Manual de “Prácticas de Bioquímica I” UNAP - FFB

PRACTICA Nº 08
DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE. FACTOR DE

CALIBRACION DE GLUCOSA.

INFLUENCIA DE LA DIETA SOBRE LA FORMACION Y

ALMACENAMIENTO DE GLUCOGENO HEPATICO

DETERMINACION DE GLUCOSA EN SANGRE. FACTOR DE

CALIBRACION DE GLUCOSA.
I. GENERALIDADES
La glucosa es el hidrato de carbono más importante que se utiliza como combustible
energético para todas las células, cuando se encuentra en exceso se almacena (en el hombre)
como un polisacárido, el glucógeno, o se convierte en grasa para ser utilizados en el momento
oportuno. La patología clínica más común relacionada con el metabolismo de los hidratos de
carbono es la Diabetes Mellitus, síndrome caracterizado por una secreción anormal de insulina
que se refleja en una tendencia a la Hiperglicemia (asociada con glucosuria) y
secundariamente en una variedad de manifestaciones patológicas metabólicas y vasculares
(cetoacidosis, alteraciones vasculares, coma diabético).

El diagnóstico precoz y el control de los pacientes diabéticos tiene por objeto evitar la
Cetoacidosis y las complicaciones de la Hiperglicemia, mediante el tratamiento adecuado.

Dado que existen múltiples factores causales de hiper o hipoglicemia, debe considerarse en
cada caso la condición fisiológica y/o la patología en el paciente en cuestión.

Los estados de estrés, cólera, ira, provocan un aumento de glucosa en sangre de 10 a 20 mg.
Los valores de glucosa en niños son bajos y en ancianos estos aumentan. La sangre arterial
posee mayor cantidad de glucosa que la sangre venosa.

Existe un umbral renal para la Glucosa que es de 170 a 180 mg/dl de sangre. El sistema de
túbulos renales reabsorbe Glucosa en tasas aproximadas de 350 mg/ minuto.

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Se hace necesario definir ciertos términos como:

SUERO: Es lo que queda como sobrenadante en el tubo de ensayo después del proceso de
coagulación o de centrifugación.
PLASMA: Se denomina plasma a toda la sangre en su conjunto es decir contiene agua (90%),
proteínas, Glucosa, Lípidos, Colesterol, Enzimas, anticuerpos, etc. Aparte de lo que
comúnmente llamamos suero y Fibrinógeno.

Existen varias metodologías para determinar la concentración de glucosa en sangre o en suero:

Follin-Wu (Fosfomolíbdica): 80-120 mg/dl
Somogy–Nelson (arsenomolibdica): 60–110 mg/dl
Enzimático: Trinder: Plasma: 65 -110 mg/dl
Wienner: Plasma: 60 -110 mg/dl Suero: 70 -110 mg/dl L.C.R.: 40-74 mg/dl
Audit. Diagnostic: Suero: 65-110 mg/dl

OBJETIVOS
➢ Determinación de glucosa en la sangre mediante el método de glucosa-oxidasa.
➢ Aplicación del Espectronic para obtener el grado de absorbancia de la muestra.
➢ Saber dar un diagnóstico acertado leyendo los niveles de Glucosa en la sangre.

II. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MATERIALES
Micropipetas Graduadas Vaso de Precipitado Tubos de Ensayo
Gradilla Metálica Aguja Hipodérmica Nº 21 Algodón Ligadura

EQUIPOS
Equipo de Baño María Espectrofotómetro Centrifuga
Cocina eléctrica Balanza analítica

MATERIAL BIOLOGICO
Muestra de Sangre

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REACTIVOS
Agua Destilada Alcohol
Kit de reactivos para determinar Glucosa
Fosfato Buffer pH 7.4 100mmol/L Fenol 24mmol/l
POD 500 U/L GOD 20000 U/L
4 Amino Antipirina 0.4mmol/L Estabilizadores

STANDARD
Glucosa 100 mg/dl ó 5.56mmol/L

PRECAUCIONES
El reactivo contiene 0.1 % de azida de Sodio

III. METODO - PROCEDIMIENTO

METODO DE LA GLUCOSA OXIDASA
La glucosa es oxidada enzimáticamente por la glucosa oxidasa (GOD; D-glucosa oxígeno l-
óxidorreductasa; a ácido Glucónico y agua oxigenada); el agua oxigenada en presencia de
peroxidasa (POD; donador: hidrógeno-peróxido óxidorreductasa); produce la copulación
oxidativa del fenol con la 4- amino-antipirina (4-amino fenazona (4-AF)) dando lugar a la
formación de un cromógeno rojo-cereza con absorbancia máxima a 500 nm. Es decir la
determinación enzimática de glucosa se da de acuerdo a las siguientes reacciones:
GOD
Glucosa + O2 + H2O Ácido Glucónico + H2O2
POD
2H2O2 + Fenol + 4-Amino-Antipirina 4-(p-benzoquinona-monoimino)-
fenazona [Rojo de Quinona] + 4H2O

1. PREPARACION y ESTABILIDAD DEL REACTIVO DE TRABAJO

En algunos Kits de reactivos para determinación de Glucosa es necesario preparar los
respectivos reactivos de trabajo, el cual se debe de proceder de la siguiente manera como se
indica en el siguiente cuadro:

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Nº de Pruebas H2O des. 4-AF Fenol Enzima

500 csp 1000 ml 50 ml 50 ml 3 ml
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En otros el reactivo está listo para su uso. Es estable hasta la fecha de expiración indicada en
la etiqueta cuando es almacenado de 2 – 8ºC. y no es necesario realizar el procedimiento
anterior.

2. OBTENSION DE LA MUESTRA:
a. Extraer la muestra de sangre a dos alumnos voluntarios previamente desinfectados.
b. Luego la sangre extraída se le lleva a centrifugar para lo cual se debe de en un casquete de
la centrifuga la sangre extraída y en el extremo opuesto se coloca otro tubo de ensayo
conteniendo agua en la misma cantidad que la muestra de sangre para contrapesar ambos
tubos, el centrifugado se lleva a cabo por 20 minutos a 1000 rpm.
c. Luego de este tiempo obtendremos en el tubo de la muestra un precipitado y una parte
sobrenadante este último es el suero con el que vamos a trabajar para determinar la
concentración de Glucosa en suero.
d. El suero obtenido debe de estar libre de hemólisis.

3. DETERMINACION DE LA GLUCOSA EN SUERO:

a. Preparar el siguiente sistema. Previamente es necesario recordarle que para proceder a
extraer el suero se debe de realizar con mucho cuidado usando una pipeta graduada y tratando
de que no absorba la parte de la sangre coagulada.
MUESTRA (1) ESTÁNDAR (2) BASAL (3)
REACTIVO 1ml 1ml 1ml
MUESTRA 10ul -------- ---------
STANDAR ------ 10ul --------

b. Mezclar y después se lleva a baño maría a todos los tubos por espacio de 5 minutos a
temperatura de incubación (37°C).

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c. Leer la densidad óptica con un espectrofotómetro a una Longitud de Onda de 500 nm, con
filtro verde, utilizando cubeta de 1 cm paso de luz.

CALCULOS
TRAMITANCIA = % de luz que pasa
ABSORBANCIA = % de luz que es absorbida
A= 2 – log T
[Glucosa] mg/dl = D.O.des. X f
mg Glucosa standar
f = si mg Glucosa standar = 1g/L = 100mg/dl
D.O. Standard
=> reemplazando:
DO Muestra Desconocida
[Glucosa] mg/dl = X 100mg/dl
DO Standard

IV. RESULTADOS

V. DISCUSION

VI. CONCLUSIONES

VII. RECOMENDACION

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1.

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INFLUENCIA DE LA DIETA SOBRE LA FORMACION Y

ALMACENAMIENTO DE GLUCOGENO HEPATICO

I. GENERALIDADES
El glucógeno es una forma de almacenamiento de glucosa fácilmente movilizable. La mayoría
de los residuos de glucosa en el glucógeno están ligados por enlaces glucosídicos alfa 1,4, las
ramificaciones se forman por enlaces glucosídicos alfa 1,6 los cuales se presentan con una
frecuencia aproximada de uno por cada diez residuos.

La cantidad de glucógeno varía según los distintos tejidos y dicha cantidad es afectada por la
dieta y el estado fisiológico. Los 02 lugares principales de almacenamiento de glucógeno son
el hígado y el músculo esquelético. La concentración en el hígado es de un 5% del peso
húmedo (pudiendo alcanzar hasta 10%) y en el músculo es de 1% a 2%. Sin embargo, su
almacenamiento es mayor en el músculo esquelético debido a su mayor masa.

El glucógeno almacenado mantiene la cantidad adecuada de glucosa disponible para la célula

durante los períodos comprendidos entre las comidas y durante la actividad muscular. El
glucógeno está presente en el citosol en forma de gránulos con un diámetro variable entre 100
y 400 Armstrong. Estos gránulos contienen firmemente enlazadas las enzimas glucógeno
fosforilasa, glucógeno sintasa y algunas otras que regulan la síntesis y degradación. El mayor
índice de recambio de residuos de glucosa ocurre en las ramas externas, mientras que la
estructura interna o núcleo del glucógeno es metabólicamente más estable con un índice de
recambio mucho menor.

El glucógeno puede ser aislado de los tejidos por digestión con soluciones de K O H caliente,
en las cuales los enlaces no reductores alfa 1,4 y alfa 1,6 son estables. El glucógeno también es
fácilmente hidrolizado por alfa y beta amilasa para rendir glucosa y maltosa respectivamente,
la acción de la beta amilasa también rinde dextrina límite.

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OBJETIVOS
➢ El objetivo de la presente práctica es cuantificar el glucógeno hepático en ayunas y después
de ingerir alimentos
➢ Evaluar los valores encontrados relacionándolos con los factores que determinan su síntesis
y degradación

II. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

MATERIALES
Micropipetas Graduadas Vaso de Precipitado Tubos de Ensayo
Gradilla Metálica Algodón

EQUIPOS
Equipo de Baño María Espectrofotómetro Centrifuga
Cocina eléctrica Balanza analítica

MATERIAL BIOLOGICO
Animal de experimentación (rata) Homogenizado de hígado de rata al 10% (pesar 10
grs. de hígado y homogenizar con agua destilada fría).

REACTIVOS
Alcohol absoluto Agua Destilada KOH 60% Fenol 80% H2SO4 cc
Na2SO4 sol. saturada

III. METODO - PROCEDIMIENTO

1. EXTRACCIÓN DEL GLUCÓGENO HEPÁTICO
Los reactivos deben ser manipulados con sumo cuidado, al salpicar quema la piel y destruye la
ropa.
Armar el siguiente sistema:
COMPONENTES I II
Homogenizado de hígado en ayunas 0.5 ml
Homogenizado de hígado post-prandial 0.5 ml

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KOH 60% 0.5 ml 0.5 ml

Calentar los tubos en baño maría a 10°C por 10 minutos
Alcohol 98% 0.5 ml 0.5 ml
Na2S04 saturada 1.0 ml 1.0 ml
Mezclar y dejar Reposar por una hora
Centrifugar a 3500 r.p.m. por 10 minutos
Eliminar el sobrenadante y colocar boca abajo los tubos sobre el papel de filtro por 5 minutos
Agregar agua destilada 5.0 ml 5.0 ml
Disolver el precipitado por agitación

2. CUANTIFICACION POR MÉTODO COLORIMÉTRICO DEL GLUCÓGENO EXTRAÍDO

Armar el siguiente sistema:
COMPONENTES I II BLANCO
Muestra del tubo I (paso interior) 1.0 ml
Muestra del tubo II (paso anterior) 1.0 ml
Agua destilada 1.0 ml 1.0 ml 2.0 ml
Fenol 80% 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml
Mezclar y Colocar los tubos en agua helada, durante 5 minutos
Agregar H2SO4 concentrado (Sin retirar los tubos del
baño helado, agregarlo gota a gota en el centro del tubo 5.0 ml 5.0 ml 5.0 ml
y mezclar).
Dejar en el baño helado durante 5 minutos
Leer en el espectrofotómetro a 540 nm.

3. CALCULOS
mg% de glucógeno = (Lec. TUBO I - Lect. TUBO II) x FACTOR

IV. RESULTADOS

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V. DISCUSION

VI. CONCLUSIONES

VII. RECOMENDACION

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1.