Tesis Maximiliano Bidegain - Corregida Final

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SUR
TESIS DE DOCTOR EN CIENCIA Y

TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
Optimización del cultivo de Ganoderma lucidum.

Evaluación de actividad y desarrollo de
nutracéuticos.
Maximiliano Andrés Bidegain
Directores:
Dra. María Amelia Cubitto
Dr. Santiago Palma
BAHÍA BLANCA ARGENTINA

2017
TESIS DE DOCTOR EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
OPTIMIZACIÓN DEL CULTIVO DE Ganoderma lucidum. EVALUACIÓN

DE ACTIVIDAD Y DESARROLLO DE NUTRACÉUTICOS.
MAXIMILIANO ANDRÉS BIDEGAIN
BAHÍA BLANCA ARGENTINA
2017
PREFACIO
Esta Tesis es presentada como parte de los requisitos para optar al grado académico de
Doctor en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, de la Universidad Nacional del Sur, y no
ha sido presentada previamente para la obtención de otro título en esta Universidad u otras.
La misma contiene los resultados obtenidos en investigaciones llevadas a cabo en el Centro
de Recursos Naturales Renovables de la Zona Semiárida (CERZOS, CONICET-UNS) y el
Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia durante el período comprendido entre
Febrero de 2012 y Diciembre de 2016, bajo la dirección de la Dra. María Amelia Cubitto y el
Dr. Santiago Palma.
Maximiliano Andrés Bidegain
[email protected]
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA, BIOQUÍMICA Y FARMACIA
Bahía Blanca, 06 de Febrero de 2017
i
A mis dos grandes amores,
Leonardo y Daniela.
ii
AGRADECIMIENTOS
A mis directores, María Amelia Cubitto y Santiago Palma. A María Amelia por su pa-
ciencia, dedicación y ayuda, sin la cual no hubiera terminado esta Tesis. A Santiago por sus
ideas y ayuda brindada en estos años.
A la Universidad Nacional del Sur, a la Agencia Nacional de Promoción Científica y

Tecnológica (ANPCyT) y al CONICET, por su apoyo académico y económico.
Al equipo del Laboratorio de Biotecnología de Hongos Comestibles y Medicinales, Pa-

blo, Soledad, Ricky, Débora y Ramiro, por haberme recibido en su lugar de trabajo, brindado
su amistad y enseñado el mundo del cultivo de hongos.
Al grupo de la cátedra de Microbiología Industrial y de los Alimentos, Lorena, Gabriela

y Patricia. A María Clara y Mauricio. Por su dedicación, su amistad y su ayuda incondicional,
tanto dentro como fuera del laboratorio. En particular a Gabriela por su aporte en el estudio
del potencial prebiótico.
A Néstor Curvetto y Silvia Delmastro, por sus ideas, y por darme la posibilidad de entrar
al fascinante mundo de la ciencia.
A todos los colegas de docencia, especialmente a la cátedra de Farmacognosia, Alejan-

dro, Nina, Ana y Soledad, por su apoyo y su amistad.
A Olga Pieroni, por su ayuda incondicional, sus valiosos aportes en el área de FT-IR, y
su calidad humana.
A Diego Obiol. Por su amistad, y porque por esas vueltas del destino, si no fuera por él
esta tesis no llevaría mi nombre.
A mi tía Adriana, por escucharme cuando lo necesito, por contactarme con el grupo de
María Amelia y Néstor, y porque sin ella tampoco sería el autor de esta tesis.
A mi familia, los que están y los que ya no están, por darle sentido a lo que hago.
iii
RESUMEN
El hongo de la pudrición blanca Ganoderma lucidum posee numerosos compuestos bioac-
tivos con potencial medicinal, principalmente triterpenoides, polisacáridos y polifenoles. El
consumo de este hongo, utilizado como coadyuvante en terapias antitumorales, y en general
como un promotor de la longevidad, ha aumentado considerablemente en los últimos años.
El objetivo general de esta Tesis es estudiar alternativas para mejorar los rendimientos de
producción de G. lucidum a partir de un residuo abundante de la agroindustria argentina, la
cáscara de semilla de girasol (CSG), optimizar la obtención de productos activos y proponer
el desarrollo de nutracéuticos.
El cultivo de G. lucidum en sustratos artificiales es un procedimiento necesario para suplir

la creciente demanda internacional. La CSG ha sido empleada para el cultivo de hongos con
buenos resultados. Sin embargo, G. lucidum produce rendimientos relativamente menores que
otros hongos de especialidad comestibles. Con el fin de mejorar el rendimiento y la produc-
tividad de un cultivo de G. lucidum en un sustrato a base de CSG, se evaluó la optimización
del sustrato mediante el agregado de distintos aceites vegetales y cobre. Se encontró que para
la primera oleada, el aceite de oliva incrementó los rendimientos de basidiocarpos hasta un
30% mientras que el agregado de cobre (II) redujo el tiempo hasta la cosecha de 35 a 28 días.
Cuando se agregaron juntos la productividad diaria se incrementó hasta un 78%.
Se evaluó la calidad microbiológica de un sustrato a base de CSG con y sin agregado de

aceites vegetales, tratado por el sistema descripto por Curvetto et al. (1997). El análisis mi-
crobiológico del proceso de pasteurización muestra que el sistema es efectivo para la elimi-
nación de grupos de microorganismos relacionados con la calidad sanitaria, aunque los
mohos solo mostraron una disminución moderada.
Uno de los desafíos de la industria de productos nutracéuticos es el aseguramiento de la

calidad de la materia prima. La composición química, cuali y cuantitativa, de un carpóforo
depende de muchos factores. En esta Tesis se comparó la composición química de basidio-
carpos obtenidos en diferentes sustratos (CSG y paja de arroz), con el agregado de diferentes
aditivos (aceites vegetales y cobre) y distintas etapas de cultivo (primera o segunda oleada).
El contenido de los principales grupos de compuestos bioactivos de G. lucidum, triterpenoi-
des, carbohidratos de alto peso molecular y compuestos fenólicos de los basidiocarpos indi-
can que la composición química del hongo es sensible a las condiciones de cultivo (sustrato,
iv
aditivos, momento de cosecha). Por otro lado, la espectroscopia FT-IR resultó útil para la
comparación cualitativa de los principales grupos funcionales presentes en el hongo y per-
mitió diferenciar entre hongos cultivados en distintos sustratos.
Los hongos han sido postulados como fuentes potenciales de prebióticos. En una pri-
mera etapa se evaluó la capacidad del extracto acuoso, para sustentar el crecimiento de mi-
croorganismos con potencial probiótico. Las cepas pertenecientes al grupo de las bacterias
lácticas presentaron un comportamiento variable en este extracto. A continuación, se evaluó
la cinética de crecimiento en el extracto acuoso de dos cepas probióticas destinadas uso hu-
mano, Bacillus subtilis y Saccharomyces boulardii. Además se incluyó en la evaluación Escherichia
coli ATCC 25922. Bacillus subtilis y E. coli mostraron mayor velocidad de crecimiento en el
extracto que S. boulardii. Por último se evaluó el crecimiento de B. subtilis con una fracción
purificada del extracto acuoso. El desempeño de B. subtilis en esta fracción fortalece la hipó-
tesis de que esta cepa es capaz de hidrolizar los polisacáridos de cadena larga con enlaces
glucosídicos β de la fracción acuosa de los extractos de G. lucidum.
Se desarrolló una nueva formulación nutracéutica que reúne a los extractos alcohólicos
y acuosos de G. lucidum en una única presentación. Cuando se juntan en proporciones iguales
un extracto alcohólico (rico en triterpenoides) y un extracto acuoso (rico en polisacáridos),
parte de los compuestos presentes no son solubles en el nuevo solvente hidroalcohólico y
precipitan. Se determinó que el 30% de los triterpenoides totales, y el 19% de los compuestos
fenólicos, presentes en los extractos originales, precipitan al realizarse la mezcla. Por último,
se estudió el efecto del agregado de un agente viscosante, Carbomer® 940, para retener estos
compuestos en una suspensión hidroalcohólica. Estudios de la estabilidad y de la reología de
las suspensiones, mostraron que una concentración de Carbomer® 940, entre 0,5 y 1% es
adecuada para obtener una dispersión homogénea de los compuestos insolubles por agita-
ción leve a moderada, con una viscosidad adecuada para su administración oral.
v
ABSTRACT
White-rot mushroom Ganoderma lucidum has many bioactive compounds with medicinal
potential, mainly triterpenoids, polysaccharides and polyphenols. Consumption of this mush-
room, used as adjuvant in antitumor therapies, and in general as a promoter of longevity, has
increased considerably in recent years. The general objective of this Thesis is the study of
alternatives for improving the production yields of Ganoderma lucidum cultivated on sunflower
seed hulls (SSH), an abundant residue of Argentina’s agroindustry, enhancing the obtainment
of bioactive products and propose the development of nutraceutics.
Cultivation of G. lucidum in artificial substrates is a necessary procedure to supply the

growing international demand. SSH has been used as substrate for mushroom cultivation
with good results. However, G. lucidum produces relatively lower yields than other edible
specialty mushrooms. In order to improve the yield and productivity of a G. lucidum crop in
a SSH-based substrate, the optimization of the substrate by the addition of different vegeta-
ble oils and copper was evaluated. It was found that for the first flush, olive oil increased the
yield of basidiocarps up to 30%, while the addition of copper (II) reduced the time to harvest
from 35 to 28 days. When added together, daily productivity increased up to 78%.
The microbiological quality of a SSH-based substrate with or without vegetables oils,

treated by the system described by Curvetto et al. (1997), was evaluated. The microbiological
analysis of the pasteurization process shows that the system is effective in the elimintation
of groups of microorganisms related with sanitary quality, but molds showed only a moderate
decrease.
One of the challenges of the nutraceutical product industry is the assurance of the quality
of the raw material. The qualitative and quantitative chemical composition of a carpophore
depends on many factors. In this Thesis the chemical composition of basidiocarps produced
on different substrates (SSH and rice straw), with the addition of different additives (vegeta-
bles oils and copper) and different harvesting flushes (first or second flushes), were com-
pared. The content of the main bioactive compound groups of G. lucidum, total triterpenoids,
phenolic compounds and high molecular weight carbohydrates, of the basidiocarps indicates
that the mushroom chemical composition is sensitive to cultivation conditions (substrate,
vi
additives, harvest flush). On the other hand, FT-IR spectroscopy was useful for the qualita-
tive comparison of the main functional groups present in the mushroom, and allowed the
differentiation between mushrooms grown on different substrates.
Mushrooms have been postulated as potential sources of prebiotics. On a first stage, the
capacity of the aqueous extract to support growth of microorganisms with probiotic potential
was evaluated. Strains belonging to the group of lactic acid bacteria had a variable behavior
in this extract. Next, the growth kinetics in the aqueous extract of two probiotic strains in-
tended for human use, Bacillus subtilis y Saccharomyces boulardii, were evaluated. Escherichia coli
ATCC 25922 was also included in the evaluation. Bacillus subtilis and E. coli showed higher
growth rates in the extract than S. boulardii. Finally, growth of B. subtilis with a purified frac-
tion of the aqueous extract was evaluated. The performance of B. subtilis in this fraction
strengthens the hypothesis that this strain is capable of hydrolyzing the long chain polysac-
charides with β-glucosidic bonds present in the aqueous fraction of the extracts of G. lucidum.
A new nutraceutical formulation that brings together the alcoholic and aqueous extracts
of G. lucidum in a single presentation was developed. When an alcoholic extract (rich in
triterpenoids) and an aqueous extract (rich in polysaccharides) are mixed in equal propor-
tions, some of the constituents are not soluble in the new hydroalcoholic solvent and pre-
cipitate. It was determined that 30% of the total triterpenoids and 19% of the phenolic com-
pounds present in the original extracts precipitate upon mixing. Finally, the effect of the
addition of a thickener agent, Carbomer® 940, to retain these compounds in a hydroalco-
holic suspension, was studied. Studies on the stability and rheology of the suspensions
showed that a concentration of Carbomer® 940, between 0.5 and 1% is adequate to obtain
a homogeneous dispersion of the insoluble compounds by mild to moderate agitation, with
a viscosity suitable for oral administration.
vii
ABREVIATURAS
ADN, ácido desoxirribonucleico
AE, bacterias esporógenas aerobias
ANMAT, Administración Nacional de Alimentos, Medicamentos y Tecnología Médica
ANOVA, análisis de varianza
BHI, infusión cerebro corazón
BL, bacterias lácticas
BSA, sero albúmina bovina
CAA, Código Alimentario Argentino
CSG, cáscara de semilla de girasol
CSR, clostridios sulfito reductores
CT, coliformes totales
D.C., después de Cristo
D1ºF, días desde la inoculación hasta la primera oleada
D2ºF, días desde la inoculación hasta la segunda oleada
D3ºF, días desde la inoculación hasta la tercera oleada
DCM, días de corrida del micelio
DO, densidad óptica
EB, eficiencia biológica
Eq., equivalente
Ext., extracto
h, horas
HR, humedad relativa
IFN, interferón
Il, interleukina
Lev, levaduras
MEA, malta, levadura y sucrosa en agar
MP, producción de hongos
MRS, Mann, Rogosa y Sharpe
NK, natural killer
PCA, Agar Recuento en Placa
PDA, Agar Papa Dextrosa
RHP, recuento de heterótrofas aerobias totales
viii
rpm, revoluciones por minuto
SPS, Sulfito-Polimixina-Sulfadiacina
TNF, factor de necrosis tumoral
TTC, trifenil tetrazolio cloruro
UFC, unidades formadoras de colonias
VIH, virus de la inmunodeficiencia humana
YG, extracto de levadura – glucosa
ix
ÍNDICE
PREFACIO ..........................................................................................................................................I
AGRADECIMIENTOS ........................................................................................................................III
RESUMEN....................................................................................................................................... IV
ABSTRACT ...................................................................................................................................... VI
ABREVIATURAS ............................................................................................................................ VIII
ÍNDICE ............................................................................................................................................. X
ÍNDICE DE FIGURAS ....................................................................................................................... XV
ÍNDICE DE TABLAS...................................................................................................................... XVIII
CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN................................................................................................... 1
1.1 LOS HONGOS COMESTIBLES Y MEDICINALES................................................................................... 1

1.1.1 El Reino Fungi ........................................................................................................... 1
1.1.2 Propiedades nutricionales ........................................................................................ 2
1.1.3 Características medicinales ...................................................................................... 4
1.1.4 Mercado nacional e internacional de los hongos comestibles y medicinales ............. 5
1.2 EL HONGO GANODERMA LUCIDUM ............................................................................................. 6
1.2.1 Taxonomía ............................................................................................................... 7
1.2.2 Características morfológicas .................................................................................... 7
1.3 ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE GANODERMA LUCIDUM.......................................................................... 9
1.3.1 Efecto antitumoral ................................................................................................. 10
1.3.2 Efectos inmunomodulatorios .................................................................................. 10
1.3.3 Actividad antiinflamatoria ...................................................................................... 11
1.3.4 Actividad hepatoprotectora.................................................................................... 11
1.3.5 Efecto antidiabetes................................................................................................. 11
1.3.6 Funciones cardiovasculares y circulatorias.............................................................. 11
1.3.7 Poder antibiótico y antiviral.................................................................................... 11
1.3.8 Actividad antioxidante ........................................................................................... 12
1.3.9 Actividad antiandrogénica...................................................................................... 12
1.3.10 Toxicidad ................................................................................................................ 12
1.4 COMPOSICIÓN QUÍMICA DE GANODERMA LUCIDUM ..................................................................... 13
1.4.1 Triterpenoides ........................................................................................................ 13
1.4.2 Polisacáridos .......................................................................................................... 14
x
1.4.3 Proteínas ................................................................................................................ 15
1.4.4 Otros compuestos .................................................................................................. 15
1.5 LOS HONGOS MEDICINALES COMO NUTRACÉUTICOS, MICOTERÁPICOS Y SUPLEMENTOS DIETARIOS. .......... 16
1.6 OBJETIVOS DE LA TESIS .......................................................................................................... 18
CAPÍTULO 2: OPTIMIZACIÓN DEL CULTIVO DE GANODERMA LUCIDUM EN UN SUSTRATO A

BASE DE CÁSCARA DE SEMILLA DE GIRASOL. EFECTO DE ACEITES VEGETALES Y COBRE ....................... 20
2.1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 20

2.1.1 El cultivo de hongos comestibles y medicinales ....................................................... 20
2.1.2 Producción del inóculo............................................................................................ 21
2.1.3 Preparación del sustrato ........................................................................................ 22
2.1.4 Pasteurización del sustrato..................................................................................... 24
2.1.5 Incubación o corrida del micelio ............................................................................. 24
2.1.6 Desarrollo de los cuerpos de fructificación .............................................................. 25
2.1.7 Cultivo de Ganoderma lucidum............................................................................... 25
2.1.8 Optimización del cultivo de Ganoderma lucidum .................................................... 28
2.1.9 Objetivos ................................................................................................................ 30
2.2 MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................... 30
2.2.1 Cepa de Ganoderma lucidum ................................................................................. 30
2.2.2 Aceites vegetales evaluados como aditivos del sustrato ......................................... 30
2.2.3 Biomasa y crecimiento radial en placa.................................................................... 30
2.2.4 Test de crecimiento lineal ....................................................................................... 31
2.2.4.1 Determinación de proteínas en el sustrato .......................................................................... 32
2.2.5 Producción de inóculo ............................................................................................ 32
2.2.6 Instalaciones para el cultivo de hongos del CERZOS (CONICET-UNS) ....................... 33
2.2.7 Preparación del sustrato, inoculación y sistema de bolsas ...................................... 35
2.2.8 Evaluación microbiológica del sustrato antes y después del tratamiento térmico ... 36
2.2.8.1 Recuento de bacterias heterótrofas aerobias y anaerobias facultativos mesófilas totales37
2.2.8.2 Recuento de bacterias coliformes totales y Escherichia coli ............................................... 37
2.2.8.3 Enterococos ............................................................................................................................ 38
2.2.8.4 Recuento de mohos y levaduras ........................................................................................... 38
2.2.8.5 Recuento de bacterias aerobias esporógenas (AE) y clostridios sulfito reductores (CSR) . 38
2.2.9 Corrida del micelio, cosecha y rendimiento del cultivo ............................................ 38
2.2.10 Procesamiento post-cosecha .................................................................................. 40
2.2.11 Actividad de lacasas en el sustrato residual ............................................................ 40
2.2.11.1 Extracción de lacasas ............................................................................................................ 40
2.2.11.2 Determinación de la actividad de lacasas ............................................................................ 40
2.2.12 Análisis estadístico ................................................................................................. 41
2.3 RESULTADOS ....................................................................................................................... 41
xi
2.3.1 Efecto de los aceites vegetales sobre el crecimiento radial del micelio .................... 41
2.3.2 Efecto de los aceites vegetales sobre el crecimiento lineal del micelio .................... 43
2.3.2.1 pH del sustrato antes y después del tratamiento térmico ................................................... 43
2.3.2.2 Evaluación del crecimiento lineal .......................................................................................... 44
2.3.2.3 Cuantificación de proteínas solubles en el sustrato colonizado .......................................... 45
2.3.3 Efecto de aceite de oliva y cobre en un cultivo a escala piloto ................................. 47
2.3.3.1 Corrida del micelio ................................................................................................................. 47
2.3.3.2 Parámetros de rendimiento de hongo .................................................................................. 47
2.3.3.3 Contenido de agua en el sustrato y en el carpóforo ............................................................ 51
2.3.3.4 Actividad de lacasas ............................................................................................................... 52
2.3.4 Evaluación microbiológica del proceso de pasteurización a escala piloto del sustrato
52
2.4 DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 54
2.4.1 Efecto de aceites vegetales sobre el crecimiento del micelio ................................... 54
2.4.2 Cultivo de Ganoderma lucidum en cáscara de semilla de girasol a escala piloto.
Efecto de aceite de oliva y cobre (II). .............................................................................................. 55
2.4.3 Evaluación microbiológica del proceso de pasteurización a escala piloto del sustrato
57
2.5 CONCLUSIONES .................................................................................................................... 57
CAPÍTULO 3: INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO SOBRE LA COMPOSICIÓN

QUÍMICA DEL BASIDIOCARPO DE GANODERMA LUCIDUM ................................................................... 59
3.1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 59

3.1.1 Efecto de las condiciones de cultivo sobre la calidad química de G. lucidum ........... 59
3.1.2 Análisis mediante espectroscopia infrarroja (IR) ..................................................... 61
3.1.3 Objetivos ................................................................................................................ 62
3.2.1 Muestras analizadas .............................................................................................. 63
3.2.2 Obtención de los extractos ..................................................................................... 64
3.2.2.1 Extracción con etanol............................................................................................................. 64
3.2.2.2 Extracción con agua caliente ................................................................................................. 64
3.2.3 Determinación del residuo seco en los extractos ..................................................... 64
3.2.4 Contenido de triterpenoides ................................................................................... 64
3.2.5 Determinación de ácidos ganodéricos .................................................................... 65
3.2.6 Contenido de carbohidratos de alto peso molecular. .............................................. 65
3.2.7 Contenido de compuestos fenólicos ........................................................................ 67
3.2.8 Contenido de cobre ................................................................................................ 67
3.2.9 Espectrofotometría visible ...................................................................................... 68
3.2.10 Espectrofotometría FT-IR ........................................................................................ 68
xii
3.2.11 Análisis estadístico ................................................................................................. 68
3.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................................... 68
3.3.1 Residuo seco........................................................................................................... 68
3.3.2 Contenido de triterpenoides y ácidos ganodéricos .................................................. 70
3.3.3 Contenido de carbohidratos de alto peso molecular ............................................... 72
3.3.4 Contenido de compuestos fenólicos ........................................................................ 73
3.3.5 Contenido de cobre ................................................................................................ 75
3.3.6 Espectrofotometría visible ...................................................................................... 75
3.3.7 Efecto del agregado de Cobre (II)............................................................................ 78
3.3.8 Efecto del agregado de aceites vegetales ............................................................... 78
3.3.9 Influencia del momento de la cosecha .................................................................... 78
3.3.10 Influencia del sustrato ............................................................................................ 79
3.3.11 Espectrofotometría FT-IR ........................................................................................ 79
3.4 CONCLUSIONES .................................................................................................................... 86
CAPÍTULO 4: ESTUDIO DEL POTENCIAL PREBIÓTICO DE LA FRACCIÓN DE POLISACÁRIDOS DE

GANODERMA LUCIDUM ........................................................................................................................ 87
4.1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 87

4.1.1 Objetivos ................................................................................................................ 89
4.2.1 Obtención de extractos de polisacáridos................................................................. 89
4.2.2 Microorganismos ................................................................................................... 90
4.2.3 Utilización del extracto crudo (E1) como medio de cultivo ...................................... 91
4.2.4 Determinación de la cinética de crecimiento de las cepas de B. subtilis y S. boulardii
en el extracto E1 ............................................................................................................................ 91
4.2.5 Crecimiento con el extracto purificado E2 ............................................................... 92
4.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...................................................................................................... 92
4.3.1 Utilización del extracto crudo (E1) como medio de cultivo ...................................... 93
4.3.2 Determinación de la cinética de crecimiento de cepas de B. subtilis y S. boulardii en
el extracto E1 94
4.3.3 Crecimiento de B. subtilis con la fracción purificada E2 ........................................... 97
4.4 CONCLUSIONES .................................................................................................................... 98
CAPÍTULO 5: FORMULACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA SUSPENSIÓN HIDROALCOHÓLICA

.......................................................................................................................... 99
5.1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 99

5.1.1 Productos a base de Ganoderma lucidum ............................................................... 99
5.1.2 Formulación de una suspensión hidroalcohólica ................................................... 103
xiii
5.1.3 Objetivo ............................................................................................................... 104
5.1.4 Objetivos particulares........................................................................................... 104
5.2 MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................... 104
5.2.1 Extracción alcohólica ............................................................................................ 104
5.2.2 Extracción acuosa................................................................................................. 104
5.2.3 Extracción hidroalcohólica .................................................................................... 105
5.2.4 Preparación de la infusión .................................................................................... 105
5.2.5 Obtención de la mezcla hidroalcohólica ................................................................ 105
5.2.6 Redisolución del precipitado insoluble de las mezclas hidroalcohólicas ................. 105
5.2.7 Caracterización química ....................................................................................... 106
5.2.7.1 Residuo sólido ...................................................................................................................... 106
5.2.7.2 Contenido de triterpenoides totales ................................................................................... 106
5.2.7.3 Contenido de carbohidratos de alto peso molecular ......................................................... 106
5.2.7.4 Contenido de compuestos fenólicos ................................................................................... 106
5.2.8 Formulación de la suspensión hidroalcohólica ...................................................... 107
5.2.9 Viscosidad ............................................................................................................ 107
5.2.10 Sedimentación acelerada ..................................................................................... 107
5.2.11 Estabilidad física de la suspensión ........................................................................ 108
5.2.12 Análisis de datos .................................................................................................. 108
5.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................................... 108
5.3.1 Contenido de residuos sólidos............................................................................... 109
5.3.2 Contenido de triterpenoides totales...................................................................... 110
5.3.3 Contenido de carbohidratos de alto peso molecular ............................................. 111
5.3.4 Contenido de compuestos fenólicos ...................................................................... 112
5.3.5 Sedimentación acelerada, estabilidad de la suspensión y reología ........................ 113
5.4 CONCLUSIONES .................................................................................................................. 115
CAPÍTULO 6: CONCLUSIONES GENERALES Y PERSPECTIVAS FUTURAS................................. 117
BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 120
ANEXO I: RESULTADOS COMPLEMENTARIOS .......................................................................... 133
I.1 EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA DEL PROCESO DE PASTEURIZACIÓN ................................................. 133

I.2 ESPECTROS IR ................................................................................................................... 133
ANEXO II: MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................... 142
PUBLICACIONES Y PRESENTACIONES A CONGRESO REALIZADAS EN EL MARCO DE ESTA TESIS. . 143
TRABAJOS PUBLICADOS EN REVISTAS INTERNACIONALES ......................................................................... 143

PATENTES ................................................................................................................................... 143
TRABAJOS PRESENTADOS EN CONGRESOS ........................................................................................... 144
xiv
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1: BASIDIOCARPO DE GANODERMA LUCIDUM EN SU FORMA HABITUAL DE “SOMBRERO”. POR JATLAS [CC BY-SA 2.5
(HTTP://CREATIVECOMMONS.ORG/LICENSES/BY-SA/2.5)], VIA WIKIMEDIA COMMONS. ...................................... 8
FIGURA 2: FORMA DE “CUERNOS DE CIERVO” DE GANODERMA LUCIDUM. POR HOKKAIDO REISHI CO., LTD (TRABAJO PROPIO)
[CC BY-SA 3.0 (HTTP://CREATIVECOMMONS.ORG/LICENSES/BY-SA/3.0)], VIA WIKIMEDIA COMMONS. ................ 9
FIGURA 3: ESTRUCTURA BÁSICA DE LOS ÁCIDOS GANODÉRICOS. LAS CADENAS LATERALES R1 - R6 DETERMINAN EL TIPO DE
ÁCIDO GANODÉRICO............................................................................................................................ 13
FIGURA 4: ESTRUCTURA DE ALGUNOS ÁCIDOS GANODÉRICOS (SANODIYA ET AL. 2009). .............................................. 14

FIGURA 5: ESTRUCTURA BÁSICA DE LOS Β-GLUCANOS DE G. LUCIDUM (DEEPALAKSHMI Y MIRUNALINI 2011). .................. 15
FIGURA 6: ESQUEMA DE LAS TÉCNICAS Y LOS PASOS GENERALES DEL CULTIVO DE HONGOS (STAMETS Y CHILTON 1983). ..... 22
FIGURA 7: VISTA EXTERIOR DE LA NAVE DE CULTIVO DE HONGOS............................................................................. 33
FIGURA 8: SISTEMA HUMIDIFICADOR DE ALTA PRESIÓN POR BRUMA. ....................................................................... 34
FIGURA 9: SISTEMA DE DISTRIBUCIÓN DE AIRE FILTRADO. ...................................................................................... 34
FIGURA 10: SISTEMA DE SUMINISTRO DE AIRE CALIENTE MEDIANTE CAÑÓN CALEFACTOR. ............................................. 34
FIGURA 11: EQUIPO PARA DECONTAMINACIÓN DE SUSTRATO. ............................................................................... 35
FIGURA 12: PREPARACIÓN DEL "TRONCO SINTÉTICO" EN BOLSAS DE POLIETILENO. ...................................................... 36
FIGURA 13: EVOLUCIÓN DE UN CULTIVO DE GANODERMA LUCIDUM........................................................................ 39
FIGURA 14: A) DIÁMETRO, (B) SUPERFICIE Y (C) DENSIDAD MICELIAR SUPERFICIAL DE UNA COLONIA DE GANODERMA
LUCIDUM EN UN CULTIVO EN MEDIO MEA DE 5 DÍAS CON DISTINTAS CONCENTRACIONES DE ACEITE DE OLIVA. ......... 43
FIGURA 15: PH DEL SUSTRATO A BASE DE CÁSCARA DE GIRASOL ADITIVADO CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ACEITE DE
OLIVA, ANTES Y DESPUÉS DE ESTERILIZAR POR AUTOCLAVE. ........................................................................... 44
FIGURA 16: INCREMENTO DEL CONTENIDO DE PROTEÍNA SOLUBLE POR GRAMO DE SUSTRATO COLONIZADO CON RESPECTO AL
SUSTRATO SIN INOCULAR. EFECTO DEL ACEITE DE GIRASOL............................................................................ 45
SUSTRATO SIN INOCULAR. EFECTO DEL ACEITE DE CÁRTAMO. ........................................................................ 46
SUSTRATO SIN INOCULAR. EFECTO DEL ACEITE DE OLIVA. .............................................................................. 46
FIGURA 19: COMPARACIÓN DE FRUTOS DE LA PRIMERA OLEADA DE CINCO TRONCOS SINTÉTICOS REPRESENTATIVOS, LUEGO DE
27 DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN. ........................................................................................................... 49
FIGURA 20: ACTIVIDAD DE LACASAS EN EL SUSTRATO RESIDUAL TRAS UN CICLO DE CULTIVO DE TRES OLEADAS CON Y SIN ACEITE
DE OLIVA Y/O COBRE. .......................................................................................................................... 52
FIGURA 21: TEMPERATURA DEL SUSTRATO DURANTE EL PROCESO DE PASTEURIZACIÓN ................................................ 53

FIGURA 22: EFECTO DEL TRATAMIENTO DE PASTEURIZACIÓN EN HORMIGONERA SOBRE INDICADORES MICROBIANOS. LOS
RESULTADOS SON EL PROMEDIO DE AMBOS SUSTRATOS, EXPRESADOS COMO LOG10 UFC/GRAMO DE SUSTRATO SECO.
...................................................................................................................................................... 53
FIGURA 23: MODOS NORMALES DE VIBRACIÓN DE UNA MOLÉCULA......................................................................... 62
xv
FIGURA 24: CURVA DE CALIBRADO REPRESENTATIVA DE ÁCIDO URSÓLICO POR EL MÉTODO DE LA VAINILLINA - ÁCIDO
PERCLÓRICO ...................................................................................................................................... 65
FIGURA 25: CURVA DE CALIBRADO REPRESENTATIVA DE GLUCOSA POR EL MÉTODO DE ANTRONA - ÁCIDO SULFÚRICO .......... 66
FIGURA 26: CURVA DE CALIBRADO REPRESENTATIVA DE ÁCIDO GÁLICO POR EL MÉTODO DE FOLIN-CIOCALTEU .................. 67
FIGURA 27: ESPECTRO VISIBLE DE LOS EXTRACTOS ALCOHÓLICOS ............................................................................ 76
FIGURA 28: ESPECTRO VISIBLE DE LOS EXTRACTOS ACUOSOS .................................................................................. 77
FIGURA 29: CORRELACIÓN ENTRE EL CONTENIDO DE POLIFENOLES Y LA ABSORBANCIA A 400 NM EN LOS EXTRACTOS ACUOSOS.
...................................................................................................................................................... 77
FIGURA 30: ESPECTROS IR DE BASIDIOCARPOS DE G. LUCIDUM CULTIVADOS EN CSG Y COSECHADOS ANTES DE LA MÁXIMA
LIBERACIÓN DE ESPORAS (CCP1) O DESPUÉS (CCP2) ................................................................................. 80
FIGURA 31: ESPECTROS IR DEL BASIDIOCARPO DE G. LUCIDUM CULTIVADO EN CSG CON O SIN ACEITE DE OLIVA Y/O COBRE
(PRIMERA OLEADA)............................................................................................................................. 81
FIGURA 32: ESPECTROS IR DEL BASIDIOCARPO DE G. LUCIDUM CULTIVADO EN CSG CON DIFERENTES ACEITES VEGETALES
(PRIMERA OLEADA)............................................................................................................................. 81
FIGURA 33: ESPECTROS IR DEL BASIDIOCARPO DE G. LUCIDUM CULTIVADO EN CSG CON O SIN ACEITE DE OLIVA O COBRE
(SEGUNDA OLEADA) ............................................................................................................................ 82
FIGURA 34: ESPECTROS IR DE BASIDIOCARPOS DE G. LUCIDUM CULTIVADOS EN CSG O PAJA DE ARROZ........................... 83
FIGURA 35: ESPECTROS IR DEL BASIDIOCARPO DE G. LUCIDUM CULTIVADO EN PAJA DE ARROZ CON O SIN ACEITE DE OLIVA O
COBRE (PRIMERA OLEADA). .................................................................................................................. 84
FIGURA 36: ESPECTROS IR DEL BASIDIOCARPO DE G. LUCIDUM CULTIVADO EN PAJA DE ARROZ SIN SUPLEMENTOS (PRIMERA
OLEADA) Y CON ACEITE DE OLIVA (SEGUNDA OLEADA). ................................................................................ 84
FIGURA 37: ESPECTROS IR DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE BASIDIOCARPOS CULTIVADOS EN PAJA DE ARROZ O CSG.............. 85
FIGURA 38: CRECIMIENTO DE B. SUBTILIS EN EL EXTRACTO E1 ............................................................................... 95
FIGURA 39: CRECIMIENTO DE SACCHAROMYCCES CEREVICEAE VAR BOULARDII EN EL EXTRACTO E1 ................................. 95
FIGURA 40: CRECIMIENTO DE E. COLI EN EL EXTRACTO E1 .................................................................................... 96
FIGURA 41: VARIACIONES DE PH DETERMINADAS EN E1 DURANTE EL CULTIVO CON LAS DISTINTAS CEPAS ........................ 97
FIGURA 42: CRECIMIENTO DE B. SUBTILIS EN GLUCOSA Y E2.................................................................................. 98
FIGURA 43: DISTINTOS PRODUCTOS A BASE DE GANODERMA LUCIDUM (LEE Y CHANG 2016). .................................... 101
FIGURA 44: CONTENIDO DE RESIDUO SÓLIDO EN UN VOLUMEN EQUIVALENTE A 10 ML DEL EXTRACTO ORIGINAL DE DISTINTOS
EXTRACTOS Y PREPARACIONES. ............................................................................................................ 110
FIGURA 45: CONTENIDO TOTAL DE TRITERPENOIDES EN UN VOLUMEN EQUIVALENTE A 10 ML DEL EXTRACTO ORIGINAL DE
DISTINTOS EXTRACTOS Y PREPARACIONES. .............................................................................................. 111
FIGURA 46: CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS DE ALTO PESO MOLECULAR EN UN VOLUMEN EQUIVALENTE A 10 ML DEL
EXTRACTO ORIGINAL DE DISTINTOS EXTRACTOS Y PREPARACIONES. ............................................................... 112
FIGURA 47: CONTENIDO DE COMPUESTOS FENÓLICOS TOTALES EN UN VOLUMEN EQUIVALENTE A 10 ML DEL EXTRACTO
ORIGINAL, DE DISTINTOS EXTRACTOS Y PREPARACIONES. ............................................................................ 112
FIGURA 48: VISCOSIDAD DINÁMICA DE UNA SUSPENSIÓN HIDROALCOHÓLICA CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE
CARBOMER® 940. ........................................................................................................................... 115
xvi
FIGURA 49: ESPECTROS IR DEL BASIDIOCARPO DE GANODERMA LUCIDUM CULTIVADO EN DISTINTOS SUSTRATOS ............. 141
xvii
ÍNDICE DE TABLAS
TABLA 1: CONDICIONES AMBIENTALES REQUERIDAS EN DISTINTOS ESTADIOS DEL CULTIVO DE GANODERMA LUCIDUM
(STAMETS 1993; ZHOU ET AL. 2012; DATOS PROPIOS). ............................................................................. 26
TABLA 2: DIFERENTES SUSTRATOS UTILIZADOS PARA LA FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO DE GANODERMA LUCIDUM....... 26
TABLA 3: ESPECIES DE HONGOS COMESTIBLES CULTIVADOS EN CÁSCARA DE SEMILLA DE GIRASOL Y RENDIMIENTOS. ............ 28
TABLA 4: SUPERFICIE DE LA COLONIA DE GANODERMA LUCIDUM LUEGO DE 5 Y 7 DÍAS DE CULTIVO EN UN MEDIO MEA CON
DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ACEITE DE GIRASOL Y ACEITE DE CÁRTAMO. ................................................. 42
TABLA 5: BIOMASA Y DENSIDAD SUPERFICIAL DE LA COLONIA DE GANODERMA LUCIDUM LUEGO DE 7 DÍAS DE CULTIVO EN UN
MEDIO MEA CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ACEITE DE GIRASOL Y ACEITE DE CÁRTAMO. ......................... 42
TABLA 6: CRECIMIENTO LINEAL DEL MICELIO DE GANODERMA LUCIDUM EN 12 DÍAS EN UN MEDIO BASE DE CÁSCARA DE
GIRASOL ADITIVADO CON DIFERENTES CONCENTRACIONES DE ACEITES VEGETALES. ............................................. 44
TABLA 7: CRECIMIENTO LINEAL DEL MICELIO DE GANODERMA LUCIDUM EN 12 DÍAS EN UN MEDIO DE CÁSCARA DE GIRASOL
ADITIVADO CON DIFERENTES CONCENTRACIÓN DE ACEITE DE OLIVA. ............................................................... 45
TABLA 8: DÍAS PARA LA CORRIDA DEL MICELIO CON Y SIN ACEITE DE OLIVA Y/O COBRE. ................................................ 47
TABLA 9: PARÁMETROS DE RENDIMIENTO DE LA PRIMERA OLEADA CON Y SIN ACEITE DE OLIVA Y/O COBRE. ....................... 48
TABLA 10: PARÁMETROS DE RENDIMIENTO DE LA SEGUNDA Y TERCERA OLEADA CON Y SIN ACEITE DE OLIVA Y/O COBRE. ...... 50
TABLA 11: RENDIMIENTO ACUMULADO DE UN CULTIVO A TRES OLEADAS CON Y SIN ACEITE DE OLIVA Y/O COBRE................ 50
TABLA 12: CONTENIDO DE AGUA DEL SUSTRATO AL FINAL DE UN CICLO DE CULTIVO DE TRES OLEADAS (82 DÍAS) CON Y SIN
ACEITE DE OLIVA Y/O COBRE.................................................................................................................. 51
TABLA 13: ORIGEN DE LAS MUESTRAS DE HONGO ANALIZADAS .............................................................................. 63

TABLA 14: CONTENIDO DE RESIDUO SECO (MG/G DE HONGO SECO) ........................................................................ 69
TABLA 15: CONTENIDO DE TRITERPENOIDES Y ÁCIDOS GANODÉRICOS ...................................................................... 71
TABLA 16: CONTENIDO DE CARBOHIDRATOS DE ALTO PESO MOLECULAR................................................................... 72
TABLA 17: CONTENIDO DE POLIFENOLES ........................................................................................................... 73
TABLA 18: RELACIÓN ENTRE COMPUESTOS FENÓLICOS Y RESIDUO SECO ................................................................... 75
TABLA 19: ASIGNACIÓN DE LOS GRUPOS FUNCIONALES DE LOS PRINCIPALES PICOS DEL ESPECTRO IR ............................... 79
TABLA 20: MICROORGANISMOS EMPLEADOS PARA LOS ESTUDIOS DE POTENCIAL PREBIÓTICO ........................................ 90
TABLA 21: CRECIMIENTO DE CEPAS PROBIÓTICAS EN E1 ....................................................................................... 94
TABLA 22: PARÁMETROS DE CRECIMIENTO OBTENIDOS EN EL EXTRACTO E1 .............................................................. 96
TABLA 23: ALGUNOS PRODUCTOS BASADOS EN GANODERMA DISPONIBLES EN EL MERCADO, CON SUS BENEFICIOS
REPORTADOS (BATRA ET AL. 2013). ..................................................................................................... 102
TABLA 24: ASPECTO DE UNA SUSPENSIÓN HIDROALCOHÓLICA CON DISTINTAS CONCENTRACIONES DE CARBOMER® 940 LUEGO
DE LA APLICACIÓN DE UNA FUERZA CENTRÍFUGA DURANTE 1 MINUTO ........................................................... 113
TABLA 25: ALTURA DE SEDIMENTACIÓN RELATIVA DE UNA SUSPENSIÓN HIDROALCOHÓLICA CON DISTINTAS CONCENTRACIONES
DE CARBOMER® 940 A LOS 3, 11 Y 60 DÍAS DESDE SU PREPARACIÓN. .......................................................... 114
xviii
TABLA 26: EVOLUCIÓN DE LOS PRINCIPALES GRUPOS MICROBIOLÓGICOS DURANTE LA PASTEURIZACIÓN ......................... 133
xix
CAPÍTULO 1
CAPÍTULO 1:
INTRODUCCIÓN
1.1 LOS HONGOS COMESTIBLES Y MEDICINALES

1.1.1 El Reino Fungi
Se estima que existen en el planeta entre 500.000 y 10.000.000 de especies de hongos,

de las cuáles unas 100.000 están descriptas (Wasser 2011). De las especies de hongos cono-
cidas, aproximadamente 14.000 producen cuerpos reproductivos macroscópicos. De estos,
más de 3.000 se consideran comestibles, y alrededor de 2.000 son hongos medicinales con
una variedad de atributos para la salud (Chang y Miles 2004).
Los humanos prehistóricos probablemente utilizaron hongos recolectados en la natura-

leza por su alto valor nutritivo y, posiblemente, por su propiedades medicinales. Entre las
pertenencias de “Ötzi, el hombre de hielo”, la momia natural de un hombre que vivió en los
Alpes hace unos 5.300 años, se encontraron muestras secas de un hongo, Piptoporus betulinus,
que probablemente utilizaba con fines antibióticos y laxantes (Halpern 2007). Las civilizacio-
nes tempranas de los griegos, egipcios, romanos, chinos y aztecas apreciaron a los hongos
como una delicia, conocían algunas de sus propiedades medicinales y los usaban habitual-
mente en ceremonias religiosas (Chang y Miles 2004). Históricamente el uso de hongos con
fines medicinales se remonta a hace al menos 2.000 años, en la Medicina Tradicional China,
pero sus propiedades recién han sido objeto de la investigación científica moderna desde los
años 1960’s (Pala y Wani 2011).
Los hongos son organismos eucariotas, unicelulares (levaduras) o multicelulares (micro

y macrofilamentosos), que se pueden encontrar prácticamente en cualquier ambiente y sobre
una gran diversidad de sustratos. Los hongos multicelulares típicamente crecen como hifas,
con crecimiento apical, pero algunas veces pueden aparecer como levaduras. Los hongos
poseen características suficientes y significativamente diferentes a las plantas y los animales
como para ubicarlos en un reino separado: el Reino Fungi.
Los miembros del reino Fungi no contienen clorofila y por lo tanto no realizan fotosín-
tesis. Son heterótrofos, es decir dependen de nutrientes orgánicos preformados, al igual que
1
CAPÍTULO 1
los animales. Sin embargo, difieren de los animales en que obtienen los nutrientes solubles
absorbiéndolos a través de la pared celular y la membrana plasmática. Dependiendo del sus-
trato donde crecen los hongos pueden ser saprófitos cuando se alimentan de materiales en
descomposición, parásitos cuando se alimentan de otros seres vivos y simbiontes cuando
viven en asociación con otros organismos vivos, y se benefician mutuamente. Los hongos
cumplen una importante función ecológica en la descomposición de la materia orgánica. En
efecto, los hongos son desensambladores moleculares, tomando compuestos complejos,
como celulosa, lignina, carbohidratos y proteínas, y degradándolos a productos más simples.
Los hongos poseen paredes compuestas principalmente por quitina y glucanos, a dife-
rencia de las paredes celulares de las plantas que están compuestas por celulosa, hemicelulosa
y pectinas. El genoma del micelio vegetativo es típicamente haploide. De algunos hongos
aún no se conoce la fase de reproducción sexual, y todos tienen la capacidad de reproducción
asexual. La reproducción asexual se lleva a cabo a través de hifas haploides que originan
esporas por medio de mitosis. La reproducción sexual consiste en la unión de dos hifas ha-
ploides compatibles que dan lugar a hifas dicarióticas, que en condiciones propicias formarán
los carpóforos, y a su vez a esporas.
De acuerdo a sus características, los miembros del reino Fungi se encuentran divididos
en cinco filos, Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota y Glomeromy-
cota (Deacon 2006). Chang y Miles (2004) definen como “hongo” o “seta” al cuerpo de
reproducción o carpóforo de los hongos macroscópicos (macromicetos) que pertenecen al
filo Basidiomycota (basidiocarpos), o en menor medida al filo Ascomycota (ascocarpos). Es-
tos cuerpos de reproducción pueden ser epigeos o hipogeos, como es el caso de las trufas.
En caso de no presentar riesgos para la salud, cuando son carnosos y palatables pueden ser
comestibles. También existen carpóforos leñosos, no palatables, que pueden consumirse en
infusiones, sopas, tónicos, polvos, etc.
1.1.2 Propiedades nutricionales
Los hongos son muy apreciados en gastronomía por su textura, sabor y aromas. Más
allá de las reconocidas características culinarias de los hongos, por lo general, poseen un alto
valor nutricional.
2
CAPÍTULO 1
El contenido nutricional de los hongos es muy variable con la especie, la cepa, las con-
diciones de cultivo y las condiciones postcosecha. Por lo general, los hongos poseen un con-
tenido alto de carbohidratos y proteínas, moderado en fibras y cenizas, y bajo en grasas
(Chang y Miles 2004). Los hongos frescos suelen tener un alto contenido de agua, en torno
al 75 – 90%.
En contenido de proteínas totales los hongos están por debajo de casi todas las carnes
animales, pero muy por encima de la mayoría del resto de los alimentos, incluyendo a pro-
ductos animales como la leche (Chang y Miles 2004). Las proteínas de los hongos contienen
los nueve aminoácidos esenciales y tienen un valor biológico elevado, en torno a 72 y 99 (Boa
2004). La FAO ha recomendado el consumo de hongos en países subdesarrollados donde la
malnutrición proteica es un problema común (Pala y Wani 2011).
De acuerdo a la especie, el contenido de grasas varía del 1,1 al 8,3% en base seca, con
una alta proporción de ácidos grasos insaturados, a diferencia de las carnes animales que
tienen una alta proporción de ácidos grasos saturados (Chang y Miles 2004). Además, los
hongos son ricos en ácido linoleico, un aceite esencial (Günç Ergönül et al. 2013).
Los hongos son una buena fuente de varias vitaminas, incluyendo vitamina B, niacina,
riboflavina, tiamina, biotina y ácido ascórbico. Los hongos son la única fuente no-animal de
vitamina D. El ergosterol, presente en las paredes celulares de los hongos, puede ser conver-
tido en vitamina D por radiación ultravioleta (Koyyalamudi et al. 2009). El contenido de
vitamina D dependerá de las condiciones postcosecha, ya que un hongo expuesto a la luz
solar, incluso por cortos tiempos, tendrá mayor concentración de esta vitamina.
Además, los hongos son una buena fuente de minerales. Su contenido depende de la
composición del sustrato, ya que los minerales presentes en él son tomados por el micelio y
luego traslocados a los carpóforos. Los constituyentes minerales mayoritarios son potasio
(K), fósforo (P), sodio (Na), calcio (Ca) y magnesio (Mg), con menores cantidades de cobre
(Cu), zinc (Zn), hierro (Fe), molibdeno (Mo) y cadmio (Cd). Es importante tener en cuenta
que los hongos también bioacumulan minerales tóxicos, como plomo (Pb) y radiocesio
(137Cs) (Yoshida et al. 1994; Kirchner y Daillant 1998), por lo que su presencia deberá ser
evitada en los sustratos de cultivo.
3
CAPÍTULO 1
1.1.3 Características medicinales
Los hongos son una vasta fuente natural de productos medicinales. Entre las sustancias
con actividad biológica aisladas de hongos se pueden mencionar, polisacáridos de alto peso
molecular, polisacáridos ligados a proteínas de bajo peso molecular, glicoproteínas, alcaloi-
des, triterpenoides y proteínas fúngicas inmunomoduladoras (Fips) (Chang y Miles 2004; Pala
y Wani 2011). Varios de los compuestos polisacáridos de hongos se encuentran en distintas
fases de ensayo clínico y se utilizan, especialmente en Asia, para tratar cáncer y otras enfer-
medades.
La utilización de hongos en la Medicina Tradicional China se remonta a la antigüedad y

su práctica ha quedado registrada en antiguos manuscritos chinos (Smith et al. 2002). A lo
largo de la historia los hongos se han utilizado para tratar epilepsia, heridas, enfermedades
de la piel, enfermedades coronarias, artritis reumatoidea, cólera, fiebres intermitentes, diafo-
resis, diarrea, disentería, resfríos y enfermedades hepáticas (Pala y Wani 2011). Entre los
efectos medicinales reportados en diferentes especies de hongos se encuentran: actividad
antibiótica, actividad antiviral, incluyendo actividad anti-HIV, efectos antitumorales, activi-
dad antioxidante, efectos cardiovasculares y renales, actividad antiaterogénica, actividad hi-
poglucémica, entre otros (Lindequist et al. 2005; Wasser 2011). Existe un volumen creciente
de reportes que describen estas actividades, tanto en ensayos in vivo e in vitro en animales,
como en ensayos clínicos en humanos (Roupas et al. 2012).
Algunos autores concuerdan en definir a los hongos como “adaptógenos”. Los adaptó-
genos modifican la respuesta biológica mediante la promoción de factores positivos y elimi-
nando los factores negativos del cuerpo humano. Algunos hongos pueden estimular la res-
puesta inmune, mejorando las funciones del cuerpo ya existentes que previenen y enfrentan
a las enfermedades. Por otro lado, pueden actuar frente a un rango de enfermedades autoin-
munes, como las alergias. Es por ello que se considera que estos hongos son inmunoregula-
dores, activando o disminuyendo la producción de glóbulos blancos de acuerdo a la circuns-
tancia (Smith et al. 2002).
Los compuestos de algunas especies de hongos previenen la oncogénesis y la metástasis,

y muestran acción antitumoral directa contra varios tipos de tumores. La evidencia científica
muestra que la suplementación de la dieta con distintos hongos medicinales puede mejorar
significativamente la condición fisiológica y la prognosis de pacientes con cáncer (Smith et al.
2002; Pala y Wani 2011).
4
CAPÍTULO 1
Una ventaja importante de los hongos medicinales y sus extractos es que suelen mostrar
toxicidades muy bajas cuando se consumen regularmente, siendo bien tolerados con ninguno
o escasos efectos adversos (Roupas et al. 2012). Por sus propiedades medicinales y su baja
toxicidad, los hongos son un grupo representativo de los alimentos denominados “funcio-
nales”, es decir, aquellos que presentan un efecto saludable, más allá de su efecto puramente
nutricional, mostrando ventajas en la prevención y tratamiento de enfermedades.
1.1.4 Mercado nacional e internacional de los hongos comestibles y medicinales
La producción de hongos comestibles y medicinales se ha incrementado notablemente

en las últimas décadas, lo que indica un creciente interés en su consumo por parte de la
población. En particular, el crecimiento de la producción de hongos de especialidad (distintos
de los champiñones), se debe fundamentalmente a que su cultivo no requiere de sustratos
compostados, y, en consecuencia, los costos de inversión, la infraestructura, mano de obra y
tiempo de cultivo, son menores. Además, uno de los principales atractivos del cultivo de
estos hongos, como se verá más adelante, es la posibilidad de emplear para ello materiales
residuales de la agroindustria. La producción de hongos cuenta con la posiblidad de obtener
una importante cantidad de un producto alimenticio apreciado por el mercado, en pequeñas
áreas y en cortos períodos de tiempo
En China, principal productor de hongos comestibles y medicinales del mundo, la pro-

ducción de hongos cultivados creció de 60.000 toneladas en 1978 a 6.630.000 toneladas en
2000 (Chang y Miles 2004). Si bien la mayor parte del mercado se concentra en Asia y Europa,
en los últimos años en Norteamérica se ha incrementado a un ritmo de entre el 20 y el 40%
anual. En Estados Unidos, entre 1989 y 1995, las ventas de hongo Shiitake (Lentinula edodes)
se duplicaron, las de Gírgola (Pleurotus ostreatus) aumentaron un 36% y, en general, la venta de
hongos comestibles creció un 25% (Halpern 2007).
La producción de hongos comestibles y medicinales en América Latina representa alre-

dedor del 1% de la producción mundial de hongos. Entre 1994 y 1997 la participación en el
mercado mundial se incrementó del 0,2% al 0,8%, siendo, después de Asia, la región que
mayor crecimiento experimentó (Chang y Miles 2004).
Es difícil calcular la producción de hongos en Argentina ya que no existen estadísticas

oficiales. Se estima que en el año 2000 la producción anual alcanzó un total de 1.500
toneladas, aunque la crisis económica de 2001 provocó un brusco descenso (Albertó y
5
CAPÍTULO 1
Gasoni 2003). Sin embargo, en los últimos años se evidenció una recuperación de los valores
de producción acompañando el creciente interés por parte de los consumidores, y se estima
que hacia 2009 la producción anual había alcanzado las 2.500 toneladas (Urrutibehety 2009).
En Argentina se cultivan comercialmente tres especies de hongos comestibles, Agaricus
bisporus (champiñón, desde 1941), Pleurotus ostreatus (gírgola, desde los años `80) y Lentinula
edodes (shiitake, intermitentemente desde 1993), y el total de la producción se destina al
consumo interno (Albertó y Gasoni 2003).
El creciente interés por parte de la población en el valor nutricional y medicinal de los

hongos y los bajos niveles de consumo (en torno a 50 g/hab/año) comparado con otras
regiones (por ejemplo, Europa, 2 kg/hab/año), la posibilidad de incorporar nuevas especies
comestibles y medicinales que hoy no son cultivadas (entre ellas Ganoderma lucidum) y la
posiblidad de exportar el excendente de la producción, hacen del cultivo de hongos una
actividad con alto potencial de desarrollo en Argentina. En nuestro país, el cultivo de hongos
comestibles es una actividad en desarrollo, representada por algunos grandes productores,
pero principalmente por PYMES y emprendimientos familiares, con una fuerte tendencia al
asociativismo. Esta actividad representa una alternativa económica promisoria para muchos
productores agrícolas, ya que la demanda interna no ha sido cubierta por la producción local.
Una de las características favorables para el desarrollo de la fungicultura en la Argentina, es
que emplea como sustrato residuos de la actividad agropecuaria y de la agroindustira. La
biodegradación de residuos lignocelulósicos llevada a cabo por los hongos degradadores
primarios, como los llamados hongos de la “pudrición blanca” (por ejemplo: gírgolas,
shiitake y reishi) es un proceso de importancia en el sector productivo, ya que se logran dos
objetivos al mismo tiempo, la producción de alimentos y la reducción del impacto ambiental
que genera la eliminación inadecuada de tales residuos (Postemsky et al. 2014). Además, los
sustratos agotados de la producción de hongos pueden tener aplicación en otras actividades
como biofertilizantes y fuentes de enzimas para la biorremediación (Hölker et al. 2004;
Postemsky et al. 2016). Este panorama indica que es importante favorecer el desarrollo de la
fungicultura en el país, ya que es una actividad productiva, amigable con el ambiente y
generadora de empleo.
1.2 EL HONGO GANODERMA LUCIDUM

Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P. Karst (Lingzhi en chino; Reishi, Mannentake o Sachitake
en japonés; Youngzi en coreano) es una especie de la clase Agaricomycetes, que pertenece a
la familia Ganodermataceae del orden Polyphorales. Este hongo es responsable de producir
6
CAPÍTULO 1
pudrición blanca en una gran cantidad de especies arbóreas y puede ser descripto como un
hongo fitopatógeno. De acuerdo a la tradición China, Lingzhi también es conocido como el
“milagroso zhi” o “hierba auspiciosa”, y usualmente se lo considera como un símbolo de
augurios felices y como una fuente de buena fortuna, salud, longevidad, y hasta inmortalidad
(Chang y Miles 2004).
El género Ganoderma está ampliamente distribuido desde el Amazonas hasta el sur de

Norteamérica y en la mayor parte de Asia. Se lo encuentra con más frecuencia regiones sub-
tropicales que en regiones templadas (Stamets 1993). Es un hongo muy raro en el medio
natural (Upton 2006), lo que en parte explica las leyendas que han surgido a su alrededor en
China.
1.2.1 Taxonomía
La taxonomía del género Ganoderma (del latín, gano, brillante, derma, piel) es muy compleja
e incluye más de 250 especies descriptas (Wasser 2005). Como resultado, el concepto de
especie en el género ni está bien establecido ni es universalmente aceptado (Bishop et al.
2015). La incertidumbre en la identificación taxonómica de las especies de Ganoderma se debe
mayormente a la gran variabilidad de las características macroscópicas y microscópicas del
basidiocarpo. De acuerdo a Chang y Miles (2004), a grandes rasgos, el género Ganoderma
puede dividirse en dos grupos: el complejo G. lucidum (del latín, lucidus, brillante, en referencia
a la apariencia de la superficie del carpóforo) con píleo laqueado y el complejo G. applanatum,
no-laqueado.
1.2.2 Características morfológicas
Las especies del complejo Ganoderma lucidum poseen carpóforos anuales con una cutícula
laqueada amarilla a rojiza y una capa superior que es suave y usualmente está dispuesta en
bandas concéntricas, con zonas de diferente color (Figura 1). Las áreas de nuevo crecimiento
(bordes) son de color blanco, oscureciéndose hacia un amarillo amarronado y luego rojo
amarronado cuando maduro. La forma del carpóforo es variable, de circular a semi-circular
a arriñonada, 2-20 cm de ancho, 4-8 cm de espesor. La superficie a veces está cubierta por
un polvo amarronado de esporas. Posee poros en el lado inferior, de color blanco que se
torna marrón al ser tocado. El estípite, cuando está presente, es blanco a amarillo, eventual-
mente oscureciéndose hacia el marrón o negro, excéntrico o unido lateralmente al sombrero,
usualmente sinuoso. El basidiocarpo fresco es suave, fresco, húmedo y algo correoso.
Cuando se seca es duro y leñoso.
7
CAPÍTULO 1
Cuando los niveles de dióxido de carbono son altos y los niveles de luz bajos (por ejem-
plo, en el interior de la cavidad formada por el sistema de raíces de un árbol caído), surgen
hongos con estípites largos, habitualmente ramificados y sin “sombrero”; esta rara forma se
conoce como “cuernos de ciervo” (Figura 2) y es altamente valuada en Asia (Stamets 1993;
Upton 2006).
Se observa la forma arriñonada y las bandas de crecimiento concéntrico, más claras hacia los
bordes.
Figura 1: Basidiocarpo de Ganoderma lucidum en su forma habitual de “sombrero”.

Por jatlas [CC BY-SA 2.5 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.5)], via Wiki-
media Commons.
8
CAPÍTULO 1
De acuerdo a las condiciones ambientales o de cultivo, Ganoderma lucidum puede perder su

forma de “sombrero” y adquirir la forma de “cuernos de ciervo”.
Figura 2: Forma de “cuernos de ciervo” de Ganoderma lucidum. Por Hokkaido Reishi

Co., Ltd (trabajo propio) [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-
sa/3.0)], via Wikimedia Commons.
Cuando es molido, el basidiocarpo se fractura característicamente en hebras en vez de

formar un polvo homogéneo. Estas hebras están compuestas principalmente por hifas gene-
rativas, de unión y esqueléticas, que se diferencian por el grosor de sus paredes y grado de
ramificación.
Ganoderma lucidum produce esporas de color marrón rojizo, elipsoides con extremo romo,
verrugosa, 9-12 x 5,5-8 µm, doble pared, con pilares internos entre paredes que asemejan a
columnas.
1.3 ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE GANODERMA LUCIDUM

Desde hace mucho tiempo en China, G. lucidum ha sido conocido como una especie de
panacea para curar todo tipo de enfermedades. Tradicionalmente se lo ha utilizado para me-
jorar la capacidad intelectual y la memoria, potenciar la sexualidad, promover la agilidad y la
longevidad, tratar enfermedades hepáticas, distrofia muscular, neurastenia, envenenamiento,
nefritis, hiperlipemia, artritis, asma, bronquitis, úlcera gástrica, arteriosclerosis, leucopenia,
diabetes, insomnio y anorexia (Chang y Miles 2004; Wasser 2005; Russell y Paterson 2006;
9
CAPÍTULO 1
Halpern 2007; Sanodiya et al. 2009; Ulbricht et al. 2010). Se mencionan a continuación bre-
vemente algunas de las actividades biológicas atribuidas a diferentes extractos o sustancias
aisladas de distintas partes de G. lucidum.
1.3.1 Efecto antitumoral
Ganoderma lucidum mostró efectos antineoplásicos en estudios en animales. En humanos

la actividad antitumoral no está probada; sin embargo estudios clínicos sugieren que algunos
compuestos de G. lucidum tienen utilidad como coadyuvantes en terapias tradicionales, mejo-
rando algunos parámetros hematológicos, reduciendo los síntomas y mejorando la calidad
de vida en pacientes con cáncer (Ulbricht et al. 2010). Estudios recientes mostraron que ex-
tractos de G. lucidum mejoraron la supervivencia y calidad de vida de pacientes tratados con
quimio y radioterapia, pero no se observaron efectos cuando se lo administró solo (Jin et al.
2016).
La actividad antitumoral de G. lucidum se debería a la acción conjunta en distintos niveles

de varios de sus componentes. Entre estas acciones se pueden mencionar la habilidad de los
polisacáridos de mediar en el sistema inmune incrementando la producción de citoquinas, la
inhibición de la ADN polimerasa y de la modificación postranscripcional de oncoproteínas
(Wasser 2005). Algunos estudios han mostrado citotoxidad directa de G. lucidum en células
tumorales en animales (Upton 2006). También se ha reportado actividad anti-angiogénica en
extractos alcohólicos y polisacáridos del cuerpo de fructificación (Batra et al. 2013).
1.3.2 Efectos inmunomodulatorios
Los efectos inmunomodulatorios de sustancias aisladas de G. lucidum incluyen mitogeni-

cidad y activación de células inmunes efectoras como linfocitos T, macrófagos y células NK,
lo que lleva a la producción de citoquinas incluyendo, Ils, TNF-α, e IFNs (Sanodiya et al.
2009). También se han reportado otros efectos como inhibición de mastocitos, activación de
linfocitos B y del sistema de complemento (Wasser 2005). Tanto los polisacáridos, proteínas
(LZ-8) y triterpenoides serían responsables de esta acción (Batra et al. 2013). El hongo G.
lucidum también mostró efectos quimio y radioprotectores que son atribuidos a sus efectos
en el sistema inmune (Sanodiya et al. 2009).
10
CAPÍTULO 1
1.3.3 Actividad antiinflamatoria
Tradicionalmente G. lucidum se ha utilizado como agente antiinflamatorio para el trata-

miento de asma y alergia. Distintos triterpenoides presentes en G. lucidum han mostrado po-
tente actividad antiinflamatoria en ensayos animales (Sanodiya et al. 2009). Algunos ácidos
ganodéricos y otros compuestos no triterpenoides han mostrado actividad inhibitoria de la
liberación de histamina desde mastocitos y actividad antiinflamatoria en líneas celulares in
vitro (Wasser 2005; Batra et al. 2013).
1.3.4 Actividad hepatoprotectora
Varios estudios han mostrado que G. lucidum exhibe actividad protectora contra daño de
los hepatocitos inducido por compuestos químicos tóxicos, como cloroformo y d-galacto-
samina (Sanodiya et al. 2009). Si bien el mecanismo de acción no está definido se han suge-
rido varias posibilidades como la actividad antioxidante y anti-radical, modulación de enzimas
hepáticas, inhibición de la enzima β-glucuronidaza, actividad antifibrótica y antiviral, modu-
lación de la producción de NO, mantenimiento del calcio hepatocelular, homeostasis y efec-
tos inmunomodulatorios (Wasser 2005; Batra et al. 2013).
1.3.5 Efecto antidiabetes
La fracción de polisacáridos de G. lucidum tiene potencial actividad hipoglucémica y an-

tihiperglicémica. Estos efectos se deberían a la capacidad de los polisacáridos de G. lucidum
de elevar los niveles séricos de insulina y su habilidad de mejorar la utilización de glucosa en
tejidos periféricos y en el hígado (Upton 2006; Batra et al. 2013).
1.3.6 Funciones cardiovasculares y circulatorias
Estudios en animales y clínicos han mostrado que diversas fracciones de G. lucidum tie-
nen actividad antihipertensiva y disminuyen significativamente los niveles de colesterol y tri-
glicéridos en sangre (Batra et al. 2013). También se ha reportado la habilidad de G. lucidum
de inhibir la agregación plaquetaria (Upton 2006). Estudios in vitro en corazón de rana con
una tintura de G. lucidum mostraron un efecto cardiotónico significativo (Upton 2006).
1.3.7 Poder antibiótico y antiviral
De acuerdo a varios estudios, algunos constituyentes de G. lucidum presentes en extractos

acuosos y orgánicos, serían capaces de inhibir el crecimiento de bacterias gram-positivas y
11
CAPÍTULO 1
gram-negativas (Batra et al. 2013). Otros compuestos, como la proteína aislada de carpóforo
Ganodermina, mostraron potencial actividad antifúngica (Batra et al. 2013).
Además, estudios in vitro indican que algunos componentes de bajo peso molecular ten-
drían efecto inhibitorio contra el VIH, el virus Epstein-Barr, el virus del herpes simple, y
otros virus. Por otro lado, un preparado de polisacáridos mostró actividad contra el virus de
la Hepatitis B (Ulbricht et al. 2010). El mecanismo de acción aún no ha sido dilucidado,
aunque estarían involucrados múltiples mecanismos en diferentes blancos. Se ha reportado
que algunos triterpenoides actúan como potentes inhibidores de las enzimas ADN-polime-
rasas y VIH-1-proteasas (Sanodiya et al. 2009).
1.3.8 Actividad antioxidante
La actividad antioxidante ha sido reportada en estudios en animales in vivo e in vitro, tanto

en extractos acuosos como extractos orgánicos de G. lucidum (Batra et al. 2013).
1.3.9 Actividad antiandrogénica
Se ha reportado que algunos triterpenoides de G. lucidum tienen potente actividad inhi-

bitoria 5α-reductasa. Estudios clínicos y en animales mostraron que G. lucidum tiene gran
potencial para el tratamiento de enfermedades mediadas por andrógenos, como la hiperplasia
prostática benigna (Sanodiya et al. 2009; Batra et al. 2013).
1.3.10 Toxicidad
En experimentos en animales, los extractos de G. lucidum han mostrado muy baja toxi-
cidad. En estudios clínicos algunos pacientes han reportado síntomas temporarios de som-
nolencia, sed, erupciones, hinchazón, micción frecuente, transpiración anormal y diarrea
(Wasser 2005). También podrían presentarse interacciones con otros medicamentos. La ac-
tividad antiplaquetaria de G. lucidum puede presentar un efecto aditivo con medicaciones an-
ticoagulantes como warfarina y aspirina. Por su acción inmunomoduladora puede interferir
con la acción de drogas inmunosupresoras utilizadas en pacientes trasplantados.
El perfil de seguridad de G. lucidum está clasificado por la American Herbal Products

Association como Clase 1: hierbas que pueden ser consumidas de forma segura cuando se
utiliza apropiadamente (Upton 2006).
12
CAPÍTULO 1
1.4 COMPOSICIÓN QUÍMICA DE GANODERMA LUCIDUM

La diversidad en las acciones biológicas del hongo Ganoderma lucidum se puede atribuir al
hecho de que está compuesto de una gran cantidad de sustancias químicas que pueden agru-
parse en diferentes grupos. El carpóforo, el micelio y las esporas de G. lucidum contienen más
de 400 compuestos bioactivos diferentes (Wasser 2005). Entre ellas podemos encontrar al-
caloides, aminoácidos y péptidos, elementos inorgánicos, esteroides, esteroles, nucleótidos,
elementos traza, ácidos grasos y ácidos orgánicos. Los dos grupos de compuestos con mayor
actividad farmacológica parecen ser los triterpenoides y los polisacáridos.
1.4.1 Triterpenoides
Los triterpenos son un tipo de terpeno formado por seis unidades de isopreno. Se han
identificado más de 140 triterpenoides en Ganoderma lucidum, divididos en 10 grupos diferen-
tes de acuerdo a su estructura química y propiedades biológicas conocidas (Wasser 2005; Xia
et al. 2014). Los triterpenoides predominantes son los ácidos ganodéricos A-Z (Upton 2006).
Los ácidos ganodéricos están formados por cuatro unidades de isopreno cíclicas y dos linea-
les (Figuras 3 y 4).
Los triterpenoides son compuestos de bajo peso molecular que regulan directamente
ciertas funciones celulares como la apoptosis, el ciclo celular y la angiogénesis. Los triterpe-
noides de G. lucidum tendrían efecto antioxidante, citotóxico, anti-metástasis, anti-VIH y neu-
roprotector (Bishop et al. 2015). Los triterpenoides son los que le dan al hongo su caracte-
rístico sabor amargo.
Figura 3: Estructura básica de los ácidos ganodéricos. Las cadenas laterales R1 - R6

determinan el tipo de ácido ganodérico.
13
CAPÍTULO 1
Figura 4: Estructura de algunos ácidos ganodéricos (Sanodiya et al. 2009).
1.4.2 Polisacáridos
La mayoría de los polisacáridos de Ganoderma lucidum son de alto peso molecular (400.000
a 1.000.000 Da) y comprenden β-d-glucanos, heteropolisacáridos y glicoproteínas (Wasser
2005; Boh et al. 2007). La estructura básica de los glucanos es una cadena de β-1-3 D-gluco-
pironano con cadenas laterales de 1-15 unidades de β-1-6 D monoglucil (Figura 5). La ma-
yoría de los polisacáridos de G. lucidum son heteropolímeros compuestos principalmente por
glucosa junto con xilosa, manosa, galactosa y fucosa, en diferentes conformaciones (Bishop
et al. 2015). Los polisacáridos serían los principales responsables de la actividad inmunomo-
duladora observada en estudios en animales y clínicos (Bishop et al. 2015). Además de los
polisacáridos solubles, G. lucidum posee una matriz del polisacárido quitina que no es digerible
y que le confiere al hongo su dureza.
14
CAPÍTULO 1
Figura 5: Estructura básica de los β-glucanos de G. lucidum (Deepalakshmi y

Mirunalini 2011).
1.4.3 Proteínas
Varias proteínas con actividad medicinal han sido reportadas en G. lucidum. Una de ellas,
LZ-8, fue aislada del micelio y tiene una secuencia similar a la región variable de la cadena
pesada de la inmunoglobulina, y ha mostrado actividad inmunomoduladora. LZ-8 tiene una
estructura de 110 aminoácidos con un amino terminal acetilado, y una masa molecular de 12
kDa (Russell y Paterson 2006). También se han reportado complejos péptido-polisacárido
con actividad antioxidante y antitumoral. Otra proteína aislada de G. lucidum ha sido deno-
minada Ganodermina. Ganodermina tiene un peso molecular de 15 kDa y actividad antifún-
gica (Russell y Paterson 2006).
1.4.4 Otros compuestos
Los nucleósidos y nucleótidos adenina, adenosina, uracilo y uridina han sido aislados del
micelio de algunas especies de Ganoderma (Russell y Paterson 2006). Adenosina ha mostrado
tener actividad antiagregante. También se han aislado los alcaloides colina y betaína, además
de los alcaloides nóveles ganoina, ganodina y ganoderpurina (Russell y Paterson 2006). Se ha
reportado la presencia de compuestos fenólicos que estarían relacionados con la actividad
antioxidante del hongo (Sliva 2003).
15
CAPÍTULO 1
1.5 LOS HONGOS MEDICINALES COMO NUTRACÉUTICOS, MICOTERÁPICOS

Y SUPLEMENTOS DIETARIOS.
Los “nutracéuticos” (contracción de nutrición y farmacéutico) pueden definirse como un

producto aislado de un alimento, que se cree tiene un efecto beneficioso para la salud o para
la prevención de enfermedades crónicas. Sin embargo, el término no está globalmente acep-
tado y no existe una definición regulatoria (Bishop et al. 2015). En la definición más amplia,
el término incluye a los alimentos funcionales, a los suplementos dietarios y a los alimentos
medicinales.
El Código Alimentario Argentino (CAA) define a los suplementos dietarios como “pro-
ductos destinados a incrementar la ingesta dietaria habitual, suplementando la incorporación
de nutrientes en la dieta de las personas sanas que, no encontrándose en condiciones pato-
lógicas, presenten necesidades básicas dietarias no satisfechas o mayores a las habituales”.
Como todos los alimentos, se venden libremente. Las publicidades de los suplementos die-
tarios no pueden atribuirle “acciones y/o propiedades terapéuticas, que sugieran que es un
producto medicinal o mencionen que diagnostica, cura, calma, mitiga, alivia, previene o pro-
tege de una determinada enfermedad. Sólo se admitirá incluir “ayuda a prevenir” o “ayuda a
proteger”, siempre que dichas declaraciones resulten beneficiosas ante una enfermedad clá-
sica por deficiencia de nutrientes” (Disposición ANMAT N° 4980/2005).
Por otro lado, la Administración Nacional de Alimentos, Medicamentos y Tecnología

Médica (ANMAT) define como medicamento fitoterápico a “los medicamentos que conten-
gan como principio activo drogas vegetales puras y/o mezclas definidas de estas y/o prepa-
rados de drogas vegetales, tradicionalmente usadas con fines medicinales, y que no contengan
sustancias activas químicamente definidas o sus mezclas aun cuando fuesen constituyentes
aislados de plantas, salvo los casos que así se justifiquen”. Los medicamentos (incluyendo los
fito y micoterápicos) deben cumplir con tres requisitos básicos: seguridad, eficacia y calidad.
Mientras que los suplementos dietarios son considerados alimentos y sólo deben cumplir con
las buenas prácticas de manufactura. Las hierbas o sus extractos, con actividad farmacológica
científicamente comprobada, que quieran ser comercializadas con indicaciones de uso medi-
cinal, deben ser registradas en la categoría de medicamentos fitoterápicos. Dado que muchas
de estas hierbas se encuentran registradas en el CAA, pueden también registrarse como su-
plementos dietarios, sólo que sin referencia a acciones terapéuticas (Debenedetti 2011).
16
CAPÍTULO 1
Actualmente, en las sociedades occidentales existe una fuerte tendencia a lo natural y a

buscar productos con un mayor valor agregado. Los hongos comestibles (champiñón de
Paris, gírgolas, shiitake, entre los más conocidos) ya tienen una gran aceptación por los con-
sumidores, considerándolos como un alimento nutritivo, de agradable sabor y beneficiosos
para la salud. En el área de la herboterapia, son los hongos los que en la actualidad aportan
a la industria farmacéutica una nueva fuente de productos con potencial acción terapéutica,
visualizándose como las drogas del futuro, por lo que es válido pensar que el consumo de
estos productos tenderá a incrementarse significativamente en los próximos años.
El interés creciente en medicinas tradicionales y el reconocimiento de las numerosas

actividades biológicas de los hongos han llevado al desarrollo de los “nutracéuticos de hon-
gos”. Un nutracéutico de hongos se define como un extracto refinado, o parcialmente refi-
nado, del micelio o el carpóforo del hongo, que se consume en forma de gotas, comprimidos
o cápsulas como suplemento dietario y que tiene potenciales aplicaciones terapéuticas
(Wasser 2011).
En EEUU, el 42% de la población consume algún tipo de fitoterápico. El mercado de

los fitomedicamentos aumentó sustancialmente después de la creación de la ley “Dietary
Supplement Health and Education Act” del año 1994. Esta ley permite considerar a los me-
dicamentos a base de hierbas y hongos como suplementos dietarios.
También en nuestro país gran parte de la sociedad consume hierbas medicinales si-
guiendo una cultura de tradición, obteniendo las hierbas de ambientes naturales o de ventas
no controladas. Existe una demanda en aumento en los grandes centros urbanos donde se
consumen como suplementos dietarios, o como fitoterápicos producidos en laboratorios
farmacéuticos reconocidos. En Argentina existen muy pocos trabajos sobre su prevalencia;
pero una indicación del tamaño de la población que los consume puede apreciarse en un
estudio observacional sobre 245 entrevistados donde se concluyó que un tercio de las perso-
nas que asistían al centro de salud utilizaban medicinas alternativas y/o complementarias
(Ruiz y Soso 2006); las mismas eran personas de mejores ingresos y en su mayoría de sexo
femenino.
En Estados Unidos los productos derivados del hongo Ganoderma lucidum están regula-
dos como suplementos dietarios. El hongo también está incluido en la Farmacopea de la Repú-
blica Popular de China (ed. año 2000) como un agente aprobado para el tratamiento de mareos,
insomnio, palpitaciones, falta de aliento, tos y asma (Ulbricht et al. 2010). Los productos de
17
CAPÍTULO 1
Ganoderma pueden ser vendidos como drogas de prescripción, o micoterápicos, en algunos

países asiáticos, aunque internacionalmente se los publicita como suplementos dietarios
(Bishop et al. 2015).
Entre 1991 y 1999 el mercado mundial de hongos medicinales, extractos de hongos

medicinales y derivados, creció de USD 1,2 mil millones a USD 6 mil millones, de los cuáles
USD 1,6 mil millones pueden atribuirse solo a Ganoderma lucidum (Smith et al. 2002; Chang y
Miles 2004; Lindequist et al. 2005). En 2011 el mercado de los suplementos dietarios prove-
nientes de hongos llegó a los USD 15 mil millones, representando un 10% del mercado total
de los suplementos dietarios (Wasser 2011). En 2008 la producción mundial de G. lucidum
era de 9.500 toneladas de las cuales 6.000 toneladas fueron producidas en China (Sanodiya
et al. 2009).
1.6 OBJETIVOS DE LA TESIS

Ganoderma lucidum es económica y ecológicamente importante no solo como una fuente
de productos medicinales y nutracéuticos, sino que, como hongo de la pudrición blanca,
posee una batería enzimática que le permite descomponer compuestos como la lignina y la
celulosa. Estos compuestos aparecen como constituyentes mayoritarios en muchos residuos
agroindustriales, que pueden utilizarse como sustrato base para la producción del hongo. A
su vez, el residuo biotransformado por acción del hongo puede ser utilizado como punto de
partida de otras actividades productivas (Rinker 2002; Phan y Sabaratnam 2012; Postemsky
et al. 2016), lo que fundamentaría un ciclo productivo sustentable de emisión cero.
En Argentina actualmente no existe producción comercial de G. lucidum. Esto se debe

en parte a que su cultivo produce rendimientos menores al de otros hongos comestibles
cultivables de especialidad y a que su consumo no está tan extendido en la población como
el de gírgola o shiitake. Es por ello que es necesario, en primer lugar, optimizar su cultivo
para mejorar los rendimientos, y además facilitar el consumo del hongo por parte de la po-
blación mediante el desarrollo de productos nutracéuticos.
Teniendo en cuenta la importancia y el gran potencial de desarrollo del hongo medicinal

G. lucidum y sus productos derivados como actividad productiva sustentable en nuestro país
y la región, el objetivo general de esta Tesis fue estudiar alternativas para mejorar los rendi-
mientos de producción de G. lucidum a partir de un residuo abundante de la agroindustria
18
CAPÍTULO 1
Argentina, buscando optimizar la obtención de productos activos con el fin de proponer el

desarrollo de nutracéuticos.
Este objetivo general se abordó mediante los siguientes objetivos particulares:
1. Evaluar diferentes aceites vegetales y sulfato de cobre como estimuladores del

crecimiento y fructificación optimizada de G. lucidum en sustrato a base de cás-
cara de semilla de girasol.
2. Evaluar el efecto de diferentes sustratos de cultivo sobre el contenido de com-
puestos bioactivos: polisacáridos, triterpenoides y polifenoles.
3. Estudiar el potencial prebiótico de los polisacáridos obtenidos de G. lucidum, so-
bre cepas de bacterias probióticas.
4. Desarrollar una formulación a partir del basidiocarpo de G. lucidum que conserve
la mayor proporción de compuestos activos posible para su uso como nutracéu-
tico.
19
CAPÍTULO 2
CAPÍTULO 2:
OPTIMIZACIÓN DEL CULTIVO DE Ga-
noderma lucidum EN UN SUSTRATO A
BASE DE CÁSCARA DE SEMILLA DE GI-
RASOL. EFECTO DE ACEITES VEGE-
TALES Y COBRE
2.1 INTRODUCCIÓN
2.1.1 El cultivo de hongos comestibles y medicinales
El cultivo de hongos nació hacia el año 600 D.C. cuando Auricularia auricula fue por
primera vez cultivada en China en troncos de madera. Le siguieron otros hongos, cultivados
de manera similar, como Flammulina velutipes (800 D.C.) y Lentinula edodes (1000 D.C.). El
mayor avance en el cultivo de hongos surgió en Francia alrededor de 1600 D.C. cuando
Agaricus bisporus (champiñón) fue cultivado en un sustrato compostado (Chang y Miles 2004).
El champiñón fue ganando popularidad en el mundo occidental y es aún hoy el hongo de
cultivo más popular. En las últimas décadas, como consecuencia del perfeccionamiento de
las técnicas de cultivo y el mejoramiento de las cepas, así como también de una mayor acep-
tación por parte del consumidor, el cultivo de hongos comestibles y medicinales se expandió
en varios órdenes de magnitud (Kües y Liu 2000).
Las dos fases en el crecimiento y desarrollo de un hongo cultivado se conocen como

estados vegetativo y reproductivo. En la jerga de los cultivadores de hongos el estado ve-
getativo se conoce como fase de corrida del “spawn” o micelio, y el estado reproductivo
como fase de fructificación. El cultivo de hongos puede considerarse como la práctica de
obtener cuerpos reproductivos mediante la repetición artificial de estas dos fases de creci-
miento (Cho 2005).
Durante la fase de crecimiento vegetativo el micelio produce enzimas extracelulares que

degradan los componentes lignocelulósicos del sustrato en compuestos más simples. Estos
20
CAPÍTULO 2
compuestos más simples son solubles y pueden ser absorbidos por las hifas para ser utiliza-
dos en el metabolismo del hongo. Cuando la colonización del sustrato es completa se puede
pasar del estado vegetativo al reproductivo. Este cambio en la fase de crecimiento se logra
mediante ciertos estímulos ambientales que pueden ser aprovechados por el cultivador. Al-
gunos de estos factores ambientales pueden ser: temperatura, luz y cambio de la concen-
tración de gases atmosféricos. Estos factores, junto con la humedad ambiental y del sus-
trato, deben ser regulados y controlados, ya que son críticos en el crecimiento y desarrollo
del hongo (Chang y Miles 2004).
El cultivo de hongos consiste en una serie de pasos definidos, cada uno con sus propios
requisitos y procedimientos. Estos pasos son la producción del spawn o inóculo, la prepara-
ción e inoculación del sustrato, la corrida del spawn, el desarrollo de los cuerpos reproducti-
vos y la cosecha (Figura 6).
2.1.2 Producción del inóculo
Se conoce como “spawn”, “semilla” o inóculo, al medio en el cual se ha desarrollado

el micelio de un cultivo que tiene la capacidad genética para formar cuerpos de fructificación
en condiciones apropiadas de cultivo, y que se utiliza para inocular el sustrato en el cultivo
de hongos. El micelio del hongo se cultiva inicialmente en un medio nutritivo de agar. Este
se utiliza para inocular al sustrato que servirá de portador del micelio. El sustrato utilizado
para la producción del inóculo puede ser diferente a los materiales utilizados en el cultivo, o
puede ser el mismo. Algunos de los sustratos utilizados en la producción del inóculo pueden
ser granos (centeno, trigo, sorgo), paja de arroz cortada, residuos de algodón, cáscara de
arroz, etc. (Chang y Miles 2004).
La preparación del inóculo es un proceso que debe realizarse bajo condiciones asépticas.
Este paso es crítico para el cultivo de hongos ya que un micelio viejo, degenerado, no apto
genéticamente para producir cuerpos de reproducción o contaminado microbiológicamente,
afectará directamente el rendimiento del cultivo (Chang y Miles 2004).
21
CAPÍTULO 2
Figura 6: Esquema de las técnicas y los pasos generales del cultivo de hongos (Stamets
y Chilton 1983).
2.1.3 Preparación del sustrato
Al ser heterótrofos, los hongos deben satisfacer todos sus requerimientos nutritivos
desde el sustrato, a diferencia de las plantas que pueden sintetizar compuestos orgánicos a
través de la fotosíntesis. Es por ello que la preparación del sustrato juega un rol más exhaus-
tivo en la producción de hongos, que el del suelo en el crecimiento de las plantas superiores.
El sustrato para el crecimiento de hongos debe ser apropiado tanto química como física-
mente, como también tener un contenido microbiano apropiado. Su composición química
22
CAPÍTULO 2
debe satisfacer las necesidades nutricionales del hongo y no poseer sustancias que inhiban su
desarrollo. Por lo general, los hongos solo requieren una fuente de carbono, una fuente de
nitrógeno, algunos minerales y vitaminas, y agua. La relación C:N es importante para el cre-
cimiento del hongo y depende de cada especie. Las fuentes de carbono y nitrógeno suelen
estar disponibles en el sustrato en forma de lignina, celulosa, hemicelulosa y proteínas. Como
se indicó anteriormente, los hongos de la pudrición blanca, como Ganoderma lucidum, poseen
una batería enzimática que les permite crecer directamente en el sustrato lignocelulósico sin
la necesidad de realizar un procedimiento de compostaje previo. Al sustrato lignocelulósico
básico se le pueden agregar suplementos nutricionales (por ejemplo, distintos tipos de gra-
nos) que aporten proteínas, carbohidratos, vitaminas y minerales (Stamets y Chilton 1983).
También debe controlarse el pH con el agregado de sustancias que actúan como buffers,
como el carbonato de calcio (CaCO3).
Desde el punto de vista físico, el sustrato debe tener una adecuada capacidad de reten-
ción de agua y su estructura debe permitir una buena aireación en toda su masa. Esto se logra
controlando el tamaño de partícula y con el agregado de yeso (SO4Ca), que ayuda a mantener
a las partículas separadas y aireadas.
La microbiota presente en el sustrato no debe competir con el crecimiento del hongo,

y por lo general se requieren procesos de pasteurización. La pasteurización reduce la carga
microbiana original que pueda interferir con el desarrollo normal del hongo y por lo tanto
tiene un efecto directo sobre el rendimiento final del cultivo.
El cultivo de hongos es el único proceso biotecnológico de gran escala que utiliza crea-
tivamente materiales lignocelulósicos (Stamets 1993). Todos los hongos de la pudrición
blanca son degradadores de lignocelulosa y pueden utilizar madera como sustrato para el
crecimiento miceliar o la producción de carpóforos (Smith et al. 2002). El método histórico
de cultivo, que aún se practica principalmente en Asia o en producciones a baja escala, es
directamente sobre troncos de madera dura. Este método, que se realiza al aire libre, produce
hongos de buena calidad. Sin embargo, requiere condiciones climáticas apropiadas y al pro-
ducir bajos rendimientos no es económicamente adecuado.
Actualmente la mayor parte de la producción a gran escala de hongos comestibles y

medicinales se realiza sobre una gran diversidad de sustratos, muchos de ellos residuos
agroindustriales con alto contenido lignocelulósico, empacados en bolsas de polipropileno
para formar “troncos sintéticos”. Estos “troncos sintéticos” son en esencia biorreactores
23
CAPÍTULO 2
formados por las tres fases requeridas por el hongo: (1) una fase sólida con el material ligno-
celulósico y el resto de los nutrientes, (2) una fase acuosa íntimamente asociada con la fase
sólida y (3) una fase gaseosa continua con el ambiente externo (Smith et al. 2002).
2.1.4 Pasteurización del sustrato
La elaboración del sustrato para el cultivo de hongos comestibles y medicinales, es uno

de los desafíos más importantes en la producción de los mismos. El desarrollo de microor-
ganismos contaminantes competidores durante la etapa de corrida y fructificación del micelio
puede generar problemas en los rendimientos. Además hay que tener en cuenta su influencia
en la calidad sanitaria de un producto destinado al consumo humano. La pasteurización es
un proceso simple, de fácil acceso para la mayoría de los productores, mediante el cual se
trata de dar ventaja en la colonización del sustrato al micelio del hongo a cultivar. Sin em-
bargo, los procedimientos se replican sin tener en cuenta los sustratos y aditivos, que podrían
afectar el resultado de dicho tratamiento térmico.
2.1.5 Incubación o corrida del micelio
La corrida del micelio (o corrida del “spawn”) es la fase en la que el micelio crece desde
el inóculo hacia el sustrato. Durante esta etapa se debe mantener la temperatura y humedad
adecuada para la especie particular que se esté cultivando. Es importante controlar la tempe-
ratura del sustrato ya que en esta etapa el micelio produce calor. Temperaturas demasiado
altas pueden inhibir o incluso matar al micelio. Para disminuir el riesgo de la termogénesis,
la disposición de las bolsas en la sala de corrida de micelio debe ser tal que permita un ade-
cuado flujo del aire.
Durante la fase vegetativa de incubación el crecimiento ocurre enteramente dentro del

ambiente de la bolsa de plástico cerrada, donde el dióxido de carbono (CO 2) y otros gases
existen en condiciones de concentración relativamente altas. Pese a la presencia de pequeños
orificios en las bolsas que permiten una lenta difusión de gases, en el centro de las bolsas se
pueden alcanzar concentraciones de dióxido de carbono que exceden el 2% (Stamets 1993).
La recirculación de aire dentro de la sala es necesaria para evitar la formación de bolsones de
CO2 (tiende a acumularse junto al piso) y mantener una temperatura uniforme.
Las condiciones de corrida del micelio deben favorecer una rápida colonización del sus-
trato, de lo contrario pueden establecerse organismos competidores (Stamets y Chilton
24
CAPÍTULO 2
1983). Una vez que se completa la colonización del sustrato debe inducirse la fructificación
y pasar a la siguiente etapa.
2.1.6 Desarrollo de los cuerpos de fructificación
Una vez completa la colonización del sustrato, la bolsa se traslada a la “sala de fructifi-
cación”, se abre por un extremo y los niveles de concentración de dióxido de carbono se
emparejan con el del ambiente (en torno al 0,035%). El cambio brusco de concentración de
dióxido de carbono es uno de los estímulos para la formación de primordios. Estos son el
primer estadio de diferenciación micelial que finalmente se desarrollarán en carpóforos.
Las condiciones ambientales de la sala de fructificación deben mantenerse en el rango

óptimo ya que juegan un rol crucial en la formación del primordio y la producción de los
cuerpos de fructificación. Las condiciones ambientales apropiadas, por lo general son dife-
rentes de las condiciones de incubación y deber ser empíricamente determinadas para cada
especie (Kües y Liu 2000).
La aparición de los cuerpos de reproducción se produce comúnmente en ciclos rítmicos

que se conocen como “oleadas”. El estado de maduración al momento de la cosecha y el
método de cosecha varía con la especie.
2.1.7 Cultivo de Ganoderma lucidum
Ganoderma lucidum es difícil de encontrar en estado natural y por lo tanto la cantidad de

hongo silvestre no es suficiente para su explotación comercial (Sanodiya et al. 2009). Enton-
ces su cultivo en sustratos sintéticos sólidos es esencial para abastecer la demanda creciente
de los mercados internacionales. El cultivo artificial de G. lucidum se logró por primera vez a
principios de la década de 1970 y, desde 1980 particularmente en China, la producción de G.
lucidum se ha desarrollado rápidamente (Chang y Miles 2004; Zhou et al. 2012).
Su cultivo es más complejo que el de otras especies comerciales. El desarrollo del basi-
diocarpo requiere condiciones ambientales estables. El control de la temperatura y la hume-
dad es crítico; la desecación de la superficie de crecimiento o una temperatura fuera del rango
adecuado interrumpe el crecimiento del basidiocarpo. En la Tabla 1 se detallan las condicio-
nes ambientales óptimas para cada una de las principales fases del desarrollo de un cultivo
de G. lucidum.
25
CAPÍTULO 2
Tabla 1: Condiciones ambientales requeridas en distintos estadios del cultivo de Gano-

derma lucidum (Stamets 1993; Zhou et al. 2012; datos propios).
Corrida del Iniciación del pri- Desarrollo del

micelio mordio carpóforo
Temperatura 25-30 ºC 18-25 ºC 24-28 ºC
Humedad del sustrato 60-65% 60-65% 60-65%
Humedad del ambiente 60-70% 85-90% 85-95%
Niveles de CO2 Hasta 50.000 2.000-5.000 ppm <2.000 ppm

ppm 20.000-40.000 ppm
(formas de “cuer-
nos de ciervo”)
Luz Oscuridad 500 a 1.000 lx 1.000 a 3.000 lx

(fotoperiodo de 12 (fotoperiodo de
hs.) 12 hs.)
Por otro lado, G. lucidum puede crecer en sustratos sintéticos hechos de una variedad de
residuos agroindustriales. De hecho varios residuos ricos en lignocelulosa han sido reporta-
dos en formulaciones de sustrato exitosas, tal como se resume en la Tabla 2.
Tabla 2: Diferentes sustratos utilizados para la fermentación en estado sólido de Gano-

derma lucidum.
Sustrato E.B. Notas Autor
Paja de arroz 15,3±3,8% Ensayo a escala piloto. Ci- (Postemsky et al.

clo de cultivo en dos olea- 2014)
das; 55 a 65 días. Sustrato
enriquecido con aceite de
oliva 1%. Inóculo: 8%.
Paja de arroz + Salvado de 27,5% - (Jandaik et al. 2013)

trigo
Aserrín de café : Café mo- 24,2±9,2% Dos oleadas. Azúcar: 1%; (Jaramillo 2010)
lido usado : Salvado de maíz Carbonato de calcio: 1%;
Yeso:1%.
26
CAPÍTULO 2
Sustrato E.B. Notas Autor
: Cascarilla de algodón
(35:35:10:17)
Aserrín : Residuos de Té 34,9% Ciclo de cultivo de una o (Peksen y

(80:20) dos oleadas: 90 días. Hu- Yakupoglu 2008)
medad del basidiocarpo:
77%
Aserrín de álamo : Salvado 20,8% Ciclo de cultivo en tres (Erkel 2009a)

de trigo (80:20) oleadas: 72 días.
Aserrín de roble : Salvado de 20,7% Ciclo de cultivo en tres (Erkel 2009a)

maíz (80:20) oleadas: 72 días.
Aserrín de álamo : Salvado 20,4% Ciclo de cultivo en dos (Erkel 2009b)

de trigo (80:20) oleadas: 57 días. Sustrato
enriquecido con melaza de
maíz 1%.
Aserrín de álamo : Salvado 18,7% - (Azizi et al. 2012)

de trigo : Extracto de malta
(85:10:5)
Aserrín de Acacia : Cáscara 6,2% Otros componentes: azú- (Changhai et al.

de semilla de algodón : Sal- car 1%, yeso 1%, carbo- 2013)
vado de trigo : Polvo de nato de calcio 1%, fosfato
maíz (35:35:20:6) dipostásico 1%.
Residuo de caña de azúcar 12,9% - (Lakshmi 2013)
Médula de coco : residuos 4,6% - (Lakshmi 2013)

de pesca (1:1)
Aserrín de Alnus nepalensis 15,7% Ciclo de cultivo en una (Gurung et al. 2013)
oleada: 60 días.
Tallo de maíz (44%), vaina 8,2±1,4% Con salvado de trigo y (Bernabé-González

de frijol (22%), pulpa de 69% humedad. et al. 2015)
café (11%). Ciclo de cultivo en una
oleada: 72 días.
Aserrín de Mango + Sal- 58,6% Una oleada. (Mehta et al. 2014)

vado de trigo (20%)
E.B.: Eficiencia Biológica. [kg de carpóforo fresco / kg de sustrato seco] x 100%
La cáscara de semilla de girasol (CSG) constituye un producto residual abundante y ba-

rato de la industria del aceite de girasol. En 1999 se produjeron en el mundo más de 14
millones de toneladas de CSG (Chang y Miles 2004). La deposición de grandes cantidades de
27
CAPÍTULO 2
este residuo agro-industrial presenta un problema para el ambiente porque se degrada muy
lentamente en el suelo y usualmente se quema a campo abierto. Estudios previos han mos-
trado que la CSG puede ser usada como el principal componente en la formulación de un
sustrato para cultivar hongos en troncos sintéticos, con buenos rendimientos. En la Tabla 3
se resumen algunos de estos ensayos.
Tabla 3: Especies de hongos comestibles cultivados en cáscara de semilla de girasol y

rendimientos.
Especie EB MP Notas Autor
Pleurotus ostreatus 60 – 112% 23 – 45% Ciclo de cultivo en (Curvetto et al.

dos oleadas. Sustrato 2002b)
enriquecido con N-
NH4+ y/o Mn(II).
Lentinula edodes 102 – 41 – 47% Ciclo de cultivo en (Curvetto et al.

112% dos oleadas. 2002a)
Ganoderma lucidum 8,8% 3,5% Ciclo de cultivo en (Gonzalez Matute

una oleada: 25 días. et al. 2002)

Con 5% salvado de
trigo.

Con 5% extracto de
malta
Ganoderma lucidum 23,2% - Dos oleadas en 79 (Gonzalez Matute

días. Con 5% cebada y et al. 2011)
100 ppm Cu (II).
E.B.: Eficiencia Biológica. [kg de carpóforo fresco / kg de sustrato seco] x 100%; Pr.H.: Pro-
ducción de hongos. [kg de carpóforo seco / kg de sustrato seco] x 100%
2.1.8 Optimización del cultivo de Ganoderma lucidum
Usualmente, Ganoderma lucidum produce rendimientos relativamente bajos comparado

con otros hongos comestibles cultivables (Tabla 3). Esto, junto con el alto valor de este
hongo en el mercado internacional y la posibilidad de usar los basidiocarpos como una fuente
28
CAPÍTULO 2
de compuestos bioactivos, hace que cualquier mejora en los rendimientos de cultivo sea una
propuesta interesante con impacto económico.
La formación del cuerpo de fructificación está muy influenciada por las condiciones
fisiológicas y el estado nutricional del micelio (Kües y Liu 2000). Es por ello, que un incre-
mento en la producción de hongo en términos de rendimientos de cultivo puede ser alcan-
zado por el agregado de aditivos y suplementos para mejorar la calidad nutricional de un
sustrato dado. Los aceites vegetales y fracciones particulares de sus ácidos grasos han mos-
trado poseer propiedades de estimulación de crecimiento en cultivos líquidos de Grifola fron-
dosa, Cordyceps militaris y G. lucidum (Yang et al. 2000; Park et al. 2002; Hsieh et al. 2008). Tam-
bién, los aceites vegetales y ácidos grasos han demostrado estimular los rendimientos de cul-
tivo de Agaricus bisporus y Tricholoma matsutake en sistemas de fermentación en estado sólido
(Schisler 1967; Guerin-Laguette et al. 2003).
Por otro lado, estudios previos llevados a cabo en nuestro laboratorio sobre la habilidad
de G. lucidum para acumular Cu o Zn en los basidiomas mostraron un efecto estimulatorio
en el rendimiento de cultivo cuando Cu (II) estaba incluido en la formulación del sustrato.
También Tang y Zhu (2010) observaron un crecimiento en la biomasa cuando agregaron Cu
(II) a un cultivo líquido sumergido. El cobre es un interesante elemento traza, que es esencial
para el crecimiento normal en concentraciones en torno a 10-7 y 10-6 M. Mayores concentra-
ciones pueden ser tóxicas (Chang y Miles 2004).
La información disponible sobre el efecto de los aceites vegetales y cobre sobre el cre-
cimiento y el rendimiento de G. lucidum en sistemas de fermentación en estado sólido es
limitada. Por lo tanto, en este capítulo se estudia el crecimiento del micelio de G. lucidum
frente a distintas concentraciones de aceites vegetales en un medio semisólido en caja de
Petri, y en un sistema de crecimiento lineal usando cáscara de girasol como sustrato. También
se evalúan estos aceites, con y sin el agregado de Cu (II), sobre distintos parámetros de ren-
dimiento en un sistema de cultivo a escala piloto, utilizando cáscara de girasol como sustrato
base. Paralelamente, y dada su importancia en el éxito de un procedimiento de cultivo, se
analiza la eficacia de un sistema de pasteurización en la reducción de la carga microbiológica
del sustrato.
29
CAPÍTULO 2
2.1.9 Objetivos
1. Estudiar el efecto de aceites vegetales y Cu (II) sobre el crecimiento de G. lucidum y

evaluar dichos aditivos en los rendimientos del hongo en un sustrato base de cáscara
de girasol, a fin de proponer procedimientos de cultivo de mayor rentabilidad.
2. Analizar el efecto de un tratamiento de pasteurización a escala piloto descripto por
Curvetto et al. (1997) en la calidad microbiológica de un sustrato a base de cáscara
de girasol con y sin el agregado de aceite de oliva y cobre. Si bien este sistema ha
sido propuesto y utilizado por el grupo desde hace varios años, no existían aun datos
microbiológicos de dicho proceso.
2.2 MATERIALES Y MÉTODOS

2.2.1 Cepa de Ganoderma lucidum
Para todos los ensayos de esta tesis se utilizó la cepa de Ganoderma lucidum E47 (Univer-
sidad de Guelph, Guelph, Ontario, Canadá). La cepa se cultivó en un medio MEA (ver Anexo
II) a 25 ºC en oscuridad.
2.2.2 Aceites vegetales evaluados como aditivos del sustrato
Los aceites vegetales evaluados fueron aceite de girasol (Molinos, Argentina), aceite de
cártamo (disponible a granel en dietéticas) y aceite de oliva (Natura; Aceitera General Deheza,
Argentina).
2.2.3 Biomasa y crecimiento radial en placa
Para estudiar el efecto de los aceites vegetales en la biomasa y crecimiento radial miceliar
de G. lucidum se utilizó un medio MEA adicionado con el aceite vegetal en estudio a distintas
concentraciones (0%, 0,1%, 0,25%, 0,5% y 0,75% para aceite de girasol y de cártamo; 0%,
0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75%, 1,0% y 1,5% para aceite de oliva). Porciones de micelio de 6.5
mm de diámetro de un cultivo stock se inocularon en el centro de placas de Petri con medio
MEA previamente esterilizado a 121 ºC durante 15 minutos. Luego de incubar los cultivos a
25 ºC en oscuridad por 5 o 7 días, se midió el diámetro, se estimó la biomasa, y se calculó la
densidad superficial miceliar.
La biomasa miceliar se estimó de acuerdo a Sánchez y Viniegra-Gonzaléz (1996). Se

fundió el medio agar sólido que contenía el micelio durante 1 minuto en un horno microon-
das (BGH, Mod. 16600, 1250 watts). Después el micelio fue removido suavemente con la
30
CAPÍTULO 2
ayuda de unas pinzas y lavado en agua destilada. El exceso de líquido fue extraído con papel
tisú y el micelio se secó en estufa a 60 ºC hasta alcanzar un peso constante.
El diámetro de la colonia (n=7) se midió a los 5 y 7 días. La biomasa y la densidad

superficial (n=5) se determinaron a los 7 días de crecimiento. En el caso del aceite de oliva,
debido a un crecimiento más rápido de la colonia, el diámetro (n=15), la biomasa (n=11) y
la densidad superficial (n=11) se determinaron a los 5 días de cultivo. En todos los casos los
aceites fueron agregados al medio MEA durante la preparación del medio. Para lograr una
distribución homogénea del aceite en el medio se emulsificó con 0,5% de gelatina y agitación
vigorosa durante 1 minuto. Este procedimiento también se realizó en los tratamientos con-
trol sin aceite.
2.2.4 Test de crecimiento lineal
Se evaluó el crecimiento miceliar en los sustratos enriquecidos con diferentes concen-

traciones de aceites vegetales utilizando el test de crecimiento lineal de Duncan (1997). Este
tipo de ensayo está orientado a evaluar el comportamiento en el sustrato de cultivo, pero
manteniendo las dimensiones de un ensayo de laboratorio. Cada sustrato (10 g), se empacó
a una densidad aproximada de 0,5 g/mL en tubos de vidrio (20 cm de largo por 16 mm de
ancho). Se realizaron 10 réplicas por tratamiento. Los tubos se cerraron por ambos extremos
con tapones de algodón, y se esterilizaron en autoclave a 121 ºC durante 60 minutos.
El sustrato en los tubos fue inoculado bajo condiciones asépticas por uno de los extre-
mos con discos de agar de 16 mm que contenían el micelio del hongo en crecimiento activo,
cultivado en medio MEA durante 7 días. Los tubos se incubaron en una estufa de cultivo a
25 ºC, 80% de humedad relativa y oscuridad, durante 12 días. Al finalizar la incubación se
midió la extensión del micelio a lo largo del tubo.
La formulación del sustrato consistió en 32,5% cáscara de girasol (provista por un pro-
ductor local de aceite de girasol), 5% cebada perlada (Hordeum vulgare, comercialmente dispo-
nible), 2% SO4Ca, 0,5% Ca2CO y 60% agua. Los aceites vegetales se agregaron durante la
preparación del sustrato. Para asegurar una distribución homogénea del aceite se emulsionó
con 0,5% de gelatina y agitación vigorosa durante 1 minuto en agua, previo al agregado al
medio. El mismo procedimiento se realizó en los tratamientos sin aceite. Se determinó el pH
del medio antes y después de la esterilización. Para determinar el pH se suspendieron 5 gra-
mos del sustrato en 100 mL de agua destilada y se agitó vigorosamente durante 5 minutos.
31
CAPÍTULO 2
Luego se dejó reposar la mezcla durante cinco minutos y se midió el pH de la porción líquida
con un pHmetro (LT Lutron 207).
En un primer ensayo se estudiaron distintas concentraciones de los aceites vegetales

(0%, 0,1%, 0,25%, 0,5% y 0,75%). De acuerdo a los resultados obtenidos en el primer ensayo,
se realizó un segundo ensayo con distintas concentraciones de aceite de oliva (0%, 0,5%,
0,75%, 1,0% y 1,5%). Al finalizar la incubación se midió la extensión lineal del micelio.
2.2.4.1 Determinación de proteínas en el sustrato
Cuando el micelio de Ganoderma lucidum crece las hifas se unen íntimamente con el sus-
trato por lo que no es posible realizar una determinación directa de la biomasa. En estos
casos el contenido de proteína soluble puede considerarse como una medida indirecta
(Córdova-López et al. 1996; Raimbault 1998). Con el fin de estimar el crecimiento de la bio-
masa miceliar, se analizó el incremento del contenido de proteína soluble en los sustratos
colonizados con respecto al sustrato sin inocular.
Se retiró el sustrato colonizado de los tubos del primer ensayo de crecimiento lineal y
las muestras se reunieron en un pool separado por tratamiento. Para la extracción de proteí-
nas solubles se tomaron alícuotas de la muestra por triplicado (3,0 gramos, peso fresco), se
dispersaron en 15 mL de un buffer fosfato 0,05 M (pH 7,0) y se homogeneizó en mortero
durante 2 minutos. A continuación se centrifugó (10 min, 1.400 g, centrífuga ROLCO mod.
2036) y se determinó el contenido de proteínas solubles.
El contenido de proteínas solubles en los extractos se determinó mediante el test de

Bradford utilizando sero albúmina bovina (BSA; cod. 05470; Sigma) como estándar
(Bradford 1976). Alícuotas de 0,3 mL del extracto se mezclaron con 2 mL del reactivo de
Bradford. Se dejó transcurrir la reacción durante 5 minutos y se leyó la absorbancia a 595 nm
en un espectrofotómetro (Genesys 20, Thermo Scientific). Los resultados se expresaron en
contenido de proteína por gramo de sustrato colonizado seco (µg eq. BSA/g). Las determi-
naciones se realizaron por triplicado.
2.2.5 Producción de inóculo
El inóculo (spawn) se preparó de acuerdo a Curvetto et al. (2004). Se llenaron botellas

de un litro con 59,1% de grano de trigo (Triticum durum, disponible comercialmente), 0,1%
CaCO3, 0,8% CaSO4 y 40% agua por peso. Las botellas se esterilizaron en autoclave a 1 atm
32
CAPÍTULO 2
por 90 minutos y se inocularon con micelio previamente cultivado en medio MEA. La incu-
bación se realizó a 25 ºC en la oscuridad por 10-15 días; las botellas se agitaron periódica-
mente para minimizar el aglutinamiento de los granos y permitir una mejor colonización.
2.2.6 Instalaciones para el cultivo de hongos del CERZOS (CONICET-UNS)
Los ensayos de cultivo de Ganoderma lucidum se realizaron a escala piloto en la nave de

cultivo de hongos (Figura 7) perteneciente al Laboratorio de Biotecnología de Hongos Co-
mestibles y Medicinales del CERZOS (CONICET-UNS). Esta nave de cultivo cuenta con
una superficie de 200 m2 destinada a la pasteurización del sustrato, corrida del micelio del
hongo y fructificación. La sala de incubación cuenta con dos estufas eléctricas tipo radiador
con termostato, y sistema extractor de aire. La sala de fructificación posee humidificación
por bruma con sistema ventilador de alta presión y control de encendido automático (Figura
8), tubos fluorescentes de luz blanca con temporizador de encendido/apagado y sistema de
distribución de aire con filtros HEPA (Figura 9) y un cañón calefactor a gas de 25.000 kcal
con termostato (Figura 10).
Figura 7: Vista exterior de la nave de cultivo de hongos.
33
CAPÍTULO 2
Figura 8: Sistema humidificador de alta presión por bruma.
Figura 9: Sistema de distribución de aire filtrado.
Figura 10: Sistema de suministro de aire caliente mediante cañón calefactor.
34
CAPÍTULO 2
2.2.7 Preparación del sustrato, inoculación y sistema de bolsas
El sustrato para el cultivo de Ganoderma lucidum se formuló de la siguiente manera: 32,5%

cáscara de girasol, 5% cebada perlada, 2% SO4Ca, 0,5% Ca2CO y 60% agua. A partir de los
resultados obtenidos en los ensayos de crecimiento en placa y de crecimiento lineal, se eva-
luaron los efectos de la aditivación del sustrato base (control) con 1,5% de aceite de oliva
con o sin el agregado de cobre (II) (60 ppm). Los aditivos a estudiar (aceites de oliva y cobre)
se añadieron en el agua. La distribución uniforme del aceite se logró mediante la obtención
de una emulsión con el agregado de gelatina al 0,5% y agitación vigorosa. En el caso de los
controles se realizó el mismo procedimiento sin agregar el aceite.
La descontaminación de los sustratos se realizó en un sistema de descontaminación pre-

parado ad hoc (Curvetto et al. 1997). El sistema está compuesto por una hormigonera aco-
plada a un mechero y una tapa metálica (Figura 11). El sustrato (37 kg) se calentó a 80 ºC
durante 3 horas con el tambor rotando alternativamente por 15 minutos y detenido por 15
minutos. Luego se dejó enfriar el sustrato por debajo de los 38 ºC y se agregó el inóculo en
una proporción del 8% (p/p) mezclando por rotación del tambor durante 15 minutos. La
alta tasa de inoculación permite disminuir el riesgo de contaminación durante la fase de co-
rrida de micelio, además de incrementar el rendimiento del cultivo (Postemsky et al. 2014).
Figura 11: Equipo para decontaminación de sustrato.
35
CAPÍTULO 2
Se llenaron bolsas de polietileno (100 micras, 39,5 x 13,5 cm) con 0,8 – 0,9 kg de sustrato
y se empacó hasta una densidad de 0,5 g/mL, bajo condiciones asépticas (Figura 12). Se
cerró el extremo abierto de cada bolsa con un precinto de plástico y para permitir el inter-
cambio de gases las bolsas se agujerearon uniformemente con un instrumento ad-hoc (ca. 4
agujeros por cm2). Cada tratamiento incluyó al menos 40 unidades experimentales (troncos
sintéticos).
Todos los aditivos estudiados (aceites de oliva y cobre) fueron agregados antes de la
descontaminación del sustrato.
Figura 12: Preparación del "tronco sintético" en bolsas de polietileno.
2.2.8 Evaluación microbiológica del sustrato antes y después del tratamiento tér-
mico
Para evaluar el comportamiento del sistema de pasteurización descripto previamente

(ver sección 2.2.7) frente a las distintas composiciones de sustrato y su efecto sobre distintos
grupos microbianos, se realizó el seguimiento durante un ciclo completo de pasteurización.
Dicho seguimiento consistió en el control de temperaturas cada media hora y en la toma de
muestras para el análisis microbiológico, cada hora (0, 1, 2 y 3 horas de tratamiento). En cada
36
CAPÍTULO 2
muestreo se cuantificaron los siguientes grupos de microorganismos: heterótrofos mesófilos

aerobios y anaerobios facultativos, coliformes totales (CT), Escherichia coli, bacterias esporó-
genas aerobias (AE), clostridios sulfito reductores (CSR), enterococos, hongos microfilamen-
tosos y levaduras. El muestreo consintió en tomar 4 sub-muestras del sustrato con cuchara
estéril (aprox. 2 g), de distintas regiones de la hormigonera (adelante, atrás, costado, profun-
didad). Las 4 sub-muestras se integraron en un recipiente de aluminio estéril para conformar
la muestra total de la hormigonera y se mantuvieron refrigeradas hasta su procesamiento,
dentro de las 12 horas de colectadas. El análisis se realizó para los sustratos con o sin aditivos
descriptos en la sección 2.2.7.
En el laboratorio cada muestra fue mezclada y se procedió al cuarteo hasta obtener una
muestra de 3 g (peso húmedo) la cual se suspendió en un frasco con 27 ml de agua peptonada
estéril (1% peptona de carne, 0,5 % NaCl, Britania, Argentina) y perlas de vidrio. Este dilu-
yente es recomendado en lugar de solución fisiológica para recuperar células dañadas por
procesos fisicoquímicos, tales como un tratamiento térmico. El frasco se colocó en agitador
orbital a 500 rpm durante 5 minutos y se dejó reposar durante 30 segundos, y luego se tomó
una alícuota y se realizaron diluciones decimales en solución fisiológica y se sembraron los
medios correspondientes. La muestra restante fue destinada a la determinación de peso seco
del sustrato. Para determinar el peso seco del sustrato se colocó la muestra en una estufa a
60 ºC durante al menos 24 horas, hasta alcanzar un peso constante.
Todos los recuentos se expresaron como Unidades Formadoras de Colonias por gramo
de sustrato seco (UFC/g seco).
2.2.8.1 Recuento de bacterias heterótrofas aerobias y anaerobias facultativos mesófilas totales
Se utilizó la técnica de agar volcado. Un mililitro de la muestra o de sus diluciones deci-

males fue transferido a una placa Petri estéril, luego se volcaron 20 ml de Plata Count Agar
(PCA, Merck, Alemania), fundido y enfriado a 45 °C. Las placas se incubaron a 30 °C durante
72 horas. Se contaron todas las colonias.
2.2.8.2 Recuento de bacterias coliformes totales y Escherichia coli
Se procedió igual que en 2.2.8.1 pero en este caso se utilizó el Chromobrit® agar (Bri-
tania, Argentina. Las placas se incubaron 36 horas a 37 °C. Luego de la incubación, las colo-
nias con centro rosado-rojizo, debido a la ruptura del sustrato magenta-Gal por la acción de
la ß galactosidasa, fueron reportadas como coliformes totales. Las colonias color azul o azul
37
CAPÍTULO 2
oscuro a violeta en el centro, producido por la ruptura del X-glucurónido a partir de la ß-D
glucuronidasa, y verificadas como indol positivo, se contaron como E. coli.
2.2.8.3 Enterococos
Este grupo se cuantificó por siembra en superficie en el medio KF streptococcus agar

(Merck-Millipore) con la adicción de 2,3,5-trifenil tetrazolio cloruro (TTC). Las placas se
incubaron a 37 °C durante 48 horas. Se contaron las colonias rojas por la reducción del TTC,
produciendo un formazán rojo y rodeadas de un halo amarillo por la producción de ácido.
2.2.8.4 Recuento de mohos y levaduras
Este grupo se cuantificó por siembra en superficie en Agar Papa Dextrosa (PDA, Brita-
nia, Argentina), cuyo pH se ajustó a 3,5 con una solución estéril de ácido cítrico. Las placas
se incubaron a 25 °C durante 5 días. Las colonias algodonosas fueron registradas como
mohos y las cremosas como levaduras.
2.2.8.5 Recuento de bacterias aerobias esporógenas (AE) y clostridios sulfito reductores (CSR)
Una vez que se sembraron los medios para los grupos anteriores, la suspensión de sus-
trato se sometió a 80 °C durante 10 minutos, para seleccionar las endosporas. Luego se rea-
lizaron diluciones decimales y con las mismas se sembraron placas con medio PCA, para AE
y Agar SPS (Agar Sulfito-Polimixina-Sulfadiacina) para CSR. Las placas de PCA se incubaron
a 30 °C durante 72 horas y las placas SPS se incubaron en jarra de anaerobiosis con genera-
dores de anaerobiosis (GENbag, Biomerieux) a 30 °C durante 5 días. Luego se contaron
todas las colonias obtenidas en PCA y en el medio SPS, se contaron las colonias negras,
debido a la reducción el sulfito a sulfuro que reacciona con el hierro para dar FeS.
2.2.9 Corrida del micelio, cosecha y rendimiento del cultivo
Una vez preparados los troncos sintéticos se colocaron horizontalmente en estantes y

fueron incubados a 22 - 26 ºC en oscuridad, hasta que el sustrato estuvo completamente
colonizado y aparecieron los primeros signos de metabolitos secundarios (exudados amari-
llos, anaranjados y amarronados). En ese momento se movieron los troncos sintéticos a la
sala de fructificación y se removieron los precintos plásticos para exponer el micelio maduro
a las siguientes condiciones ambientales: 80-100% HR, 25-30 ºC, fotoperiodo de 12 horas
(irradiación con luz fluorescente blanca, 100-500 lux), y ventilación de aire adecuada. La Fi-
gura 13 muestras distinas etapas de un cultivo de G. lucidum.
38
CAPÍTULO 2
Para evitar la saturación del ambiente con gran cantidad de esporas, los hongos fueron
cosechados cuando el borde amarillento más claro, en la zona activa de crecimiento, se redujo
a menos de 1 cm, justo antes de completar la maduración del basidiocarpo y la máxima libe-
ración de esporas
Los basidiocarpos se cosecharon con la ayuda de un escalpelo. Luego de la cosecha de

la primera y segunda oleada, se movieron los troncos sintéticos a otra sección dentro de la
sala de fructificación, para segregarlos de los troncos sintéticos que aún no habían sido cose-
chados.
(A) Tronco sintético recién preparado; (B) Colonización del sustrato completa, con aparición de los
primeros exudados; (C) Apertura del extremo de la bolsa para inducir a la fructificación; (D) Forma-
ción de los primordios; (E) Basidiomas en fase de crecimiento. La barra de escala representa 10 cm.
Figura 13: Evolución de un cultivo de Ganoderma lucidum.
Para cada unidad experimental (tronco sintético) se obtuvo el tiempo de corrida del mi-
celio en días (DCM) y el tiempo de cada oleada en días desde la inoculación (D1ºF, D2ºF, D3ºF).
39
CAPÍTULO 2
El rendimiento de cultivo fue expresado como la eficiencia biológica [(kg. de hongo

fresco/kg de sustrato seco) x 100%] de cada oleada (EB1°F, EB2°F, EB3°F) y eficiencia biológica
acumulada. Como los basidiocarpos de G. lucidum se comercializan secos, también se calcu-
laron los parámetros de rendimiento en base seca. La producción de hongo para cada oleada
(MP1ºF, MP2ºF, MP3ºF) y la producción total de hongo se calcularon como la eficiencia bioló-
gica pero considerando el peso seco de los hongos en vez del peso fresco. También se obtu-
vieron los porcentajes de unidades experimentales que mostraban basidiocarpos en cada
oleada (%1°F, %2°F, %3°F).
2.2.10 Procesamiento post-cosecha
Inmediatamente luego de cosechar se tomó el peso fresco del basidiocarpo y se cortó

en trozos longitudinales. El basidiocarpo troceado se colocó en bolsitas de tela de red ad hoc
individualizadas, que permiten el flujo de aire caliente en su interior. Las bolsas con el basi-
dioma en su interior fueron colocadas en una estufa a 60 ºC durante 48 horas. Luego de
tomar el peso seco, los basidiocarpos troceados y secos se reunieron por tratamiento en un
pool y se almacenaron herméticamente para análisis posteriores.
2.2.11 Actividad de lacasas en el sustrato residual
2.2.11.1 Extracción de lacasas
Las muestras se obtuvieron de las porciones medias de los troncos sintéticos (n = 16)
donde la actividad de las lacasas es mayor (Postemsky et al. 2014). La determinación se realizó
para los tratamientos del segundo ensayo de cultivo. Las muestras se mantuvieron a -18 ºC
hasta que se realizó la extracción de las lacasas. Se agregó agua destilada (30 mL) en tubos de
vidrio de fondo plano de 50 mL que contenían 3,0 g de sustrato de hongo residual fresco. La
mezcla se mortereó durante 0,5 minutos y se mantuvo a 4 ºC durante 24 horas. Otra porción
(10 g) de sustrato de hongo residual se utilizó para obtener el peso seco. Luego de 24 horas
de extracción la muestra se comprimió (5 kg/cm2) para obtener una alícuota de extracto de
enzima crudo, y su volumen fue medido. Los extractos fueron filtrados usando papel de filtro
(J. prolab tipo JP -3003-4) y se almacenó a -18 ºC hasta que la actividad de lacasas fue anali-
zada.
2.2.11.2 Determinación de la actividad de lacasas
La actividad de lacasas fue determinada por espectrofotometría usando siringaldazina

(S7896; Sigma). Se determinó el incremento de la absorbancia a 525 nm (ε525 = 65000
40
CAPÍTULO 2
M−1cm−1) como resultado de la oxidación del sustrato. La reacción enzimática se inició por
adición de 25 µl de una solución de siringaldazina en etanol (20 mmol/L) a 1 mL de extracto
(concentración final 0,5 mmol/L). Un extracto sin siringaldazina fue utilizado como blanco.
Las lecturas de absorbancia se obtuvieron a los 0,5, 1 y 2 minutos después de agregar sirin-
galdazina. Muestras de alícuotas de extracto calentadas a 100 ºC durante 10 minutos para
desnaturalizar proteínas también fueron incluidas como controles. La unidad de actividad de
lacasas se definió como la cantidad de enzima que oxida 1 µmol de siringaldazina por minuto.
La actividad de lacasas se expresó en base del peso seco del sustrato de hongo residual (uni-
dades por kilogramo de peso seco).
2.2.12 Análisis estadístico
Los datos de los ensayos de crecimiento miceliar y de producción de hongo fueron ana-
lizados por análisis de varianza de un factor (ANOVA). La separación de los valores medios
se realizó mediante el test de Tukey. Los análisis se efectuaron utilizando el software Infostat
(Di Rienzo J.A., Casanoves F., Balzarini M.G., Gonzalez L., Tablada M., Robledo C.W. In-
foStat versión 2016. Grupo InfoStat, FCA, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina.
URL http://www.infostat.com.ar)
2.3 RESULTADOS
2.3.1 Efecto de los aceites vegetales sobre el crecimiento radial del micelio
Las Tabla 4 y Tabla 5 resumen los efectos del agregado de distintas concentraciones
de aceite de girasol y aceite de cártamo sobre el micelio de Ganoderma lucidum en un cultivo
en medio MEA en placa de Petri. Con aceite de girasol, la biomasa fue significativamente
mayor (p < 0,05) para una concentración de aceite de 0,75%. Para un nivel de 0,10% de aceite
de girasol la superficie de la colonia fue significativamente mayor tanto para los días 5 y 7.
Dado que la biomasa no mostró cambios con respecto al control, la densidad superficial
miceliar fue menor, aunque no estadísticamente diferente del control. Para el rango de 0,1%-
0,75% de aceite de girasol no se observaron cambios significativos en la densidad del micelio
con respecto al control, pero si se observaron diferencias importantes y significativas entre
la densidad superficial miceliar observada a la mayor concentración (0,0070 g/cm2) y las me-
nores concentraciones de aceite (0,0035 y 0,0040 g/cm2 para 0,1% y 0,25%, respectiva-
mente).
41
CAPÍTULO 2
En el caso del aceite de cártamo no se observaron diferencias significativas (p > 0,05) en

el diámetro y la superficie de la colonia en el rango de concentraciones evaluado (0,1-0,75%).
Sin embargo, se observó un incremento de la biomasa y la densidad miceliar superficial para
las dos mayores concentraciones estudiadas.
Tabla 4: Superficie de la colonia de Ganoderma lucidum luego de 5 y 7 días de cultivo

en un medio MEA con diferentes concentraciones de aceite de girasol y aceite de cártamo.
Superficie (cm2)
Conc. % Aceite de Girasol Aceite de Cártamo
Día 5 Día 7 Día 5 Día 7
B B AB
0,00% 12,6 ± 2,8 32,9 ± 7,8 12,6 ± 2,8 32,9 ± 7,8AB
0,10% 26,1 ± 7,1A 51,7 ± 11A 13,9 ± 2,9AB 36,7 ± 6,4AB
0,25% 18,7 ± 3,5B 45,4 ± 7,6AB 8,5 ± 1,4B 27,1 ± 3,6B
0,50% 14,0 ± 3,8B 38,7 ± 8,5AB 12,2 ± 4,2AB 38,1 ± 6,4A
0,75% 19,3 ± 4,0AB 45,6 ± 8,1AB 14,4 ± 4,9A 39,2 ± 5,0A
Medias con una letra común en una misma columna no son significativamente diferentes (p >
0,05).
Tabla 5: Biomasa y densidad superficial de la colonia de Ganoderma lucidum luego de

7 días de cultivo en un medio MEA con diferentes concentraciones de aceite de girasol y
aceite de cártamo.
Aceite de Girasol Aceite de Cártamo

Conc. % 2
Biomasa (g) Densidad (g/cm ) Biomasa (g) Densidad (g/cm2)
0,00% 0,17 ± 0,03B 0,0052 ± 0,0008AB 0,17 ± 0,03CD 0,0052 ± 0,0008BC
0,10% 0,20 ± 0,02B 0,0035 ± 0,0003B 0,21 ± 0,03BC 0,0051 ± 0,0007BC
0,25% 0,17 ± 0,03B 0,0040 ± 0,0011B 0,12 ± 0,04D 0,0045 ± 0,0010C
0,50% 0,20 ± 0,02B 0,0050 ± 0,0011AB 0,29 ± 0,03AB 0,0070 ± 0,0010AB
0,75% 0,34 ± 0,06A 0,0070 ± 0,0019A 0,31 ± 0,07A 0,0077 ± 0,0020A
0,05).
La Figura 14 muestra el efecto del agregado de distintas concentraciones de aceite de

oliva sobre la superficie, la biomasa y la densidad superficial miceliar de G. lucidum. La adición
de aceite de oliva en concentraciones de 0,75% a 1,5% redujo la superficie de la colonia (p <
0,05) en el medio de agar hasta un 19% (en el nivel de concentración de 1,5%). Sin embargo,
para esa concentración de aceite de oliva la biomasa obtenida fue un 150% mayor que en el
control. La superficie miceliar superficial (g/cm2) se incrementó linealmente con la concen-
tración de aceite de oliva hasta la mayor concentración ensayada (y = 0,3096x +0,002; r2 =
0,9678).
42
CAPÍTULO 2
Medias con una letra común en un mismo gráfico no son significativamente diferentes (p > 0,05).
Figura 14: A) Diámetro, (B) superficie y (C) densidad miceliar superficial de una colonia
de Ganoderma lucidum en un cultivo en medio MEA de 5 días con distintas concentraciones
de aceite de oliva.
2.3.2 Efecto de los aceites vegetales sobre el crecimiento lineal del micelio
2.3.2.1 pH del sustrato antes y después del tratamiento térmico
Se observó un incremento de la acidez después del tratamiento térmico en las muestras

que contenían aceites vegetales, determinándose disminuciones de pH superiores a 0,3 uni-
dades para los niveles más altos de aceite (Figura 15).
43
CAPÍTULO 2
Figura 15: pH del sustrato a base de cáscara de girasol aditivado con diferentes concen-
traciones de aceite de oliva, antes y después de esterilizar por autoclave.
2.3.2.2 Evaluación del crecimiento lineal
Se evaluó el crecimiento lineal (cm) del micelio de G. lucidum en un sustrato a base de

CSG con diferentes concentraciones de aceite de girasol, aceite de cártamo y aceite de oliva
(Tabla 6). Con aceite de girasol no se observaron diferencias estadísticamente significativas
(p > 0,05) en el rango de concentraciones evaluado (0,1-0,75%). Sin embargo, para las ma-
yores concentraciones evaluadas de aceite de cártamo y de oliva (0,75%) se midió una dismi-
nución significativa (p < 0,05) de la extensión lineal del micelio con respecto al control.
Tabla 6: Crecimiento lineal del micelio de Ganoderma lucidum en 12 días en un medio

base de cáscara de girasol aditivado con diferentes concentraciones de aceites vegetales.
Crecimiento lineal (cm.)

Conc. % Aceite de Girasol Aceite de Cártamo Aceite de Oliva
A A
0,00% 9,0 ± 0,2 9,0 ± 0,2 9,0 ± 0,2A
0,10% 8,5 ± 0,2A 8,6 ± 0,1AB 9,0 ± 0,1A
A AB
0,25% 8,9 ± 0,1 8,6 ± 0,1 9,0 ± 0,2A
0,50% 8,7 ± 0,1A 8,5 ± 0,1AB 8,5 ± 0,2AB
0,75% 8,7 ± 0,2A 8,4 ± 0,1B 8,2 ± 0,2B
0,05).
44
CAPÍTULO 2
Se realizó un segundo ensayo de crecimiento lineal (Tabla 7) para evaluar concentracio-

nes crecientes de aceite de oliva (0,5-1,5%). También se observó una disminución significa-
tiva (p < 0,05) del crecimiento lineal miceliar en el sustrato para la mayor concentración de
aceite de oliva (1,5%).
Tabla 7: Crecimiento lineal del micelio de Ganoderma lucidum en 12 días en un medio

de cáscara de girasol aditivado con diferentes concentración de aceite de oliva.
Crecimiento lineal (cm.)

Conc. % Aceite de Oliva
0,00% 8,1 ± 0,3A
0,50% 8,1 ± 0,5A
0,75% 7,8 ± 0,5AB
1,00% 7,9 ± 0,4A
1,50% 7,4 ± 0,4B
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05).
2.3.2.3 Cuantificación de proteínas solubles en el sustrato colonizado
Dado que el micelio del hongo se une íntimamente con el sustrato no es posible deter-
minar directamente la biomasa. Sin embargo, puede estimarse indirectamente por medición
de algunos componentes o de la actividad específica del micelio (Raimbault 1998). En este
caso se midió el incremento de la proteína soluble en el sustrato colonizado, con respecto al
sustrato sin inocular. Los resultados se presentan en las Figuras 16, 17 y 18.
Figura 16: Incremento del contenido de proteína soluble por gramo de sustrato coloni-
zado con respecto al sustrato sin inocular. Efecto del aceite de girasol.
45
CAPÍTULO 2
zado con respecto al sustrato sin inocular. Efecto del aceite de cártamo.
zado con respecto al sustrato sin inocular. Efecto del aceite de oliva.
46
CAPÍTULO 2
Para el aceite de girasol se observó un incremento significativo (p < 0,05) en los niveles
de proteína soluble con respecto al control para las concentraciones 0,25% y 0,75%. También
se observó un incremento estadísticamente significativo con 0,75% de aceite de cártamo.
Todas las concentraciones ensayadas de aceite de oliva incrementaron los niveles de proteína
soluble, y este incremento fue dosis – dependiente.
2.3.3 Efecto de aceite de oliva y cobre en un cultivo a escala piloto
2.3.3.1 Corrida del micelio
La adición de 60 ppm de cobre (II) al sustrato incrementó significativamente la velocidad

en la que el micelio colonizó el sustrato y comenzó a exudar metabolitos secundarios. El
tiempo de incubación se redujo de 11 días a 7 días (Tabla 8). Por otro lado, la adición de
1,5% de aceite de oliva retrasó el tiempo de corrida del micelio a 14 días. Sin embargo, el
aceite de oliva no tuvo efecto en el tiempo de corrida del spawn cuando Cu (II) también
estaba presente en el sustrato.
Tabla 8: Días para la corrida del micelio con y sin aceite de oliva y/o cobre.
Formulación del sus-

DCM (días)
trato
Control 11±2B
Cu (II) (60 ppm) 7±1A
Aceite de oliva (1,5%) 14±1C
Cu (II) (60 ppm) +
7±1A
Aceite de oliva (1,5%)
DCM: tiempo de corrida del micelio (días). Medias con una letra común no son significativa-
mente diferentes (p > 0,01).
2.3.3.2 Parámetros de rendimiento de hongo
Las Tablas 9, 10 y 11 muestran los parámetros de rendimiento para un cultivo de tres

oleadas. La adición de 60 ppm de Cu (II) o 1,5% de aceite de oliva incrementaron los rendi-
mientos de la primera oleada de G. lucidum en un 27% y 30%, respectivamente, comparados
con el control. Cuando el Cu (II) y el aceite de oliva se agregaron juntos, la producción en
base seca de la primera oleada se incrementó significativamente un 43% (p < 0,01). También,
la adición de Cu (II) redujo el tiempo hasta la cosecha de la primera oleada en 7 días, debido
a una reducción tanto en los tiempos de corrida del micelio como de desarrollo de los basi-
diomas. El aceite de oliva (1,5%) no tuvo efecto en el tiempo necesario para el crecimiento,
47
CAPÍTULO 2
desarrollo y maduración de los carpóforos; el incremento en el tiempo necesario para alcan-

zar la cosecha de la primera oleada se debió a una corrida del micelio más lenta. El incremento
de los rendimientos del cultivo por la adición de Cu (II) y aceite de oliva, junto con la reduc-
ción del tiempo necesario para alcanzar la cosecha de la primera oleada, mejoró notablemente
la productividad diaria de esta oleada en un 78% (p < 0,01).
La Figura 19 muestra una comparación de carpóforos producidos en troncos sintéticos

representativos de cada tratamiento justo antes de la cosecha de la primera oleada. Los sus-
tratos que contienen aceite de oliva o Cu (II) produjeron un mayor número de basidiocarpos
comparados con el control.
Tabla 9: Parámetros de rendimiento de la primera oleada con y sin aceite de oliva y/o
cobre.
Formulación del sus- D1°F MP1ºF MP1ºF diaria

%1°F EB1°F (%)
trato (días) (%) (%/día)
Control 100 35±3B 12,6±1,6A 3,0±0,4A 0,087±0,011A
Cu (II) (60 ppm) 100 28±1A 16,0±2,3B 3,8±0,4B 0,137±0,015C
Aceite de oliva (1,5%) 100 37±3C 15,5±2,5B 3,9±0,7B 0,108±0,017B
Cu (II) (60 ppm) +
Aceite de oliva (1,5%)
100 28±1A 18,1±1,9C 4,3±0,5C 0,155±0,018D
%1ºF: porcentaje de unidades experimentales que produjeron basidiocarpos en la primera

oleada. D1ºF: tiempo hasta la cosecha de la primera oleada (días). EB1ºF: eficiencia biológica de la pri-
mera oleada (%). MP1ºF producción de hongos de la primera oleada (%). MP1ºF diaria: producción
de hongos de la primera oleada por día (%/día). Medias con una letra común en una misma co-
lumna no son significativamente diferentes (p > 0,01).
48
CAPÍTULO 2
Figura 19: Comparación de frutos de la primera oleada de cinco troncos sintéticos re-
presentativos, luego de 27 días desde la inoculación.
Los rendimientos de la segunda y tercera oleada fueron menores que los de la primera
oleada (
Tabla 10). El aceite de oliva no tuvo efecto en los rendimientos de la segunda y tercera
oleada. Sin embargo, la presencia de 60 ppm de Cu (II) disminuyó los rendimientos en esta
etapa. En la segunda oleada, tanto la EB como el porcentaje de unidades experimentales que
produjeron hongos fue marcadamente menor en los sustratos que contenían Cu (II). Más
aún, el tiempo para alcanzar la segunda oleada fue mayor para el sustrato con cobre (29 días
vs. 20 días en el control). Sin embargo, la presencia de 1,5% de aceite de oliva mejoró el
número de troncos sintéticos con cobre que produjeron carpóforos en la segunda oleada
(93,6% vs. 77%).
Solo la mitad o menos de las unidades experimentales con Cu (II) mostraron desarrollo
de basidiomas para la tercera oleada, y la producción fue significativamente menor que los
rendimientos obtenidos con los otros sustratos. Aproximadamente el 80% de los troncos
sintéticos que no incluían Cu (II) mostraron desarrollo de carpóforos en la tercera oleada.
49
CAPÍTULO 2
Tabla 10: Parámetros de rendimiento de la segunda y tercera oleada con y sin aceite de
oliva y/o cobre.
Segunda oleada Tercera oleada

Formulación del MP2ºF MP dia- EB3°F MP3ºF MP diaria
%2°F EB2°F (%) %3°F
sustrato (%) ria(%/día) (%) (%) (%/día)
Control 97,7 4,4±1,2A 1,0±0,3BC 0,053±0.022A 81,4 2,3±0,9A 0,7±0,2B 0,05±0,015A
Cu (II) (60 ppm) 77 3,1±1,3B 0,7±0,3A 0,027±0.016B 45,8 1,6±0,7A 0,5±0,1A 0,035±0,012A
Aceite de oliva
97,4 4,9±1,5A 1,1±0,3BC 0,058±0.017A 79,4 2,1±1,1A 0,7±0,2B 0,053±0,025A
(1,5%)
Cu (II) (60 ppm) +
Aceite de oliva 93,6 3,4±1,3B 0,9±0,4AB 0,031±0.018B 51 2,2±1,3A 0,6±0,2AB 0,041±0,016A
(1,5%)
%2ºF: porcentaje de unidades experimentales que produjeron basidiocarpos en la segunda
oleada. EB2ºF: eficiencia biológica de la segunda oleada (%). MP2ºF producción de hongos de la se-
gunda oleada (%). MP2ºF diaria: producción de hongos de la segunda oleada por día (%/día). %3ºF:
porcentaje de unidades experimentales que produjeron basidiocarpos en la tercera oleada. EB3ºF:
eficiencia biológica de la tercera oleada (%). MP3ºF producción de hongos de la tercera oleada (%).
MP3ºF diaria: producción de hongos de la tercera oleada por día (%/día). Medias con una letra co-
mún en una misma columna no son significativamente diferentes (p > 0,01).
El rendimiento total del cultivo se presenta en la Tabla 11 tanto como eficiencia bioló-
gica (EB) acumulada y producción de hongos total (MP). El aceite de oliva mejoró significa-
tivamente el rendimiento total en un 22%. Por otro lado, el Cu (II) no tuvo efecto en el
rendimiento total después de tres oleadas.
Tabla 11: Rendimiento acumulado de un cultivo a tres oleadas con y sin aceite de oliva
y/o cobre.
EB acumulada MP acumulada
Formulación de sustrato n
(%) (%)
Control 43 18,8±2,7A 4,6±0,6A
Cu (II) 60 ppm 48 19,2±3,5A 4,6±0,7A
Aceite de oliva 1.5% 39 22,0±4,0B 5,6±0,9B
Cu (II) 60 ppm + Aceite de

47 22,4±3,0B 5,4±0,6B
oliva 1.5%
0,01).
50
CAPÍTULO 2
Considerando solo la primera oleada, el agregado de Cu (II) al sustrato indujo un incre-

mento significativo en la productividad tanto por incrementar el rendimiento como por re-
ducir el tiempo hasta la cosecha. Sin embargo, la primera oleada fue seguida de una impor-
tante disminución, de hasta 80%, en la productividad diaria. Las unidades experimentales que
no produjeron carpóforos en la segunda o tercera oleada no fueron consideradas para calcu-
lar este valor. En el caso del sustrato control y de aquellos que contenían 1,5% de aceite de
oliva, la productividad disminuyó gradualmente a largo de las oleadas, y el 30-35% del rendi-
miento total de hongo se dio en la segunda y tercera oleada.
2.3.3.3 Contenido de agua en el sustrato y en el carpóforo
Al finalizar el ciclo de cultivo de tres oleadas se observó una marcada disminución en el

contenido de humedad (Tabla 12) en todos los troncos sintéticos (contenido inicial de agua,
60%). Sin embargo, la reducción fue incluso más abrupta en aquellos sustratos que contenían
60 ppm de Cu (II)
Tabla 12: Contenido de agua del sustrato al final de un ciclo de cultivo de tres oleadas
(82 días) con y sin aceite de oliva y/o cobre.
Humedad del
Formulación de sustrato
sustrato (%)
Control 42,6±2,3A
Cu (II) 60 ppm 32,6±4,2B
Aceite de oliva 1,5% 39,3±5,3A
Cu (II) 60 ppm + Aceite de

32,2±4,9B
oliva 1,5%
0,01).
El contenido de agua en el carpóforo en la segunda y tercera oleada fue de 74-78%, sin

diferencias significativas entre tratamientos (p > 0,05). El contenido de agua de los carpófo-
ros obtenidos en la tercera oleada fue de 61-67%. Comparado con las oleadas previas, la
reducción en el contenido de agua fue significativa (p < 0,05), pero, de nuevo, no se obser-
varon diferencias significativas entre tratamientos (p > 0,05).
51
CAPÍTULO 2
2.3.3.4 Actividad de lacasas
La Figura 20 muestra la actividad de lacasas de extractos acuosos obtenidos de sustratos

residuales luego de tres oleadas de cosecha. En estas condiciones, la actividad de lacasas
disminuyó notablemente en los sustratos que contenían Cu.
Control Cu (60 ppm)

Aceite de oliva (1,5%) Aceite de Oliva + Cu
Figura 20: Actividad de lacasas en el sustrato residual tras un ciclo de cultivo de tres
oleadas con y sin aceite de oliva y/o cobre.
dddfdfdfddfdfdfd
dddfdfdfddfdfdfd
2.3.4 Evaluación microbiológica del proceso de pasteurización a escala piloto del

sustrato
La Figura 21 muestra la curva de temperatura obtenida en las hormigoneras durante la

pasteurización del sustrato a base de CSG. En cuanto al efecto del tratamiento térmico sobre
los microorganismos estudiados, no se detectaron diferencias significativas entre las dos
composiciones de sustrato ensayadas (Tabla 26). La Figura 22 muestra los recuentos de los
microorganismos indicadores a largo del proceso de pasteurización.
52
CAPÍTULO 2
°C 100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 1 1.5 2 2.5 3
horas
Figura 21: Temperatura del sustrato durante el proceso de pasteurización
8.00
7.00
6.00
5.00
Log UFC/g
4.00
3.00
2.00
1.00
0.00
0 1 2 3 Horas
RHP CT EA CSR
Mohos Enterococos E. coli
Figura 22: Efecto del tratamiento de pasteurización en hormigonera sobre indicadores

microbianos. Los resultados son el promedio de ambos sustratos, expresados como Log 10
UFC/gramo de sustrato seco.
53
CAPÍTULO 2
2.4 DISCUSIÓN
2.4.1 Efecto de aceites vegetales sobre el crecimiento del micelio
Los residuos agroindustriales lignocelulósicos pueden ser eficientemente utilizados por

basidiomicetes, quienes además de usarlos para su crecimiento producirán una cantidad de
metabolitos que pueden tener un alto valor para la salud y el consumo humano (Kües y Liu
2000). Últimamente se ha puesto gran esfuerzo en cultivar G. lucidum en medios sólidos para
la producción de carpóforos en residuos lignocelulósicos. Sin embargo, dado que el cultivo
en sustratos sólidos requiere más tiempo que otros métodos para cultivar G. lucidum, varios
estudios se han enfocado en optimizar el cultivo sumergido. La aditivación de los sustratos
es uno de los mayores aspectos del cultivo de G. lucidum con el propósito de incrementar el
rendimiento biológico mientras se reduce el tiempo requerido para la producción de hongos
en medio sólido.
Los ensayos de crecimiento miceliar en medio de agar y los ensayos de crecimiento lineal
(test de Duncan), permiten evaluar la formulación de distintos sustratos, con o sin suplemen-
tos y aditivos, rápidamente y a bajo costo. Estos estudios son útiles para evaluar el efecto de
distintas formulaciones sobre la fase de crecimiento vegetativo del hongo, pero por lo general
no aportan información sobre el potencial rendimiento del cultivo. En este caso, previo al
ensayo de cultivo a escala piloto, se evaluó el efecto del agregado de distintas concentraciones
de aceites vegetales (aceites de girasol, oliva y cártamo) en un medio MEA en placa de Petri
y en un medio a base de CSG en un ensayo de crecimiento lineal.
El aceite de girasol y el aceite de cártamo estimularon la producción de biomasa y au-

mentaron la densidad miceliar superficial en un medio MEA en placa de Petri a las mayores
concentraciones evaluadas. Los resultados de los ensayos lineales en un sustrato a base de
CSG mostraron correlación con los resultados de los ensayos de crecimiento radial en medio
MEA. A las mayores concentraciones evaluadas (0,75%), el aceite de girasol y el aceite de
cártamo incrementaron el contenido de proteínas solubles, un indicador indirecto de la bio-
masa, en el sustrato colonizado. Por otro lado, el aceite de girasol no afectó la extensión lineal
del micelio, mientras que aceite de cártamo la redujo a las mayores concentraciones.
Para el caso del aceite de oliva, en el rango de concentraciones estudiadas (0,1%-1,5%)

se observó una estimulación dosis-dependiente en el crecimiento del micelio. Esta estimula-
ción se evidenció en forma de un incremento lineal con la concentración de la biomasa y la
densidad miceliar superficial en el medio MEA y un incremento de la proteína soluble en el
54
CAPÍTULO 2
sustrato a base de CSG colonizado. También se observó una reducción en la extensión radial
y lineal del micelio para las mayores concentraciones del aceite.
Los aceites vegetales evaluados en estas experiencias contienen diferentes proporciones

de ácidos grasos insaturados. Mientras que el aceite de oliva es rico en ácido oleico (66-78%),
los aceites de girasol y de cártamo tienen mayor contenido de ácido linoleico (59-62% y 76-
79%, respectivamente) (Kostik et al. 2012; Orsavova et al. 2015). Esta diferente composición
de ácidos grasos podría explicar las diferencias observadas entre el aceite de oliva y el aceite
de girasol y de cártamo. Yang et al. (2000) demostraron en cultivos sumergidos de G. lucidum,
que el ácido oleico es un estimulante del crecimiento miceliar, mientras que el ácido linoleico
lo inhibe. El efecto estimulante de la biomasa del ácido oleico ha sido demostrado en cultivos
sumergidos de otros hongos, como Acremonium persicinum (Stasinopoulos y Seviour 1990),
donde también se observó un potente efecto inhibidor del ácido linoleico a altas concentra-
ciones, pero estimulante a bajas concentraciones.
Se determinó el pH antes y después de la esterilización del sustrato por tratamiento tér-

mico en autoclave. El pH de los sustratos que contenían aceite de oliva tendió a disminuir
con la concentración de aceite. Esta disminución del pH se debería a la liberación de ácidos
grasos desde triglicéridos.
2.4.2 Cultivo de Ganoderma lucidum en cáscara de semilla de girasol a escala pi-

loto. Efecto de aceite de oliva y cobre (II).
Los valores de producción de hongo en base seca fluctuaron entre 4,6% y 5,6%, y fueron
algo mayores a los observados por Gonzalez Matute et al. (2002) usando el mismo sustrato.
Considerando la eficiencia biológica, esta fluctuó entre el 18,8% y el 22,4%, valores acordes
a lo reportado para otros sustratos (Tabla 2). La mayor parte de la producción se obtuvo en
la primera oleada. En general, la reducción del rendimiento de la segunda a tercera oleada fue
menos marcada que de la primera a la segunda. Sin embargo, el contenido de humedad de
los hongos de la tercera oleada fue menor que los de la primera y segunda oleadas.
Los resultados obtenidos en los ensayos de crecimiento radial y lineal del micelio de
Ganoderma lucidum mostraron no solo que el micelio puede crecer sin inconvenientes en pre-
sencia de aceites vegetales, sino que a mayores concentraciones los aceites parecen estimular
el crecimiento de la biomasa miceliar. De los aceites vegetales evaluados, el aceite de oliva
55
CAPÍTULO 2
fue el que mostró los mejores resultados, es por ello que se decidió investigar su efecto en
los parámetros de rendimiento de un cultivo a escala piloto.
La estimulación con el agregado de aceite de oliva se evidenció principalmente en la

primera oleada y se debió a un mayor número de basidiocarpos formados por unidad expe-
rimental (Figura 19). Este resultado es similar al reportado por Schisler (1967) con Agaricus
bisporus y aceite de oliva y otros aceites vegetales. El incremento de los rendimientos de cul-
tivo podría ser el resultado de un mayor crecimiento de la biomasa miceliar causada por el
aceite. Los ácidos grasos, en particular el ácido oleico, han sido vinculados al efecto de esti-
mulación del crecimiento del aceite de oliva (Wardle y Schisler 1969; Yang et al. 2000; Park
et al. 2002). El catabolismo de los ácidos grasos es complejo; pueden ser utilizados como
fuente de energía y además los lípidos son esenciales en las paredes celulares (Chang y Miles
2004). La estimulación podría ser consecuencia de un incremento de la permeabilidad de la
hifa (Stasinopoulos y Seviour 1990; Yang et al. 2000; Guerin-Laguette et al. 2003). Este fe-
nómeno podría también explicar la ligera reducción en la superficie de la colonia, de la ex-
tensión lineal del micelio y los mayores tiempos de corrida del micelio producidos por aceite
de oliva; los nutrientes estarían más fácilmente disponibles sin que la hifa tenga la necesidad
de expandirse para explorar nuevo sustrato fresco. Por otro lado, los ésteres de sucrosa de
los ácidos grasos han sido mencionados como inductores de la formación de carpóforos
(Kües y Liu 2000).
La adición de 60 ppm de Cu (II) a la formulación del sustrato redujo significativamente

el tiempo necesario tanto para la corrida del micelio como para el desarrollo y maduración
de basidiocarpos en la primera oleada, y también incrementó el rendimiento en la primera
oleada. Los tiempos más cortos hasta la cosecha de la primera oleada y el mayor rendimiento
del cultivo contribuyeron al incremento observado de la productividad diaria.
Dado que el carbono utilizado por G. lucidum es de un carácter lignocelulósico, durante

el crecimiento vegetativo el micelio produce un amplio rango de enzimas para degradar estos
sustratos. Las lacasas son una familia de enzimas involucradas en esta función. Los metales
pesados son importantes moduladores de la actividad de estas enzimas. Se ha reportado que
el Cu (II) estimula tanto la producción como la actividad de lacasas fúngicas (Baldrian y
Gabriel 2002; Cordi et al. 2007). Podría esperarse que la excreción y actividad mejorada de
las enzimas líticas mejoraran la disponibilidad de nutrientes y facilitaran la colonización del
sustrato. Postemsky et al. (2014) reportaron que el Cu estimuló la actividad de lacasas en la
56
CAPÍTULO 2
primera oleada de un cultivo de G. lucidum en paja de arroz. Sin embargo, también podría
inducir el agotamiento de nutrientes y del micelio. Esto se vuelve evidente por una reducción
abrupta en los rendimientos de las cosechas de la segunda y la tercera oleadas, menor conte-
nido de humedad en el sustrato, y menor actividad de lacasas luego de la tercera oleada. De
hecho, la actividad de lacasas en el control fue similar a la observada tras una oleada en un
sustrato de paja de arroz (Postemsky et al. 2014).
2.4.3 Evaluación microbiológica del proceso de pasteurización a escala piloto del

sustrato
Cuando se realiza un cultivo de hongos en un sustrato lignocelulósico, por lo general es

necesario realizar un tratamiento de pasteurización para disminuir la carga de microorganis-
mos competidores en dicho sustrato. En este caso se evaluó la calidad microbiológica de un
sustrato a base de CSG con y sin agregado de aceites vegetales, tratado por el sistema des-
cripto por Curvetto et al. (1997).
Los resultados indican que el tratamiento fue muy efectivo al reducir algunos grupos de
microorganismos relacionados a la calidad sanitaria del producto tales como coliformes to-
tales y E. coli. Este grupo presentó la mayor pendiente de eliminación de viables y se alcan-
zaron niveles muy bajos o estuvieron por debajo del nivel de detección (E. coli) al final del
proceso; seguidos por los enteroccocos, que habitualmente tiene una mayor resistencia a las
altas temperaturas que los miembros de la familia Enterobacteriacea. Como era de esperar las
bacterias esporógenas (AE y CSR) presentaron la menor pendiente de reducción de viables.
Los mohos, principales posibles competidores del hongo a cultivar, mostraron un descenso
moderado, logrando una reducción de 2 logaritmos con respecto a su número inicial. La
mayor pendiente de perdida de hongos viables luego de la primer hora de tratamiento pudo
deberse a la muerte de las formas vegetativas, quedando la esporas y formas de resistencia
con menor sensibilidad, que no pudieron ser eliminadas. Sin embargo, en nuestras experien-
cias, se han registrado pocos casos de contaminación, probablemente debido a la alta tasa de
inoculación de G. lucidum utilizada.
2.5 CONCLUSIONES
De los aceites vegetales estudiados, el aceite de oliva fue el que mostró una mayor esti-
mulación del crecimiento miceliar. Los ensayos de crecimiento radial y lineal, sugieren una
corrida de micelio más lenta, pero más robusta, con un aumento de la densidad miceliar. Por
57
CAPÍTULO 2
otro lado, la adición de 60 ppm de Cu (II) aceleró la corrida del micelio y aumentó los ren-
dimientos de basidiocarpos en una primera oleada.
Desde un punto de vista económico, el uso de una formulación de sustrato de CSG que
contenga tanto aceite de oliva como Cu (II), sería costo-eficiente para la producción de ba-
sidiocarpos de G. lucidum. La adición de 60 ppm de Cu (II) junto con 1,5% de aceite de oliva
incrementó la productividad diaria hasta la primera oleada en un 78%, aumentando notable-
mente el rendimiento y reduciendo el tiempo hasta la cosecha. Debería notarse que el 80%
de la producción total con esta formulación de sustrato se obtuvo en la primera oleada en
solo 28 días.
Finalmente, el análisis microbiológico del proceso de pasteurización muestra que el sis-

tema es efectivo para la eliminación de grupos de microorganismos relacionados con la cali-
dad sanitaria, aunque los mohos solo mostraron una disminución moderada. Estos resultados
indican que el sistema podría perfeccionarse para lograr una mayor eliminación de mohos
viables a los fines de no poner en riesgo la producción.
58
CAPÍTULO 3
CAPÍTULO 3:
INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES DE
CULTIVO SOBRE LA COMPOSICIÓN
QUÍMICA DEL BASIDIOCARPO DE Gano-
derma lucidum
3.1 INTRODUCCIÓN
3.1.1 Efecto de las condiciones de cultivo sobre la calidad química de G. lucidum
La seguridad y eficacia de cualquier producto mico o fitofarmacéutico es determinada

por los compuestos que contiene. Para tener resultados terapéuticos reproducibles es nece-
sario mantener constante el patrón y la concentración de los constituyentes del micoterápico.
Uno de los propósitos del control de calidad es asegurar que cada unidad de dosaje contenga
la misma cantidad de principio activo de un lote a otro (Busse 2000). Sin embargo, los fito-
medicamentos son mezclas complejas que provienen de fuentes biológicas, caracterizadas
por su variabilidad, y por lo tanto se deben dedicar grandes esfuerzos para garantizar una
calidad adecuada y constante. Por ello deben estandarizarse no solo los métodos de manu-
factura del producto sino también los métodos de obtención de la materia prima.
El control de calidad es uno de los principales problemas que presenta la industria de

los productos basados en Ganoderma lucidum. En un estudio realizado por Yang et al. (2012)
se evaluó la calidad de 17 productos (16 cápsulas y un comprimido) derivados de Lingzhi
(Ganoderma spp.). Los autores encontraron que la homogeneidad de la calidad de los produc-
tos era pobre, con considerables variaciones en la composición de triterpenoides y polisacá-
ridos. Esto podría deberse a diferentes técnicas de preparación de los productos o a varia-
ciones en las materias primas. De hecho, por lo general, los elaboradores de estos productos
dependen de varias fuentes que les proveen carpóforos, las cuales suelen mostrar una varia-
ción considerable con respecto a la calidad (Chang y Miles 2004). Los carpóforos de los
hongos son estructuras complejas, tanto morfológica como fisiológicamente, con variaciones
59
CAPÍTULO 3
indudables en la composición química entre lotes. La composición química, cuali y cuantita-

tiva, de un carpóforo va a depender de la cepa, de las condiciones de cultivo, de la composi-
ción básica del sustrato y del agregado de ingredientes suplementarios (Smith et al. 2002;
Wasser 2005; Suárez Arango y Nieto 2013; Bishop et al. 2015). El nivel de compuestos acti-
vos en el hongo es difícil de controlar y la caracterización del perfil químico de G. lucidum es
importante para facilitar el control de calidad de los productos (Bishop et al. 2015). En la
Medicina Tradicional China (MTC) la calidad del hongo Lingzhi se determina por color,
tamaño y forma. Los hongos grandes, de color rojo vivo y forma arriñonada son general-
mente considerados de mejor calidad (Upton 2006). Sin embargo, no existe información dis-
ponible que correlacione estos caracteres con la composición química o la actividad farma-
cológica.
El efecto de las condiciones de cultivo sobre la producción de principios activos en G.

lucidum ha sido estudiado principalmente en cultivos sumergidos. En general, en este tipo de
cultivos, las condiciones de cultivo son críticas para el crecimiento de la biomasa y la pro-
ducción de exopolisacáridos y ácidos ganodéricos (Yang y Liau 1998; Fang y Zhong 2002;
Tang y Zhong 2003). Chang et al. (2006) observaron que el aceite de oliva estimula la pro-
ducción de exopolisacáridos en medios líquidos. Por otro lado, en otro estudio, el aceite de
oliva redujo el contenido de ácidos ganodéricos, mientras que el agregado de CaCl 2, ZnCl2,
celulasa y malto-oligosacárido, estimularon su producción (Zhang et al. 2014). Zhou et al.
(2013) demostraron que el agregado de coixenolide a un cultivo sumergido incrementa la
producción de polisacáridos y exopolisacáridos. Se ha demostrado incluso que las condicio-
nes de cultivo influyen sobre la configuración estructural de los exopolisacáridos producidos
(Fraga et al. 2014).
En cuanto a la calidad química del basidiocarpo de G. lucidum, existen varios estudios

que muestran la influencia de las condiciones de cultivo sobre la concentración de principios
activos. Por ejemplo, se ha reportado que cuando el hongo crece en madera de cerezo pro-
duce mayor cantidad de triterpenoides pero crece más lentamente y produce menores rendi-
mientos que cuando crece en roble (Upton 2006). Otros estudios han mostrado que el con-
tenido de ácido ganodérico B, depende del estadio y lugar del cultivo (Ding et al. 1999). Lu
et al. (2012) analizaron el contenido de triterpenoides, ácidos ganodéricos A y B, y polisacár-
idos, de basidiocarpos cultivados en diferentes zonas de China sobre diferentes sustratos
(semilla de algodón y distintos tipos de maderas). Los autores encontraron diferencias signi-
ficativas en el contenido de estos compuestos de acuerdo al lugar de origen, demostrando la
60
CAPÍTULO 3
influencia de las condiciones de cultivo sobre la composición de los principales grupos me-
dicinales del hongo. Más aún, Ćilerdžić et al. (2014) determinaron que la actividad antibacte-
riana y antioxidante del hongo varía con las condiciones de cultivo y esta se correlaciona con
el contenido de compuestos fenólicos.
En el capítulo anterior se observó que la adición de aceite de oliva y cobre a un sustrato

a base de cáscara de semilla de girasol (CSG) tiene un efecto positivo sobre el rendimiento
de un cultivo de G. lucidum. Sin embargo, es necesario conocer el efecto de estos aditivos
sobre el contenido de compuestos bioactivos presentes en el basidiocarpo. También es im-
portante conocer el efecto de las condiciones de cosecha (momento de la cosecha; primera
o segunda oleada).
Por otro lado existen numerosos trabajos en los cuales se evalúan diferentes sustratos
para el cultivo de G. lucidum (ver Tabla 2). Entre ellos la paja de arroz es uno de los agrore-
siduos más abundantes del mundo y ha demostrado buenos rendimientos en el cultivo de G.
lucidum (Postemsky et al. 2014). Es concebible pensar que un elaborador de productos de G.
lucidum obtenga su materia prima de diferentes fuentes. Es por ello que resulta interesante
evaluar en un sustrato distinto a la CSG, en este caso paja de arroz, el contenido y perfil de
compuestos bioactivos, así como también la respuesta frente al agregado de aditivos al sus-
trato.
3.1.2 Análisis mediante espectroscopia infrarroja (IR)
La Medicina Tradicional China (MTC) considera que la acción de una fitomedicina no

se debe a un compuesto particular sino a la acción sinérgica de múltiples sustancias en una
composición química compleja. Por lo tanto el análisis cuantitativo simple de uno o más
marcadores químicos en una materia prima no puede representar bien su calidad (Song et al.
2013). Es por ello que se han desarrollado nuevas metodologías, como la toma de las “huellas
dactilares” por cromatografía (generalmente HPLC), que permite evaluar la calidad de un
producto o materia prima por la comparación de cromatogramas. Sin embargo, estos proce-
dimientos suelen ser costosos, requieren un tiempo considerable, y utilizan un gran cantidad
de solventes orgánicos de alta pureza.
Una alternativa para el análisis de fitomedicinas o materias primas complejas es la es-

pectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR), pues presenta la ventaja de ser
un método no destructivo, rápido y efectivo, y que requiere una pequeña cantidad de muestra
61
CAPÍTULO 3
(Choong et al. 2014). La región del espectro infrarrojo medio (4000-400 cm-1) puede ser uti-
lizada para estudiar las vibraciones fundamentales de las moléculas y la estructura rotacional
vibracional asociada. Para que un modo vibracional de una muestra sea “activo” en el IR,
tiene que estar asociado a cambios en el momento dipolar entre los átomo que componen
un enlace. Existen seis modos normales de vibración: de tensión: simétrica y asimétrica; de
deformación en el plano: tijereteo y balanceo y de deformación fuera del plano: aleteo y torsión, (Fi-
gura 23). Cada uno de estos modos de vibración se asocia a una frecuencia determinada. El
espectro infrarrojo de una sustancia natural compleja consiste en muchas bandas de absor-
ción superpuestas que representan los diferentes modos de vibración de la gran cantidad de
constituyentes moleculares de la mezcla, por lo que permite determinar cualitativamente los
principales grupos químicos presentes en una muestra. Esta técnica también es útil para iden-
tificar plantas medicinales por sus picos de absorción característicos y determinar diferencias
entre materias primas de distinto origen (Singh et al. 2010; Zhu y Tan 2015).
Figura 23: Modos normales de vibración de una molécula
3.1.3 Objetivos
1. Cuantificar y comparar el contenido de los principales grupos de compuestos bioac-

tivos, triterpenoides, carbohidratos de alto peso molecular y polifenoles, en extractos
obtenidos del basidiocarpo de una misma cepa de Ganoderma lucidum cultivada en
cáscara de semilla de girasol y paja de arroz con y sin el agregado de aditivos (aceites
vegetales y cobre).
62
CAPÍTULO 3
2. Caracterizar y comparar los principales grupos químicos del basidiocarpo y de ex-

tractos alcohólicos de una misma cepa de Ganoderma lucidum cultivada en cáscara de
semilla de girasol y paja de arroz con y sin el agregado de aditivos (aceites vegetales
y cobre) mediante espectroscopia FT-IR.

3.2.1 Muestras analizadas
Las muestras de hongo analizadas en este capítulo provienen de tres ensayos de cultivo
diferentes con la misma cepa (Ganoderma lucidum E47, ver sección 2.2.1). Las muestras de
hongo cultivado en sustrato de cáscara de semilla de girasol (CSG) con y sin aceite de oliva
y/o cobre, fueron obtenidas durante los ensayos de optimización del cultivo en CSG (ver
Capítulo 2). Las muestras cultivadas en paja de arroz fueron gentilmente provistas por el
Dr. Pablo Postemsky y las condiciones de cultivo han sido previamente publicadas
(Postemsky et al. 2014). Las muestras cultivadas en cáscara de semilla de girasol con y sin
aceite de girasol o aceite de maíz se obtuvieron siguiendo los procedimientos y condiciones
descriptos anteriormente (ver secciones 2.2.7, 2.2.9 y 2.2.10), pero los hongos fueron cose-
chados después de la desaparición del borde claro de crecimiento activo, tras el máximo de
liberación de esporas. Se presenta en la Tabla 13 un breve resumen de las muestras analiza-
das.
Tabla 13: Origen de las muestras de hongo analizadas
ID Sustrato Aditivos Oleada Notas

CCP1 CSG Ninguno Primera
CCS1 CSG Ninguno Segunda
CO15P1 CSG Aceite de Oliva 1,5% Primera Estudios de la optimi-
CO15S1 CSG Aceite de Oliva 1,5% Segunda zación de cultivo en
CCuP1 CSG Cobre 60 ppm Primera CSG (ver Capítulo 2)
COCuP1 CSG Aceite de Oliva 1,5% + Cobre 60 ppm
Primera
CCuS1 CSG Cobre 60 ppm Segunda
CCP2 CSG Ninguno Primera Cosechado luego de la
CGP2 CSG Aceite de Girasol 1,5% Primera desaparición del
borde activo de creci-
CMP2 CSG Aceite de Maíz 1,5% Primera miento
PCP1 Paja de Arroz Ninguno Primera Estudios de biodegra-
PO1P1 Paja de Arroz Aceite de Oliva 1% Primera dación de paja de
PO1S1 Paja de Arroz Aceite de Oliva 1% Segunda arroz (Postemsky et
POCuP1 Paja de Arroz Aceite de Oliva 1% + Cobre 100 ppm Primera al. 2014)
CSG: cáscara de semilla de girasol
63
CAPÍTULO 3
3.2.2 Obtención de los extractos
3.2.2.1 Extracción con etanol
El basidiocarpo de Ganoderma lucidum previamente secado y troceado (ver sección 2.2.10)

fue molido a hebras utilizando una picadora comercial (Moulinex, modelo AD5661). Se pesó
exactamente alrededor de 1 gramo del basidiocarpo molido y se extrajo con 20 volúmenes
de etanol 96% (Dorwil) durante 24 horas a temperatura ambiente. La extracción se realizó
tres veces para agotar al material. Los extractos se filtraron con papel de filtro Whatmann (nº
41) y se reunieron en un pool. Los extractos se obtuvieron por triplicado.
3.2.2.2 Extracción con agua caliente
El marco insoluble remanente de la extracción alcohólica se secó en estufa a 60 ºC du-

rante 24 horas y luego se extrajo con 20 volúmenes de agua destilada durante 4 horas a 80
ºC, con agitación. Luego se dejó en reposo a temperatura ambiente hasta completar las 24
horas de extracción. El procedimiento se realizó tres veces para agotar el material. Los ex-
tractos se filtraron con papel de filtro Whatmann (nº 41) y se reunieron en un pool. Los
extractos acuosos se obtuvieron por triplicado.
3.2.3 Determinación del residuo seco en los extractos
El residuo seco se determinó por evaporación del solvente en estufa a 60 ºC hasta peso
constante. La determinación se realizó por triplicado.
3.2.4 Contenido de triterpenoides
Para la valoración de triterpenoides se utilizó el método colorimétrico de la vainillina –

ácido perclórico, utilizando una solución de ácido ursólico (Sigma) en etanol absoluto (Dorwill)
(0,1 mg/mL) como estándar. Este método fue descripto por Few (1965) para la determina-
ción de esteroides y posteriormente fue utilizado para la determinación de triterpenoides en
G. lucidum (Cui et al. 2006; Chen et al. 2007; Lu et al. 2012). El método se adaptó para micro-
placas de 96 pocillos. Se colocó en los pocillos una alícuota determinada de estándar de ácido
ursólico (60, 80, 100, 140, 200 y 250 µl) o de extracto etanólico y se llevó a sequedad por
evaporación del solvente en estufa (60 ºC) durante 24 horas. A continuación se agregó a cada
pocillo 10 µL de vainillina (Sigma) en ácido acético glacial (Anedra) al 5% (p/v) y 35 µL de
ácido perclórico (Cicarelli). Se calentó en estufa a 60 ºC durante 45 minutos. Luego de enfriar
64
CAPÍTULO 3
a temperatura ambiente durante 15 minutos se diluyó con 165 µL de ácido acético glacial y
se midió la absorbancia a 548 nm en lectora de microplacas (Biotek, Sinergy HTX). La curva
de calibrado corresponde al promedio de la absorbancia de cuatro determinaciones vs. la
concentración de ácido ursólico. Las determinaciones se realizaron por cuadriplicado.
Curva de calibrado de ácido ursólico

0.900
0.800 y = 29.167x + 0.0031
R² = 0.9908
0.700
0.600
Absorbancia
0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03
mg Ácido Ursólico
Figura 24: Curva de calibrado representativa de ácido ursólico por el método de la vai-
nillina - ácido perclórico
3.2.5 Determinación de ácidos ganodéricos
Los ácidos ganodéricos son triterpenoides de baja polaridad que poseen uno o más gru-
pos carboxilos ionizables a pH básico. Son insolubles en agua o soluciones ácidas, pero so-
lubles en soluciones alcalinas.
Para valorar el contenido de ácidos ganodéricos, se llevó a sequedad en estufa a 60 ºC

una cantidad determinada de extracto etanólico. Posteriormente se redisolvió en una solución
de bicarbonato de sodio (Cicarelli) al 5%, separando el residuo insoluble por centrifugación
a 8.000 rpm. La cuantificación se realizó por el método espectrofotométrico descripto ante-
riormente (sección 3.2.4), por cuadriplicado.
3.2.6 Contenido de carbohidratos de alto peso molecular.
La fracción de carbohidratos de alto peso molecular (polisacáridos y proteoglucanos) se

separó de los de bajo peso molecular a través de un proceso de diálisis (c.o. 14.000 MW)
65
CAPÍTULO 3
durante 72 horas contra agua corriente (las primeras 48 horas) y finalmente contra agua des-
tilada (últimas 24 horas). La cuantificación de carbohidratos de alto peso molecular del ex-
tracto dializado se realizó mediante una adaptación del método descripto por Laurentin y
Edwards (2003) en microplacas de 96 pocillos usando una solución de glucosa (Anedra) en
agua destilada (1,4 mg/mL) como estándar.
Para realizar la curva de calibrado de glucosa se colocó en los pocillos una alícuota de la
solución de glucosa (5, 10, 15, 20, 30 y 40 µL) y se completó el volumen a 40 µL con agua
destilada. Para la determinación de las muestras se agregó a cada pocillo una alícuota cono-
cida del extracto acuoso dializado y se completó el volumen a 40 µL con agua destilada. Las
microplacas se llevaron a heladera durante 15 minutos. Luego se preparó una solución de
antrona (Sigma) en ácido sulfúrico (Dorwill) (2 g/L) y se agregó 100 µl de ese reactivo en
cada pocillo. Finalmente se llevó la placa a estufa a 92 ºC durante 5 minutos y luego se leyó
la absorbancia a 630 nm en lectora de microplacas. Las determinaciones se hicieron por cua-
driplicado.
Curva de calibrado de glucosa

2.500
2.000
Absorbancia
1.500
1.000 y = 33.734x + 0.0501

R² = 0.9973
0.500
0.000
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
mg glucosa
Figura 25: Curva de calibrado representativa de glucosa por el método de antrona - ácido
sulfúrico
66
CAPÍTULO 3
3.2.7 Contenido de compuestos fenólicos
El contenido de compuestos fenólicos se determinó tanto en los extractos etanólicos

como en los extractos acuosos. La valoración de compuestos fenólicos se realizó a través de
un método espectrofotométrico mediante el reactivo de Folin-Ciocalteu (mezcla de fosfo-
molibdato y fosfotungstato). Se utilizó una adaptación del método en microplacas de 96 po-
cillos descripto por Magalhaes et al. (2010) utilizando una solución de ácido gálico (Sigma)
en agua (0,125 mg/mL) como estándar.
Se agregaron alícuotas de estándar (5, 10, 20, 30, 40 y 50 µL) o de extracto a los pocillos
y se completó el volumen hasta 50 µL con agua. Luego se adicionó 50 µL de una dilución 1:5
en agua del reactivo de Folin – Ciocalteu (Sigma). Finalmente se agregó 100 µL de una solu-
ción de hidróxido de sodio 0,175 nM y se midió la absorbancia a 760 nm en lectora de mi-
croplacas. Las determinaciones se realizaron por cuadriplicado.
Curva de calibrado de ácido gálico

1.400
1.200
1.000
Absorbancia
0.800
0.600 y = 174.14x + 0.0153

R² = 0.9978
0.400
0.200
0.000
0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007
mg. ácido gálico
Figura 26: Curva de calibrado representativa de ácido gálico por el método de Folin-
Ciocalteu
3.2.8 Contenido de cobre
El basidiocarpo seco y molido se digirió con 1,5 mL de HNO3 y HClO4 (2:1 v/v) durante
2 horas a 280 ºC y se diluyó con agua bidestilada. El contenido de cobre se midió utilizando
un espectrómetro de emisión óptica por plasma acoplado inductivamente (modelo 1000:III;
Shimadzu).
67
CAPÍTULO 3
3.2.9 Espectrofotometría visible
Con el fin de determinar diferencias en el color de los extractos, se midió el espectro de

absorción entre 400 y 900 nm de los extractos acuosos y etanólicos. Para ello se colocaron
200 µL de cada extracto en pocillos y se realizó un barrido espectral en lectora de microplacas
con una resolución de 10 nm. Para cada longitud de onda se restó la absorción de un blanco
de solvente (agua o etanol 96 º). Las lecturas se normalizaron por el peso de basidiocarpo
utilizado para la extracción y representan la absorción de un extracto por gramo de hongo
extraído en 20 volúmenes de solvente. Los espectros corresponden al promedio de tres ex-
tractos por tratamiento.
3.2.10 Espectrofotometría FT-IR
El registro de los espectros se obtuvo como dispersión en bromuro de potasio, KBr,

(sólido en sólido, al 1 % peso en peso), utilizando el material seco proveniente de la molienda
del basidiocarpo de G. lucidum. Se empleó un accesorio de reflectancia difusa (Avatar). Los
extractos etanólicos (CCP1 y PCP1) se prepararon como película por evaporación del sol-
vente sobre ventanas de KBr. En ambos casos, se utilizó un espectrofotómetro infrarrojo
con transformada de Fourier (Nicolet-Nexus 470), con 64 escaneos de barrido dentro del
intervalo de frecuencias del infrarrojo medio (4000-400 cm-1). Los espectros se procesaron
utilizando el software Omnic 32. Estas determinaciones se realizaron en el Laboratorio per-
teneciente al Área II, Química Orgánica, del Departamento de Química (UNS) bajo la su-
pervisión y asesoramiento de la Dra. Olga Pieroni.
3.2.11 Análisis estadístico
Los resultados de las determinaciones se expresaron en mg de compuesto por g de car-

póforo seco, y en relación al residuo seco (mg de compuesto / mg de residuo seco x 100%).
Los datos fueron analizados por análisis de varianza de un factor (ANOVA). La separación
de los valores medios se realizó mediante el test de Tukey. Los análisis se efectuaron utili-
zando el software Infostat.
3.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.3.1 Residuo seco
El residuo seco representa el total de compuestos extraídos del basidiocarpo y es una

medida de la eficiencia de extracción. La Tabla 14 resume la cantidad de residuo seco extraída
68
CAPÍTULO 3
por gramo de hongo en las extracciones alcohólica y acuosa. Además se presenta el total de
residuo seco extraído (extracción alcohólica más extracción acuosa).
Tabla 14: Contenido de residuo seco (mg/g de hongo seco)
Residuo Seco (mg/g de hongo)

Muestra Ext. Alcohólico Ext. Acuoso Total
CCP1 135 ± 12 AB 162 ± 13 BC 296 ± 17 AB
CCS1 128 ± 10 ABC 151 ± 4,9 CD 274 ± 10 BC
CO15P1 117 ± 10 CDE 182 ± 7,3 A 303 ± 13 A
CO15S1 111 ± 12 DE 137 ± 10 DE 252 ± 7,3 DEF
CCuP1 126 ± 11 BCD 172 ± 8,3 AB 296 ± 13 AB
CCuS1 118 ± 9,7 DE 150 ± 7,6 CD 266 ± 16 CD
COCuP1 111 ± 9,1 DE 183 ± 4,0 A 295 ± 10 AB
CCP2 136 ± 11 AB 119 ± 8,3 FG 254 ± 17 CDE
CGP2 89,1 ± 5,1 F 108 ± 6,2 G 197 ± 7,9 H
CMP2 82,9 ± 9,1 F 144 ± 6,0 CD 228 ± 9,3 G
PCP1 143 ± 10 A 120 ± 4,8 FG 264 ± 13 CD
PO1P1 111 ± 13 DE 117 ± 13 FG 229 ± 23 FG
PO1S1 115 ± 12 DE 122 ± 9,6 FG 239 ± 10 EFG
POCuP1 109 ± 9,1 E 127 ± 13 EF 236 ± 13 EFG
Se presenta la media ± el desvío estándar. Letras diferentes en la misma columna indican medias
significativamente diferentes (p < 0,05).
La eficiencia total de extracción varió entre 197 y 303 mg/g de hongo seco. La eficiencia
de la extracción acuosa fluctuó entre 108 y 183 mg/g de hongo seco, mientras que la de la
extracción alcohólica varió entre 82,9 y 143 mg / g de hongo seco.
En general, los hongos cosechados después del máximo de liberación de esporas (CCP2,
CGP2 y CMP2) presentaron menores eficiencias de extracción, probablemente por translo-
cación de compuestos a la espora. En el caso del sustrato sin aditivos, la reducción se produjo
principalmente en los extractos acuosos, lo que indicaría una pérdida de compuestos de ca-
rácter polar. Con la presencia de 1,5% de aceite de girasol se obtuvo significativamente (p <
0,05) menos residuo sólido en ambos extractos con respecto al sustrato sin aditivo en la
misma condición de cosecha (CCP2), mientras que con aceite de maíz (1,5%) se redujo de
manera similar el residuo seco en los extractos alcohólicos, pero aumentó significativamente
en los extractos acuosos.
69
CAPÍTULO 3
Comparando sustratos (paja de arroz y cáscara de semilla de girasol), no se observaron

diferencias significativas para el extracto alcohólico, pero se observó un menor valor en el
extracto acuoso en el caso de los hongos cultivados en paja de arroz.
En paja de arroz, la adición de aceite de oliva o aceite de oliva y cobre no modificó la

eficiencia de extracción en los extractos acuosos pero la redujo significativamente (p < 0,05)
en los extractos alcohólicos. La adición de aceite de oliva y/o cobre en el sustrato de cáscara
de semilla de girasol no modificó la eficiencia de extracción total, pero se observó, en pre-
sencia de aceite de oliva, un incremento de la eficiencia en los extractos acuosos en detri-
mento de la eficiencia de los extractos alcohólicos, lo que indicaría un aumento de compues-
tos polares y una disminución de los apolares.
En general, las eficiencias de extracción en carpóforos de la segunda oleada fueron me-

nores a la de carpóforos de la primera oleada.
3.3.2 Contenido de triterpenoides y ácidos ganodéricos
Los triterpenoides y ácidos ganodéricos de G. lucidum están involucrados en muchas de

las acciones biológicas adjudicadas al hongo, y son responsables de su característico sabor
amargo. La Tabla 15 resume el contenido de triterpenoides en relación al carpóforo (mg Eq.
ácido ursólico/g) y al residuo seco (%), y de ácidos ganodéricos en relación al carpóforo (mg
Eq. ácido ursólico/g) y a los triterpenoides totales (%). El contenido de triterpenoides totales
varió entre 32,7 y 48,6 mg Eq. ácido ursólico/g y el de ácidos ganodéricos entre 10,8 y 22,4
mg Eq. ácido ursólico/g. Estos valores son similares a los reportados por otros autores
(Sukarno et al. 2004; Lu et al. 2012).
70
CAPÍTULO 3
Tabla 15: Contenido de triterpenoides y ácidos ganodéricos
Triterpenoides Ácidos ganodéricos

(mg Eq. ácido Triterpenoides (% Re- (mg Eq. ácido ursó- Ácidos ganodéricos
Muestra ursólico/g) siduo Seco) lico/g) (% Triterpenoides)
CCP1 37,8 ± 3,6 CD 28,2% ± 3,9% F 19,2 ± 0,9 BCD 51,2% ± 5,4% AB
CCS1 39,6 ± 7,0 C 28,3% ± 3,6% EF 20,4 ± 1,1 ABCD 53,7% ± 14,3% AB
CO15P1 37,4 ± 4,5 CD 30,8% ± 4,6% DEF 20,7 ± 1,6 ABC 56,4% ± 10,8% A
CO15S1 38,2 ± 7,2 CD 34,7% ± 6,9% CDEF 22,4 ± 2,2 A 60,5% ± 13,6% A
CCuP1 42,3 ± 3,0 BC 33,7% ± 5,4% CDEF 21,9 ± 2,7 A 51,8% ± 6,1% AB
CCuS1 38,2 ± 3,5 CD 33,2% ± 4,7% CDEF 22,3 ± 2,7 A 58,4% ± 6,6% A
COCuP1 48,6 ± 4,5 A 44,4% ± 4,9% A 17,8 ± 1,6 DEF 36,1% ± 3,2% C
CCP2 39,3 ± 2,5 C 29,0% ± 3,6% DEF 13,5 ± 0,5 G 34,0% ± 2,2% C
CGP2 32,7 ± 2,7 D 36,3% ± 4,4% BCDE 10,8 ± 0,8 H 33,4% ± 4,7% C
CMP2 32,7 ± 3,9 D 39,0% ± 7,5% ABC 16,2 ± 1,2 EF 50,5% ± 8,6% AB
PCP1 39,1 ± 3,2 C 27,4% ± 2,2% F 16,3 ± 1,2 EF 42,0% ± 4,1% BC
PO1P1 37,4 ± 4,8 CD 34,2% ± 5,9% CDEF 18,1 ± 3,2 CDE 49,4% ± 11,2% AB
PO1S1 41,7 ± 3,4 BC 36,9% ± 4,9% ABCD 21,2 ± 1,8 AB 50,8% ± 6,6% AB
POCuP1 47,6 ± 5,2 AB 43,9% ± 4,5% AB 15,5 ± 1,7 FG 33,1% ± 7,4% C
No se observaron diferencias significativas (p > 0,05) en el contenido de triterpenoides

totales de carpóforos cultivados en CSG y paja de arroz sin aditivos. Sin embargo, la adición
de cobre y aceite de oliva estimuló significativamente (p < 0,05) la producción de triterpe-
noides entre un 22 y 28% tanto en CSG como paja de arroz. Por otro lado, la adición de
aceite de maíz o aceite de girasol, redujeron el contenido de triterpenoides totales un 17%.
El contenido de ácidos ganodéricos representó entre el 33,1 y el 60,5% de los triterpe-

noides totales. Se observó que con la adición de aceite de oliva y cobre se redujo la propor-
ción de ácidos ganodéricos de 51,2% a 36,1% en CSG, y de 42,0% a 33,1% en paja de arroz.
En ambos casos la reducción se debió a un aumento de los triterpenoides totales sin obser-
varse una disminución significativa del contenido de ácidos ganodéricos. Por otro lado se
observó una reducción significativa tanto en el contenido de ácidos ganodéricos como su
relación con respecto a los triterpenoides totales en los hongos cosechados tras la máxima
liberación de esporas. El contenido de ácidos ganodéricos depende del estadio de cultivo
(Ding et al. 1999; Liu et al. 2012). En estas condiciones de cosecha, el contenido de ácidos
ganodéricos, y su proporción con respecto a los triterpenoides totales, se incrementó con la
adición de aceite de maíz.
71
CAPÍTULO 3
3.3.3 Contenido de carbohidratos de alto peso molecular
La fracción de carbohidratos de alto peso molecular incluye principalmente polisacári-

dos y proteoglucanos. A esta fracción se le atribuye acción inmunomoduladora. La Tabla 16
muestra el contenido de carbohidratos de alto peso molecular por gramo de basidiocarpo
seco (mg Eq. glucosa/g) y su relación con respecto al residuo seco total (%). El contenido
total de carbohidratos de alto peso molecular fluctuó entre 8,0 y 16,3 mg Eq. glucosa/g.
Estos valores fueron similares a los reportados por otros autores (Chin et al. 2011; Lu et al.
2012; Pan et al. 2013; Mai et al. 2015).
Tabla 16: Contenido de carbohidratos de alto peso molecular
Carbohidratos Carbohidratos Alto

Alto PM (mg Eq. PM (% Residuo
Muestra glucosa/g) Seco)
CCP1 14,0 ± 2,7 ABC 8,6% ± 1,8% BC
CCS1 12,2 ± 1,5 BCD 8,1% ± 0,5% BC
CO15P1 11,7 ± 1,6 CDE 6,4% ± 0,8% BC
CO15S1 11,2 ± 2,1 CDE 8,1% ± 1,1% BC
CCuP1 9,3 ± 2,1 DE 5,4% ± 1,3% BC
CCuS1 12,0 ± 2,7 BCD 8,0% ± 1,9% BC
COCuP1 9,4 ± 1,8 DE 5,2% ± 1,1% C
CCP2 9,3 ± 0,5 DE 7,9% ± 0,5% BC
CGP2 8,0 ± 0,8 E 7,5% ± 0,9% BC
CMP2 8,7 ± 1,0 DE 6,0% ± 0,8% BC
PCP1 16,3 ± 4,5 A 13,7% ± 3,7% A
PO1P1 15,6 ± 4,2 AB 13,3% ± 5,1% A
PO1S1 15,0 ± 2,3 ABC 12,3% ± 1,7% A
POCuP1 9,9 ± 0,7 DE 7,9% ± 0,7% BC
No se observaron diferencias significativas (p > 0,05) en el contenido de carbohidratos

de alto peso molecular entre hongos cultivados en CSG y paja de arroz sin aditivos. La adi-
ción de cobre (II) al sustrato redujo significativamente (p < 0,05) el contenido de carbohi-
dratos de alto peso molecular entre un 33 a 39%, tanto en CSG como en paja de arroz. En
CSG esta reducción fue solo evidente para carpóforos cosechados en la primera oleada. Asi-
mismo se observó una reducción en el contenido de carbohidratos de alto peso molecular
en las muestras cosechadas tras la máxima liberación de esporas. Esto podría deberse a una
72
CAPÍTULO 3
translocación de polisacáridos hacia la espora y coincide con lo observado para el residuo

seco del extracto acuoso.
La propiedad antioxidante de los hongos está correlacionada con el contenido de com-

puestos fenólicos (Pala y Wani 2011). El contenido de compuestos fenólicos solubles en
alcohol, de compuestos fenólicos solubles en agua y el total de compuestos fenólicos por
gramo de hongo seco se presenta en la Tabla 17. El contenido total de compuestos fenólicos
varió entre 5,5 y 9,5 mg Eq. ácido gálico/g, mientras que los compuestos fenólicos solubles
en agua fluctuaron entre 2,6 y 6,5 mg Eq. ácido gálico/g. El contenido de polifenoles solubles
en etanol se ubicó entre 2,5 y 4,6 mg Eq. ácido gálico/g.
Tabla 17: Contenido de polifenoles
Compuestos fenólicos (mg Eq. ácido gálico/g)

CCP1 2,8 ± 0,2 CD 4,0 ± 0,6 CD 6,8 ± 0,7 DE
CCS1 2,5 ± 0,1 F 3,8 ± 0,2 CDE 6,3 ± 0,2 EF
CO15P1 2,8 ± 0,2 C 5,1 ± 0,5 B 7,9 ± 0,3 B
CO15S1 2,5 ± 0,1 EF 3,6 ± 0,5 DE 6,1 ± 0,5 FG
CCuP1 2,9 ± 0,3 C 6,5 ± 0,5 A 9,5 ± 0,5 A
CCuS1 2,9 ± 0,2 C 4,4 ± 0,4 C 7,3 ± 0,5 CD
COCuP1 3,4 ± 0,2 B 6,1 ± 0,5 A 9,4 ± 0,5 A
CCP2 4,6 ± 0,3 A 2,9 ± 0,4 FG 7,5 ± 0,4 BC
CGP2 3,2 ± 0,2 B 2,6 ± 0,4 G 5,8 ± 0,4 FGH
CMP2 2,5 ± 0,3 F 4,4 ± 0,5 C 6,8 ± 0,6 DE
PCP1 2,7 ± 0,1 CDE 2,8 ± 0,4 FG 5,6 ± 0,4 GH
PO1P1 2,5 ± 0,1 DEF 2,9 ± 0,3 FG 5,5 ± 0,3 H
PO1S1 2,7 ± 0,1 CDEF 3,0 ± 0,2 FG 5,7 ± 0,3 FGH
POCuP1 4,5 ± 0,3 A 3,4 ± 0,4 EF 7,8 ± 0,5 BC
Los hongos cultivados en paja de arroz tuvieron menor contenido de compuestos fenó-
licos totales que los cultivados en CSG. Esto se debió a un menor contenido de compuestos
fenólicos solubles en agua. La adición de cobre al sustrato aumentó significativamente el
contenido de compuestos fenólicos totales, tanto en paja de arroz como en CSG. Sin em-
bargo, este aumento se debió en CSG a un aumento de los compuestos fenólicos solubles en
agua, mientras que en paja de arroz se debió a un aumento de los compuestos fenólicos
73
CAPÍTULO 3
solubles en alcohol, lo que indica una diferencia estructural entre los compuestos analizados.
Por otro lado, la adición de aceite de oliva incrementó significativamente (p < 0,05) el con-
tenido de compuestos fenólicos solubles en agua en CSG pero no tuvo efecto en paja de
arroz. El aceite de oliva aporta al sustrato una fracción compleja de compuestos fenólicos
polares (Boskou et al. 2006) que podrían ser absorbidos por el micelio de G. lucidum (Aksu
2005). Sin embargo, la paja de arroz puede actuar como un adsorbente eficiente de compues-
tos fenólicos polares (Amin et al. 2012), lo que en este sustrato estaría limitado el acceso del
micelio de G. lucidum a estos compuestos.
Con respecto al momento de la cosecha se observó un leve aumento en el nivel de

compuestos fenólicos totales en la muestra cosechada tras la desaparición del borde de cre-
cimiento activo. Sin embargo, se observaron grandes diferencias en la distribución de estos
compuestos, siendo en la muestra cosechada más tarde mucho mayor el contenido de com-
puestos fenólicos solubles en alcohol, pero mucho menor el de solubles en agua (p < 0,05).
Por otro lado, la adición de aceite de girasol redujo el contenido de compuestos fenólicos
solubles en alcohol sin alterar el contenido de compuestos fenólicos solubles en agua. De
igual manera, el aceite de maíz redujo el contenido de compuestos fenólicos solubles en al-
cohol, pero incrementó en de los solubles en agua.
Finalmente, no se observaron grandes diferencias en los contenidos de compuestos fe-

nólicos de los basidiocarpos de la segunda oleada.
La Tabla 18 presenta la relación entre compuestos fenólicos y el residuo seco. Se ob-

servó una fuerte correlación positiva entre el contenido de compuestos fenólicos y el residuo
seco en el extracto acuoso, excepto en los hongos cultivados en CSG con el agregado de
cobre, donde se observó un incremento significativo (p < 0,05) de la relación.
74
CAPÍTULO 3
Tabla 18: Relación entre compuestos fenólicos y residuo seco
Polifenoles/Residuo seco (%)

CCP1 2,1% ± 0,3% GHI 2,5% ± 0,4% D 2,3% ± 0,3% EFG
CCS1 1,9% ± 0,1% I 2,6% ± 0,1% D 2,3% ± 0,1% FG
CO15P1 2,4% ± 0,1% FG 2,8% ± 0,2% BCD 2,6% ± 0,2% CDEF
CO15S1 2,3% ± 0,3% FGHI 2,6% ± 0,3% CD 2,4% ± 0,2% EFG
CCuP1 2,4% ± 0,4% FG 3,8% ± 0,2% A 3,2% ± 0,3% AB
CCuS1 2,5% ± 0,3% EF 2,8% ± 0,3% BCD 2,7% ± 0,2% CDE
COCuP1 3,0% ± 0,3% CD 3,3% ± 0,3% AB 3,2% ± 0,2% AB
CCP2 3,3% ± 0,4% BC 2,5% ± 0,4% D 2,9% ± 0,3% BCD
CGP2 3,6% ± 0,4% AB 2,5% ± 0,4% D 3,0% ± 0,2% ABC
CMP2 2,9% ± 0,2% DE 3,1% ± 0,4% BC 3,0% ± 0,2% ABC
PCP1 1,9% ± 0,1% HI 2,4% ± 0,3% D 2,1% ± 0,1% G
PO1P1 2,3% ± 0,3% FGH 2,7% ± 0,4% CD 2,5% ± 0,2% DEF
PO1S1 2,4% ± 0,2% FG 2,5% ± 0,3% D 2,4% ± 0,1% EFG
POCuP1 4,1% ± 0,4% A 2,7% ± 0,4% CD 3,3% ± 0,3% A
3.3.5 Contenido de cobre
Se observó un incremento de 145-155% en el contenido de Cu, desde 53 a 130-135

mg/kg, en los carpóforos que provenían de sustratos enriquecidos con este mineral. Este
resultado concuerda con lo reportado por Gonzalez Matute et al. (2011). El cobre es un
micronutriente esencial para la salud humana (Uauy et al. 1998), por lo que este resultado es
interesante desde un punto de vista nutricional y medicinal. El mayor contenido de Cu con-
tribuiría a enriquecer con este mineral a los productos nutracéuticos derivados del basidio-
carpo.
3.3.6 Espectrofotometría visible
La Figura 27 muestra el espectro de absorción de los extractos etanólicos. Se observa

una banda ancha de absorción entre 400 – 500 nm similar en todos los extractos, con dife-
rencias en las intensidades de la banda.
75
CAPÍTULO 3
0.4
0.35
0.3
0.25
ABS
0.2
0.15
0.1
0.05
0
400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
Longitud de onda (nm)
CCuP1 CoCuP1 CCuS1 CCP2 POCuP1 CGP2 CMP2

CCP1 PCP1 CCS1 PO1P1 PO1S1 CO15P1 CO15S1
Figura 27: Espectro visible de los extractos alcohólicos
La Figura 28 muestra el espectro de absorción de los extractos acuosos. Al igual que en

los extractos etanólicos se observa una banda ancha de absorción entre 400 – 550 nm, pero
de mayor intensidad. Además se observan grandes diferencias en las intensidades de absor-
ción. De acuerdo a la intensidad del pico los extractos se separaron en tres grupos: los de
mayor intensidad (pico a 400 nm entre 0.850 – 0.950) corresponden a los hongos cultivados
en CSG con el agregado de cobre, los de intensidad media (absorbancia en 400 nm entre
0.550 – 0.680) a la mayor parte de los hongos cultivados en CSG, y los de menor intensidad
(absorbancia en 400 nm entre 0.350 – 0.400) corresponden a los hongos cultivados en paja
de arroz y el resto de los cultivados en CSG. Se observó además que el pico de absorción se
corresponde fuertemente con el contenido de compuestos fenólicos en el extracto acuoso
(Figura 29). Por lo tanto estos compuestos podrían ser los pigmentos responsables del color
del extracto.
76
CAPÍTULO 3
0.9
0.8
0.7
0.6
ABS
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
Longitud de onda (nm)
CCuP1 COCuP1 CCuS1 CCP2 POCUP1

CGP2 CMP2 CCP1 PCP1 CCS1
PO1P1 PO1S1 CO15P1 CO15S1
Figura 28: Espectro visible de los extractos acuosos
1.2
1 R² = 0.9023
0.8
ABS400
0.6
0.4
0.2
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Contenido de polifenoles (mg Eq. ácido gálico/g)
Figura 29: Correlación entre el contenido de polifenoles y la absorbancia a 400 nm en

los extractos acuosos.
77
CAPÍTULO 3
3.3.7 Efecto del agregado de Cobre (II)
En términos generales, el agregado de cobre a los sustratos de cultivo incrementó el

contenido de triterpenoides y compuestos fenólicos en los extractos estudiados. Esto podría
deberse a una estimulación en la producción de estos compuestos, ya que su contenido no
solo aumentó en términos de cantidad absoluta extraída por gramo de hongo, sino que se
incrementó en relación a la del resto de los compuestos extraídos (residuo seco). El cobre es
un conocido inductor de la enzimas lacasas (Kuhar y Papinutti 2014). La mayor actividad de
las enzimas lacasas promovería una mayor degradación de la lignina presente en el sustrato,
hacia compuestos fenólicos de menor peso molecular, que podrían ser absorbidos por la hifa.
Además, existen reportes de la estimulación de la producción de ácidos ganodéricos por la
presencia de iones Cu2+ en el medio (Tang y Zhu 2010).
Por otro lado, la presencia de cobre disminuyó el contenido de carbohidratos de alto

peso molecular, siendo esta disminución más marcada en sustrato de paja de arroz. También
se determinó un aumento significativo del contenido de cobre en el basidiocarpo cuando este
mineral se agregó al sustrato.
3.3.8 Efecto del agregado de aceites vegetales
Se estudió el efecto del agregado de aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de girasol. La
adición de aceite de oliva no tuvo grandes efectos sobre el contenido de los principales gru-
pos químicos estudiados, pero incrementó ligeramente el contenido de compuestos fenólicos
polares cuando se cultivó en CSG.
La adición de aceite de maíz y aceite de girasol redujeron ligeramente los contenidos de

triterpenoides y compuestos fenólicos. Sin embargo, la proporción con el resto de los com-
puestos extraídos no varió o incluso aumentó. Esto podría deberse a una mayor presencia de
fibra insoluble en el hongo, lo que “diluye” el contenido del resto de los compuestos en el
hongo. Las menores eficiencias de extracción observadas en aceite de girasol y aceite de maíz
apoyan esta hipótesis.
3.3.9 Influencia del momento de la cosecha
Al cosechar tras la desaparición del borde claro de crecimiento, luego de la liberación

máxima de esporas, no se detectaron cambios en el contenido de triterpenoides totales, pero
78
CAPÍTULO 3
disminuyó el contenido y proporción de ácidos ganodéricos. Además disminuyó el contenido

de carbohidratos de alto peso molecular y se modificó la proporción de compuestos fenóli-
cos, aumentando los solubles en alcohol en detrimento de los solubles en agua. Con respecto
a la oleada de cultivo, no se observaron diferencias significativas entre hongos de la primera
y segunda oleada cultivados en sustratos sin aditivos. Sin embargo, la influencia de los aditi-
vos no fue evidente en hongos obtenidos durante la segunda oleada, revirtiéndose los efectos
observados en la primera oleada.
3.3.10 Influencia del sustrato
No se observaron diferencias importantes entre los hongos cultivados en CSG y paja de

arroz, excepto en el contenido de compuestos fenólicos solubles en agua, que fue menor
para los hongos cultivados en paja de arroz.
3.3.11 Espectrofotometría FT-IR
En todos los espectros infrarrojos de las muestras provenientes de CSG o paja de arroz
como sustratos, se observa un alto grado de asociación por formación de puentes de hidró-
geno, puesto en evidencia por las anchas bandas entre 4000 y 2500 cm-1, y la poca resolución
y el aspecto ensanchado de las restantes.
Teniendo en cuenta las diferentes zonas de absorción, es posible hacer una asignación
cualitativa de los grupos funcionales presentes en el material registrado, teniendo en cuenta
las diferentes zonas de absorción. Estas se resumen en la Tabla 19.
Tabla 19: Asignación de los grupos funcionales de los principales picos del espectro IR
3600-2400: –OH; –NH (alcoholes, fenoles, ácidos, aminas y amidas primarias y secundarias)1
2980-2720: -CH- (metilo, metileno y metino en alquilos sustituyentes y/o esqueleto hidrocarbonado
alifático)1
1650-1600: C=O (amidas, cetonas y ácidos altamente asociados)1 y C=C (alquenos y/o aromáticos)1
1550-1500: C=C (aromáticos y/o alquenos)1; C=O (carboxilatos)1 y N-H (aminas y amidas primarias
y secundarias)2
1500-1200: -CH- (metilo y metileno en cadenas alquílicas)2 y –OH (alcoholes, fenoles y ácidos)2
1200-970: C-O (alcoholes, fenoles, éteres)1 y –CH- (esqueléticas de ciclos)2
800-400: -CH- (anillos saturados e insaturados aromáticos)3
1: vibraciones de tensión; 2: vibraciones de deformación en el plano; 3: vibraciones de deformación fuera del

plano
79
CAPÍTULO 3
Si bien, resulta casi imposible determinar a partir del espectro infrarrojo, cuáles son los
componentes individuales de este material, puede resumirse en base a las bandas de absor-
ción anteriormente enunciadas, que intervienen en su contenido en forma mayoritaria, pro-
teínas, lípidos y azúcares. Este resultado es concordante con lo informado por Choong et al.
(2011) en un estudio sobre extractos crudos y por Zhu y Tan (2015).
La comparación de los espectros obtenidos a partir del material cultivado sobre CSG,
permite deducir que tanto en la primera como en la segunda oleada sin suplementos, las
bandas de absorción, tanto en posición como en intensidad y forma, no muestran variaciones
significativas (Figura 30); de esta observación puede inferirse que sobre este sustrato, la
oleada de cosecha no tiene marcada influencia.
a) CCP1 b) CCP2
Figura 30: Espectros IR de basidiocarpos de G. lucidum cultivados en CSG y cosecha-

dos antes de la máxima liberación de esporas (CCP1) o después (CCP2)
Por otra parte, está más marcada la región correspondiente a las uniones carbono-hidró-
geno saturadas y/o de grupos alquílicos sustituyentes (2980-2720 cm-1), aparece en todos los
casos con intensidad; y a medida que se hacen los agregados de aceites y/o de cobre, se ven
mejor resueltas las bandas en 1650 y 1550 cm-1 (sin variación de la intensidad relativa entre
ambas), con un incremento moderado de la banda entre 1200 y 970 cm-1 (Figuras 31, 32 y
33). Estas diferencias permitirían suponer que la adición de aceites y/o de cobre incremen-
taría el contenido de proteínas, lípidos, glúcidos y fenoles, involucrando las funciones –NH−,
-OH, -CH- , C=O y C-O.
80
CAPÍTULO 3
a) Sin aditivos b) Con aceite de oliva y cobre c) Con cobre
Figura 31: Espectros IR del basidiocarpo de G. lucidum cultivado en CSG con o sin
aceite de oliva y/o cobre (primera oleada)
a) Con aceite de girasol b) Con aceite de maíz c) Con aceite de oliva
Figura 32: Espectros IR del basidiocarpo de G. lucidum cultivado en CSG con diferentes
aceites vegetales (primera oleada).
81
CAPÍTULO 3
a) Sin aditivos b) Con aceite de oliva c) Con cobre
Figura 33: Espectros IR del basidiocarpo de G. lucidum cultivado en CSG con o sin
aceite de oliva o cobre (segunda oleada)
Los espectros infrarrojos de las muestras provenientes de paja de arroz, son semejantes
a los espectros infrarrojos de las muestras provenientes de CSG (Figura 34), lo que significa
que las absorciones (y por ende, los grupos funcionales), son coincidentes para ambos sus-
tratos.
Las vibraciones de tensión –OH, NH-, C-H, C=O, C=C y C-O, sumadas a las de de-
formación N-H y C-H, manifiestan la presencia de alcoholes, fenoles, ácidos, aminas, amidas,
alcanos, alquenos y aromáticos, que pueden en su conjunto, como en el caso anterior, perte-
necer a proteínas, lípidos y sacáridos. El marcado incremento de las intensidades en las ab-
sorciones comprendidas entre 1250 y 400 cm-1 para paja de arroz como sustrato permite
inferir que el total de las funciones oxigenadas y nitrogenadas mencionadas, se hallan en
mayor proporción que en CSG.
82
CAPÍTULO 3
a) CSG b) Paja de arroz
Figura 34: Espectros IR de basidiocarpos de G. lucidum cultivados en CSG o Paja de

arroz
Para las muestras provenientes de paja de arroz como sustrato, la comparación de los
espectros correspondientes a primera oleada sin suplementos, y a primera oleada con aceite
y/o cobre (Figura 35), arroja como resultado una coincidencia plena en las bandas, tanto en
su forma como en su posición, sin diferencias apreciables en las intensidades de las mismas.
Esto permitiría inferir que el agregado de suplementos al sustrato de paja de arroz o el tiempo
de cosecha como segunda oleada (Figura 36), no provoca modificaciones sustanciales sobre
los grupos funcionales presentes en la estructura química del material, que sea detectable por
medio de este método espectroscópico.
83
CAPÍTULO 3
a) Con aceite de oliva. b) Sin aditivos. c) Con aceite de oliva y cobre
Figura 35: Espectros IR del basidiocarpo de G. lucidum cultivado en paja de arroz con
o sin aceite de oliva o cobre (primera oleada).
a) Segunda oleada. Con aceite de oliva. b) Primera oleada. Sin suplementos.
Figura 36: Espectros IR del basidiocarpo de G. lucidum cultivado en paja de arroz sin
suplementos (primera oleada) y con aceite de oliva (segunda oleada).
84
CAPÍTULO 3
Con el fin de establecer si los constituyentes químicos podían variar con relación al ma-
terial seco original proveniente de cáscara de girasol y de paja de arroz, se obtuvieron los
extractos etanólicos de cada uno de ellos.
La primera conclusión que surge de los espectros registrados, es que la concentración

de los componentes que pasan a la fase alcohólica es muy baja, razón por la cual los valores
de absorbancia resultan muy minimizados y se hace necesario mostrar los resultados en trans-
mitancia por ciento.
Tal como se puede ver en la Figura 37, hay bandas intensas y bien resueltas entre 3000
y 2800 cm-1 (tensiones C-H de alquílicos) y en 1700 cm-1 (tensión C=O), con un ensancha-
miento (sin resolución) en 1650 cm-1 (tensión C=O de amidas y carboxilatos, deformación
de enlaces N-H); permanecen las bandas entre 1200 y 1000 cm-1 (tensiones C-O y C-N);
aparecen con forma aguda e intensidad media bandas entre 1000 y 800 cm-1 (deformaciones
fuera del plano C-H) y hay una simplificación de la zona entre 750 y 500 cm-1 (deformaciones
fuera del plano C-H en anillos de sacáridos).
En términos generales, pueden asignarse entonces, funciones oxigenadas (carbonílicas e

hidroxiladas) y nitrogenadas (amídicas); cadenas alquílicas e insaturaciones de tipo cíclicas y
olefínicas, por lo que es posible concluir que el etanol extrae del total de componentes, aque-
llos con esqueleto hidrocarbonado alquílico, parcialmente insaturado que contienen funcio-
nes de tipo ácido graso y/o fenol, terpenos y/o azúcares con bajo grado de polaridad.
a) CSG b) Paja de arroz
Figura 37: Espectros IR del extracto etanólico de basidiocarpos cultivados en paja de

arroz o CSG
85
CAPÍTULO 3
3.4 CONCLUSIONES
Previo a esta tesis no existían estudios que analicen la composición química del basidio-
carpo de G. lucidum cultivado en distintos sustratos con o sin diferentes aditivos bajo condi-
ciones controladas de cultivo (cepa, temperatura, humedad, etc.). El contenido de los princi-
pales grupos de compuestos bioactivos de G. lucidum, triterpenoides, carbohidratos de alto
peso molecular y compuestos fenólicos, y los espectros IR de los basidiocarpos indican que
la composición del hongo es sensible a las condiciones de cultivo (sustrato, aditivos, mo-
mento de cosecha). Esto resalta la necesidad de estandarizar las condiciones de cultivo con
el fin de asegurar una composición química reproducible entre lotes.
Por otro lado, la espectroscopia FT-IR resultó útil para la comparación cualitativa de los
principales grupos funcionales presentes en el hongo y permitió diferenciar entre hongos
cultivados en distintos sustratos e incluso con distintos aditivos. Sin embargo, no se pudo
correlacionar la variación de la intensidad de los picos con la variación del contenido de los
principales grupos bioactivos del hongo.
Por último, sería importante extender la caracterización química al micelio y las esporas
para evaluar su variabilidad con las condiciones de cultivo. En cuanto a la espectroscopia
FT-IR es necesario continuar el análisis de los extractos e intentar establecer correlaciones
con el contenido químico para permitir una rápida evaluación de la materia prima.
86
CAPÍTULO 4
CAPÍTULO 4:
ESTUDIO DEL POTENCIAL PREBIÓ-
TICO DE LA FRACCIÓN DE POLISACÁRI-
DOS DE Ganoderma lucidum
4.1 INTRODUCCIÓN
Durante los últimos 30 años los compuestos con propiedades prebióticos han suscitado
un gran interés entre investigadores de ámbitos como la nutrición, la biomedicina y la indus-
tria de alimentos. A lo largo estos años se han propuesto diferentes definiciones, persistiendo
todavía hoy el debate de si éstas reflejan todas las propiedades que pueden presentar los
prebióticos. Gibson et al. (2004), revisaron este concepto y definieron los prebióticos como:
“ingredientes que al ser fermentados selectivamente dan lugar a cambios específicos en la
composición y/o actividad de la microbiota intestinal, confiriendo beneficios tanto para la
salud como para el bienestar del individuo”. Básicamente un prebiótico se define como un
compuesto no digerible por el consumidor, pero que puede ser utilizado como fuente de
carbono y energía por un número limitado de microorganismos; este hecho causa una mo-
dificación selectiva en la microbiota intestinal, que favorecería la salud de hospedador (Zhou
et al. 2010). La mayoría de los prebióticos en el mercado son oligosacáridos con diferentes
estructuras moleculares, presentes habitualmente en la dieta, como oligofructanos de origen
vegetal. Debido al gran potencial de los prebióticos en la alimentación, se han impulsado
investigaciones tendientes a evaluar nuevas fuentes y compuestos con estas propiedades.
Muchos estudios han propuesto el potencial de polisacáridos complejos de cadena larga. Los
hongos han sido postulados como fuentes potenciales de prebióticos como quitina, hemice-
lulosa, glucanos, mananos, xilanos y galactanos (Aida et al. 2009; Quigley 2010). Entre los
compuestos activos más estudiados se destacan los glucanos de cadena larga, incluyendo
homo y hetero glucanos, con enlaces glucosídicos ß 1-3, β1-4 y β 1-6, obtenidos de hongos
comestibles (Manzi y Pizzoferrato 2000). Los hongos Ganoderma lucidum (Reishi), Lentinula
edodes (Shiitake) y Pleurotus ostreatus (Gírgola) han sido propuestos como fuentes de glucanos
con efecto prebiótico (Djordjevic et al. 2009; Mohd Hamim et al. 2010). Recientemente se
ha reportado el rol de polisacáridos de G. lucidum en la modulación de la microbiota intestinal.
87
CAPÍTULO 4
El tracto gastrointestinal está habitado por una compleja comunidad de microorganis-

mos. El colon es el principal sitio de colonización microbiana; se considera que la microbiota
nativa está compuesta por más de 500 diferentes especies (Blaut et al. 2002). La composición
de microorganismos intestinales se denomina “microbiota” intestinal, mientras que la totali-
dad de los genes de la microbiota se conoce como “microbioma”. Los genes del microbioma
intestinal superan a los genes del cuerpo humano en aproximadamente 150 veces. La micro-
biota intestinal ha pasado de considerarse como un comensal acompañante, a ser un «órgano
metabólico», con funciones en la nutrición, la regulación de la inmunidad y la inflamación
sistémica (Hattori y Taylor 2009; Round y Mazmanian 2009), además de prevenir la coloni-
zación del intestino por microorganismo patógenos.
La microbiota intestinal puede ser seriamente afectada por tratamiento con antibióticos,
otros medicamentos y/o la alimentación. El suministro de microorganismos eficientes que
puedan recolonizar el intestino mejorando la función intestinal es una opción terapéutica y
preventiva importante. El desarrollo de un suplemento dietético a base de microorganismos
vivos que afecta beneficiosamente al animal huésped mejorando su equilibrio intestinal, dio
lugar al termino probiótico, que ha recorrido un largo camino desde los primeros conceptos
propuestos por Élie Metchnikoff (1845-1916) hasta nuestro días. Según la definición de la
Organización Mundial de la Salud (OMS), un probiótico es todo aquel microorganismo vivo
que, administrado en la cantidad adecuada, proporciona beneficios a la salud del receptor
(FAO/WHO, 2001). Las cepas probióticas tienen la capacidad de realizar la exclusión com-
petitiva de patógenos, protegen el epitelio intestinal, brindan beneficios nutricionales y ade-
más participan de procesos de inmunomodulación.
Como se indicó anteriormente, el compuesto prebiótico sería selectivamente consu-

mido por algunos microorganismos beneficiosos, generando una modificación en la micro-
biota intestinal. Por lo tanto, los estudios de selección de compuestos prebióticos se basan,
en primera instancia, en evaluar si pueden ser utilizados por cepas probióticas. Los princi-
pales géneros de bacterias que se han estudiado como objeto de esta selección correspon-
den al grupo de las bacterias lácticas (BL), entre los que se reconocen numerosas cepas con
capacidad probiótica, particularmente géneros Lactobacillus y Bifidobcterium (Zubillaga et al.
2001; Roberfroid 2002; Su et al. 2007a; Wang 2009). En los últimos años, se han extendido
los estudios sobre el efecto de los prebióticos en cepas probióticas de otros grupos tales
como bacterias del género Bacillus y levaduras (Nyangale et al. 2014).
88
CAPÍTULO 4
Por último, los simbióticos se definen como una combinación de microorganismos pro-
bióticos y compuestos prebióticos. Los probióticos y prebióticos al combinarse en un sim-
biótico pueden tener un comportamiento sinérgico, mejorando el efecto que tienen al admi-
nistrarse por separado. El uso de simbióticos como promotores de la salud está aún poco
definido y los estudios son escasos. En humanos, la aplicación de simbióticos ha mostrado
resultados prometedores en el tratamiento de determinadas enfermedades inflamatorias del
intestino y en la inmunosenescencia ocasionada por la vejez (Quigley 2011; Jirillo et al. 2012).
4.1.1 Objetivos
En nuestro conocimiento hasta la fecha no se han realizado estudios del potencial

prebiótico de la fracción de polisacáridos de Ganoderma lucidum E 47 cultivado en CSG. Por
lo tanto el objetivo de los estudios detallados en este capítulo fue determinar si los extractos
de polisacáridos de Ganoderma lucidum cultivado en sustrato de CSG, podrían ser utilizados
como fuentes de carbono y energía por cepas microbianas con propiedades probióticas.

4.2.1 Obtención de extractos de polisacáridos
Como se indicó anteriormente (ver sección 2.2.10) los basidiocarpos de G. lucidum fue-
ron secados en estufa y posteriormente molidos a hebras utilizando una picadora comercial.
El basidiocarpo molido y seco se extrajo con 20 volúmenes de etanol (Dorwil) al 96%. Este
tratamiento no solo permite eliminar lípidos, sino también desactivar enzimas y remover algo
del material soluble, incluyendo azúcares simples, aminoácidos y fenoles. El material insolu-
ble remanente de la extracción alcohólica se secó en estufa a 60 ºC durante 24 horas y luego
se extrajo con 20 volúmenes de agua destilada durante 4 horas a 80 ºC, con agitación, dejando
reposar a temperatura ambiente durante 20 h. Esta operación se repitió 2 veces más. Cada
uno de los tres extractos se filtró con papel Whatmann (nº 41) y se reunieron en un pool.
Esta fracción (E1) constituye el extracto crudo, que por las características de la extracción
estará enriquecido en polisacáridos, pero también posee proteínas y carbohidratos de bajo
peso molecular. El pH de E1 se determinó en 5,9, por lo que para su utilización en los culti-
vos se lo llevó a 6,8.
La purificación de la fracción E1 prosiguió con una desproteinización mediante el reac-

tivo de Sevag (cloroformo:butanol 4:1, v/v). Luego se trató el extracto con α amilasa (cod.
A4551; Sigma) y se dializó (c.o. 14.000) durante 72 h; las primeras 48 h contra agua corriente
y las últimas 24 h contra agua destilada. Los polisacáridos se aislaron por precipitación con 4
89
CAPÍTULO 4
volúmenes de etanol en frío y se obtuvo un polvo (E2), de color marrón avellana, compuesto
principalmente por β-glucanos.
4.2.2 Microorganismos
En las experiencias se utilizaron cepas de bacterias lácticas provenientes de la colección

del laboratorio de Microbiología Industrial y de los Alimentos de la UNS (LMIA), aislados
durante estudios previos, destinados al aislamiento y selección de probióticos para uso vete-
rinario (Sica et al. 2010; Sica et al. 2012; Lopez Cazorla et al. 2014). También se utilizaron
cepas de especies probióticas aisladas de productos farmacéuticos para uso humano. En la
Tabla 20 se listan las cepas utilizadas en el estudio. Las cepas se conservaron a -70°C en
caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI, Britania, Argentina) con 20% de glicerol como crio-
protector. Previo a cada experiencia las cepas de bacterias lácticas fueron cultivadas en caldo
Mann, Rogosa Sharpe (MRS. Biokar, Francia), Bacillus subtilis se cultivó en BHI y S. boulardii
en caldo Extracto de levadura-Glucosa (YG) preparado a partir de sus componentes (2 %
glucosa, 0,5% Extracto de levadura, Britania, Argentina).
Tabla 20: Microorganismos empleados para los estudios de potencial prebiótico

Cepa Origen
Lactobacillus paracasei subsp. Tolerans F2* LMIA
Weissella viridescens F4* LMIA
Lactobacillus pentosus S14* LMIA
Pediococcus pentosaceus S17* LMIA
Pediococcus pentosaceus S18* LMIA
Enterococcus mundtii S20* LMIA
Total Flora
Bacillus subtilis
(Roux Ocefa)
Floratil (Temis
Saccharomyces cereviseae var. boulardii
Lostalo)
90
CAPÍTULO 4
* Genbank: FJ892726 al 46, http://www.ncbi.nim.nih.gov
4.2.3 Utilización del extracto crudo (E1) como medio de cultivo
En una primera etapa se intentó determinar si el extracto acuoso E1, sin ningún tipo de
agregado, podía sustentar el crecimiento de las cepas indicadas en la Tabla 20. Cada una de
las cepas se cultivó como se indica en 4.2.2 durante 24 horas a 30 ºC. Cinco mililitros de cada
cultivo se centrifugaron a 1.600 g, durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante, las células
se resuspendieron en agua destilada, se agitó en vortex durante 1 minuto y se volvió a cen-
trifugar. Esta operación se repitió 2 veces más para obtener un inoculo libre de nutrientes
provenientes del medio de cultivo. La absorbancia (densidad óptica, DO) de las suspensiones
se ajustó a una DO550 de 0,25 (108 cél/mL) (Thermo Spectronic Genesys 20, Thermo Elec-
tron Corporation, MA, USA). Tubos con 5 ml de E1 autoclavado, (15 min a 1 atm), pH
ajustado a 6,8, se inocularon con 100 µl de las suspensiones de las cepas. Los tubos se incu-
baron a 30 °C y diariamente se controló la aparición de turbidez comparando con controles
sin inocular. Las cepas se ensayaron por triplicado. Los resultados fueron consignados como
(++): turbidez evidente dentro de las 24 h de cultivo, (+): turbidez evidente entre las 48-72
h, (d): turbidez débil luego de 72 h de cultivo, (-): No se observó turbidez luego de 72 h.
4.2.4 Determinación de la cinética de crecimiento de las cepas de B. subtilis y S.

boulardii en el extracto E1
Para esta experiencia se seleccionaron cepas de las dos especies calificadas como pro-
bióticos de uso humano, B subtilis y S. boulardii. Cada uno de ellas se cultivó como se indica
en 4.2.2. En esta experiencia se incluyó Escherichia coli ATCC 25922 que es una cepa comensal
del intestino. Los inóculos se obtuvieron como se indica en 4.2.3. En esta oportunidad, tubos
Falcón con 35 ml de E1 estéril, con el pH ajustado a 6,8, se inocularon con 1 ml de la sus-
pensión de células. Se incluyeron controles sin inocular. Cada cepa se ensayó por triplicado.
Los tubos fueron incubados en forma estática en un baño termostatizado a 35 °C durante 24
hs. Periódicamente se tomaron alícuotas de 1 ml para leer la absorbancia a una longitud de
onda 580 (DO580) (en la cual se determinó la menor absorción del extracto, manteniendo
buena sensibilidad al recuento UFC/ml). Paralelamente en algunos tiempos se realizó el re-
cuento de viables en placa, para corroborar las absorbancias leídas. Para lo cual se aplicó un
micrométodo en multiplaca, 20 µl de la muestra se agregaron a microcubetas con 180 µl de
solución fisiológica estéril, se realizaron diluciones decimales sucesivas y se sembraron en
91
CAPÍTULO 4
Agar para Recuento en Placa (PCA, Merck, Alemania) por la técnica de diseminación en
superficie. Las placas se incubaron a 35 °C durante 48 horas. Se contaron todas las colonias,
y el resultado fue expresado como Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por mililitro.
Los valores de DO580 se graficaron vs tiempo en un gráfico de dispersión de donde se

obtuvo la recta de tendencia y la ecuación correspondiente, cuya pendiente se utilizó para
determinar la constante especifica de crecimiento (µ). A partir de la siguiente ecuación
Ln DOf = µ. 𝑡 + Ln DOi
donde DOf corresponde a la DO580 leída en el tiempo t y DOi la DO580 del tiempo
inicial. Por lo tanto la pendiente de la recta de tendencia obtenida será es igual a µ. A partir
de µ se calculó el valor del tiempo de generación o duplicación: g= 0,69/µ
4.2.5 Crecimiento con el extracto purificado E2
En esta experiencia se utilizó la cepa de Bacillus subtilis, que demostró mejor desempeño
en el extracto E1 y una cepa de E. coli. El extracto E2, obtenido como se indica en 4.2.1, se
trata de una fracción purificada conformada principalmente por polisacáridos de cadena larga
con enlaces glucosídicos tipo β. Por lo tanto se utilizó como ingrediente en un caldo basado
en el medio MRS (De Man, Rogosa y Sharpe) (De Man et al. 1960). En este caso se preparó
el MRS sin ninguna fuente de carbono (Su et al. 2007b), salvo extracto de levadura a una
concentración 0,05%, lo cual es la mitad de lo habitual en dicho medio (ver Anexo II), que
en este caso debería proveer micronutrientes y factores de crecimiento. Como fuente de car-
bono y energía se agregó 2% de extracto E2 liofilizado (MRSE2). Los inóculos de B subtilis y
E. coli provinieron de sendos cultivos de 24 h en MRS con glucosa, lavado y preparado como
se indica en 4.2.3. El caldo MRSE2 estéril fue inoculado con 100 µl de la suspensión. Los
cultivos se incubaron a 35 ºC durante 24 h. El crecimiento se monitoreó midiendo cada hora
la densidad óptica a 580 nm. Se incluyeron cultivos con glucosa en MRS2 como control
positivo y controles sin inocular. Se determinó la constante específica de crecimiento (µ)
como se indica en 4.2.4.

Por su consistencia leñosa y sabor amargo una de las formas más tradicionales para
consumir los carpóforos de G. lucidum es mediante infusiones, que incluyen un hervor pro-
longado del hongo seco y molido en hebras. De este modo el consumidor bebe la fracción
92
CAPÍTULO 4
acuosa, compuesta por los triterpenoides solubles en agua, proteínas, minerales y principal-
mente los glúcidos capaces de persistir al tratamiento térmico. Teniendo en cuenta esta forma
de consumo, en una primera etapa se decidió evaluar la capacidad de este extracto, para
sustentar el crecimiento de microorganismos con potencial probiótico.
4.3.1 Utilización del extracto crudo (E1) como medio de cultivo
En la Tabla 21 se muestran los resultados de la primera experiencia, donde se evaluó el

potencial del extracto E1 como medio de cultivo para varias cepas con potencial probiótico.
El extracto se empleó en la forma que se obtuvo, sin ningún agregado de nutrientes, ni mo-
dificación de la concentración de sus componentes.
Las cepas pertenecientes al grupo de las bacterias lácticas presentaron un comporta-

miento variable en el extracto E1. Una causa podría ser la baja concentración de mono y
disacáridos fermentables y la imposibilidad de utilizar glúcidos de mayor tamaño. Otra posi-
bilidad es que luego del tratamiento térmico prolongado es probable que algunos factores
nutricionales como vitaminas hayan disminuido en forma significativa. Es sabido que mu-
chos miembros de este grupo suelen presentar auxotrofias. Sin embargo, es una buena pers-
pectiva que cepas pertenecientes al género Lactobacillus (F2 y S19) o muy relacionadas filoge-
néticamente al mismo como Weisella (F4), y cepas del género Pediococcus, hayan mostrado
crecimiento en E1. La cepa de Bacillus subtilis proveniente de un producto farmacéutico, fue
la más eficiente y mostró crecimiento en las primeras 24 h de cultivo. Las características
metabólicas de este género y su gran potencial enzimático probablemente le dieron ventajas
sobre las demás cepas (Ludwig et al. 2009).
93
CAPÍTULO 4
Tabla 21: Crecimiento de cepas probióticas en E1
Cepas Crecimiento*
F2 Lb. paracasei +
F4 Weissella viridescens +
F9 Weissella viridescens -
F10 Weissella viridescens d
F11 Weissella viridescens -
S14 Lb. pentosus -
S15 Lb pentosus -
S17 Pediococcus pentosaceus +
S18 Pediococcus pentosaceus d
S19 Lactobacillus pentosus ++
S20 Enterococcus mundtii -
S21 Enterococcus mundtii -
Sacharomyces Cereviceae var boulardii +
Bacillus subtilis ++
* (++): turbidez evidente dentro de las 24 h de cultivo, (+): turbidez evidente entre las 48 y 72
h, (d): turbidez débil luego de 72 h, (-): no se observó turbidez luego de 72 h.
4.3.2 Determinación de la cinética de crecimiento de cepas de B. subtilis y S. bou-

lardii en el extracto E1
Esta experiencia tuvo el objetivo de determinar la cinética de crecimiento que las cepas
ensayadas podían expresar en el extracto E1. Este estudio se realizó con dos cepas probióti-
cas destinadas a en uso humanos, de las especies B subtilis y S. boulardii. Además se incluyó E.
coli ATCC 25922; esta cepa no patógena es parte de una especie de amplia distribución como
comensal del intestino de los animales homeotermos. Las Figuras 38, 39 y 40 muestran las
rectas obtenidas DO580 vs tiempo. Para la determinación de la cinética, se utilizaron solo los
puntos dentro de la fase exponencial para cada cepa. La Tabla 22 muestra un resumen de
los resultados obtenidos en esta experiencia.
Bacillus subtilis y E. coli mostraron mayor velocidad de crecimiento en E1 que S. boulardii.

Este hecho es lógico ya que S boulardii es eucariota, y estos organismos por lo general poseen
tiempos de duplicación mayores que los procariotas. La respuesta de B subtilis es coincidente
con lo observado en la primera experiencia.
94
CAPÍTULO 4
horas
0.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00
-0.50
-1.00
y = 0.1838x - 3.5033
Ln DO580
R² = 0.9593
-1.50
-2.00
-2.50
-3.00
Fase Exponencial Fase Estacionaria
Figura 38: Crecimiento de B. subtilis en el extracto E1
horas
0.00
-0.50 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00
-1.00
-1.50
Ln DO580
-2.00 y = 0.0727x - 4.5154

-2.50 R² = 0.938
-3.00
-3.50
-4.00
-4.50
Fase Exponencial
Figura 39: Crecimiento de Saccharomycces cereviceae var boulardii en el extracto E1
95
CAPÍTULO 4
0.00
0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00horas35.00
-0.50
-1.00
y = 0.2099x - 3.6248
Ln DO 580
R² = 0.9533
-1.50
-2.00
-2.50
-3.00
Fase Exponencial Fase Estacionaria
Figura 40: Crecimiento de E. coli en el extracto E1
Tabla 22: Parámetros de crecimiento obtenidos en el extracto E1
Cepa µ (h-1) g (h)=0,69/µ

B subtilis 0,184 3.75
S. boulardii 0.073 9.45
E. coli 0.210 3.28
La velocidades de crecimiento de B subtilis y E. coli observadas en E1 son menores a las

usualmente observadas en medio nutritivos con glucosa. Este resultado probablemente sea
causado por la presencia de nutrientes más complejos y/o por la necesidad de sintetizar algún
factor de crecimiento ausente en el medio. El hecho de que el extracto también puede ser
utilizado por un miembro habitual de la microbiota intestinal, podría verse como una pérdida
de la “exclusividad” del sustrato, sin embargo, E. coli cumple importantes funciones en el
intestino, entre ellas, la síntesis de las vitaminas K2 y B12. Además, las cepas patógenas de
este grupo suelen tener perfiles metabólicos distintos. De todas formas, sería importante
profundizar estos resultados en futuros estudios. Los cambios de pH detectados en el medio
(Figura 41), indican que probablemente E coli utilizó otro tipo de nutrientes distinto a los
glúcidos y/o los glúcidos que pudo utilizar eran insuficientes para sustentar el crecimiento,
96
CAPÍTULO 4
optando por otras fuentes, probablemente proteicas. Tanto B. subtilis como S. boulardii gene-
raron un cambio significativo de pH, haciendo suponer la fermentación de glúcidos.
6.75
pH 6.5 S boulardi
B subtilis
6.25 E. coli
6
0 10 23 30
horas
Figura 41: Variaciones de pH determinadas en E1 durante el cultivo con las distintas

cepas
Una opción para beneficiar directamente al desempeño de una cepa probiótica, sería que
prebiótico y probiótico se consuman juntos en un simbiótico. Esto favorecería que el pro-
biótico sea el primero en utilizar el extracto, frente a otras cepas presentes en el intestino.
4.3.3 Crecimiento de B. subtilis con la fracción purificada E2
En la Figura 42 se observa el crecimiento de B. subtilis en el MRS modificado, con el

extracto purificado E2 (MRSE2) y con glucosa (MRS2). La velocidad específica de creci-
miento (µ) obtenida en E2 es de 0,227 h-1, lo cual corresponde a un tiempo de generación (g)
de 3 h. Con glucosa se determinó una µ de 0,58 h-1, que corresponde a un g de 1,20 h. Estas
diferencias son razonables teniendo en cuenta la fácil asimilación de la glucosa por estos
microorganismos. No se observó crecimiento de la cepas de E. coli, en el MRSE2, en el
tiempo de la experiencia, y en el medio con glucosa se obtuvo una µ de 0,80 h-1.
El desempeño de B. subtilis en el cultivo con el Extracto E2, fortalece la hipótesis que

esta cepa es capaz de hidrolizar los polisacáridos de cadena larga con enlaces glucosídicos β
de la fracción acuosa de los extractos de G. lucidum.
97
CAPÍTULO 4
0.00
0 1 2 3 4 5 Horas 6
-0.50
-1.00 y = 0.5869x - 3.569

R² = 0.9628
Ln DO 580 -1.50
-2.00
-2.50 y = 0.2276x - 2.8404

R² = 0.9357
-3.00
-3.50
Glucosa E2
Figura 42: Crecimiento de B. subtilis en glucosa y E2
4.4 CONCLUSIONES
La utilización del extracto crudo E1 por parte de miembros del grupo de las bacterias
lácticas, con potencial probiótico, pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Pediococcus y Wei-
sella (cepas F2, F4, S17, y S19), así como cepas de otros organismos probióticos provenientes
de productos farmacéuticos presentes en el mercado nacional (Bacillus subtilis y Saccharomyces
cereviceae var. boulardii), abre una buena perspectiva para el estudio de los extractos acuosos de
G. lucidum cultivado en sustrato base de CSG como prebióticos. Cabe destacar que el proceso
para obtener el extracto acuoso crudo es económico, puede liofilizarse (resultados no mos-
trados), incorporarse a los alimentos o asociarse al probiótico en un nuevo producto. La
cinética de crecimiento obtenida por B. subtilis en el extracto purificado E2, indica que los
polisacáridos de G. lucidum pueden ser utilizados por la cepa probiótica y generar un creci-
miento aceptable comparado con la glucosa.
Estos resultados justifican y sirven de base para ampliar los estudios, los cuales son ne-
cesarios para profundizar el conocimiento sobre la utilización de los β-glucanos de G. lucidum
por cepas microbianas probióticas, ampliar a mayor cantidad de cepas, evaluar los efectos
sobre la actividad competitiva del probiótico frente a patógenos y determinar in vivo la pre-
sencia de efectos inmunomudulares en el hospedador.
98
CAPÍTULO 5
CAPÍTULO 5:
FORMULACIÓN Y CARACTERIZACIÓN
DE UNA SUSPENSIÓN HIDROALCOHÓ-
LICA
5.1 INTRODUCCIÓN
5.1.1 Productos a base de Ganoderma lucidum
La Medicina Tradicional China (MTC) mantiene como uno de los ejes centrales de su
filosofía, que la efectividad de una droga natural en su acción medicinal no es producto de
un único componente químico claramente definido, sino que se debe a la acción sinérgica de
las muchas sustancias que la componen (Williamson 2001; Rather et al. 2013). Este concepto
también se aplica a la fitomedicina moderna. En muchos casos se ha observado que la po-
tencia de los extractos naturales disminuye a medida que continúa la purificación hacia frac-
ciones más aisladas o compuestos específicos (Carmona y Pereira 2013). Los efectos sinérgi-
cos no solo implican una mayor efectividad y potencia, sino que también reducen los efectos
adversos y evitan posibles resistencias al actuar por múltiples vías (Rather et al. 2013).
El principio de sinergia cobra especial relevancia en el caso de Ganoderma lucidum, por su

composición compleja y por ser una de las principales especies medicinales utilizadas por los
practicantes de la MTC tanto en China como en Europa (Williamson et al. 2013). Son varias
las investigaciones que sugieren que al menos algunos de los efectos beneficiosos de G. luci-
dum y otros hongos medicinales se deberían a la acción conjunta de dos o más grupos de
compuestos (Bishop et al. 2015). Por ejemplo, en la actividad anti-cancerígena, distintos com-
puestos de G. lucidum modulan diferentes mecanismos no relacionados entre sí (Russell y
Paterson 2006). Es así como la actividad citotóxica de algunos triterpenoides (ácidos gano-
déricos Z, Y, X, W, V, T; lucialdehídos A, B, C) (Wu et al. 2001; Lindequist et al. 2005)
sumada a la acción inmunoestimulante, antitumoral y antimutagénica de algunos polisacári-
dos de alto peso molecular (Wasser 2002), sería responsable de las propiedades observadas
tanto en modelos animales in vivo como en ensayos clínicos (Wasser 2005). La actividad an-
tiviral de G. lucidum es otro ejemplo de la acción conjunta de varios compuestos sobre distin-
99
CAPÍTULO 5
tas dianas. Esta acción se debería al efecto directo de moléculas de bajo peso molecular (tri-
terpenoides como el ganoderiol F, ganodermanontriol y ácido ganodérico B) sobre las enzi-
mas virales y la síntesis de ácidos nucleicos virales, sumado al efecto indirecto inmunomodu-
lador de los polisacáridos (Lindequist et al. 2005)
Entre el 80 y el 85% de todos los productos de hongos medicinales son obtenidos del
carpóforo (Lindequist et al. 2005). Aunque comestible, el carpóforo de G. lucidum es duro,
leñoso y amargo. La biodisponibilidad de sus compuestos bioactivos sería poca o nulamente
aprovechada por su consumo directo. Es por ello que el carpóforo se consume habitualmente
en forma de infusiones. Sin embargo, para lograr una adecuada extracción de los principios
activos se requieren largos tiempos de extracción con agua caliente (dos horas o más), lo que
limita su consumo a solo la parte más dedicada de la población. Esta es una de las razones
por la que existen en el mercado diversas formulaciones de G. lucidum que acercan sus pro-
piedades benéficas al resto de la población, que de otra manera no estaría dispuesta a su
consumo. Hay un gran número de productos de G. lucidum disponibles, variando en la parte
del hongo procesada, el método de extracción y también el modo de administración (Bishop
et al. 2015). Entre ellos podemos encontrar comprimidos, cápsulas, formas farmacéuticas
acuosas, alcohólicas e hidroalcohólicas, y distintos tipos de presentaciones cosemecéuticas
como jabones, cremas y champús (Figura 43 y Tabla 23). Sin embargo, la mayoría de las
presentaciones que existen en el mercado se enfocan principalmente en uno u otro grupo de
compuestos. Es así que encontramos presentaciones enfocadas en los polisacáridos (compri-
midos, cápsulas, polvos liofilizados) o en los triterpenoides (tinturas). Debido a las diferentes
estructuras químicas y propiedades fisicoquímicas de los principales grupos bioactivos pre-
sentes en G. lucidum, estos compuestos son solubles en diferentes solventes, siendo por ejem-
plo los polisacáridos solubles en agua, mientras que los triterpenoides lo son preferentemente
en solventes más apolares. La solubilidad diferencial de estos grupos de compuestos explica
en parte porque es difícil encontrar en el mercado actual productos que contengan más de
una fracción en una misma formulación.
100
CAPÍTULO 5
Figura 43: Distintos productos a base de Ganoderma lucidum (Lee y Chang 2016).
101
CAPÍTULO 5
Tabla 23: Algunos productos basados en Ganoderma disponibles en el mercado, con sus
beneficios reportados (Batra et al. 2013).
Productos comerciales Componentes Beneficios

DXN Ganoderma (RG y GL) Cápsulas con extractos de G. Suplementos para la sa-
lucidum lud
Organo Gold Ganoderma Cápsulas Suplementos para la sa-
lud
Organo Gold Ganoderma luci- Contiene extracto de micelio Refuerza el sistema in-
dum mycelium capsules de G. lucidum mune
Organo Gold organic Contiene extracto de polvo Refuerza el sistema in-
Ganoderma spores capsules de espora (pared-rota) de G. mune
lucidum
Reishi mushroom powder Extracto 100% concentrado Incrementa el sistema in-
de G. lucidum mune
Ganoderma HG capsule Contiene extracto de Coriolus Mejora la inmunidad,
versicolor, extracto de G. luci- previene el hígado al-
dum y polvo de esporas con cohólico y el hígado
pared rota graso
Reishi (Gano) immune and Contiene extracto de hongo Mejora la función in-
energy support tea Ganoderma y té negro mune y beneficia el
sueño y la memoria
Ganoderma chocolateTM Contiene Ganoderma combi- Incrementa el sistema in-
nado con cacao mune
Ganoderma 2-in-1TM classic Contiene café suplementado Mejora la energía y la re-
café style black cofee con extractos de Ganoderma sistencia, alivia dolores
musculares y de articula-
ciones
Ganozhi toothpaste Contiene extracto de Ganode- ----
rma
Gano massage oil Contiene extractos de Gano- Mejor para lesiones le-
derma y aceite de palma. ves, quemaduras y ca-
lambres
102
CAPÍTULO 5
Productos comerciales Componentes Beneficios

Ganozhi shampoo pH balanceado con extracto Nutre el folículo capilar
de Ganoderma y vitamina B5 y promueve el creci-
miento de nuevo cabello
5.1.2 Formulación de una suspensión hidroalcohólica
Al mezclar en partes iguales un extracto acuoso con otro alcohólico de G. lucidum, parte
de los compuestos presentes en las soluciones originales precipita, ya que no son solubles en
la mezcla hidroalcohólica resultante. Esta fracción insoluble podría eliminarse por filtración
o directamente realizando la extracción con solventes hidroalcohólicos (“tinturas”). Sin em-
bargo, cualquiera de estas dos opciones no ponderaría una cantidad indeterminada de com-
puestos que podrían tener influencia sobre la efectividad del producto final. Una opción que
permitiría conservar a este grupo de compuestos sería mediante la formulación de una sus-
pensión hidroalcohólica por el agregado de un agente viscosante. La Farmacopea Interna-
cional en su cuarta edición (World Health Organization 2006), define a una suspensión oral
como “preparaciones líquidas para uso oral que contienen uno o más ingredientes activos
suspendidos en un vehículo apropiado. Para suspensiones orales que contienen más de un
ingrediente activo, algunos de los de ellos pueden estar en solución”. En este caso la formu-
lación estaría formada por un vehículo hidroalcohólico, un agente estabilizante de la suspen-
sión, los compuestos de G. lucidum solubles en la mezcla hidroalcohólica y los compuestos
insolubles en la mezcla suspendidos de manera homogénea en el vehículo. La dispersión
homogénea de los compuestos insolubles es fundamental para asegurar la uniformidad de
contenido (Barker 2013). Los agentes estabilizantes de la suspensión suelen ser agentes vis-
cosantes que impiden o retrasan la sedimentación de los compuestos insolubles dispersos
(Alonso González 1999). Al momento de formular una suspensión se deben considerar dos
factores: la velocidad de sedimentación y la redispersabilidad del sedimento (Barker 2013).
Una baja velocidad de sedimentación sería óptima; sin embargo, la redispersabilidad del se-
dimento es más importante para asegurar una exactitud de dosis reproducible.
En el caso de la formulación de una suspensión hidroalcohólica de G. lucidum es impor-

tante contar con un agente espesante que sea compatible tanto con el agua como el alcohol.
Los Carbomer® (o Carbopol®) son polímeros reticulados del ácido poliacrílico que tienen
la capacidad de absorber y retener agua. Los códigos de Carbomer (934, 934P, 940, etc.) son
indicativos de su peso molecular y componentes específicos del polímero. Carbomer® tiene
la capacidad de formar geles tanto en agua, como en alcohol o una mezcla de ambos, por lo
103
CAPÍTULO 5
que resulta un agente con gran potencial para ser utilizado en la formulación de una suspen-
sión hidroalcohólica de G. lucidum.
5.1.3 Objetivo
Evaluar la formulación de un producto físicamente estable, que contenga la mayor can-

tidad de compuestos bioactivos del basidiocarpo de G. lucidum disueltos o suspendidos de
manera homogénea en el vehículo.
5.1.4 Objetivos particulares
1. Caracterizar dos extractos del carpóforo de Ganoderma lucidum, uno acuoso y otro
alcohólico, y cuantificar la cantidad de compuestos de cada grupo que precipita en
una mezcla 1:1 de estos extractos.
2. Comparar el producto final, una suspensión hidroalcohólica de administración oral,
con un extracto hidroalcohólico y una infusión acuosa evaluando diferencias cuan-
titativas en la composición que puedan justificar el procesado extra de la formula-
ción.
3. Estudiar la formulación y estabilidad física de la suspensión hidroalcohólica, selec-
cionando la concentración adecuada de Carbomer® 940.

5.2.1 Extracción alcohólica
Para obtener los extractos alcohólicos se maceró una cantidad determinada de basidio-
carpo seco y molido, obtenido en la primera oleada de un cultivo en cáscara de semilla de
girasol sin aditivos (ver Capítulo 2), con 20 volúmenes de etanol (Dowil, 96%) durante 24
horas. El extracto alcohólico se recuperó por centrifugación y se filtró con papel de filtro
tipo Whatman (nº 41). Una parte del extracto se utilizó para la obtención de la mezcla hi-
droalcohólica y el resto se almacenó a -18 ºC para posteriores determinaciones. El marco
sólido remanente se conservó para realizar la extracción acuosa. Los extractos alcohólicos se
prepararon por cuadriplicado.
5.2.2 Extracción acuosa
El marco remanente de la extracción alcohólica se secó en estufa a 60 ºC durante 24

horas. La extracción se realizó con 20 volúmenes de agua destilada, calentando a 80 ºC, con
agitación moderada, durante 4 horas. Luego se dejó reposar a temperatura ambiente durante
104
CAPÍTULO 5
20 horas. El extracto acuoso se recuperó por centrifugación y se filtró con papel de filtro
tipo Whatman (nº 41). Una parte del extracto se utilizó para la obtención de la mezcla hi-
droalcohólica, y el resto se almacenó a -18 ºC para posteriores determinaciones. Los extractos
acuosos se obtuvieron por cuadriplicado.
5.2.3 Extracción hidroalcohólica
Una cantidad determinada de basidiocarpo seco y molido, obtenido en la primera oleada

de un cultivo en cáscara de semilla de girasol sin aditivos, se extrajo con 20 volúmenes de
una mezcla (1:1) de agua destilada y etanol (96%), por digestión a 80 ºC, con agitación mo-
derada, durante 4 horas. A continuación se dejó reposar a temperatura ambiente durante 20
horas. El extracto se separó del marco por centrifugación, se filtró con papel de filtro tipo
Whatman (nº 41) y se almacenó a -18 ºC para posteriores determinaciones. La extracción
hidroalcohólica se realizó por cuadriplicado.
5.2.4 Preparación de la infusión
Para preparar la infusión se agregaron 20 partes de agua destilada a una cantidad deter-
minada de basidiocarpo seco y molido, obtenido en la primera oleada de un cultivo en cáscara
de semilla de girasol sin aditivos, y se calentó a 80 ºC durante dos horas. A continuación se
clarificó por centrifugación y filtración con papel de filtro tipo Whatman (nº 41). Las infu-
siones se obtuvieron por cuadriplicado.
5.2.5 Obtención de la mezcla hidroalcohólica
La mezcla hidroalcohólica se obtuvo por combinación de los extractos alcohólicos y

acuoso en una relación 1:1. Se dejó en reposo un par de horas y se observó la aparición de
un precipitado insoluble. La mezcla se clarificó por centrifugación y se almacenó a -18 ºC
para posteriores determinaciones. El sedimento se secó en estufa a 60 ºC durante 24 horas y
se conservó para su redisolución. Las mezclas hidroalcohólicas se realizaron por cuadripli-
cado.
5.2.6 Redisolución del precipitado insoluble de las mezclas hidroalcohólicas
El sedimento insoluble en la mezcla hidroalcohólica, previamente secado, se redisolvió

en agua destilada utilizando un volumen equivalente al que se encontraba disuelto original-
mente. La porción insoluble en agua se recuperó por centrifugación y se secó en estufa a 60
ºC durante 24 horas. Este precipitado insoluble en agua se disolvió en un volumen de etanol
96º equivalente al volumen original, observándose la completa disolución del mismo.
105
CAPÍTULO 5
De esta forma se obtuvieron dos soluciones, una acuosa y otra alcohólica, por cada ré-
plica de la mezcla hidroalcohólica. Estas soluciones contienen los compuestos insolubles en
la mezcla de los extractos en proporción 1:1, en una concentración igual a la del extracto
original.
5.2.7 Caracterización química
Se realizaron las siguientes determinaciones en el extracto acuoso, extracto alcohólico,

extracto hidroalcohólico, infusión, mezcla hidroalcohólica, solución de compuestos insolu-
bles en la mezcla y solubles en agua y solución de compuestos insolubles en la mezcla y
solubles en etanol.
5.2.7.1 Residuo sólido
El contenido de residuo sólido se determinó por evaporación del solvente en estufa a

60 ºC hasta peso constante. La determinación se realizó por triplicado.
5.2.7.2 Contenido de triterpenoides totales
Los triterpenoides totales se cuantificaron de acuerdo a lo descripto en la sección 3.2.4.

La determinación se realizó por cuadriplicado.
5.2.7.3 Contenido de carbohidratos de alto peso molecular
Esta determinación se realizó solo para los extractos o soluciones acuosas e hidroal-
cohólicas, y no se realizó para los extractos o soluciones alcohólicas.
Para valorar el contenido de carbohidratos de alto peso molecular se tomó una alícuota
conocida de muestra y se dializó durante 3 días con membrana de diálisis (c.o. 14.000 MW)
contra agua corriente (dos días) y agua destilada (un día) para los extractos acuosos, o contra
una solución de etanol (96º):agua (1:1) para los extractos hidroalcohólicos.
La determinación se realizó de acuerdo al protocolo detallado en la sección 3.2.6. La

determinación se realizó por cuadriplicado.
5.2.7.4 Contenido de compuestos fenólicos
La cuantificación de compuestos fenólicos se realizó de acuerdo a lo descripto en la

sección 3.2.7. La determinación se realizó por cuadriplicado.
106
CAPÍTULO 5
5.2.8 Formulación de la suspensión hidroalcohólica
Para obtener las suspensiones hidroalcohólicas se utilizó un extracto alcohólico y un

extracto acuoso preparados con se describió previamente (secciones 5.2.1 y 5.2.2). Para
estabilizar la suspensión se probaron cuatro concentraciones distintas de Carbomer® 940
(0,1%, 0,3%, 0,5% y 1,0%). Se tomaron 50 mL del extracto acuoso y se agregó lentamente
Carbomer® en cantidad suficiente para alcanzar la concentración deseada en el producto
final. Se agitó bien para favorecer una distribución homogénea y se dejó reposar al menos
una hora. A continuación se agregó lentamente y manteniendo agitación, 50 mL del extracto
alcohólico para obtener la suspensión hidroalcohólica final. Las suspensiones hidroalcohóli-
cas estabilizadas se almacenaron en frascos de vidrio color caramelo de 200 mL a temperatura
ambiente.
5.2.9 Viscosidad
El efecto de las distintas concentraciones de Carbomer® 940 sobre la viscosidad diná-

mica de las suspensiones hidroalcohólicas se determinó en un reómetro rotacional Paar Phy-
sica modelo MCR301 (Anton Paar GmbH, Austria), usando una geometría de platos parale-
los (diámetro 50 mm, separación 2 mm), con control de temperatura. Se colocó una alícuota
de la suspensión en el plato inferior del reómetro. El plato superior se hizo descender hasta
la muestra y se removió el exceso de la misma. La viscosidad dinámica se midió a 20 ºC para
una tasa de corte de entre 1 y 100 1/s. Estas determinaciones se realizaron en el Área de
Ingeniería de Alimentos de la Planta Piloto de Ingeniería Química (PLAPIQUI) bajo la su-
pervisión del Dr. Diego Genovese.
5.2.10 Sedimentación acelerada
Se realizó una prueba acelerada de la estabilidad de la suspensión evaluando el efecto de

la fuerza centrífuga sobre la misma. Se colocaron 10 mL de cada muestra en un tubo de
vidrio y se centrifugó durante 1 min (Labofuge 200, Kendra, Alemania), a mayores g cada
vez, buscando signos visibles de sedimentación. La aparición de sedimentación se evaluó
visualmente de acuerdo a la siguiente escala: (-) no hay sedimentación visible, (+/-) ligera
sedimentación, (+) sedimentación que se redispersa fácilmente con agitación moderada, (++)
marcada sedimentación que redispersa con agitación moderada, (+++) marcada sedimenta-
ción que no redispersa con agitación moderada.
107
CAPÍTULO 5
5.2.11 Estabilidad física de la suspensión
La estabilidad física de la suspensión se evaluó a los 3, 11 y 60 días. El comportamiento

de sedimentación se midió como la relación entre la altura del sedimento (hs) y la altura ori-
ginal de la suspensión (h0) para 15 mL de suspensión guardados en tubos de vidrio de fondo
plano de 15 mL y 5 cm de altura (Barker 2013).
5.2.12 Análisis de datos
Los datos de los ensayos fueron analizados por análisis de varianza de un factor
(ANOVA). La separación de los valores medios se realizó mediante el test de Tukey. Para
realizar las comparaciones los resultados se agruparon en contenido teórico o esperado de la
mezcla (contenido en el extracto alcohólico + contenido en el extracto acuoso) y contenido
real de la mezcla (contenido en la mezcla hidroalcohólica + contenido en la solución de
precipitado insoluble en la mezcla y soluble en agua + contenido en la solución de precipitado
insoluble en la mezcla y soluble en etanol). Diferencias estadísticamente significativas entre
el contenido esperado y real de las mezclas, indicarían posibles errores durante su prepara-
ción. Los resultados se expresan como la media ± el desvío estándar de un volumen equiva-
lente a 10 mL del extracto original. Es necesario tener en cuenta que en el caso de las mezclas,
durante su preparación se produce una dilución a la mitad (el contenido de 10 mL del extracto
original se encuentra en 20 mL de la mezcla), por lo que, a fines comparativos, los gráficos
se refieren al contenido en 20 mL de mezcla. Los análisis se efectuaron utilizando el software
Infostat.

El proceso propuesto, en trámite de patentamiento, para la obtención de la suspensión
hidroalcohólica de G. lucidum, comienza con la maceración del basidiocarpo seco y molido
con una cantidad apropiada de alcohol 96% durante 24 horas hasta asegurar la mayor extrac-
ción de compuestos posible. A continuación se realiza una decocción con un volumen apro-
piado de agua, calentando durante 4 horas para asegurar la mayor extracción de compuestos
posible. Finalmente se mezclan ambos extractos, previamente filtrados para eliminar partí-
culas remanentes de la extracción, en proporciones iguales, agregando como agente visco-
sante Carbomer® 940 en una concentración adecuada para asegurar la estabilidad de la sus-
pensión formada.
108
CAPÍTULO 5
5.3.1 Contenido de residuos sólidos
El residuo sólido representa el contenido total de compuestos presentes en los extractos

y las formulaciones. En la Figura 44 se compara el valor esperado de residuo sólido en 20
mL de las mezclas (1:1) o 10 mL de los extractos originales. El extracto acuoso aporta casi el
70% de los compuestos totales presentes en la mezcla final. Por otro lado, al mezclar ambos
extractos en partes iguales, alrededor del 9% de los compuestos totales presentes en uno u
otro extracto, precipitan. Aunque pequeña, esta fracción de compuestos insolubles es esta-
dísticamente significativa (p < 0,05) y es responsable del fuerte enturbiamiento observado al
realizar la mezcla. De los compuestos que precipitan, la mayor parte (77%) proviene del
extracto alcohólico.
No se observaron diferencias significativas (p > 0,05) entre los contenidos de residuo

seco del extracto hidroalcohólico, la infusión y la mezcla clarificada, pero el contenido de los
tres fue ligeramente menor (p < 0,05) que el de la suspensión.
180.00
160.00 A
C
140.00 AB BC
BC
120.00
mg Residuo sólido
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
Esperado Suspensión Hidroalcohólico Mezcla clarificada Infusión
Etanólico Acuoso
Etanol - Agua (50:50) Mezcla hidroalcohólica (50:50) (clarificada)
Infusión Insoluble en mezcla (soluble en etanol)
Insoluble en mezcla (soluble en agua)
En las mezclas se considera un volumen de 20 mL para compensar el efecto de dilución a la mitad propio la
preparación. Valores con una misma letra no difieren significativamente de acuerdo a la prueba de Tukey (p >
0,05).
109
CAPÍTULO 5
Figura 44: Contenido de residuo sólido en un volumen equivalente a 10 mL del extracto

original de distintos extractos y preparaciones.
5.3.2 Contenido de triterpenoides totales
La Figura 45 muestra el contenido de triterpenoides totales en 20 mL de las mezclas

(1:1) o 10 mL de los extractos originales. El extracto alcohólico fue el responsable del mayor
aporte de triterpenoides a la mezcla (más del 80%). Por otro lado, alrededor de un 30% de
los triterpenoides, la mayoría proveniente del extracto alcohólico, no son solubles en solu-
ciones hidroalcohólicas y precipitaron al realizar la mezcla. Además, del total de compuestos
que precipitan durante la mezcla, los triterpenoides representaron más del 40% del total.
Estos resultados implican que una alta proporción de los triterpenoides totales, uno de los
principales grupos bioactivos de G. lucidum, se perdería durante la clarificación de la mezcla.
Se observaron también diferencias significativas en el contenido de triterpenoides totales

del extracto hidroalcohólico y la infusión. El contenido de ambos fue menor (p < 0,05) que
el de la suspensión hidroalcohólica, y a su vez el de la infusión fue un 58% menor (p < 0,05)
que el del extracto hidroalcohólico.
25.00
20.00 A A
mg Eq ácido ursólico
B B
15.00
10.00
C
5.00
0.00
Etanólico Acuoso
110
CAPÍTULO 5
0,05).
Figura 45: Contenido total de triterpenoides en un volumen equivalente a 10 mL del

extracto original de distintos extractos y preparaciones.
5.3.3 Contenido de carbohidratos de alto peso molecular
La Figura 46 muestra el contenido de carbohidratos del alto peso molecular en 20 mL

de las mezclas (1:1) o 10 mL de los extractos originales. Los carbohidratos de alto peso mo-
lecular corresponden principalmente a polisacáridos y proteoglucanos. La cantidad de car-
bohidratos de alto peso molecular que precipitan por la mezcla (1:1) de los extractos acuosos
y alcohólicos no fue estadísticamente significativa (p > 0,05). En cuanto a la comparación de
los distintos extractos y preparación, la infusión mostró un contenido significativamente ma-
yor (p < 0,05) que el extracto hidroalcohólico y la mezcla clarificada.
4.50
A
4.00
3.50
AB
B
3.00
B B
mg Eq. de glucosa
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
Etanólico Acuoso
0.05).
111
CAPÍTULO 5
Figura 46: Contenido de carbohidratos de alto peso molecular en un volumen equiva-

lente a 10 mL del extracto original de distintos extractos y preparaciones.
El contenido de compuestos fenólicos en 20 mL de las mezclas (1:1) o 10 mL de los

extractos originales se muestra en la Figura 47. El extracto acuoso aportó la mayor cantidad,
alrededor del 70%, de compuestos fenólicos a la mezcla (1:1). Casi el 19% de los compuestos
fenólicos precipitaron al realizarse la mezcla siendo este valor estadísticamente significativo
(p < 0,05). De los compuestos fenólicos que precipitaron, la mayor parte (81%) pertenecían
al extracto alcohólico. Por otro lado el contenido de compuestos fenólicos en el extracto
hidroalcohólico fue menor al contenido en la suspensión, pero no se observaron diferencias
entre la suspensión y la infusión.
3.50
A A A
3.00
B B
2.50
mg Eq. de ácido gálico
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
Etanólico Acuoso
0,05).
Figura 47: Contenido de compuestos fenólicos totales en un volumen equivalente a 10 mL del

extracto original, de distintos extractos y preparaciones.
112
CAPÍTULO 5
5.3.5 Sedimentación acelerada, estabilidad de la suspensión y reología
La caracterización química de los extractos y las preparaciones mostró que una cantidad
apreciable de los triterpenoides y compuestos fenólicos, dos de los principales grupos bioac-
tivos de G. lucidum, se pierden durante la preparación y clarificado de una mezcla (1:1) de los
extractos acuoso y alcohólico. Esta pérdida puede evitarse mediante la formulación de una
suspensión que mantenga a estos compuestos dispersos de manera homogénea en el prepa-
rado. La suspensión puede lograrse mediante el agregado de un agente viscosante. En este
caso se evaluaron los efectos de distintas concentraciones de Carbomer® 940 (0,1, 0,3, 0,5 y
1%) sobre la estabilidad y reología de la suspensión.
Lo estudios de sedimentación acelerada permiten predecir rápidamente la estabilidad de

la suspensión en el tiempo. En la Tabla 24 se muestra la estabilidad acelerada de las suspen-
siones hidroalcohólicas estabilizadas con distintas concentraciones de Carbomer® 940. Para
una concentración de 1% no se observaron cambios en la suspensión para todas las fuerzas
g evaluadas.
Tabla 24: Aspecto de una suspensión hidroalcohólica con distintas concentraciones de

Carbomer® 940 luego de la aplicación de una fuerza centrífuga durante 1 minuto
Concentración de Carbomer® 940

g 0,10% 0,30% 0,50% 1,00%
114,5 ++ - - -
144,9 ++ +/- - -
178,9 ++ +/- - -
216,4 ++ +/- +/- -
257,6 +++ +/- +/- -
302,3 +++ + +/- -
350,6 +++ +++ +/- -
402,5 +++ +++ +/- -
547,8 +++ +++ ++ -
(-) no hay sedimentación visible, (+/-) ligera sedimentación, (+) sedimentación que se redispersa
fácilmente con agitación moderada, (++) marcada sedimentación que redispersa con agitación mo-
derada, (+++) marcada sedimentación que no redispersa con agitación moderada.
La Tabla 25 muestra la altura de sedimentación en las suspensiones con distintas con-

centraciones de Carbomer® 940 en 3, 11 y 60 días desde su preparación. Para una concen-
tración de 0,1% se observó una rápida sedimentación de las partículas en suspensión, que
fue total en menos de 3 días. En el otro extremo, para una suspensión estabilizada con 1%
113
CAPÍTULO 5
de Carbomer® 940 no se observó sedimentación apreciable en el periodo estudiado (60 días).

Para el resto de las concentraciones estudiadas se produjo sedimentación completa de las
partículas en suspensión antes de los 60 días desde la preparación pero, para las concentra-
ciones 0,3 y 0,5% el sedimento se resuspendió fácilmente con agitación leve a moderada. Sin
embargo, para una concentración de 0,1% se requirió una agitación vigorosa para lograr una
adecuada resuspensión del sedimento.
Tabla 25: Altura de sedimentación relativa de una suspensión hidroalcohólica con dis-
tintas concentraciones de Carbomer® 940 a los 3, 11 y 60 días desde su preparación.
Altura de sedimentación relativa

(hs/h0)
Concentración 3 días 11 días 60 días

0,10% 0,2 0,2 0,2
0,30% 0,84 0,3 0,2
0,50% 0,9 0,56 0,2
1,00% 1 1 1
Los estudios reológicos de las suspensiones con distintas concentraciones de Car-

bomer® 940 (Figura 48) muestran un comportamiento no Newtoniano del tipo pseudo-
plástico. Este comportamiento es el ideal para la formulación de una suspensión ya que pre-
senta alta viscosidad a bajas velocidades de cizalladura (durante almacenamiento), y baja vis-
cosidad a altas velocidades de cizalladura (durante agitación) (Swarbrick et al. 2013). La vis-
cosidad aumentó exponencialmente con la concentración de Carbomer® 940 (log (η) = -
0,3894x +0,1603, R2 = 0,9981) y se correlacionó directamente con la estabilidad de la sus-
pensión.
114
CAPÍTULO 5
1% 0.50% 0.30% 0.10%
10
1
Viscosidad (mPa s)
0.1
0.01
0.001
1 10 100
Velocidad de cizalladura (1/s)
Figura 48: Viscosidad dinámica de una suspensión hidroalcohólica con diferentes con-
centraciones de Carbomer® 940.
La suspensión obtenida con el agregado de 1% de Carbomer® 940 fue la que mayor

estabilidad mostró a lo largo del tiempo; sin embargo, la formulación presenta una viscosidad
elevada que dificulta el flujo desde el envase contenedor. Por otro lado, la formulación con
0,5% de Carbomer® 940 mostró una viscosidad más adecuada para su administración, y si
bien se observó sedimentación completa en menos de dos meses, las partículas del sedimento
pudieron resuspenderse fácilmente con agitación moderada. Entonces, se estableció que una
concentración de entre 0,5 y 1% de Carbomer® 940 es adecuada para obtener una suspen-
sión hidroalcohólica de G. lucidum estable y de fácil administración.
5.4 CONCLUSIONES
Con el fin de obtener una formulación nutracéutica que contenga la mayor parte de
compuestos bioactivos de G. lucidum se mezclaron dos extractos del hongo, uno alcohólico
y otro acuoso. Aproximadamente el 9% de los compuestos presentes en los extractos origi-
nales no son solubles en la mezcla hidroalcohólica resultante y precipitan. Este precipitado
incluye al 30% de los triterpenoides totales, y al 19% de los compuestos fenólicos, presentes
115
CAPÍTULO 5
en los extractos originales. Ambos grupos de compuestos son importantes en la actividad

biológica del hongo, por lo que es interesante conservarlos en la formulación final del pro-
ducto nutracéutico. Es por ello que se estabilizó la mezcla resultante con el agregado de un
agente viscosante, Carbomer® 940, para obtener una suspensión hidroalcohólica de G. luci-
dum. Estudios de la estabilidad y de la reología de las suspensiones, mostraron que una con-
centración de Carbomer® 940, entre 0,5 y 1% es adecuada para obtener una dispersión ho-
mogénea de los compuestos insolubles por agitación leve a moderada, con una viscosidad
adecuada para su administración oral. Finalmente, la formulación propuesta permitió con-
servar mayor contenido de triterpenoides y de compuestos fenólicos frente a presentaciones
tradicionales como el extracto hidroalcohólico (“tinturas”) o infusiones.
116
CAPÍTULO 6
CAPÍTULO 6:
CONCLUSIONES GENERALES Y PERS-
PECTIVAS FUTURAS
El trabajo de investigación realizado en el marco de esta Tesis permitió optimizar el

rendimiento de un cultivo de Ganoderma lucidum en un sustrato a base de cáscara de semilla
de girasol. Esto se logró mediante el agregado de aditivos, aceite de oliva y cobre (II), al
sustrato. La adición de 60 ppm de Cu (II) junto con 1,5% de aceite de oliva aumentó el
rendimiento del cultivo y redujo el tiempo hasta la primera cosecha a solo 28 días. Los resul-
tados obtenidos sugieren que el aceite de oliva estimuló el desarrollo del micelio mientras
que el Cu (II) aceleró su crecimiento. Si bien el Cu (II) probablemente actúa por estimulación
de las enzimas lacasas, son necesarios nuevos estudios para comprender los mecanismos de
acción de estos aditivos sobre el crecimiento de G. lucidum.
Se ha desarrollado y escalado el protocolo para el cultivo de Reishi en forma controlada,

con insumos locales de bajo costo y óptimo rendimiento para producir un alimento funcional
de alto valor, sin el agregado de ningún agroquímico, logrando así, una producción orgánica
y sustentable. El manejo optimizado de la tecnología de producción de G. lucidum permitirá
obtener mejores precios y asegurar calidad, cantidad y continuidad en el suministro; por lo
cual es factible su transferencia al ámbito pruductivo
El análisis químico de los basidiocarpos mostró que el contenido de los principales gru-
pos de compuestos bioactivos de G. lucidum, triterpenoides, carbohidratos de alto peso mo-
lecular y compuestos fenólicos, varía con el sustrato empleado para el cultivo, el agregado de
aditivos y el momento de cosecha. Por lo tanto es necesario estandarizar las condiciones de
cultivo, no solo para obtener los mejores rendimientos, sino para asegurar una composición
química reproducible entre lotes. Para ello es necesario realizar nuevos estudios que permitan
correlacionar las diferentes condiciones (por ejemplo concentración de aditivos) con el ren-
dimiento del cultivo y el contenido de los principales compuestos bioactivos del hongo. A
partir de estas diferencias observadas, resulta también interesante estudiar el efecto de las
condiciones de cultivo sobre alguna de las actividades biológicas atribuídas a G. lucidum.
117
CAPÍTULO 6
Se estudió la utilidad de la espetroscopia FT-IR para el análisis de los principales grupos

funcionales presentes en el hongo. El patrón de los principales picos de los espectros del
basidiocarpo se mantuvo con las diferentes condiciones de cultivo, pero se observaron dife-
rencias en las intensidades de los mismos. Esto indica variaciones cuantitativas, pero no cua-
litativas, en el contenido químico del basidiocarpo de acuerdo a las condiciones de cultivo.
Sin embargo, no se pudo correlacionar la variación de la intensidad de los picos con la varia-
ción del contenido de los principales grupos bioactivos del hongo. Sería interesante estable-
cer correlaciones entre los espectros y el contenido químico del hongo, que permitan una
rápida evaluación de su composición química. Por otro lado, esta técnica podría ser útil para
el control de calidad, con el fin de identificar rápidamente la especie de hongo y detectar
posibles adulteraciones. Para ello, es necesario extender el estudio de los espectros IR a dis-
tintas cepas y especies de hongo con el fin de establecer una base de datos.
El análisis microbiológico del proceso de pasteurización muestra que el sistema es efec-

tivo para la eliminación de grupos de microorganismos relacionados con la calidad sanitaria.
Sin embargo, ya que los mohos solo mostraron una disminución moderada, el sistema podría
perfeccionarse para lograr una mayor eliminación de mohos viables a los fines de no poner
en riesgo la producción.
El extracto acuoso crudo del basidiocarpo de G. lucidum soportó el crecimiento de cepas

probióticas del grupo de las bacterias lácticas, pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Pedio-
coccus y Weisella, así como también de cepas provenientes de productos farmacéuticos presen-
tes en el mercado nacional (Bacillus subtilis y Saccharomyces cereviceae var. boulardii). Por otro lado,
la cinética de crecimiento obtenida por B. subtilis en un extracto acuoso purificado, indica que
los polisacáridos de G. lucidum pueden ser utilizados por la cepa probiótica. Los resultados
obtenidos justifican futuros estudios en la utilización de los β-glucanos de G. lucidum por
cepas microbianas probióticas. También sería interesante ampliar a mayor cantidad de cepas
y evaluar los efectos sobre la actividad competitiva del probiótico frente a patógenos y de-
terminar in vivo la presencia de efectos inmunomudulares en el hospedador.
Por último, se desarrolló una formulación nutracéutica que contiene la mayor parte de
los compuestos bioactivos de G. lucidum. Esta formulación en una suspensión formada por
la mezcla de un extracto acuoso y otro alcohólico del basidiocarpo y estabilizada por el agre-
gado de Carbomer® 940. Esta formulación retuvo el 30% de los triterpenoides totales, y el
19% de los compuestos fenólicos que no son solubles en la mezcla hidroalcohólica 1:1. Son
118
CAPÍTULO 6
necesarios mayores estudios para determinar la identidad química de estos compuestos que
precipitan y estudiar su potencial actividad biológica. Finalmente, estudios de la estabilidad y
de la reología de las suspensiones, mostraron que una concentración de Carbomer® 940,
entre 0,5 y 1% es adecuada para obtener una dispersión homogénea de los compuestos in-
solubles por agitación leve a moderada, con una viscosidad adecuada para su administración
oral.
119
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ANEXO I:
RESULTADOS COMPLEMENTARIOS
I.1 EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA DEL PROCESO DE PASTEURIZACIÓN
Tabla 26: Evolución de los principales grupos microbiológicos durante la pasteurización
Tiempo RHP CT E. coli AE CSR Mohos Lev Enterococos

h
Sustrato 1
0 7,33 5,40 2,18 5,24 3,31 4,96 4,83 5,93
1 6,07 4,60 1,70 4,94 3,41 3,83 2,71 4,72
2 4,96 2,40 1,00 4,54 2,90 2,87 <1 3,86
3 4,53 0,95 <1 3,80 2,01 3,01 <1 2,44
Sustrato 2
0 7,44 5,48 2,30 5,24 3,42 5,00 5,02 6,12
1 5,48 4,62 1,48 4,59 3,44 3,40 2,83 4,74
2 4,86 2,51 <1 4,04 2,95 2,90 <1 3,70
3 4,20 1,30 <1 3,63 2,36 2,70 <1 2,39
Sustrato 1: cáscara de girasol, 5% cebada perlada, 2% SO 4Ca, 0,5% Ca2CO y 60% agua;
Sustrato 2: cáscara de girasol, 5% cebada perlada, 2% SO 4Ca, 0,5% Ca2CO, 60% agua y 1,5
% de aceite de Oliva.
RHP: Recuento de heterótrofas Aerobias Totales, CT: Coliformes totales, AE: Bacterias es-
porógenas aerobias, CSR: Clostridios sulfito reductores, Lev: Levaduras
I.2 ESPECTROS IR
Se presentan a continuación los espectros IR, en Transmitancia%, del basidiocarpo de
Ganoderma lucidum cultivado en los siguientes sustratos:
a) Cáscara de girasol sin aditivos; primera oleada; ensayo 1
b) Cáscara de girasol sin aditivos; primera oleada; ensayo 2
c) Cáscara de girasol sin aditivos; segunda oleada
d) Cáscara de girasol con aceite de girasol 1.5%
e) Cáscara de girasol con aceite de maíz 1.5%
133
f) Cáscara de girasol con aceite de oliva 1.5%; primera oleada
g) Cáscara de girasol con aceite de oliva 1.5%; segunda oleada
h) Cáscara de girasol con sulfato de cobre 60 ppm; primera oleada
i) Cáscara de girasol con sulfato de cobre 60 ppm; segunda oleada
j) Cáscara de girasol con sulfato de cobre 60 ppm y aceite de oliva 1.5%
k) Paja de arroz sin aditivos
l) Paja de arroz con aceite de oliva 1%; primera oleada
m) Paja de arroz con aceite de oliva 1%; segunda oleada
n) Paja de arroz con aceite de oliva 1% y sulfato de cobre 100 ppm
a)
100 **CCP1 ( 1)
95
90
85
80
75
70
65
60
%T
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
134
b)
100 **CCP2 ( 2) 2809
95
90
85
80
75
70
65
60
%T
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
c)
100 **CCS1 ( 3) 2809
95
90
85
80
75
70
65
60
%T
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
135
d)
90 **CGP1 ( 4) 2909
85
80
75
70
65
60
55
50
%T
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

cm-1
e)
100 **CMP1 ( 5) 2909
95
90
85
80
75
70
65
60
%T
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
136
f)
100 **C015P1 ( 7) 2909
95
90
85
80
75
70
65
60
%T
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
g)
100 **C015S1 ( 6) 2909
95
90
85
80
75
70
65
60
%T
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
137
h)
100 **CWP1 ( 9) 2909
95
90
85
80
75
70
65
60
%T
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
i)
100 **CWS1 ( 10) 2909
95
90
85
80
75
70
65
60
%T
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
138
j)
100 **CowP1( 8) 2909
95
90
85
80
75
70
65
60
%T
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
k)
100 **PCP1 ( 11) 3009
95
90
85
80
75
70
65
60
%T
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
139
l)
100 **P01P1 ( 12) 3009
95
90
85
80
75
70
65
60
%T
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
m)
100 **P01S1 ( 13) 3009
95
90
85
80
75
70
65
60
%T
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
140
n)
100 **P0wP1 (14) 3009
95
90
85
80
75
70
65
60
%T
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
cm-1
Figura 49: Espectros IR del basidiocarpo de Ganoderma lucidum cultivado en distintos

sustratos
141
ANEXO II: MEDIOS DE CULTIVO
Agar Papa Dextrosa (PDA): 4 g infusión de Papa, 20 g dextrosa y 15 g agar, por litro;
pH: 5,6.
Agar Sulfito-Polimixina-Sulfadiacina (SPS): 0,5 g citrato férrico, 10 g extracto de

levadura, 15 g hidrolizado pancreático de caseína, 0,01 g polimixina B sulfato, 0,12 g sulfa-
diacina, 0,5 g sulfito sódico, 0,1 g tioglicolato sódico y 15 g agar, por litro.
Chromobrit® agar: 10 g tripteína, 1 g piruvato de sodio, 5 g peptona de soya, 1 g nitrato

de potasio, 1 g L-triptofano, 0,2 g lauril sulfato de sodio, 2,5 g fosfato dipotásico, 5 g extracto
de levadura, 0,1 g X-GUD, 0,1 g Magenta GAL, 0,1 g IPTG y 15 g agar, por litro.
Extracto levadura glucosa (YG): 0,5 g extracto de levadura, 2 g glucosa, por litro.
Infusión Cerebro Corazón (BHI): 200 g infusión de cerebro de ternera, 250 g infusión
corazón vacuno, 10 g peptona, 5 g cloruro de sodio, 2 g glucosa, 2,5 g fosfato disódico, por
litro; pH: 7,4.
KF streptococcus agar: 10 g de digeridoo enzimático de tejido animal, 10 g extracto

de levadura, 5 g cloruro de sodio, 10 g glicerofosfato de sodio, 20 g maltosa, 1 g lactosa, 0,4
azida de sodio, 0,015 g púpura de bromocresol, 20 g agar, por litro; pH: 7,2.
MEA (malta, levadura y sucrosa en agar): 20 g extracto de malta, 2 g de extracto de

levadura, 10 g sucrosa y 20 g agar, por litro; pH 6
De Man, Rogosa, Sharpe (MRS) completo: 10 g proteosa peptona, 10 g extracto de

carne, 5 g extracto de levadura, 20 g dextrosa, 1 g polisorbato 80, 2 g citrato de amonio, 5 g
acetato de sodio, 0,1 g MgSO4, 0,05 g MnSO4 y 2 g K2PO4H, por litro.
MRS base: 0,5 g extracto de levadura, 1 g polisorbato 80, 2 g citrato de amonio, 5 g

acetato de sodio, 0,1 g MgSO4, 0,05 g MnSO4 y 2 g K2PO4H por litro.
Plate Count Agar (PCA): 5 g triptona, 1 g dextrosa, 2,5 g extracto de levadura, 12 g

agar, por litro; pH: 7,0
142
PUBLICACIONES Y PRESENTACIONES A
CONGRESO REALIZADAS EN EL MARCO
DE ESTA TESIS.
TRABAJOS PUBLICADOS EN REVISTAS INTERNACIONALES
Bidegain, M.A., Postemsky, P.D.; Pieroni, O.; Palma, S.; Cubitto, M.A. Relationship bet-
ween Ganoderma lucidum cultivation conditions and the chemical composition of ba-
sidiomes. Formulation and evaluation of a nutraceutical suspension. Trabajo en evaluación.
Bidegain, M. A., Cubitto, M. A., & Curvetto, N. R. (2015). Optimization of the Yield of
Lingzhi or Reishi Medicinal Mushroom, Ganoderma lucidum (Higher Basidiomycetes),
Cultivated on a Sunflower Seed Hull Substrate Produced in Argentina: Effect of Olive
Oil and Copper. International Journal of Medicinal Mushrooms, 17(11), 1095–1105.
http://doi.org/10.1615/IntJMedMushrooms.v17.i11.100
Casoni AI, Bidegain M, Cubitto M a, Curvetto N, Volpe M a (2015) Pyrolysis of sun-

flower seed hulls for obtaining bio-oils. Bioresource Technology 177:406–409. doi:
10.1016/j.biortech.2014.11.105
Postemsky PD, Bidegain MA, González-Matute R, Figlas ND, Cubitto MA (2017) Pilot-
scale bioconversion of rice and sunflower agro-residues into medicinal mushrooms and
laccase enzymes through solid-state fermentation with Ganoderma lucidum. Bioresource
Technology 231:85–93. doi: 10.1016/j.biortech.2017.01.064
PATENTES
Bidegain, M. A., Cubitto, M. A., Curvetto, N. R. & Palma, S. D. (2017). Método de obten-
ción de una suspensión hidroalcohólica de Ganoderma lucidum. Tramitado en IMPI bajo
el Nº 20170100864. 05/04/2017
143
TRABAJOS PRESENTADOS EN CONGRESOS
PRESENTACIÓN ORAL
1. Bidegain, M.; Postemsky P.; González Matute R.; Figlas D., Devalis R.; Delmastro
S.; Pereyra Huertas C.; Curvetto N.; Cubitto MA. “Optimización de la Producción
del Hongo Medicinal Reishi (Ganoderma lucidum) para el Desarrollo de Nutracéuticos
y Fitoterápicos”. V Jornadas Académicas RedVITEC. Córdoba, 20 – 21 de No-
viembre de 2014.
P R E S E N T A C I Ó N DE P Ó S T E R S
1. Liberatti, J; Bidegain MA; Sica MG; Cubitto MA. “Evaluación del potencial prebiótico
de la fracción de polisacáridos del hongo medicinal Ganoderma lucidum (Reishi) culti-
vado en sustrato e cáscara de girasol”. XCII Jornadas Argentinas de Microbiología y Jor-
nadas Bioquímicas del Sur Argentino. Bahía Blanca, 7 – 9 de Junio de 2017.
2. Viceconte FR; Vela Gurovic MS; Bidegain MA; Cubitto MA. “Evaluación microbioló-
gica del potencial antitumoral de extractos de Ganoderma lucidum.” XCII Jornadas Ar-
gentinas de Microbiología y Jornadas Bioquímicas del Sur Argentino. Bahía Blanca, 7 –
9 de Junio de 2017.
3. Bidegain MA; Sica, MG; Cubitto, MA. “Potencial prebiótico de polisacáridos del hongo
medicinal Ganoderma lucidum (Reishi) sobre una cepa prebiótica de Bacillus subtilis.
XIV Congreso Argentino de Microbiología. Rosario, 26 al 30 de Septiembre de 2016.
4. Postemsky, P.; Bidegain, M.; Devalis, R.; Figlas, D.; Gonzalez Matute, R.; Delmas-
tro, S.; Curvetto, N.; Cubitto, MA. ”Aprovechamiento de Residuos Agroindustriales
del Arroz Para el Cultivo del Hongo Medicinal Ganoderma lucidum”. V Jornadas
Académicas RedVITEC. Córdoba, 20 – 21 de Noviembre de 2014.
5. Bidegain, M.; Cubitto, M.; Brugnoni, L.; Sica, G.; Devalis, R.; Curvetto, R. “Efecto
del aceite de oliva sobre el crecimiento del hongo medicinal Reishi (Ganoderma luci-
dum) cultivado en un sustrato a base de cáscara de semilla de girasol. XIII Congreso
144
Argentino de Micología. Ciudad Autónoma de Buenos Aires, 24 a 27 de Agosto
de 2014. Publicado en la revista Lilloa – Vol. 51 – Supl. I, pág 200, 2014.
6. Panelista en la TERCERA JORNADA DE INTERCAMBIO DE PRODUC-

CIÓN CIENTÍFICO TECNOLÓGICA (III JIPCiTe), Bahía Blanca, 05 de Di-
ciembre de 2013
7. Ferronato, María J.; Obiol, Diego J.; Bidegain, Maximiliano A.; Gandini, Ariel N;
Alonso, Eliana N.; Salomón, Débora G.; Cubitto, María A.; Curvetto, Néstor R.; Cu-
rino, Alejandro C.; Facchinetti, María M. “Efectos de Ganoderma lucidum sobre líneas
celulares de carcinoma celular escamoso de cabeza y cuello”. LVIII Reunión Cien-
tífica Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica, Mar del Plata,
20 al 23 de Noviembre de 2013. Publicado en la revista Medicina – Vol. 73 – Supl.
III, pag. 118, 2013.
8. Formica, M; Bidegain, M.; Curvetto, N.; Cubitto, M.; Palma, S. “Uso de la criomo-
lienda como alternativa en el diseño de formas farmacéuticas de Ganoderma lucidum
(Fr.) Karst.”. XLV Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Far-
macología Experimental, Mar del Plata, 20 al 23 de Noviembre de 2013. Publicado
en la revista Medicina, Vol. 73, Supl. III, pag. 157-158, 2013.
9. Bidegain, Maximiliano; Cubitto, María Amelia; Curvetto, Néstor. “Obtención de

triterpenoides de Ganoderma lucidum cultivado en un sustrato a base de cáscara de
girasol”. VIII Encuentro Latinoamericano y del Caribe de Biotecnología, Mar
del Plata, 18 al 22 de Noviembre de 2013.
10. Bidegain, Maximiliano; Casoni, Andrés; Volpe, Mara; Curvetto, Néstor; Cubitto,
María Amelia. “Transformación de la cáscara de girasol por Ganoderma lucidum para la
obtención de productos útiles por pirólisis”. VIII Encuentro Latinoamericano y
del Caribe de Biotecnología, Mar del Plata, 18 al 22 de Noviembre de 2013.
11. Brugnoni, L. I.; Marucci, P. L., Sica, M. G.; Bidegain, M., Cubitto, M. A. “Evalua-
ción de un proceso de pasteurización de sustratos para el cultivo del hongo Reishi
(Ganoderma lucidum)”, XIII Congreso Argentino de Microbiología, Ciudad Autó-
noma de Buenos Aires, 23 al 26 de Septiembre de 2013. Publicado en la Revista
Argentina de Microbiología, Vol. 45, Supl. I, pag. 105.
145
12. Bidegain, Maximiliano; Casoni, Andrés; Volpe, Mara; Curvetto, Néstor; Cubitto,
María Amelia. “Aprovechamiento de la cáscara de girasol en el cultivo de Ganoderma
lucidum y obtención de productos por pirolisis del sustrato residual”. I Jornada Anual
de Intercambio de Becarios y Tesistas del CONICET Bahía Blanca “Me-
dioambiente y Preservación”, Bahía Blanca, 16 de Agosto de 2013.
146

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SUR

TESIS DE DOCTOR EN CIENCIA Y

Optimización del cultivo de Ganoderma lucidum.

Maximiliano Andrés Bidegain

BAHÍA BLANCA ARGENTINA

TESIS DE DOCTOR EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

OPTIMIZACIÓN DEL CULTIVO DE Ganoderma lucidum. EVALUACIÓN

MAXIMILIANO ANDRÉS BIDEGAIN

BAHÍA BLANCA ARGENTINA

Doctor en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, de la Universidad Nacional del Sur, y no

La misma contiene los resultados obtenidos en investigaciones llevadas a cabo en el Centro

de Recursos Naturales Renovables de la Zona Semiárida (CERZOS, CONICET-UNS) y el

Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia durante el período comprendido entre

Dr. Santiago Palma.

Maximiliano Andrés Bidegain

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA, BIOQUÍMICA Y FARMACIA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SUR

Bahía Blanca, 06 de Febrero de 2017

A la Universidad Nacional del Sur, a la Agencia Nacional de Promoción Científica y

Al equipo del Laboratorio de Biotecnología de Hongos Comestibles y Medicinales, Pa-

Al grupo de la cátedra de Microbiología Industrial y de los Alimentos, Lorena, Gabriela

A todos los colegas de docencia, especialmente a la cátedra de Farmacognosia, Alejan-

El cultivo de G. lucidum en sustratos artificiales es un procedimiento necesario para suplir

Se evaluó la calidad microbiológica de un sustrato a base de CSG con y sin agregado de

Uno de los desafíos de la industria de productos nutracéuticos es el aseguramiento de la

Cultivation of G. lucidum in artificial substrates is a necessary procedure to supply the

The microbiological quality of a SSH-based substrate with or without vegetables oils,

ABREVIATURAS ............................................................................................................................ VIII

ÍNDICE DE FIGURAS ....................................................................................................................... XV

ÍNDICE DE TABLAS...................................................................................................................... XVIII

1.1 LOS HONGOS COMESTIBLES Y MEDICINALES................................................................................... 1

CAPÍTULO 2: OPTIMIZACIÓN DEL CULTIVO DE GANODERMA LUCIDUM EN UN SUSTRATO A

2.1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 20

CAPÍTULO 3: INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO SOBRE LA COMPOSICIÓN

3.1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 59

CAPÍTULO 4: ESTUDIO DEL POTENCIAL PREBIÓTICO DE LA FRACCIÓN DE POLISACÁRIDOS DE

4.1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 87

CAPÍTULO 5: FORMULACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA SUSPENSIÓN HIDROALCOHÓLICA

5.1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 99

CAPÍTULO 6: CONCLUSIONES GENERALES Y PERSPECTIVAS FUTURAS................................. 117

BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 120

ANEXO I: RESULTADOS COMPLEMENTARIOS .......................................................................... 133

I.1 EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA DEL PROCESO DE PASTEURIZACIÓN ................................................. 133

ANEXO II: MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................... 142

PUBLICACIONES Y PRESENTACIONES A CONGRESO REALIZADAS EN EL MARCO DE ESTA TESIS. . 143

TRABAJOS PUBLICADOS EN REVISTAS INTERNACIONALES ......................................................................... 143

FIGURA 4: ESTRUCTURA DE ALGUNOS ÁCIDOS GANODÉRICOS (SANODIYA ET AL. 2009). .............................................. 14

FIGURA 21: TEMPERATURA DEL SUSTRATO DURANTE EL PROCESO DE PASTEURIZACIÓN ................................................ 53

TABLA 13: ORIGEN DE LAS MUESTRAS DE HONGO ANALIZADAS .............................................................................. 63

1.1 LOS HONGOS COMESTIBLES Y MEDICINALES

Se estima que existen en el planeta entre 500.000 y 10.000.000 de especies de hongos,

Los humanos prehistóricos probablemente utilizaron hongos recolectados en la natura-

Los hongos son organismos eucariotas, unicelulares (levaduras) o multicelulares (micro

1.1.2 Propiedades nutricionales

1.1.3 Características medicinales

La utilización de hongos en la Medicina Tradicional China se remonta a la antigüedad y

Los compuestos de algunas especies de hongos previenen la oncogénesis y la metástasis,

1.1.4 Mercado nacional e internacional de los hongos comestibles y medicinales

La producción de hongos comestibles y medicinales se ha incrementado notablemente