Coliformes termotolerantes-Color-Aceites y Grasas

Análisis de bacterias coliformes termotolerantes
Según el DS N° 031-2010-SA. Reglamento de la calidad del agua para el consumo humano

(2010), nos dice que el límite máximo permisible es de 0 UFC/100 mL a 44,5ºC y en caso
de realizarse el análisis mediante la técnica del NMP por tubos múltiples, deberá ser igual o
menor a 1,8/100 mL.
Métodos
a) Método de los tubos múltiples para detectar coliformes (fecales) termotolerantes o

NMP
Según Guías para la calidad del agua potable de la OMS (1998), una serie de tubos que
contienen un medio de cultivo apropiado son inoculados con porciones de prueba de una
muestra de agua. Después de un período de incubación dado a una temperatura
determinada, cada tubo donde se observa la formación de gas se considera un presunto
positivo, porque el gas indica la posibilidad de la presencia de bacterias coliformes. Sin
embargo, existen otros microorganismos que también producen gas, por lo que se deben
realizar pruebas de confirmación de seguimiento. Para las pruebas de confirmación, el
material extraído del tubo de ensayo positivo se inocula en un medio más selectivo.
Después de un tiempo de incubación apropiado se revisa para ver si hay formación de gas.
Luego, se puede utilizar una tabla estadística desarrollada específicamente para este
propósito para estimar el número de bacterias más probables (MPN) presentes en función
del número de tubos de inoculación y el número de tubos positivos obtenidos en la prueba
de confirmación.
Procedimiento
 Abrir el frasco de muestra.

 Junto con el tapón en posición, sacudir el frasco para obtener una dispersión
uniforme de las bacterias. (En caso de que el frasco esté colmado, retirar el tapón y
tirar unos 20-30 ml de agua; después, volver a tapar y agitar).
 Con una pipeta estéril de 10 mL, inocular 10 mL de la muestra en los cinco tubos
que tengan 10 mL de caldo presunto. Añadir 50 mL de la muestra a un tubo que
contenga 50 mL de caldo presunto. Se sugiere sacudir suavemente los tubos para
distribuir de manera uniforme la muestra por todo el medio.
 Incubar los tubos a 35 °C o 37°C por 24 horas.
 Finalizado el periodo de incubación, inspeccionar cada tubo para comprobar la
posible presencia de gas. Si está presente, el gas puede verse en el tubo de Durham;
si no se ve gas, sacudir suavemente el tubo; si se observa alguna efervescencia (a
través de pequeñas burbujas), el tubo debe considerarse positivo.
 Anotar en un cuadro el número de tubos positivos a las 24 horas.
 Volver a incubar los tubos negativos durante otras 24 horas. Al final de este
periodo, mirar de nuevo los tubos y ver la posible presencia de gas, como se
mencionó anteriormente. Se supone que la producción de gas después de 24 o 48
horas de incubación es debida a la presencia de coliformes en la muestra.
 Anotar el número de tubos positivos pasadas las 48 horas.
 La prueba confirmatoria se debe efectuar luego de la incubación, tanto durante 24
horas como durante 48 horas. Con un asa estéril, transportar una o dos gotas de cada
tubo presuntamente positivo a dos tubos que tengan respectivamente agua de
triptona y caldo confirmatorio. (Antes de cada transferencia, esterilizar a la llama el
asa de inoculación y dejar enfriar.)
 Incubar los tubos de subcultivo procedente de cada tubo presuntamente positivo
durante 24 horas a 44 ± 0,5 °C para confirmar la presencia de coliformes
termotolerantes.
 Pasadas las 24 horas de incubación, inspeccionar cada tubo de caldo para ver si hay
crecimiento y presencia de gas en el tubo de Durham. Anotar los resultados en el
cuadro.
 Añadir a cada tubo de agua de triptona aproximadamente 0,1 mL de reactivo de
Kovacs y mezclar suavemente. La presencia de indol (color rojo en el reactivo de
Kovacs) forma una película sobre la fase acuosa del medio.
 El crecimiento y la producción de gas en ausencia de indol confirman la presencia
de coliformes termotolerantes.
Cuadro
Valores de NMP por 100mL de muestra y límites de confianza del 95% para diversas
combinaciones de resultados positivos y negativos (cuando se usan las siguientes
porciones de ensayo: una de 50 mL y cinco de 10 mL)
N° de tubos con reacción positiva NMP (por 100 Límites de confianza del 95%
1 de 50 mL 5 de 10 mL Más bajos Más altos
mL)
0 0 <1 -- --
0 1 1 <1 4
0 2 2 <1 6
0 3 4 <1 11
0 4 5 1 13
0 5 7 2 17
1 0 2 <1 6
1 1 3 <1 9
1 2 6 1 16
1 3 9 2 21
1 4 16 4 40
1 5 >18 -- --
Nota. Obtenido de Guías para la calidad del agua potable de la OMS (1998).
Figura
Procedimiento del Método NMP
b) Método de filtrado con membrana para los coliformes (fecales) termotolerantes
Según Guías para la calidad del agua potable de la OMS (1998), brinda un recuento directo
de los de los coliformes termotolerantes y de coliformes totales presentes en una
determinada muestra de agua. Está basado en el filtrado de un volumen conocido de agua a
través de un filtro de membrana conformado por un compuesto de celulosa y con un
diámetro de poro uniforme de 0,45 o 0,2 µm; las bacterias quedan retenidas en la superficie
del filtro de membrana. Cuando la membrana que contiene las bacterias se incuba en un
recipiente estéril a temperatura apropiada con un medio de cultivo diferencial selectivo, se
desarrollan colonias características de los coliformes termotolerantes que es posible contar
de manera directa.
Procedimiento:
 Enlazar el matraz de Erlenmeyer (brazo lateral) al aparato de vacío (apagado) y

ubicar en su sitio el soporte poroso. Si se utiliza una bomba eléctrica, es
recomendable intercalar otro matraz entre el de Erlenmeyer y la bomba; este
segundo matraz actuará de trampa para el agua y, en consecuencia, protege la
bomba.
 Colocar platillo de Petri en una almohadilla absorbente.
 Esparcir el medio de caldo para colmar la almohadilla, luego retirar el exceso de
caldo.
 Acoplar el aparato de filtración mediante un filtro de membrana estéril encima del
soporte poroso, utilizando para esto unas pinzas esterilizadas a la llama.
 Colocar en su sitio el recipiente superior y fijarlo en posición. (El tipo de grapa a
utilizar dependerá del tipo de equipo que se emplee.)
 Esparcir el volumen de muestra, considerado como el óptimo para el tipo de agua en
el recipiente superior. Si la muestra que se analiza es de menos de 10 mL, se deberá
añadir al recipiente superior, antes de la filtración, por lo menos 20 mL de agua para
diluciones esterilizada. Aplicar el vacío.
 Desmontar el aparato de filtración, y, con unas pinzas estériles, colocar el filtro de
membrana en el platillo de Petri, encima de la almohadilla, con la cara de la parrilla
hacia arriba. Asegurarse de que no hayan quedado burbujas de aire retenidas entre la
almohadilla y el filtro.
 Dejar la placa de Petri a T° ambiente o a 35 o 37 °C durante 24 horas, para que
tengan así tiempo de reanimarse los microbios estresados.
 Colocar las placas de Petri en una incubadora a 44 ± 0,5 °C durante 18 a 24 horas,
con una humedad del 100%. También se pueden colocar muy apretadas o selladas
en bolsas de plástico impermeables para su posterior incubación.
 Sumergir las bolsas en un baño María a 44±0,5°C durante 18 a 24 horas. Las bolsas
de plástico deben conservarse debajo de la superficie del agua durante todo el
periodo de incubación. Pueden mantenerse en esta posición mediante un peso
adecuado, por ejemplo, una gradilla metálica.
Las colonias de bacterias coliformes termotolerantes se identifican por sus características

en el medio utilizado. El número de coliformes termotolerantes por 100 mL es obtenido
mediante la fórmula siguiente:
Coliformes termotolerantes por 100mL=
n ° de colonias de coliformes termotolerantes contadas

x 100
n ° de mL de la muestra de filtrados
Figura
Procedimiento del Método de filtrado con membrana
Análisis del color del agua

(2010), nos dice que el límite máximo permisible es 15 UCV escala Pt/Co.
Método del platino-cobalto:
Compare visualmente la muestra con una solución coloreada de concentración conocida o

un disco de vidrio coloreado calibrado con una solución preparada de antemano. La unidad
de medida del color utilizada como estándar es el color que produce platino en forma de
cloroplatinato de 1 mg/L. La proporción de cobalto a platino se puede variar para que
coincida con el tono de color. La relación Pt-Co utilizada en este método es generalmente
adecuada para la mayoría de las muestras. El color cambiará con el valor de pH de la
muestra, por lo que, al medir el color, el valor de pH de la muestra debe informarse al
mismo tiempo. Si es necesario, centrifugue la muestra para eliminar la turbidez. Las
comparaciones se realizaron utilizando soluciones de 5, 10 y hasta 70 unidades contenidas
en tubos Nessler.
Procedimiento
 Se preparan disoluciones intermedias en incrementos desde 2,5 a 100 unidades.

Estos estándares servirán para poder verificar el valor de la escala de vidrios
coloridos. Proteger estos estándares contra la evaporación y contaminación
utilizando un tapón limpio e inerte.
Cuadro
Preparación de la escala de color
mL de disolución estándar diluida a 50 mL con agua Color en unidades Pt-Co

0,0 0
0,25 2,5
0,5 5
1,0 10
1,5 15
2,0 20
2,5 25
3,0 30
3,5 35
4,0 40
4,5 45
5,0 50
6,0 60.
7,0 70
8,0 80
9,0 90
10,0 100
Nota. Obtenido de NMX-AA-045-SCFI-2001. ANÁLISIS DE AGUA - DETERMINACIÓN DE COLOR
PLATINO COBALTO EN AGUAS NATURALES, RESIDUALES Y RESIDUALES TRATADAS -
MÉTODO DE PRUEBA. (2001)
 Color aparente: Medir anticipadamente el pH de la muestra mediante un

potenciómetro correctamente calibrado, determinar el color de la muestra llenando
un tubo Nessler hasta la marca de 50 mL y comparar con las disoluciones
intermedias. Si el color excede de 70 Unidades, diluir la muestra con agua destilada
en proporciones conocidas hasta que el color sea menor de 70 y mayor de 20
Unidades Pt-Co.
 Calcular las unidades de color por medio de la siguiente ecuación:
Unidades de color Pt-Co = A x FD, donde A es el color estimado de la muestra y
FD es el Factor de dilución de la muestra.
 Reportar los resultados como se indica:
Unidades de color Redondear al valor más cercano a

1 a 50 1
51 a 100 5
101 a 250 10
251 a 500 50
 El valor de pH de la muestra debe reportarse junto con el valor del color aparente.
Análisis de aceites y grasas en el agua

(2010), nos dice que el límite máximo permisible es de 0,5 mg/L.
Método de prueba
Según la NMX-AA-005-SCFI-2013. ANÁLISIS DE AGUA – MEDICIÓN DE GRASAS

Y ACEITES RECUPERABLES EN AGUAS NATURALES, RESIDUALES Y
RESIDUALES TRATADAS – MÉTODO DE PRUEBA (2013), re realiza el siguiente
procedimiento:
 Hacer la medición del pH de las muestras, el cual debe ser de 2 o menor, si no tiene
este valor, acidificar con ácido clorhídrico 1:1 o ácido sulfúrico 1:1. Para muestras
con un pH menor de 8, generalmente es suficiente con adicionar 5 mL de ácido
clorhídrico 1:1 o 2 mL de ácido sulfúrico 1:1; para aquellas muestras con pH
superior a 8 agregar ácido concentrado para evitar la dilución de la muestra.
 Preparar los matraces de extracción introduciéndolos al horno a una T° de 103°C ±
2 °C, enfriar en desecador y pesarlos, repetir el procedimiento hasta obtener una
diferencia de < 0,000 5g en dos ciclos consecutivos; para los cálculos utilizar el
último valor de la masa.
 Preparar el material filtrante colocando un papel filtro en el embudo Büchner,
colocar el embudo en un matraz Kitazato y agregar 100 mL de la suspensión de
tierra de diatomeas-sílice sobre el filtro, aplicar vacío y lavar con al menos 100 mL
de agua.
 Transferir el total de la muestra acidificada al embudo Büchner, aplicando vacío
hasta que cese el paso de agua. Para determinar el volumen inicial de la muestra
vierta el filtrado en una probeta de 1 L.
 Con ayuda de unas pinzas, transferir el material filtrante a un cartucho de
extracción. Limpiar las paredes internas del embudo y el frasco contenedor de la
muestra, así como la contratapa del frasco con trozos de papel filtro o algodón
previamente impregnados de disolvente (hexano), tener cuidado en remover la
película de grasa y los sólidos impregnados sobre las paredes; colocar los trozos de
papel o algodón en el mismo cartucho.
 Secar el cartucho en el horno a 103°C ± 2°C, por un período de 30 minutos mínimo;
transcurrido este período colocar en el equipo de extracción.
 Agregar el volumen adecuado de hexano al recipiente de extracción previamente
puesto a masa constante y preparar el equipo de extracción. Utilizar pinzas o
guantes de látex para agarrar el cartucho y el recipiente de extracción.
 Ubicar el equipo de extracción sobre la parrilla de calentamiento, vigilar la
temperatura del reflujo y extraer a una velocidad de 20 ciclos/hora durante un
período de 4 h, a partir del primer reflujo del n-hexano en el equipo de extracción.
 Terminada la extracción, rescatar la mayor cantidad del disolvente y evaporar el
remanente.
 El recipiente de extracción libre de disolvente se pone en el desecador hasta que
alcance la T° ambiente.
 Pesar el recipiente de extracción y por diferencia de masa medir las grasas y aceites
recuperables.
 Examinar una muestra control de calidad (la cual fue preparada como se indica en el
capítulo 5) y un blanco de reactivo, bajo las mismas condiciones de la muestra.
 Cálculos:
(m f −m i)
GYA = −Blanco, donde:
Vm
GYA: las grasas y aceites recuperables (mg/L)
mf : es la masa del recipiente de extracción con el residuo (mg)

m i: es el valor de la masa constante del recipiente de extracción vacío (mg)
V m: es el volumen de la muestra (L)
Blanco: valor del blanco de reactivo (mg/L)
 Reportar los resultados en mg/L.
BIBLIOGRAFÍA
NMX-AA-045-SCFI-2001. (2001). ANÁLISIS DE AGUA - DETERMINACIÓN DE

COLOR PLATINO COBALTO EN AGUAS NATURALES, RESIDUALES Y
RESIDUALES TRATADAS - MÉTODO DE PRUEBA. Obtenido de
http://legismex.mty.itesm.mx/normas/aa/aa045-01.pdf
NMX-AA-005-SCFI-2013. (2013). ANÁLISIS DE AGUA – MEDICIÓN DE GRASAS Y

ACEITES RECUPERABLES EN AGUAS NATURALES, RESIDUALES Y
RESIDUALES TRATADAS – MÉTODO DE PRUEBA. Obtenido de
https://www.gob.mx/cms/uploads/attachment/file/166764/nmx-aa-005-scfi-2013.pdf
OMS. (1998). Guías para la calidad del agua potable (Segunda ed., Vol. 3). Ginebra.
Obtenido de https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/41985/9243545035-
spa.pdf
La cita del decreto ya la citó Anghe c:

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Según el DS N° 031-2010-SA. Reglamento de la calidad del agua para el consumo humano

a) Método de los tubos múltiples para detectar coliformes (fecales) termotolerantes o

 Abrir el frasco de muestra.

b) Método de filtrado con membrana para los coliformes (fecales) termotolerantes

 Enlazar el matraz de Erlenmeyer (brazo lateral) al aparato de vacío (apagado) y

Las colonias de bacterias coliformes termotolerantes se identifican por sus características

n ° de colonias de coliformes termotolerantes contadas

Análisis del color del agua

Método del platino-cobalto:

Compare visualmente la muestra con una solución coloreada de concentración conocida o

 Se preparan disoluciones intermedias en incrementos desde 2,5 a 100 unidades.

Preparación de la escala de color

mL de disolución estándar diluida a 50 mL con agua Color en unidades Pt-Co

 Color aparente: Medir anticipadamente el pH de la muestra mediante un

Unidades de color Redondear al valor más cercano a

Análisis de aceites y grasas en el agua

Según el DS N° 031-2010-SA. Reglamento de la calidad del agua para el consumo humano

Según la NMX-AA-005-SCFI-2013. ANÁLISIS DE AGUA – MEDICIÓN DE GRASAS

GYA: las grasas y aceites recuperables (mg/L)

mf : es la masa del recipiente de extracción con el residuo (mg)

V m: es el volumen de la muestra (L)

Blanco: valor del blanco de reactivo (mg/L)

 Reportar los resultados en mg/L.

NMX-AA-045-SCFI-2001. (2001). ANÁLISIS DE AGUA - DETERMINACIÓN DE

NMX-AA-005-SCFI-2013. (2013). ANÁLISIS DE AGUA – MEDICIÓN DE GRASAS Y

La cita del decreto ya la citó Anghe c:

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