
desmineralizada preferiblemente, no se recomienda utilizar agua de
tubería por excesos de cloro o aguas duras (con carbonatos), el agua de
lluvia tampoco es recomendada por la contaminación (lluvia ácida)

2. MEDIOS NUTRITIVOS BÁSICOS EN CAMPO DE LA INVESTIGACIÓN

Desde hace muchos años se ha venido indagando sobre qué tipo de medios
son mejores para el cultivo de plantas, células o tejidos. Algunos
investigadores a lo largo de sus trabajos han establecido con éxito varios
medios de cultivo los cuales les han dado su nombre:
 Murashige y Skoog (M  S 1962)
 B5 de Gamborg ( 1968)
 Linsmaier y Skoog ( L  S 1968)
 Kudson ( Cultivo de semilla de orquídeas)
 Schenk e Hildebrand ( S  H ) y otros.
Estos medios son considerados básicos y se pueden utilizar agregándoles
concentraciones bajas de reguladores de crecimiento de acuerdo al objetivo de
la investigación.

2.1 Cómo seleccionar el medio de cultivo adecuado?

En la literatura existe gran cantidad
de medios de cultivo por lo que es
recomendable hacer una buena
revisión de literatura antes de
realizar cualquier investigación.
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 26

Los factores más importantes a tomar en cuenta en el cultivo de células son:

origen del explante, compuestos nutritivos esenciales y reguladores de
crecimiento, sin embargo en cultivo in vitro cada planta, cada órgano o tejido
debe ser considerado en forma particular.
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 27

UNIDAD V
ASEPSIA EN LA TÉCNICA DE CULTIVO DE TEJIDOS

En un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales las condiciones de asepsia

son de fundamental importancia. Todos los medios de cultivo empleados
contienen nutrientes, los cuales facilitan el crecimiento de bacterias, hongos y
levaduras, organismos causantes de contaminación en los cultivos.
La asepsia se logra considerando tres aspectos básicos.
 Esterilización de cristalería, instrumentos, agua, medios de
cultivo.
 Desinfección de material vegetal.
 Trabajo en condiciones asépticas: de ésta forma eliminará
esporas y otras estructuras reproductivas de los organismos
contaminantes.

1. METODOS PARA ELIMINAR MICROORGANISMOS

Para eliminar microorganismos desde el punto de vista aséptico existen dos
métodos:
 Métodos físicos.
 Métodos químicos.
1.1 Métodos físicos
Entre los métodos más usados están:

1.1.1 Calor seco

Se usa únicamente para cristalería, instrumentos de metal o de otra
materia que resistan altas temperaturas. Para este procedimiento se
trabaja con hornos. A una temperatura de 160 °C por dos horas es
suficiente para esterilizar.

1.1.2 Calor húmedo

Para este método se emplean las autoclaves, que trabajan con vapor
de agua bajo presión, generalmente el tiempo empleado para una
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 28

buena esterilización es de 15-20 minutos con una presión de 15

lib/pulg2 ( 1 Kg./ cm2), a una temperatura de 120 – 121 °C.
El agua destilada, los instrumentos y la cristalería pueden
autoclavarse por más tiempo sin ningún riesgo.

1.1.3 Ultrafiltración
Los componentes termolábiles (sensibles a la temperatura) de los
medios de cultivo, se esterilizan por medio de ultrafiltración.
Se usa papel filtro microporoso hecho a partir de celulosa. Este
detiene partículas según el diámetro de los poros. Se recomienda
que el diámetro de los poros sea de 0,22 micrones, ya que retiene a
las bacterias más pequeñas.

1.1.4 Efectos de esterilizar con calor en componentes del medio

Debe evitarse la sobresterilización de los medios, porque trae como
consecuencia:
Degradación de químicos: Algunos componentes de los medios
para cultivo in vitro como reguladores de crecimiento ( AIA ácido
indol–acético, ácido giberélico, zeatina), antibióticos, vitaminas, son
termolábiles, estos químicos deben ser esterilizados empleando el
método de ultrafiltración.
La sacarosa al ser sometida a altas temperaturas en tiempos
prolongados se desdobla en D –glucosa y D – fructuosa, se da un
proceso de pirólisis que puede causar toxicidad al explante.

1.2 Métodos químicos

La esterilización química o erradicación de los microorganismos por
medio de sustancias químicas se utiliza para desinfectar el material
vegetal. Este contiene en la superficie una abundante microflora que
debe ser eliminada empleando desinfectantes a diferentes
concentraciones:
 Hipoclorito de sodio (NaCLO): es uno de los desinfectantes más
utilizados, penetra en los tejidos sin impedir luego su desarrollo
celular, se usa en una concentración entre 0.5 – 3.0 %.
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 29

 Hipoclorito de calcio ( Ca(CLO)2): Se encuentra en forma de polvo,

se adiciona la cantidad requerida de hipoclorito de calcio en un
volumen determinado de agua y se agita por 10 minutos, luego se
filtra. El hipoclorito de calcio penetra en los tejidos, pero es poco
estable, se usa en concentraciones entre 9 – 10 %.
 Cloruro de mercurio ( Hg CL 2 ): Es un producto altamente tóxico,
tanto para las plantas, como para las personas, sin embargo como
esterilizante es muy eficaz.
El proceso de esterilización química de los explantes puede hacerse más
eficiente si se tiene en cuenta lo siguiente:
 Inmersión del material vegetal en la solución desinfectante,
con un agente dispersante (Tween)
 Dar un tiempo determinado según cada caso.
 Enjuagar con agua estéril y destilada (3 veces), por un minuto
cada uno.
Esta primera etapa es difícil de realizar en ocasiones, principalmente
cuando las plantas son traídas del campo y se utilizan como explantes
las partes que están en contacto con el suelo, estas pueden estar
contaminadas de hongos y bacterias. Algunas plantas presentan en las
hojas estructuras como tricomas que dificultan su desinfección.

1.3 Uso de antibióticos

Auque la mayoría de los microorganismos se encuentran en la
superficie de los tejidos vegetales, existen algunos en forma endógena
en la planta que no es eliminada por la desinfección superficial del
tejido. Sin embargo esta contaminación en algunas ocasiones puede ser
controlada con la adición de antibióticos al medio. La mayor parte de
los antibióticos se añade al medio de cultivo por medio de una
esterilización por filtración, debido que algunos de estos son
termosencibles.
La utilización de antibiótico puede conducir a la selección de
microorganismos resistentes.
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 30

2. ESTERILIZACIÓN DEL ÁREA DE CULTIVO

El punto de partida para el proceso de esterilización, se basa en un riguroso
control de ésta área a través del aislamiento de la zona de cultivo, tanto en
términos de ubicación, como de acceso de personas a ésta área.
Para el proceso de esterilización
existen varias alternativas en
términos tanto de ubicación,
construcción, como de instalación de
algunos equipos.

En ésta área es necesario trabajar con toda la asepsia posible, es recomendable

la construcción de un cuarto de aislamiento, que evite el paso directo de aire al
área de cultivo, además se puede instalar aquí un sistema de luz ultravioleta,
que refuerce el sistema de descontaminación.
Los rayos ultravioleta, se pueden usar en el momento en que no se dé tránsito
de personas. Una vez apagadas las luces ultravioleta, se debe esperar mínimo
media hora antes de entrar al cuarto.
El material vegetal una vez esterilizado debe ser manipulado en ambiente
estéril de una cámara de flujo laminar, ésta debe estar equipada con mechero
de alcohol o de gas.
Las condiciones de asepsia deben mantenerse a lo largo de todas las etapas del
proceso de cultivo in vitro.
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 31

TRABAJO ASÉPTICO EN LA CÁMARA DE FLUJO LAMINAR

 Debe usarse gabacha, zapatos, gorras y mascarillas, completamente

limpias.
 Antes de entrar a las cámaras debe lavarse las manos y antebrazos
con bastante agua y jabón.
 Cuando se instale en la cámara debe humedecerse las manos con
alcohol al 70%, también cada vez que saque las manos de la
cámara.
 Las herramientas esterilizadas con alcohol de 96% deben ser
flameadas durante su uso en las cámaras, pero deben estar frías
antes de utilizarla.
 Todo lo que se introduzca en las cámaras debe ser aperjado antes
con alcohol al 70 %.
 No introducir ningún instrumento caliente en el alcohol.
 No dejar arder sin vigilancia la llama del mechero.
 Dejar paso libre al flujo de aire entre la pantalla y el área de
trabajo.
 Una vez apagadas las luces ultravioletas, se debe esperar 30
minutos como mínimo antes de entrar al cuarto
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 32

UNIDAD VI
PROCESOS MORFOGÉNICOS.

En la técnica de cultivo in vitro hay cuatro factores que juegan un papel muy
importante:
 Aislamiento del explante: Explante es cualquier parte de la planta,
fragmento o tejido cortado de la planta madre para iniciar un cultivo
in vitro.
 Desinfección del tejido vegetal: Puede utilizarse el medio químico.
 Condiciones físicas controladas: Temperatura, luz, humedad
relativa y fotoperíodo.
 Balance nutricional: Medios nutritivos.

Estos cuatro factores llevan a iniciar el cultivo in vitro en condiciones

asépticas. Es recomendable hablar de cultivos in vitro de plántulas, tejidos,
células, protoplastos y otros. El flujograma que a continuación se presenta nos
muestra que a partir de explantes simples se llega hasta los más complejos.

Plántulas.

Órganos

Tejido

Células

Protoplastos

Organelas
Flujograma de cultivos que pueden ser realizados in vitro
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 33

1. EVENTOS QUE INVOLUCRAN LOS PROCESOS MORFOGÉNICOS.

A partir de estos explantes se puede orientar el desarrollo de diferentes tipos
de cultivo. Eventos que involucran los procesos morfogénicos:
Etapas de cultivo in vitro.
 Iniciación o establecimiento
 Multiplicación
 Regeneración
 Enraizamiento

Si el explante aislado esta compuesto de células diferenciadas, es necesario

producir una desdiferenciación; este proceso juega un papel importante ya que
permite a las células diferenciadas (adultas) pasar desde su forma adulta a su
forma juvenil; después de la desdiferenciación, las células pueden empezar a
dividirse en forma intensiva bajo la influencia de reguladores de crecimiento
que se ponen en el medio. Éstas células son inducidas a dividirse rápidamente
y son capaces bajo circunstancias especiales de rediferenciación de regenerar
órganos o embriones.

2. INICIACIÓN DEL CULTIVO DE CALLO

El callo se define como un tejido coherente pero desorganizado y amorfo
creado por división rápida de células. La proliferación de un fragmento de
planta para la regeneración de callo puede estar influenciada por:
 La especie de la planta: de especie a especie se presenta una variación
en la capacidad para producir callo in vitro, hay algunas plantas que aun
no se logra respuesta positiva, y en otras solo se ha llegado a la
producción de callo sin regeneración de planta.
 El estado fisiológico de la planta: es importante el estado fisiológico y
edad de la planta madre siendo recomendable utilizar plantas jóvenes
con crecimiento activo, aunque también se pueden obtener resultados
buenos con plantas adultas, pero el proceso es más lento.
 Tamaño del explante: es recomendable utilizar un explante de 1 cm
cuadrado.
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 34

 Medio de cultivo: el medio de cultivo que más resultado ha dado es el

MS (Murashine y Skoog) y de los reguladores de crecimiento el más
usado para la producción de callos es el 2,4-D.
La formación de células se inicia generalmente cerca de la herida del explante,
algunas veces la proliferación de células se genera a partir de cambium o
tejido de parénquima de la planta.
Las características del callo pueden variar de acuerdo a la planta, algunos
callos tienen una textura dura o friable (fácilmente se disgrega o separa), el
color puede ser blanco, crema, verde o pigmentado. Su composición celular
varía presentándose células de tamaño, forma y grosor diferentes
Los callos sub-cultivados muchas veces pierden a través del tiempo su
habilidad para rediferenciarse, posiblemente las causas se deban a anomalías
cromosómicas (poliploidía, ruptura de cromosomas, reducción del número de
cromosomas).
El callo se puede diferenciar formando brotes, raíces, embriones o
simplemente continuar proliferando como callo dependiendo de los
reguladores de crecimiento. Desde el punto de vista morfogénico se puede
decir que la característica más importante del callo es la totipotencia.

3. INFLUENCIA DE LOS REGULADORES DE CRECIMIENTO

 Proporciones similares de auxinas y citoquininas pueden mantener la
producción de callo.
 Proporciones de citoquininas mayores que las auxinas inician la
formación de yemas y brotes.
 Proporciones de auxinas mayores que las citoquininas induce al inicio
de primordios radiculares y organogénesis del callo.
Algunas plantas no producen callo, sino directamente forman el cuerpo
protocórmico, o protocormo, un ejemplo de estas plantas es las orquídeas, el
banano.
El protocormo es un tejido meristemático nutritivo, formado por un conjunto
de células no muy diferenciadas que precede a la formación de los órganos del
embrión.
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 35

PROCESOS MORFOGÉNICOS.

CULTIVO IN VITRO.

Organogénesis. Embriogénesis.

Formación de órganos Formación de embriones

Raíz, Hoja, Tallo. Somática Sexual

Células no sexuales Células sexuales
(Embrioides) (Embriones)

Directa Indirecta Indirecta Directa

(No hay callo) (Si hay callo) (Si hay callo) (No hay callo)

Caulogénesis
(Formación de tallos)

Rizogénesis
(Formación de raíces)
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 36

UTILIDAD DEL CALLO EN CULTIVO IN VITRO

A: REGENERACIÓN DE PLANTAS A TRAVÉS DE CALLO.

B: PRODUCCIÓN DE CALLO

C: SUSPENCIONES CELULARES, CULTIVO DE PROTOPLASTOS

D: METABOLITOS SECUNDARIOS

4. FORMAS DE ORGANOGENESIS
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 37

 Rizogénesis: Formación de raíces.

 Caulogénesis: Formación de yemas y brotes.
 Embriogénesis somática: Formación de embriones provenientes de
células que no están involucradas en reproducción sexual. Provienen
de células diploides (2N)
La organogénesis es un proceso por medio del cual el tejido celular o callo
puede ser inducido a brotes o raíces.
Skoog y Meller (1957) descubrieron que el desarrollo organizado se da como
resultado de la interacción cuantitativa entre reguladores de crecimiento y
otros factores (medios de cultivo). En callos subcultivados excesivamente
(más de 6-10 veces dependiendo del cultivo) esta capacidad de regeneración
se puede perder.

5. EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA
Es un proceso de iniciación y desarrollo de un embrión proveniente de tres
fuentes de células diploides cultivadas in vitro.
 Células de tejidos diferentes a los zigotos (no sexuales)
 Células vegetativas de plantas adultas.
 Células de cotiledones, plántulas sin pasar por el estado de callo, células
del hipocótilo.
Estas células originan embrioides y pasan por una secuencia similar a la
formación de embriones zigóticos o sexuales (globular, corazón y torpedo).
La embriogénesis somática ha sido observada en muchas especies y familias
por lo que indica que las células de cualquier planta donadora de explantes
con un estímulo apropiado pueden producir embriones somáticos.
El estado fisiológico de la planta donadora de explantes para cultivo in vitro es
muy importante. Todos estos procesos morfogénicos están condicionados a la
naturaleza del explante y al tipo de planta.

6. CARACTERÍSTICAS DE LAS PLANTAS DONANTES

Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 38

 Deben ser plantas sanas y vigorosas.

 Plantas jóvenes. En plantas leñosas se recomienda iniciar el cultivo
in vitro a partir de tejidos jóvenes como yemas, hojas y otros.

6.1 Condiciones de cultivo de la planta:

Con el material procedente de campo debe ejercerse un mayor control
fitosanitario, para disminuir las poblaciones de microorganismos
(hongos, bacterias, virus). La extracción del material vegetal, en el caso
que sea tejido de hojas, debe hacerse en horas del día en que se registren
temperaturas bajas, ya sea en horas de la mañana o al final de la tarde,
esto con el fin de evitar al máximo la producción de sustancias tóxicas
que ocurre generalmente después del corte.
Dependiendo de su posición en la planta los explantes se clasifican en:
 Meristemáticos: yemas, puntas de retoño, inflorescencia joven,
embriones, nudos de tallo y otros.
 No meristemáticos: hojas, hipocótilo, rizoma, pecíolo, raíz,
cotiledón y otros.
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 39

UNIDAD VII
ADAPTACIÓN DE LAS PLANTAS CULTIVADAS IN VITRO
A CONDICIONES NATURALES

Esta etapa de gran importancia dentro del cultivo in vitro se refiere a la

transferencia de plántulas de un ambiente aséptico al invernadero.
En este proceso las plantas pueden morir si se pone en condiciones de baja
humedad relativa, alta luminosidad y condiciones sépticas.
Por lo tanto las plantas antes de sacarlas de sus condiciones asépticas deben
ser colocadas de 2-4 semanas bajo un ambiente controlado en el invernadero.

1. CARACTERÍSTICAS DE LAS PLANTAS IN VITRO

 Las plantas cultivadas in vitro se comportan como plantas heterótrofas
porque dependen de una fuente externa de carbohidratos. (sacarosa,
como fuente de energía).
 La cutícula de las plantas cultivadas in vitro es lisa y delgada, con
menos cera cuticular.
 Los estomas están poco desarrollados y se mantienen abiertos, estos
tienden a activarse de 12 a 36 horas después de haber sido sacadas al
vivero.
 Las hojas son delgadas poco desarrolladas, los primeros cambios en la
estructura de la hoja se dan con la aclimatación de éstas en el vivero.
 Las raíces son más tiernas con muchos pelos radiculares.

2. FACTORES FÍSICOS QUE AFECTAN LA ACLIMATACIÓN

 Humedad: La alta humedad evita que el material vegetal se deshidrate.
Se puede tener un sistema de riego de microasperción.
 Luz: La alta intensidad lumínica produce hojas cloróticas y quema de
hojas generalmente se controla con sarán de acuerdo a las necesidades
del cultivo.
 Temperatura: En un vivero se puede controlar con ventanas móviles o
ventiladores
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 40

Literatura consultada

1. PIERIK, R. L. M. 1990. Cultivo in vitro de las Plantas Superiores.

Ed. Mundi-Prensa. Madrid España 326 p.

2. Conn, H. J. 1960. Biological. Williams and Wilkins, Baltimore.

3. Doods, J. H y Roberto, L. W; 1982 Experiment in plant tissue culture,

Cambridge Univ. Press, Nueva York. N, 107-127 pp.

4. - Slatia, E. J, 1982. Plant tissue culture as a sourse of biochemicals, C.

R. E. Press Inc, Boca Raton , Florida .

5. Arditti and Strauss, 1979. Taro Tissue Culture- A Manual

Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 41

GLOSARIO.
ACIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (ADN.): Parte integral de la
estructura básica de los cromosomas formados por ácido fosfórico, una base
(derivados de la purina y pirimidina) y un azúcar.
AERÓBICO: Que necesita oxígeno para el crecimiento.
ANAERÓBICO: Que crece sin oxígeno.

APICE VEGETATIVO: Yema terminal de un tallo, que consiste del

meristema apical y los tejidos inmediatos debajo, incluyendo los primordios
foliares.
BANCO DE TEJIDOS: Colección de tejidos mantenidos en un cultivo
aséptico, de diferentes procedencias y plantas, funciona al mismo tiempo
como un banco de germoplasma.
CALLO: Un grupo de células vegetales indiferenciadas que, en algunas
especies, puede inducir la formación de toda la planta.
CAULOGÉNESIS: Proceso de diferenciación y formación de un vástago o
tallo en un explante no diferenciado.
CÉLULA: Unidad estructural fundamental de un organismo uni o
pluricelular. La célula vegetal consiste, además del protoplasto, de una pared
celulósica que la rodea.
Es considerada también la unidad más pequeña de la vida, capaz de sostener
metabolismo.
CÉLULA EUCARIÓTICA: Célula diferenciada poseedora de núcleo y
cromosomas.
CÉLULA PROCARIÓTICA: Célula menos diferenciada carente de núcleo
y cromosomas.
CÉLULA SOMÁTICA: Todas las células de un organismo, menos las
implicadas en reproducción sexual.

CLON: Individuos procedente de multiplicación asexual de una sola planta

madre, son genéticamente iguales.
CULTIVO IN VITRO: Es el cultivo aséptico de: protoplastos, células,
tejidos, órganos, plantas, dentro o sobre un medio de cultivo balanceado y
Curso Principios y prácticas en el cultivo de tejidos vegetales 42

mantenido en condiciones de temperatura humedad y luminosidad

controlados.

DIPLOIDE: Que tiene dos juegos de cromosomas uno materno y otro paterno
(2x)
DIFERENCIACIÓN: Proceso morfogénico que puede ser intra o
intercelular, resulta en la especialización de la función celular que conduce a
la forma adulta en la planta.
DESDIFERENCIACIÓN: Es el retroceso, a partir de un estado adulto, hasta
un estado juvenil, no especializado.
EMBRIOGÉNESIS SOMÁTICA: Formación de un embrión a partir de
células no sexuales.
EMBRIOIDE : Estructura similar a la de un embrión sexual pero formada a
partir de células somáticas.
EMBRIÓN: Plántula que se ha formado a partir de la célula fecundada dentro
de la semilla.
HAPLOIDE: Contiene un juego de cromosomas. (x)
ÓRGANO: Conjunto de tejidos que constituyen morfológicamente una parte
distinta o unidad con funciones propias Ej. : tallo, raíz, hoja.
PLANTA MADRE: Planta donadora de explantes.
REDIFERENCIACIÓN: Es el proceso que sufren las células cicatrizantes al
volver a pasar por el proceso de diferenciación celular.
TRANSGÉNICOS: Individuos, (plantas o animales) a los que se introducen
ADN de otra especie, usando técnicas de ADN recombinado.
TEJIDO: Conjunto de células de estructura similar que realizan una misma
función especializada.
TOTIPOTENCIA: Capacidad de una célula de un organismo superior de
diferenciarse en un organismo completo.
VIRUS: Organismo sub-microscópico que contiene información genética
pero no se puede reproducir por sí mismo. Para ello debe invadir otra célula y
usar partes del mecanismo reproductivo de la misma.