ELABORACION DE CURVAS DE CALIBRACION

ESPECTROSCOPICA Y SU APLICACIÓN ANALITICA

I. OBJETIVOS:

 Elaborar curvas de calibración espectroscópica y observar el cumplimiento de la ley de

Beer

 Determinación de la cantidad de hierro en una muestra mineral expresado en molaridad

y porcentaje en peso y el contenido de nitrato en muestras de agua , expresado en
ppm

 Observar el funcionamiento y los principios de los espectrofotómetros visibles y UV.

 FUNDAMENTO TEORICO

Calibración.

Se entiende por calibración al conjunto de operaciones que establece, bajo condiciones específicas, la
relación entre las señales producidas por un instrumento analítico y los correspondientes valores de
concentración o masa del juego de patrones de calibrado.

Calidad de una Calibración.

La calidad de la determinación de una concentración no puede ser mejor que la calidad intrínseca de la
calibración. Los factores que determinan la calidad de una calibración son:

La precisión de las medidas:

Estimada a través de la repetitividady la reproducibilidadde las medidas. La repetitividad se evalúa a

través del cálculo de la desviación estándar relativa
(RSD%) de la medida de los patrones de calibrado. En la práctica puede ocurrir que la repetitividad para
los patrones sea más pequeña que para las muestras, por lo que será necesario fabricar patrones
similares a las muestras o agregar el analito a las mismas.

Exactitud de los patrones.

El valor de concentración o masa asignado a cada patrón trae aparejado un error pequeño si es
preparado a partir de reactivos puros (grado analítico) con estequiometria bien definida. Este error en
general se desprecia, frente al error en las medidas de las señales producidas por el instrumento.

Validez de la calibración.

Generalmente es el factor más importante. Cuando se calibra un instrumento se debe tener una
razonable certeza de que éste responderá de igual manera a los patrones así como a las muestras,
aunque estas tengan una matriz relativamente diferente*. Si estas diferencias son muy grandes, pueden
llegar a invalidar el proceso de calibración. Es necesario estar completamente seguro de que el calibrado
es válido antes de utilizarlo para obtener el valor de concentración de muestras incógnita. En caso
contrario, pueden cometerse serios errores en la determinación.

Modelos de calibración.

La forma de calibración más sencilla es la que utiliza un solo patrón. Este modelo es útil sólo cuando el
patrón es absolutamente confiable. Además, se supone que la señal cero del instrumento corresponde al
cero de concentración de la especie que se quiere determinar. Entre el cero y valor obtenido para el
patrón se realiza una interpolación lineal, pero la extrapolación más allá de la concentración de patrón no
es recomendada. El modelo correspondiente es:

Señal = constante x concentración

y=mx
La constante m es llamada sensibilidady corresponde a la constante de proporcionalidad entre laseñal y
la concentración. Esta proporcionalidad es útil sobre un restringido intervalo de valores.
A valores muy bajos de concentración la señal es demasiado pequeña y está sujeta a una
granincertidumbre. A valores muy altos la proporcionalidad dada en ecuación (3) puede dejar de
serválida. Este modelo es utilizado en muy pocos casos.
Si la respuesta a concentración cero de analito no es conocida de antemano, es necesariauna calibración
con un mínimo de dos puntos. Para esta calibración se utiliza un modelo linealcon un término constante:

Señal = señal del blanco + constante x concentración

y=b+mx

El término b indica la magnitud de la señal estimada del blanco, mientras que m es la pendientede la
recta de calibrado e indica nuevamente la sensibilidad.
Estadísticamente, una calibración realizada a partir de dos puntos es muy pobre ysu construcción a partir
de un número mayor de patrones es obligatoria. El procedimientoestadístico para determinar los
coeficientes b y m de la ecuación (4) se denomina regresión porcuadrados mínimos. La regresión por
cuadrados mínimos es una herramienta muy útil, sinembargo, deben conocerse sus limitaciones. Además
de la regresión por cuadrados mínimossiempre debe hacerse una inspección gráfica de los datos
obtenidos, para detectar puntosanómalos o fallas en la linealidad. Las ecuaciones mediante las que se
obtienen los coeficientesde la ecuación (4) se detallan en la próxima sección.

Regresión por cuadrados mínimos:

Este método es ampliamente utilizado en todas las ramas de las ciencias, encontrándoseincorporado en
muchas calculadoras y planillas de cálculo.
Para el modelo de la ecuación (4) los coeficientes pueden ser calculados de la siguientemanera:
N

∑ ( X i−X prom ) ( Y i −Y prom )

m= i=1 N

∑ ( X i−X prom )2
i=1

b = y - mx

dondex, y son los promedio aritméticos de los valores de x (patrones de concentración) y valores de y
(señales). En la ecuación (5), el numerador es simbolizado Sxyy el denominador Sxx. La expresión:
N

∑ ( Y i−Y prom )2se denota con el símbolo Syy.

i=1

La calidad de la calibración se evalúa prediciendo el valor de la señal, yˆ , para los distintos patrones a
través del modelo utilizado (ecuación. 4). Las diferencias entre las señales observadas y las predichas se
denominan residuos. A partir de estos valores se calcula:

∑ ( Y i−Y iprom)2 = S yy −m2 S xx

Sy=
√ N −2 √ N −2

sy es llamada desviación estándarresidualy tiene unidades correspondientes a la señal observada.

También se la conoce como sy/x en el texto de Miller o como se en otros textos.
Es importante conocer las limitaciones del método de cuadrados mínimos. Al deducir las ecuaciones
anteriores fueron realizadas algunas suposiciones. Estas no siempre se cumplen en un problema de
química analítica, por lo que debemos estar atentos. Las suposiciones que se realizan son:

a.- La incertidumbre en la concentración de los patrones es despreciable frente a la desviación estándar

de la señal medida. Para ello los patrones de calibrado deben ser preparados con una precisión superior
a la de la medición de la señal.

b.- Todas las medidas son estadísticamente independientes unas de otras. Cualquier tendencia de las
señales a través del tiempo (derivas de la línea de base o contaminaciones secuenciales) invalida el
calibrado.

c.- Todas las medidas tienen igual desviación estándar, la cual no depende del valor de la señal
observada, por lo tanto las señales altas tendrán igual desviación estándar que las pequeñas. Esta
suposición es particularmente discutible si se trabaja en un amplio intervalo de concentraciones.
Si no se cumple, es necesario utilizar un método de calibración ponderado por las desviaciones estándar
de las medidas.

d.- Las medidas están normalmente distribuidas. En general, el error en una medida analítica es una
suma de errores independientes provenientes de distintas partes del instrumento. Aunque el error de cada
fuente individual no sea normalmente distribuido, la suma de esas contribuciones, producirá una
distribución normal†.
De todas las suposiciones anteriores, la más débil es la tercera, porque en general a bajas
concentraciones, la precisión de las medidas empeora. Una buena aproximación puede realizarse
restringiendo el intervalo en el cual se realiza la curva de calibración, de manera que la precisión sea
constante. Si no se desea disminuir el rango lineal, se debe hacer una regresión ponderada.
La ecuación (4) se usa para calcular la concentración de una muestra incógnita:

Y −b
X=
m

MATERIALES Y REACTIVOS:
MATERIALES:

- Vaso de precipitado
- Pipeta volumétrica
- Fiola de 50mL
- Fiola de 100mL
- Fiola de 250mL
- Luna de reloj
- Espátula
- Papel filtro

REACTIVOS:

- Solución patrón de hierro (III) 0.01 M en HClO4 0.1M

- Solución 0.1M de HClO4
- Solución 0.01 M de ácido sulfosalicílico en HClO4 0.1M
- HCl 1N
- HNO3©
- Solución stock de nitrato de potasio KNO3
- Cloroformo
 - Agua destilada
- Agua potable
- Agua contaminada

EQUIPOS:

- Balanza analítica
- Estufa eléctrica
- Espectrofotómetro
- Espectrofotómetro UV

II. PROCEDIMIIENTO EXPERIMENTAL:

1.1 Determinación de hierro con acido sulfosalicilico:
a) Principio: El hierro (III) forma un complejo coloreado (lila hasta violeta) con el acido
sulfosalicilico, cuya absorbancia a 500 nm es útil para una determinación
espectrofotométrica. Para evitar la hidrólisis del complejo la medición debe realizarse a
pH = 1.0
b) Reactivos:
 Solución patrón de hierro (III) 0.01 M en HClO4 0.1M
 Solución 0.1 M de HClO4
 Solución 0.01M de acido sulfosalicilico en HClO4 0.1M
c) Procedimiento:
c.1. Para la curva de calibración:
 Diluimos 1:1 la solución patrón con HClO 4 0.1M y medimos de esta última a una
fiola de 50 mL, volúmenes de 1, 2, 3, 4 y 5 mL, rotulamos.
 Se agregó 30 mL de ácido sulfosalicilico a cada fiola, mezclamos bien y enrasamos
con HClO4 0.1M
 Homogenizamos y dejamos en reposo por espacio de 1 hora, para desarrollar el
color.
 Se leyó las absorbancias a 500 nm de longitud de onda y utilizamos un blanco para
calibrar el equipo. El blanco solo contenía acido sulfosalicílico y HClO4 0.1M en la
misma proporción de los patrones.
c.2. Preparación de la muestra:
 Pesamos 0.2505 g de muestra pulverizada y se disolvió con 15 mL de HCl (1:1) y 2
mL de HNO3 concentrado en un vaso precipitado. Llevamos a ebullición en forma
suave, tapado el vaso con una luna de reloj, hasta que dejó de desprender NO 2.
 Enfriamos, enjuagamos la luna y las paredes del vaso hacia el vaso.
  Filtramos directamente a una fiola de 100 mL, recuperando la solución coloreada del
vaso, papel de filtro con destilada. Enrasamos con HCLO4 0.1M
 Medimos 2 mL de esta solución a una fiola de 50 mL, agregamos 30 mL de acido
sulfosalicilico, mezclamos, enrasamos con HClO4 0.1M, homogenizamos y medimos
su absorbancia igual que los patrones.

d.1.) Cálculos: Elaborar la curva de calibración, graficando A vs C(M) y realizar el ajuste

de recta si es necesario:
Hallando las concentraciones:
2∗V 2
C=C
V1
01∗0 .05
C 1=0 . =¿0.0001
50

01∗2
C 2=0 . =¿0.0004
50

01∗3
C 3=0 . =¿0.0006
50

01∗4
C 4=0 . =¿0.0008
50

01∗5
C 5=0 . =¿0.001
50
Tabla 1:

Ac. Sulfosalicílico HClO4 0.1M

Vpatron (ml) Mesa (ml) (ml) Absorbancia Concentracion
0.5 3 30 50 0.063 0.0001
2 4 30 50 0.244 0.0004
3 1 30 50 0.434 0.0006
4 2 30 50 0.565 0.0008
5 3 30 50 0.716 0.001
 Grafica C vs A
0.8
0.7 0.72
f(x) = 736.76 x − 0.02
0.6 R² = 1 0.57
0.5
0.43
0.4
Linear ()
A

0.3
0.24
0.2
0.1
0.06
0
0 0 0 0 0 0 0
C

d.2.)Determinar desde la grafica del contenido de hierro en la muestra en M y %(P)

y−a
x=C=
b

y−0.005
x=C=
1824

Ci∗Vi
Cf =
Vf
Donde:

X=C= concentración (M)

 Y= absorbancia

TABLA 2:
Absorbanci
Mesa a X=Cfinal=M Vfinal Vinicial C inicial
0.0019682
3 0.036 7.87295E-05 50 2 4
0.0022736
1 0.045 9.09461E-05 50 2 5
0.00013031 0.0032577
2 0.074 1 50 2 7
0.0024433
4 0.05 9.77331E-05 50 2 3
TABLA 3:

m inicial Fe
Mesa (g) m Fe (g) %P
0.0109916 3.96952619
1 0.2769 2 2
0.0126972 4.98320797
2 0.2548 1 8
0.0181930 7.26268380
3 0.2505 2 8
0.0136447 5.28866945
4 0.258 7 9

V 0.1 L
PM= fierro 55.845 g/mol
masa total 0.2505 g

M vs %P
0
0
0 f(x) = 0 x + 0
R² = 0.99
0 0
0
0 0
Linear ()
M

0
Polynomial ()
0
0
0
3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5
%P

D.3) Calcular la presicion de la determinación , teniendo en cuenta los resultados de las otras mesas
 %P (x1-x)^2
3.9695261 1.98943636
9 3
4.9832079 0.15744390
8 7
7.2626838 3.54449832
1 8
5.2886694 0.00834126
6 7
   
5.69971986
∑(x1-x)^2 5
X= 5.38E+00

S 1.378371003
CV 25.62027886

Precisión = 100-CV
=74.37972114

D.4. Realizar los cálculos para preparar las soluciones utilizadas.

CALCULOS:

 ACIDO PERCLÓRICO HClO4 0.1M 1L

V = PM* V * M

%p* ρ

V = (100.5g/mol * 1L * 0.1mol/L)/(0.70*1.680g/ml)

V = 8.55mL = 9mL

 Acido sulfosalicílico 0.01M en HClO4 0.01M

Masa = PM * V* M

Masa = 180.15g/mol *0.5L *0.01mol/L

Masa = 0.90075g
Ensayo 2: determinación de nitrato en muestra de agua

a) Principio: Técnica recomendada para muestras de agua no contaminadas (bajo contenido

de materia orgánica; aguas naturales) y agua potable, la ley de Beer cumple su linealidad
hasta 11 mg/L. Se mide la absorbancia de nitrato en el rango UV a 220 nm y como también
la materia orgánica absorbe a estas longitudes de onda se realiza una segunda medición a
275 nm, donde el nitrato no absorbe, para hacer la corrección correspondiente que
dependerá de la naturaleza y concentración de la materia orgánica.

b) Reactivos:
 Solución stock de nitrato de potasio: pesar 0.1805 g de KNO3 previamente secado a
105ºC por 24 horas, disolver y enrasar en una fiola de 250 mL. Agregar 0.5 mL de
cloroformo como preservante.
 Solución intermedia de KNO3: Diluir 5 mL de solución anterior a 50 mL
 Solución de HCl 1N.
c) procedimiento:
c.1. Para la curva de calibración:
 Transferimos 1,3,5,7 y 10 mL de solución intermedia a fiolas de 50 mL y enrasamos
todas con agua destilada.
 Agregamos a cada fiola 1 mL de HCl 1N y homogenizamos.
 Se leyó sus absorbancias a 220 y 275 nm, calibrando el espectrofotómetro con UV con
un blanco que contenga agua destilada y HCl 1N en la misma proporción.
c.2. para las muestras:
 Tomamos muestra de agua potable y medimos 50 mL en una fiola, agregamos 1 mL de
HCl 1N, homogenizamos, medimos su absorbancia a 220 y 275 nm.
 Se filtró una muestra de agua contaminada, medimos 50 mL, agregamos 1 mL de HCl 1
N, homogenizamos y leímos sus absorbancia igual que el anterior.
d. CALCULOS:

Determinando la concentración de nitrato en ppm:

m¿

m¿

m
C ( M )=
V∗PM

0.11097 g
Ci ( M )= =0.007159mol / L
0.25 L∗62.0049 g/mol

Corrigiendo la concentración debido a la dilución: (se diluyó debido a que la absorbancia era
muy alto)
 Vo
Cf =Co∗( )
Vf

0.007159 mol 5 mL mol

Cf =
L
∗
50 mL(=0.0007159 )
L

mol 62.0049 g 1000. mg 44.3893 mg

Cf =0.0007159
L
∗
mol( ∗
g
= )( L )( )
Las concentraciones en las siguientes muestras son:
Vo
Cf =Co∗( )
Vf

Cf = ( 44.3893
L
mg
)∗( 501mLmL )=0.887786 ppm
Cf = ( 44.3893
L
mg
)∗(
3 mL
50 mL )
=2.663358 ppm

Cf =( 44.3893
L
mg
)∗(
5 mL
50 mL )
=4.43893 ppm

44.3893 mg 7 mL
Cf =( )∗(
50 mL )
=6.214502 ppm
L

Cf = ( 44.3893
L
mg
)∗(
10 mL
50 mL )
=8.87786 ppm
TABLA 4:
C final Con agua
Vsol intermedia enrasar HCl (mL) A 220 A 275 A corregido C (ppm)
1 50 1 0 0.01 -0.02 0.887786
3 50 1 0.089 0.014 0.061 2.663358
5 50 1 0.186 0.013 0.16 4.43893
7 50 1 0.273 0.01 0.253 6.214502
10 50 1 0.383 0.005 0.373 8.87786
Muestra 1: agua potable 50 1 0.054 0.021 0.012  
Muestra 2: agua
contaminada 50 1 0.13 0.032 0.066  
 A vs C (ppm)
0.4
0.37
0.35 f(x) = 0.05 x − 0.07
R² = 1
0.3
0.25 0.25
0.2 Linear ()
A

0.15 0.16 Polynomial ()

0.1
0.05 0.06
0
2 3 4 5 6 7 8 9 10
C (ppm)

De acuerdo a la recta:
Y = 0.050X -0.066
Cm1 = (0.012+0.066)/0.050 = 1.56 ppm
Cm2 = (0.066+0.066)/0.050 = 2.64 ppm

d.3. Averigüe los límites máximos permisibles de nitrato en agua potable y agua natural y
comente los resultados obtenidos.

PARAMETRO PARA SUSTANCIAS NO DESEADA

PARAMETRO VALOR RECOMENDADO (mg/L) VALOR MAXIOMO ADMISIBLE
Nitratos 25 50
Nitritos    
Amonio 0.05 0.5
Hierro   0.3
Manganeso 0.1 0.5
Fluoruro 0.7 1.5
Sulfuro de Hidrogeno   0.05

Nitritos: Valor máximo admisible es de 0,1 o 3,0.

Si se escoge el valor de 3,0 debe relacionarse el nitrato y nitrito por la formula.

¿¿

NOTA: V.R. = Valor Recomendado.

VIII.- CONCLUSIONES:
  Se aprendióa elaborar curvas de calibración espectroscópica y se observo el cumplimiento de la
ley de Beer.
 Se logro determinarla cantidad de hierro en la muestra mineral expresado en molaridad y
porcentaje en peso.
 También; se logro determinar el contenido de nitrato en muestras de agua, expresado en ppm.
 Se logro observar el funcionamiento y los principios de los espectrofotómetros visibles y UV.
 Se concluye que no se pudo obtener el FeSO4mg/tableta requerido por errores de:
o Mal cálculo en el peso requerido de la solución patrón.
o Mala medición de la solución del patrón.

IX.-RECOMENDACIONES:

 Verificar el manual del espectrofotómetro para tener una buena lectura.

 Preparar bien las soluciones y hacer bien los cálculos.
 Prestar atención a las indicaciones del profesor a las indicaciones que se da sobre los equipos.
 Hacer una buena lectura y preparar bien las soluciones, ya que estos errores serán reflejados
en la precisión como nos sucedió en la exactitud ya que el valor nos salió muy bajo.
 La preparación de la solución patrón tiene que ser al instante ya que el fierro tiende a oxidarse a
Fe (III).

XI.- BIBLIOGRAFIA:

 www.q1.fcen.uba.ar/materias/qi1/doc/GTP08mod.pdf
 http://www.foodcolors.net/contactos.html
 www.google.com
 http://es.wikipedia.org/wiki