UNIVERSIDAD NACIONAL

AUTONOMA DE MEXICO

Facultad De Estudios Superiores

Zaragoza

Química Farmacéutico Biológica

LABORATORIO DE QUÍMICA III

1305

L-413 VIERNES 7:00-12:00

2do Informe.
(CROMATOGRAFÍA)

EQUIPO 9:

Sánchez Ibáñez José Juan

Profesor:

JORGE LEONARDO SANCHEZ MORALES

Resumen:

La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes que se han

de separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase
estacionaria, F.E.) mientras que la otra (fase móvil, F.M.) se mueve en una dirección
definida.
Otras definiciones (en la web): cromatograma, cromatografiar, cromatógrafo, fase ligada,
fase inmovilizada, eluir, efluente, muestra, componentes de la muestra, soluto, disolvente,
zona.

Varios tipos de cromatografía son posibles, dependiendo de la naturaleza de las dos fases
involucradas: sólido-liquido (capa fina, papel o columna), liquido-líquido y gases-liquido
(fase vapor).

Introducción:

La cromatografía en columna utiliza una columna de vidrio vertical que se llena con un
soporte sólido adsorbente (fase estacionaria: los más utilizados son gel de sílice y alúmina.

La muestra que se quiere separar se deposita en la parte superior de este soporte. El resto
de la columna se llena con el eluyente (disolvente que constituye la fase móvil) que, por
efecto de la gravedad, hace mover la muestra a través de la columna. Se establece un
equilibrio entre el soluto adsorbido en la fase estacionaria y el disolvente eluyente que fluye
por la columna. Debido a que cada uno de los componentes de una mezcla establecerá
interacciones diferentes con la fase estacionaria y la móvil, serán transportados a diferentes
velocidades y se conseguirá su separación.

La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa, uniforme, de un

adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales
son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante
la extensión, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se desarrollen
las placas cubiertas.
La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria
será un componente polar y el eluyente será por lo general menos polar que la fase
estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad serán
los menos polares.
La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros métodos
cromatográficos ya que el utillaje que precisa es más simple. El tiempo que se necesita para
conseguir las separaciones es mucho menor y la separación es generalmente mejor.
Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruirían el cromatograma.

Comentarios breves sobre la práctica: Se tuvo que encontrar la solución correcta para poder
efectuar la cromatografía en columna en base a la de capa fina.

Fundamento teórico: Las diversas técnicas para la separación de mezclas complejas se

fundamentan en la diversidad de afinidades de las substancias por un medio móvil gas o
líquido y un medio absorbente estacionario (papel, alúmina o sílice) a través del cual
circulan.

Objetivos:

Se desea encontrar las cámaras de elución correctas en cromatografía en capa fina para
así poder usar los eluyentes en la cromatografía en columna, para separar los pigmentos de
la espinaca correctamente.
Hipótesis:

Al encontrar los disolventes con la polaridad adecuada, mediante la cromatografía en capa

fina, se podrá proceder a identificar los componentes y separarlos por cromatografía en
columna.

Parte experimental

Reactivos

 Gel de sílice para capa fina

 Gel de sílice para columna
 Hexano
 Heptano
 Acetona
 Éter de petróleo
 Éter etílico
 Cloroformo
 diclorometano
 Metanol
 Etanol

Materiales:

 Cámaras de elusión
 Bureta
 Tubos de ensayo
 Soporte universal
 Pinzas de mariposa
 Embudo de tallo corto
 Parrilla de calentamiento y agitacion
 Anillo metálico
 Portaobjetos
 Capilares
 Papel filtro
 Lámpara de luz UV
 Pipeta Pasteur

Procedimiento experimental:
 Extracción de la espinaca:

● Se lavaron cuidadosamente las hojas de espinaca.

● Se colocaron las hojas de la espinaca grandes en un vaso de precipitados de 250 ml
● Se puso a hervir la espinaca con agua en el vaso por 5 minutos
● Se puso el vaso en un baño de hielo para romper la célula y se descartó el agua.
● Se realizó una extracción de los pigmentos de las hojas con 50 ml de una mezcla de
metanol 90% y eter dietilico 10%. Se calentó en baño maría por 5 min.
● Se repitió la extracción con 50 ml de metanol al 70% y eter dietlico 30%. Se calentó
durante 5 min.
● Se filtró y se colocó en un embudo de separación y se lava con ácido sulfúrico
● Se llevaron a cabo 3 lavados con salmuera.
● Se dejaron separar las capas.
● Se descartó la capa inferior.
● La capa superior de lavó con agua destilada.
● La capa superior del embudo

Cromatografía en capa fina:

● Se prepararon 11 cromatoplacas con gel de sílice cuidadosamente y se dejaron

secar al ambiente por completo
● Se prepararon las cámaras de elución con el papel filtro dentro de ellas
● Se agregó a cámara de elusión 5 mL de disolvente diferente
● Con un tubo capilar se colocó una muestra de la espinaca a cada placa y se puso en
la cámara, cuidando que la fase móvil no llegara a frente de elusión
● Una vez seca la cromatoplaca se marca el lugar donde llegó la fase móvil
● Se compararon todas las cromatoplacas para saber qué disolvente arrastró de mejor
manera nuestra extracción de espinaca y así poder definir la mezcla de disolventes
que se colocarían en la cromatografia en columna.

Cromatografía en columna.

● Se preparó el sistema de la cromatografia en columna con una bureta que en el

fondo tenía un poco de algodón y por encima de este arena a una altura de un cm
aproximadamente
● Se colocaron 20 cm de el gel de sílice previamente mezclado con hexano, cuidando
que en ningún momento quedase seco, hasta que quedó perfectamente
empaquetado
● Sobre el gel se colocó otra capa de arena de 1 cm
● Con una pipeta Pasteur se colocó la muestra de espinaca
● Se le agregó la muestra de disolventes previamente seleccionados
● Y se dejó que corriera la muestra de extracto de espinacas, separándose sus
componentes.
● Cada muestra, de color diferente, se recogió en tubos de ensayo, siempre
agregando más disolvente para que la columna no se fracture pues si ocurre la
cromatografía deja de ser efectiva
 ● Se realizó una cromatografía en capa fina, colocando cada color obtenido de las
muestras obtenidas en la cromatografía en columna, sin esta su color no era muy
fuerte se ponía a concentrar en baño maría.
● Se observaron las placas en la lámpara de luz UV, y se obtuvieron los Rf.

Cromatografía en capa fina:

Se prepararon 11 cromatoplacas
con gel de sílice y se dejaron
secar al ambiente por completo

Se colocó papel filtro dentro de

Con un tubo capilar se colocó cada cámara de elusión
una muestra de la espinaca a y a cada una se agregó 5 mL de
Cuidando que la fase móvil no
disolvente diferente a cada una
cada placa y se puso en la
llegara a frente de elusión.
cámara y se tapó.
El portaobjetos se retira antes de
que rebase la capa de gel de
sílice, se saca rápidamente y se
marca el frente del eluyente.

Se midió la distancia de cada

uno de los puntos a partir del
Al sacar la cromatoplaca se punto de aplicación, así como
marca el lugar donde llegó la también el frente de elución para
fase móvil posteriormente calcular el Rf.

Se compararon todas las

cromatoplacas para saber qué
disolvente arrastró de mejor
manera nuestra sustancia y así
poder definir la mezcla de
disolventes que se colocaron en
la columna cromatográfica.
 Cromatografía en columna.

Se colocaron 20 cm del gel de sílice

Se colocó en un soporte universal
previamente mezclado con hexano,
una bureta que sirve como columna
cuidando que en ningún momento
cromatográfica y en ésta se coloca
quede seco, hasta que quedó
al fondo algodón y sobre éste una
perfectamente empaquetado
capa de un cm de arena

Siempre agregando Sobre el gel se

más disolvente para colocó otra capa de
Se le agregó la muestra
que la columna no arena de 1 cm y con
de disolventes
se fracture pues si una pipeta pasteur
previamente
ocurre la se colocó sobre la
seleccionados y se dejó
cromatografía deja arena la muestra de
que corriera la muestra
de ser efectiva espinaca
de extracto de
espinacas, separándose
sus componentes.
 Se realizó una
cromatografía en Se observó en la
Una vez que la muestra capa fina, lámpara de luz UV,
llegue a la parte de debajo colocando las se obtuvieron los Rf
de la columna se toman muestras obtenidas y se realizaron las
las muestras en tubos de previamente conclusiones
ensayo, observando los concentradas
diferentes colores que se
presentan y cada uno será
vertido en un tubo de
ensayo diferente.

Resultados.

Cromatografía
en capa fina:

Disolvente Rf
Heptano 0.1
Ciclohexano 0
Hexano 0
Acetona 1.12
Cloroformo 0
Eter de petroleo 0
Acetato de etilo 1.18
Benceno 0
Diclorometano .32
Tolueno 0
Eter etílico 5.3
3.4
2.7

Etanol .3
Cetona 1.7
1.04
Metanol 1.15
 Cromatografía en columna:

Análisis de resultados.
Se pudieron identificar los componentes presentes en las espinacas por medio de la capa
fina, así como también se logró determinar el rf con cada uno de los disolventes; en base a
esto se determinó el disolvente a emplear en la cromatografía en columna y se lograron
separar también los componentes de la espinaca, a pesar de esto no se logró determinar
cada componente por separado en capa fina ya que no se lograron identificar los
componentes en las cromatoplacass, pues no se apreciaron las muestras a pesar de que
los puntos aplicados de las muestras fueron considerablemente concentrados así como
también se concentraron las muestras en los tubos de ensaye.

Conclusiones.
La cromatografía en columna es un método muy útil para la separación de porciones
considerables de compuestos de alguna mezcla que tengamos es muy importante tomar en
cuenta todas las precauciones para asegurar el un buen resultado de éste
procedimiento, el análisis que conlleva para la identificación de los componentes de
eluatos es de suma importancia ya que así aseguraremos tener un buen análisis
cuantitativo de la presencia de cada uno de los componentes presentes en la muestra.
 Cuestionario:

1. ¿A qué grupo de compuestos pertenecen los pigmentos?

R= Carotenoides y xantofilas.

2. ¿A qué se debe que estos compuestos sean coloridos?

R= Carotenoides: son los responsables de la gran mayoría de los colores amarillos,
anaranjados y rojos presentes en los alimentos vegetales. Entre mayor sea la intensidad del
color, mayor será el contenido de carotenoides.
Xantofilas: son compuestos químicos pertenecientes al grupo de los carotenoides que
poseen uno o más átomos de oxígeno en su estructura. Se encuentran de forma natural en
muchas plantas y presentan también acción fotosintética. Estos pigmentos, más resistentes
a la oxidación que las clorofilas, proporcionan sus tonos amarillentos y parduzcos a las
hojas secas.

3. Explique la diferencia entre cromatografía de adsorción y partición.

R= Cromatografía de partición: La mayoría de las sustancias tendrán distinta solubilidad en
diferentes solventes. Si una sustancia se pone en contacto con dos solventes que no se
mezclan entre sí, se distribuirá entre los dos solventes en relación a su solubilidad en cada
uno. Se llama efecto de partición a la distribución de un soluto entre dos o más solventes
que no se mezclan. El solvente o el líquido que es atrapado por el medio del sostén sea
este papel, gel, sílice o alúmina, se llama fase estacionaria. Al solvente revelador se le llama
fase móvil.
Cromatografía de adsorción: La cromatografía de adsorción o liquido-sólido, es la forma
clásica de cromatografía de líquidos. La adsorción se lleva a cabo cuando hay una
concentración más alta en la superficie de un sólido que en la solución circundante. La
adsorción se refiere al enlace de una sustancia a la superficie de otra. Generalmente los
adsorbentes usados en cromatografía son el carbón mineral, el gel de sílice, y la alúmina.

4. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la cromatografía en capa fina en

comparación con la cromatografía en columna?
R= Cromatografía en columna: Las separaciones en la cromatografía en columna pueden
realizarse por reparto, adsorción o intercambio iónico. El estado físico del adsorbente ha de
ser de tal manera que permita el empaquetamiento uniforme de la columna y el flujo libre de
disolvente a través de ella.
Cromatografía en capa fina: Cromatografía en papel y electro cromatografía. En todos los
casos se emplea una capa plana y relativamente delgada de una materia que a la vez es el
soporte o bien que recubre una superficie de vidrio, plástico o metálica. La fase móvil se
mueve a través de la fase estacionaria por capilaridad, a veces ayudada por gravedad o por
aplicación de un potencial eléctrico. En la actualidad la cromatografía en plano se centra en
la técnica de la capa fina, que es más rápida, tiene mejor resolución y es más sensible que
su alternativa en papel.
 5. Explique la diferencia que existe entre el adsorbente utilizado en cromatografía en
capa delgada y el de columna. Hacer una lista en orden creciente de actividad.
R= En columna: Puede usarse cualquier medio adsorbente siendo los más generales la
celulosa, gel de sílice, alúmina oxido de magnesio, oxido de cálcico y carbón activo (para
separaciones por adsorción y de intercambio iónico). Se emplea para la separación de
mezclas o purificación de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa,
generalmente, gel de sílice o alúmina dentro de una columna. La elección del disolvente es
crucial para una buena separación. Dicho disolvente pasa a través de la columna por efecto
de la gravedad o bien por aplicación de presión (cromatografía flash). La columna se
prepara mezclando el soporte con disolvente.
Capa delgada:
• Sílica gel (se utiliza en el 80% de las separaciones)
• Óxido de Aluminio o Alúmina (ácida, neutra o básica)
• Celulosa (Nativa o micro-cristalina)
• Poliamidas
Estos adsorbentes deben tener las siguientes características:

• Tamaño de partícula pequeño

• Diámetro de poro grande
• Área superficial grande
• Homogeneidad
• Alta pureza

6. Hacer una lista de los eluyentes usados comúnmente en cromatografía en columna

y capa delgada en orden creciente de polaridad.

• Hexano
• Éter de petróleo
• Benceno
• Tolueno
• Éter etílico
• Cloroformo
• Acetato de etilo
• Cloruro de metilo
• Dicloroetano
• Acetona
• Etanol
• Metanol

7. Lista de la capacidad de adsorción de los grps. funcionales de los compuestos

orgánicos.
R=

7.1¿Qué compuesto es más retenido una amina o un alqueno, ejemplifique en una capa
cromatográfica?
R= Un alqueno, por su polaridad.

8. ¿Cómo se prepara el capilar para aplicar la muestra en la cromatoplaca?

R= Se le aplica calor para así poder romperlo cuidando que quede un orificio no muy
grande.

9. ¿Por qué es necesario que la cámara de elusión esté saturada con los vapores del
eluyente?
R= Por que así será más fácil el arrastre de los pigmentos y no se secará la placa.
Explique cada uno de los siguientes términos:
• Eluyente: solvente que se usa en técnicas de cromatografía para extraer un
compuesto que se quiere separar de otra fase.
• Eluato: la sustancia que se separa o sale de la columna después de cada extracción.
• Elución fraccionada: Aparato de elución fraccionada electroforético tiene una
columna con una rotación conjunta de sello en el que un delgado chorro de elución búfer es
dirigido a través de la luz de la columna electroforética en una dirección perpendicular a la
de migración electroforética. El contenido de la columna se gira en relación con el jet
estacionario o se gira el jet con respecto a la columna. El sistema puede emplear
electroforesis en solución libre o en columnas empaquetadas.
• Adsorción: Es un proceso por el cual átomos, iones o moléculas son atrapados o
retenidos en la superficie de otra sustancia o material.
• Partición: La separación se basa en las diferencias de solubilidad de los
componentes de la mezcla en las fases estacionaria y móvil.
• Elución: se produce por el flujo de una fase móvil a través de la fase estacionaria.
• Adsorbente: es un sólido que tiene la capacidad de retener sobre su superficie un
componente presente en corrientes líquidas o gaseosas. Se caracteriza por una alta
superficie específica y por su inercia química frente al medio en el que se va a utilizar.
• Actividad del adsorbente: El nivel de actividad de la adsorción depende de la
concentración de la sustancia en la solución, la temperatura y la polaridad de la sustancia.
• Afinidad por el adsorbente: es que la sustancia ceda a la capacidad de capilaridad
del adsorbente y eluya a través de él.

10. ¿Cómo se clasifica la cromatografía en función de su fase estacionaria?

Naturaleza de fase estacionaria Clasificación
Naturaleza de fase móvil Líquido Líquido-líquido: partición
Líquido-sólido: adsorción, cambio iónico, exclusión, afinidad.
Gas Gas-líquido (CGL)
Gas-sólido (CGS)

11. ¿Cuál es la función de la fase móvil y como se lleva a cabo la separación en la

cromatografía de adsorción?
R= Su función es eluir los componentes de la mezcla a separar a través de la fase
estacionaria. La cromatografía de adsorción se lleva a cabo mediante el uso de una fase
estacionaria donde se observará la elución de los componentes de la mezcla, los cuales
serán eluidos por el disolvente, que es la fase móvil.
 12. ¿Cómo se prepara la papilla para la cromatografía en capa fina?, por lo menos dos
métodos.
R= Se machaca con ayuda de un mortero y pistilo hasta hacer polvo la sílica, luego se
añade el disolvente. También se puede hacer en un vaso de precipitados y con una varilla
de vidrio, agitando constantemente hasta formar la papilla.

13. ¿Cuándo es conveniente activar una placa y cómo se activa?

R= Antes de que se puedan usar las placas generalmente deben ser calentadas para retirar
el agua que actúa como una impureza y evita una buena separación. La magnitud de calor
depende del tipo de separación que se requiere para compuestos hidrófilos o polares, el
secado al aire o con un secador de pelo son generalmente suficiente; para los compuestos
hidrofóbicos o no polares es necesario un calentamiento más intenso. Las placas de óxido
de aluminio y de gel de sílice con adhesivo requieren ser secadas al aire durante
aproximadamente 30 min. Y después ser activadas en un horno a 100°C alrededor de 30
min. Las placas de celulosa deberán secarse al aire libre durante 30 min. y activarse al
horno durante 10 min. a 105°C.

14. ¿Qué espesor debe tener la fase estacionaria en una C.C.D.?

R= No debe ser espesa ni muy aguada, debe deslizarse solo por la placa al momento de
prepararla.

15. Al comparar los RF de dos componentes se encontró que eran iguales, ¿podría
pensarse que se trata del mismo compuesto? Explique brevemente.
R= Si, esto se concluye debido a que si ambos componentes eluyen de la misma manera,
significa que tienen una polaridad muy semejante, por lo tanto podría inferirse que se trata
del mismo componente.

16. Explique brevemente si existe una relación entre la cantidad de adsorbente y las
dimensiones de la columna para una mezcla.
R= Entre más grande sea una columna, más adsorbente se necesitará, esto para observar
mejor la separación de los componentes; además de necesitar más disolvente para
continuar la elución y evitar la sequedad del sistema.
17. ¿Cómo debe de ser la polaridad del eluyente al empacar una columna?
R= La polaridad del eluyente debe ser mayor

18. Con relación al Rx:

18.1 ¿Cuándo se usa el Rx en cromatografía en capa delgada?
R= Cuando no se cuenta con un compuesto con polaridad conocida, y por lo tanto elusión
conocida, que se pueda usar como referencia en la C.C.D.

18.2 ¿Qué significa la obtención de Rx igual a uno?

R= Que el compuesto y el eluyente tienen la misma polaridad, incluso hasta mayor la de
este último.
 19. ¿Cuál es el orden de polaridad en que salen los compuestos de una cromatografía
en columna?
R= En la cromatografía de columna las moléculas de una mezcla son separadas en base a
la afinidad de las moléculas por la fase estacionaria o por la fase móvil. Si una molécula A
tiene más afinidad por la fase estacionaria que la B, B bajará más rápido que A.

• Hexano
• Éter de petróleo
• Benceno
• Tolueno
• Éter etílico
• Cloroformo
• Acetato de etilo
• Cloruro de metilo
• Dicloroetano
• Acetona
• Etanol
• Metanol

20. ¿A qué se le llama frente del eluyente en cromatografía en capa delgada?

Demuéstrelo en una placa.
R= Es la línea donde acaba la elusión, si se rebasa dicha línea se corre el riesgo de que los
componentes separados se esparzan a lo largo de la parte posterior de la placa.

21. ¿Cómo se controla la salida de los componentes en una cromatografía en columna?

R= Se controla con la llave de la bureta, se va colocando los distintos pigmentos en tubos
de ensayo, a los que se les denominará como fracciones.

22. ¿Por qué no debe dejarse secar la columna cromatografía? En caso de que se
fracture ¿qué se recomienda hacer?
R= Porque de no ser así la fase estacionaria se contraería y agrietaría. Se debe rehidratar
con más eluyente si esto ocurre.

23. ¿Por qué es importante que las muestras a separar por cromatografía deban estar lo
más secas posible?
R= Para que no interfiera el agua con la elución, por medio del disolvente, de los
componentes de la muestra.

24. ¿Por qué al cargar una columna se recomienda que la muestra lleve la mínima
cantidad de disolvente?
R= Las cantidades altas de flujo dan malas separaciones, el promedio es de 3 a 4mL/min.
en una columna de 40 cm de altura aprox.

25. ¿Qué pH presenta la alúmina? Mencione los tres casos.

R= Presenta tres pH: alúmina ácida pH de 4.5, alúmina básica pH de 10.0 y alúmina neutra
pH de 8.0.
 26. ¿Por qué cuando se usa alúmina como adsorbente no se recomienda usar acetona
como eluyente?
R= Porque se desnaturaliza y queda pegada en las paredes de la columna.

27. ¿Cuáles son los pasos a seguir para la preparación de una placa preparativa?
R= Las separaciones en capa fina características se realizan en placas de vidrio o plástico
que se recubren con una capa delgada y adherente de partículas finamente divididas, esta
capa constituye Ia fase estacionaria. Las partículas son semejantes a Ias de Ia
cromatografía en columna. Las capas finas preparadas sobre vidrio se denominan
cromatoplacas o placas simplemente.

28. ¿Cuál es la aplicación de la cromatografía en placa preparativa?

R= La elección de un eluyente ideal para cromatografía en columna.

29. ¿Qué diferencia existe entre cromatografía en capa delgada analítica y

cromatografía en placa preparativa?
R= La preparativa se emplea generalmente para elegir un eluyente o mezcla de eluyentes
ideal para cromatografía en columna. La analítica ya cuenta con un eluyente ideal y registra
Rx, es decir, se analiza la elusión de los componentes para arrojar un valor numérico final.

30. ¿Cómo se clasifican los reveladores en forma general?

R= Químicos y físicos.

31. Cuando una sustancia orgánica no se revela con I2 o luz UV, ¿qué otros reveladores
pueden usarse para observar la sustancia?
R= Con reveladores químicos específicos para los componentes separados.

Bibliografía.
● http://biblioteca.uns.edu.pe/saladocentes/archivoz/curzoz/cromatografia.pdf
● http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/principio
s_de_cromatografia.pdf
● http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf
● http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Cromatografia.pdf
● Serie Académicos CBS. Cromatografía de gases y de líquidos de alta resolución
México 2000.
● H. H. Strain, Chromatografic Adsorption Analysis, Interscience Publ. In New-York
(1942).
● D.A. Skoog, J.J. Leary, “Análisis Instrumental”, McGraw-Hill, Madrid (1996)
● H.H. Willard, L.L. Merritt Jr.,J.A. Dean, F.A. Settle Jr., “Métodos Instrumentales de
análisis”, Grupo Editorial Iberoamericana S.A. de C.V., México (1991).
● Angurell, I., Casamitjana, N., Caubet, A., Dinarés, I. Operaciones Básicas en el
laboratorio de química. Universidad de Barcelona. Barcelona.
● http://www.dcne.ugto.mx/Contenido/MaterialDidactico/QuimicaBioinorganica/1.9_Cro
matografia.pdf