INSTITUTO POLITÉ CNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Bioló gicas

Regulació n de la síntesis de
β-galactosidasa en Escherichia coli

Rubro Valor Calificación

Hipó tesis y diseñ o 3%
experimental
Objetivos 1%
Registro de datos 3%
Manejo de datos 4%
Discusió n de resultados 5%
Conclusiones 3%
Bibliografía 1%
Total
Equipo 8 Sección 2 6QM1

Alumnos:
Aurelio Lomeli Jeanette
Garnica Vergara Carlos Eduardo
González Judd Pablo Miguel
López Villalva Eduardo
Terroba Escalante Paulina

Profres.
Dr. Federico Tovar Rojo
M. en C. Refugio Elisa Rivera Pérez

3 de Mayo de 2013
 Práctica. Regulación de la Síntesis de β-galactosidasa en Escherichia coli

HIPÓTESIS
Dado que la enzima β-galactosidasa, degrada la lactosa en glucosa y galactosa
que son fuentes de carbono para Escherichia coli (la galactosa por
epimerización es transformada en glucosa, que es en sí, el azúcar
metabolizable)(1), SI la β -galactosidasa modifica su actividad en presencia o
ausencia de lactosa; ENTONCES la β-galactosidasa será una enzima inducible-
reprimible y su síntesis estará sujeta a las condiciones de cultivo.

DISEÑO EXPERIMENTAL

a) Obtención del cultivo

Al matraz donde se cultivó el microorganismo (Escherichia coli) se adicionó

glicerol como fuente carbono para su crecimiento. Dicho cultivo se incubó en
agitación durante 18 horas fue para una mejor dispersión de la fuente de
carbono, con el consiguiente aumento de la superficie de contacto
microorganismo, fuente de carbono, además de para brindar aeración
suficiente para su metabolismo.
De este mismo cultivo se inocularon 10ml en dos matraces con 200ml de
medio sintético uno con glicerol y el otro con lactosa, matraces en los que el
glicerol al usarse como fuente de carbono no ejerce represión por catabolito y
en el que la lactosa induce la síntesis de la ß-galactosidasa aparte de poder
fermentarse de manera rápida (18-24 horas), en forma lenta, o no ser
fermentada. Dichos matraces se incubaron a una temperatura de 37º C de
nuevo en agitación durante 6 horas, se cosecharon las células por
centrifugación, con 2 lavados con regulador de fosfatos y resuspendiendo el
paquete celular en regulador, lavados en los que se buscaba eliminar la fuente
de carbono.

b) Determinación de la actividad de ß– galactosidasa

Cada una de las dos suspensiones de células obtenidas se ajustaron a 1.0 de

absorbancia a 600nm (Unidades arbitrarias de absorbancia). A 10 ml de
suspensión celular se le agrega 1mL de tolueno el cual inestabiliza la
membrana célular para facilitar el ingreso de las azúcares e inductores
correspondientes, aumentando con esto la acción de la ß -galactosidasa, sobre
las mismas, sin desnaturalizar a la enzima misma. Dicho preparado se agitó
vigorosamente en el vortex durante 2 min y se coloco en baño de hielo.
Ya en una celda para espectrofotómetro se colocaron 0.1 de dicha suspensión,
0.1ml de ONPG y 3.8 mL de regulador de fosfatos 50Mm para eliminar la
fuente de carbono residual, se homogenizó y se tomo la lectura (relativa a la
actividad enzimática) inmediatamente a una absorbencia de 420nm. Estas
lecturas fueron registradas cada minuto durante 10 min. Previo ajuste a cero
de la absorbencia con una celda conteniendo 3.9 mL de regulador de fosfatos y
0.1 mL de ONPG el cual tiene la característica entrar rápidamente al interior de
la célula bacteriana, sin la necesidad de utilizar la ß -galactósido permeasa, y
allí es metabolizado por la b-D-galactosidasa, liberándose o-nitro-fenol,
compuesto de color amarillo.(1), cuya absorbancia es la que se lee en el
espectrofotómetro, veáse para esto la figura siguiente.

Figura 1. Descomposición cromógena del Orto-NitroFenil

Galactósido. (Lodish et Al. 2007)

c) Velocidad de inducción y represión catabólica

Se inocularon 20mL del cultivo de 18 hrs (inciso a) ) en un matraz Erlenmeyer

conteniendo 200ml de medio sintético adicionado con glicerol (que no ejercen
represión por catabolito) incubándolo posteriormente a 37º C en agitación
durante 3 horas de acuerdo a lo ya se explicado en el inciso a).

De los mismos matraces se retiraron alícuotas de 10 ml una al principio (t=0)

y tras la toma de esta se le adicionó al cultivo restante un volumen de lactosa
a 50% estéril ; con lo que se buscó inducir la síntesis de ß-galactosidasa por
un mecanismo de control por inducción, donde la alolactosa, derivada de la
lactosa adicionada, será el inductor que se una al sitio alostérico de la proteína
represora y ocasionando un cambio conformacional de la misma que conducirá
a la pérdida de la afinidad de esta, por el operador, que es un elemento de
control.

Este matraz se siguió incubando a 37º C en agitación y del mismo, se

siguieron retirando alícuotas de 10mL a los tiempos 5, 10, 15, 20 y
30(minutos).

Al retirar la alícuota correspondiente a los 30 minutos se agregó un volumen

de glucosa al 50% estéril. En este punto se le añade, al cultivo, otra fuente de
carbono con la cual se busca reprimir por catabolito, la síntesis de las enzimas
para la degradación de la lactosa, al perderse la afinidad por el operador. Tras
esto se tomaron alícuotas cada 10 minutos a los tiempos 40 y 50 (minutos).
Tod
as las alícuotas se recibieron en tubos con 0.1ml de cloranfenicol que detiene
la síntesis proteica (concentración final de cloranfenicol= 100microgramos/ml)
y fueron conservadas en un baño de hielo.

Una vez obtenidas, todas las alícuotas, se centrifugaron a 3000rpm/min,

posteriormente se trataron con tolueno para poder medir la actividad
enzimática (2) haciendo dos lecturas de absorbancia una a los 0 min y otra a
los 10minutos de incubación.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL:
Conocer los mecanismos de control que se lleva a cabo en el operón Lac
en base a la síntesis de la β-galactosidasa en Escherichia coli.

OBJETIVOS PARTICULARES:
Conocer el efecto que ejerce la glucosa sobre la regulación de la
expresión del operón Lac.
Observar la actividad de la β-galactosidasa a diferentes tiempos.
Conocer la regulación tanto de la expresión génica como de la actividad
enzimática que se ejerce sobre el operón de la lactosa.

REGISTRO DE DATOS

Conforme a lo descrito en el desarrollo experimental se obtuvieron los datos

condensados en los cuadros 1 y 2.

Cuadro 1. Absorbencias a diferentes tiempos a 420nm, en la determinación

de la actividad de ß-galactosidasa en células de Escherichia coli crecidas
con dos fuentes de carbono diferentes
Tiempo (min) Suspensión de células de Escherichia coli crecidas
en:
Glicerol Lactosa
Absorbencia a 420nm
0 0.062 0.057
1 0.060 0.075
2 0.058 0.097
3 0.053 0.135
4 0.059 0.163
5 0.056 0.194
6 0.058 0.228
7 0.055 0.259
8 0.052 0.295
9 0.054 0.324
10 0.054 0.356
 Cuadro 2. Absorbencias obtenidas a 420nm en la determinación de la
inducción y represión catabólica de ß-galactosidasa en Escherichia coli.
Tiempo de incubación Absorbencia 420nm
(min) t=0 min t=10 min
0 0.089 0.084
5 0.072 0.081
10 0.071 0.115
15 0.087 0.208
20 0.063 0.161
25 0.067 0.176
30 0.084 0.214
40 0.079 0.240
50 0.082 0.236
60 0.069 0.260

MANEJO DE DATOS

1. Determinación de la actividad de ß-galactosidasa

A las absorbencias registradas a los diferentes tiempos en el cuadro 1 se le

resta la absorbencia inicial correspondiente para poder obtener el valor de
cambio de absorbencia (ΔA) obtenidos al llevar a cabo el crecimiento de las
células de Escherichia coli en dos fuentes de carbono diferentes (glicerol y
lactosa).

ΔA =Absorbancia 1− Absorbancia0

Ejemplo:
ΔA =0.075−0.057=0.018

Cuadro 3. Cambio de absorbencia a 420nm con respecto al tiempo

(ΔA) de la actividad de ß-galactosidasa en Escherichia coli crecida con
dos fuentes de carbono diferentes
Tiempo Suspensión de células de Escherichia coli crecidas en:
(min) Glicerol Lactosa
Absorbencia a ΔA Absorbencia a ΔA
420nm 420nm
0 0.062 0* 0.057 0
1 0.060 -0.002* 0.075 0.018
2 0.058 -0.004* 0.097 0.04
3 0.053 -0.009* 0.135 0.078
4 0.059 -0.003* 0.163 0.106
5 0.056 -0.006* 0.194 0.137
6 0.058 -0.004* 0.228 0.171
 7 0.055 -0.007* 0.259 0.202
8 0.052 -0.01* 0.295 0.238
9 0.054 -0.008* 0.324 0.267
10 0.054 -0.008* 0.356 0.299
* Los números negativos serán tomados con un valor absoluto de cero

Los valores numéricos obtenidos en el cuadro 2, se grafican en la figura 2.

0.4

0.35

0.3

0.25

0.2
ΔA

Glicerol
0.15 Lactosa

0.1

0.05

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Tiempo (min)

Figura 2. Actividad de ß-galactosidasa en Escherichia coli a 420nm por

el método del ONPG

2. Velocidad de inducción y represión catabólica

Las absorbencias obtenidas en el cuadro 2 se tratan de la siguiente manera:

A la absorbencia del tiempo 10min se le resta la absorbencia registrada en el
tiempo 0min en cada uno de los tiempos de incubación.

ΔA =A 420 nm ( 10 min ) −ΔA 420 nm (0 min)

Ejemplo:
ΔA =0.081−0.072=0.009

Posteriormente a cada valor de ΔA obtenido se le calcula la raíz cuadrada

correspondiente.
√ ΔA
Ejemplo:
√ 0.009=0.094
Los datos obtenidos del procesamiento anterior se condensa en el cuadro 3,
graficándose luego en la figura 3.

Cuadro 4. Raíz cuadrada de los cambios de absorbencia en función del

tiempo en la inducción y represión catabólica de ß-galactosidasa en
células de Escherichia coli
Tiempo de Absorbencia a 420nm
incubación t=0 min t=10 min ΔA √Δ A
(min)
0 0.089 0.084 -0.005 0
5 0.072 0.081 0.009 0.094
10 0.071 0.115 0.044 0.209
15 0.087 0.208 0.121 0.347
20 0.063 0.161 0.098 0.313
25 0.067 0.176 0.109 0.330
30 0.084 0.214 0.13 0.360
40 0.079 0.240 0.161 0.401
50 0.082 0.236 0.154 0.392
60 0.069 0.260 0.191 0.437
* Con fines de análisis los valores subrayados no son considerados al no
obedecer la tendencia del resto de los datos y por que hay repetirse la
determinación experimental de los mismos no hay precisión en la misma, vista
esta como repetitividad en las condiciones experimentales y consenso entre los
datos obtenidos.

0.5
0.45
0.4
0.35
Raiz cuadrada de ΔA

0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Tiempo de iincubacion (min)

Figura 3. Cinética de inducción y represión catabólica de ß-

galactosidasa en Escherichia coli por el método del ONPG
DISCUSIONES

En esta práctica realizamos diferentes experimentos para analizar los factores

a los que esta sujeta la síntesis de la β-galactosidasa y así poder concluir los
mecanismos de control a los cuales se encuentra sujeta dicha enzima.

Así en el primer experimento se determinó la actividad de la β-galactosidasa,

uno de los genes estructurales del operón lac, sujetos al control de la región
operadora del mismo operón, así los genes lacI regulan la trascripción de los
genes estructurales produciendo una molécula represora la cual es alostérica,
lo que significa que es una molécula que puede interaccionar de manera
reversible, provocando un cambio conformacional de su forma tridimensional y
por lo tanto un cambio en su actividad química. (cfr. diseño experimental).
Sabiendo esto podemos decir que los resultados demuestran que las células
son dependientes de la fuente de carbono que se encuentra en el medio de la
célula.

Lo anterior está de acuerdo con los resultados obtenidos en la gráfica de

actividad de la ß-galactosidasa (figura 2) en Escherichia coli, donde se observa
una relación directamente proporcional entre la actividad de esta enzima y el
tiempo, sin olvidar que el cultivo probado, estaba adicionado con lactosa. Este
aumento en la actividad enzimática de la ß-galactosidasa, al aumentar el
tiempo, se debe a que esta es una enzima inducible, ya que su concentración
aumenta en respuesta a señales ambientales. (3) Como lo es la adición de
lactosa al medio. Esto se puede comprobar al observar que en los resultados
obtenidos, en el medio con glicerol, no hay actividad de la ß-galactosiadasa.

Al crecer las células en un medio con lactosa como fuente de carbono y

energía, lo que se produce es que se induzca la transcripción de los genes que
intervienen en el catabolismo de este disacárido, es decir, la lactosa, es
transportada por la ß-galactosido permeasa al interior de la célula (debido a
que la represión del operón no es 100%eficiente, se producen pequeñas
cantidades de estas enzimas) y luego es transformada por las pequeñas
concentraciones de ß-galactosidasa en alolactosa, esta es un inductor de la
síntesis del operón lac, al unirse a la proteína represora codificada por el gen
laci, cambia su conformación y por lo tanto disminuye su afinidad por el sitio
operador (lacO), provocando que la RNA polimerasa pueda unirse al sitio
promotor y comenzar la transcripción de los genes estructurales que codifican
para las diversas enzimas que intervienen en el catabolismo de la lactosa. (3)
(4)
Otra razón por la cual en presencia de lactosa, aumenta la síntesis de ß
-galactosidasa y por ende aumenta su actividad, es por la represión catabólica
y el control positivo inducible que ejerce el AMP C sobre la transcripción del
operón lac.(5)
Lo anterior va de acuerdo a lo que se sabe sobre el operón de la lactosa, que
esta formado por genes estructurales Z, Y y A, genes que al encontrarse la
bacteria creciendo en glicerol redundan en una baja actividad de la β-
galactosidasa, misma que permanece constante, esto por que la proteína
represora interacciona con la secuencia de DNA de la región operadora y con
esta interacción se inhibe la acción de la ARN polimerasa, reprimiendo la
trascripción de los genes estructurales, sin embargo, cuando hay lactosa en el
medio este azúcar se une al represor provocando el cambio alostérico
conformacional. Este cambio altera el sitio de unión del represor, haciendo que
no pueda interaccionar con el Operón del DNA en ausencia entonces del
represor unido al operador, La RNA polimerasa trascribe los genes
estructurales los cuales producen las enzimas necesarias para poder
metabolizar la lactosa es por ello que las células que se encontraban en
crecimiento con lactosa se observa como conforme pasa el tiempo la actividad
de la β-galactosidasa va aumentando de manera significativa ya que es muy
claro como la actividad de la β-galactosidasa en presencia de lactosa en
directamente proporcional conforme avanza el tiempo.

Por otro lado en el segundo realizado se quería medir la velocidad de inducción

y de represión catabólica para esto colocamos el matraz que tenia como fuente
de carbono glicerol y al empezar el experimento de adicionamos lactosa como
fuente de carbono y así estuvimos retirando alícuotas a diferentes tiempos en
los cuales hasta el los 30 minutos del experimento las células contenían como
fuente de carbono lactosa, para esto hay que recordar que cuando la proteína
represora se encuentre unida al inductor, en este caso la lactosa, el operón lac
se activa y la RNA polimerasa transcribe los genes estructurales, esto quiere
decir entonces que la transcripción se inicia como resultado de la unión entre la
polimerasa y la secuencia nucleotídica de la región promotora, pero la
literatura nos dice que muchos análisis minuciosos han demostrado que la
unión de la polimerasa no es nunca muy eficiente a menos que CAP este
presenta para facilitar el proceso.

Por lo tanto al principio del experimento que realizamos en ausencia de glucosa

y en condiciones de inducción, CAP ejerce un control positivo uniéndose al sitio
de unión de CAP, lo que facilita que la RNA polimerasa se una al promotor y,
en consecuencia, facilita la transcripción. Por lo tanto, para que la tasa de
transcripción sea máxima, la proteína represora debe de estar unida a la
lactosa (para que no reprima la expresión del operón, y CAP debe de estas
unido al sitio de unión de CAP, pero para que se de esta unión debe de
tomarse en cuanta otra molécula, el monofosfato de adenosina cíclico, cAMP,
del cual depende la unión de CAP. Para que se produzca la unión al promotor,
CAP debe de estar unido a cAMP. Y los niveles de cAMP dependen de una
enzima, la adenil ciclasa, que cataliza la conversión de ATP a cAMP.

Entonces la función de la glucosa en la represión por catabolito que se espera

observar en los resultados a partir del minuto 30 donde se le agrega al matraz
glucosa, es que inhibe la actividad de la adenil ciclasa, lo que provoca la
disminución de cAMP en la célula y por lo tanto en estas condiciones, CAP no
puede formar complejo CAP-cAMP el cual es esencial para el control positivo de
la transcripción del operón lac.

En este punto, lo que se observó realmente fue solo una tendencia como en el
caso del experimento anterior en los primeros 30 minutos, un aumento gradual
de la actividad de la enzima con respecto al tiempo. Después de los 30
minutos, se adiciona glucosa al medio, se observa un descenso parcial de la
actividad enzimática. Esto se debe al hecho de que en presencia de glucosa, la
cantidad de AMPc en la célula disminuye, y por lo tanto ya no se efectúa el
control positivo inducible que ejercía este junto con la proteína CAP. (5)

La razón de que disminuya la concentración de AMP C en presencia de glucosa,

es debido al transporte por PTS, cuando la glucosa se transporta, el
componente del PTS denominado E IIA se encuentra sin fosforilar, ya que el
grupo fosfato continuamente se está pasando a la glucosa para formar glucosa
6 fosfato, cuando se deja de transportar la glucosa, E IIA, se fosforila, lo cual
activa a la adenilato ciclasa, la cual actúa sobre el ATP para producir AMP C, de
esta manera aumenta la concentración de este compuesto, el cual se une a la
proteína CAP (proteína activadora de genes catabólicos) y se forma CAP-AMP C,
el cual se va a unir a una parte del promotor (este es sensible a los
catabolitos), denominado sitio de unión a CAP-AMPC, esto permite a la RNA
polimerasa unirse al promotor e iniciar la transcripción.(4)(5)

CONCLUSIONES
La lactosa aumentó la actividad de la β-galactosidasa al inducir la
síntesis de ésta (hoy en día se sabe que no es la lactosa, sino la
alolactosa).
El glicerol no indujo la síntesis de la β-galactosidasa.
La actividad de la β-galactosidasa es proporcional con respecto al tiempo
siempre y cuando haya presencia de lactosa en el medio.
El operón Lac está regulado por control negativo o positivo e inducible.
La glucosa ejerce un efecto de represión catabólica sobre el operón de la
lactosa.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
(1)http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b12/onpg.htm Sitio público
en internet consultado el día 30/IV/2013 a las 23:44 hrs.
(2)http://www.quiminet.com.mx/pr7/Tolueno.htm#m-mas_art Sitio público en
internet consultado el día 1/V/2013 a las 00:05 hrs.
(3) Freifelder, A. 1994. Microbial genetics. Ed. Jones and Bartlett Publishers.
Inc. Boston. Pág. 129-131.
(4) Moat, A. 2002. Microbial Physiology. Wiley-Liss. UK. Pág. 200-205.
(5) Smith, C., E. Wood. Biología Molecular y Biotecnología. Editorial Addison-
Wesley Iberoamericana. España. Pág. 113-123.

Otras de consulta general:

-G. Tortora et. Al. (2006) Microbiology an introducción. 9th edition Benjamin
Cummings Publishing.

-Voet, D., J. Voet, 2004. Bioquímica. Editorial Médica Panamericana. 3°Edición.

España.

-Lodish et Al (2007) Biología molecular cellular Editorial Médica Panamericana.

5°Edición. Argentina.