REPORTE DE PRÁCTICA 7

¨INMOVILIZACIÓN¨

Sandra Medina Vallejo

Introducción
Una categoría principal de inmovilización
La inmovilización de células de levadura de microorganismos es el atrapamiento
en varios tipos de soporte puede dentro de matrices porosas. se utilizan
proporcionar altas densidades celulares en hidrogeles poliméricos naturales y
el biorreactor, lo que, en combinación con sintéticos como el alginato de calcio, el j-
altas tasas de flujo, conduce a tiempos de carragenano, el agar, el poliuretano, el
resistencia cortos. Estos beneficios poliestireno y el alcohol polivinílico
económicos son la fuerza impulsora de un (Ramakrishna y Prakasham 1999). Estas
esfuerzo de investigación global destinado perlas poliméricas son generalmente
a estudiar e implementar fermentadores esféricas con diámetros que varían de 0.3 a
continuos. El primer sistema de 3 mm.
fermentación continua apareció en la En la presente práctica se analizó el
década de 1960, pero pocos sistemas método descrito anteriormente a fin de
crecieron a escala industrial, lo que es observar la actividad enzimática y su
indicativo de las muchas dificultades utilidad en un proceso industrial.
técnicas y cualitativas asociadas con esta
tecnología. Existen varios métodos de Objetivo
inmovilización disponibles para los
investigadores y la naturaleza de la Realizar la inmovilización de
aplicación a menudo dicta la elección. Un microorganismos de manera adecuada, así
conocimiento profundo de la influencia de como medir de manera precisa la
la inmovilización en el rendimiento de la capacidad de reutilización de las células,
fermentación y los parámetros que afectan mediante una simulación haciendo uso de
la inmovilización es vital para afinar el enzimas.
proceso continuo y alcanzar una calidad de
Materiales y métodos
producto aceptable.
Para llevar a cabo la práctica se utilizaron
500 mg de Pancreatina (tabletas
compuestas por α-amilasas, proteasas y
lipasas), dichas pastillas se trituraron en un
mortero hasta obtener un polvo lo más fino
posible, se utilizaron 10 mL de solución de
alginato de sodio al 2% y solución de
cloruro cálcico al 2%. Una vez obtenido el
polvo de molienda, ésta se disolvió en la
Figura 1. Métodos básicos de inmovilización de solución de alginato de sodio y
levadura: (a) fijación a una superficie, (b) posteriormente esta mezcla se colocó
atrapamiento dentro de una matriz porosa, (c) dentro de una jeringa de 5 mL y desde ésta
contención detrás de una barrera y (d) se colocaron gota a gota a la solución de
autoagrupación.
cloruro de calcio. Transcurridos 5 min se

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decantó la solución de cloruro de calcio. material sólido con características de un
Se realizaron tres ensayos, el primero de gel (Avedaño, 2013). Se obtuvieron
ellos se agregó 3 mL de almidón más dos estructuras en forma de esferas tal como lo
gotas de tintura de yodo, el siguiente 3 mL reporta la bibliografía.
de almidón más una pizca de pancreatina,
después de 10 min se les agregó dos gotas En el segundo ensayo se mezcló almidón y
de tintura de yodo y el tercer ensayo tintura de yodo, se observa la formación de
consistió en agregar las esferas en 5 mL de un color violeta oscuro (Figura 2).
almidón, agitar constante durante 10 min y
agregar las dos gotas de yodo, este último
ensayo se realizó por triplicado
reutilizando las mismas esferas de
pancreatina.
Resultados y discusión
Las esferas que contenían las pancreatinas
se formaron mediante la adición gota a
gota de la solución de alginato con la
enzima a la solución de cloruro de calcio
(CaCl2), se obtuvieron esferas blancas de 2
a 3 mm de diámetro, con textura blanca
(Figura 1).
Figura 2. Prueba de almidón positiva.
La prueba de yodo es una reacción
química usada para determinar la de
almidón con una solución de yodo disuelto
en una solución acuosa de yoduro de
potasio que reacciona con almidón
produciendo un color púrpura. a prueba de
yodo se da como consecuencia de la
formación de cadenas de poliyoduro a
partir de la reacción entre el almidón y el
yodo presente en el reactivo de lugol. Es
por el acontecimiento de esta reacción que
fue posible obtener la coloración
observada.

Figura 1. Esferas de alginato

Este hecho fue posible debido a la
capacidad gelificante de los alginatos, se
sabe que la formación del gel se inicia a
partir de una solución de sal de alginato y
una fuente de calcio externa, desde donde
el ion calcio se difunde hasta alcanzar la
cadena polimérica. Como consecuencia de
esta unión se produce un reordenamiento
estructural en el espacio, resultando un

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 moléculas de yodo formando un color azul
oscuro tal como se observó durante el
primer ensayo; mientras que la
amilopectina es de estructura ramificada,
con con enlaces α (1-4) (1-6), que forma
hélices mucho más cortas y las moléculas
de yodo son incapaces de juntarse
presentando un color intermedio entre
anaranjado o amarillo.
El tercer experimento consistió en evaluar
la actividad de la enzima inmovilizada,
donde se puso en contacto el almidón con
las esferas de alginato durante 10 minutos,
posterior a ello, se agregaron las gotas de
Figura 3. Vista esquemática de una hélice tintura de yodo, se observó una ligera
de amilosa, con iones I3− embebidos. coloración morada (Figura 4a). Después se
Para el segundo experimento se agregó separaron las esferas y se colocaron en
una pequeña cantidad de pancreatina en otro recipiente con almidón, al agregar el
almidón, después de 10 minutos se agregó yodo se observó un tono morado
tintura de yodo, no se observó la ligeramente más oscuro al anterior (Figura
coloración violeta del ensayo anterior, sino 5b) y al tercer ciclo se obtuvo una solución
que la solución se mantuvo del mismo de tonalidad morada superior a las dos
color blanquecino (Figura 4). anteriores (Figura 5c).

a) b) c)

Figura 5. Reacción con enzima

inmovilizada.
El motivo por el cual se obtuvieron
tonalidades de morado diferentes para las
mismas esferas de alginato radica en que la
transferencia de masa entre las enzimas y
Figura 4. Reacción con enzima libre el almidón perdía velocidad debido a la
saturación de los sitios activos de las
La pancreatina agregada es una enzimas, observándose una mayor
combinación de enzimas digestivas y su degradación de almidón en el primer ciclo
función es la digestión de grasas, proteínas y menor en el tercero, concordando con la
y azúcares, al dejar actuar este tipo de teoría vista en clase.
proteínas fue posible que se degradara el
almidón presente. Cabe mencionar que la Con los resultados obtenidos en la práctica
amilosa y la amilopectina son se puede deducir que la reacción con la
componentes del almidón, pero la amilosa enzima libre es más rápida en comparación
es de estructura lineal, con enlaces α (1-4), a la reacción con enzimas inmovilizadas,
que forma hélices en donde se juntan las lo cual concuerda con datos reportados por

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Sabariz et al. (2012) en donde se evalúa el de matriz, pérdida de enzimas debido a
efecto de la inmovilización sobre la desplazamientos por lo que se recomienda
actividad enzimática de las α-amilasas, en realizar un correcto lavado de las esferas.
la cual se realiza la inmovilización de También se recomienda realizar un mayor
manera similar, utilizando el quitosano número de ciclos para determinar la
como agente gelificante, reportan que la cantidad de ciclos requeridos para que las
velocidad máxima de reacción es enzimas pierdan la actividad catalítica
aproximadamente 10 veces mayor con la totalmente, o comparar dos enzimas
enzima libre en comparación con las diferentes.
enzimas inmovilizadas.
La microencapsulación permite proteger a
A pesar de que la producción de glucosa a los compuestos encapsulados de factores
partir de almidón con α-amilasas, es más adversos como el calor y la humedad,
rápida con las enzimas libres, resultó más mejorando así su estabilidad y
eficiente la utilización de las enzimas biodisponibilidad. Se han descrito
inmovilizadas, ya que se pudieron diferentes aplicaciones de la
reutilizar 3 veces, por lo que con la misma microencapsulación empleando como
cantidad de enzimas se pudo tratar el triple principio activo: vitaminas, minerales,
de volumen en comparación con las ácidos grasos, microorganismos
enzimas libre. probióticos, proteínas, aminoácidos,
polifenoles, fibras y enzimas (Nieves et
Tal como se observa en los resultados, una al., 2010). La microencapsulación ha
de las desventajas de la inmovilización son permitido inmovilizar bacterias probióticas
las restricciones a la transferencia de masa, en una matriz de alginato con la finalidad
sin embargo, Arroyo (1998) menciona que de proteger y mejorar la biodisponibilidad
existen algunas maneras de minimizar de los microorganismos, tanto en los
estas restricciones como disminuir el productos alimentarios como en el tracto
tamaño del biocatalizador, aumentar la intestinal. En la Tabla 1 se muestran
concentración de sustrato, incrementar la algunos ejemplos de bacterias probióticas
agitación. Con estas medidas se consigue encapsuladas en alginato.
reducir el grosor de la capa de difusión, tal
como se realizó en la presente práctica.
Al investigar el posible tipo de inhibición
producida durante la reacción se puede
suponer inhibición por sustrato, ya que en
la práctica se llevó a cabo la saturación de
la enzima con la solución de almidón.
Además, durante la práctica existieron
factores que alteraron la reacción y los
resultados, como la generación de esferas
de formas y tamaños irregulares, estas
condiciones permiten considerar diferencia
entre la transferencia de masa entre las
esferas y el medio no fue homogénea.
Figura 5. Aplicaciones de alginato para
Es por esto que en el último experimento microencapsulación de probióticos
la coloración de las soluciones fue agregados a alimentos. (Avedaño, 2013)
aumentando de forma gradual ya que las
enzimas perdieron actividad catalítica en Otras investigaciones reportan la
cada ciclo por factores como la saturación encapsulación de bacterias ácido lácticas
(probióticos y cultivos inicadores) en
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perlas de laginato, lo que facilita la de alginato aplicadas a cocina.
propagación de sepas sensibles al oxígeno Alimentaria. 388:79-83.
(Champagne, 2006), y de extractos
naturales con algo contenido de Champagne, C. (2006). Starter cultures
polifenoles provenientes de plantas biotechnology: the productionof
medicinales, hierbas, flores y semillas. Por concentrated lactic cultures in alginate
ejemplo, un aceite muy utilizado en la beads and their applications in the
industria de bebidas es el limoneno, el cual mutraceutical and food industries.
es sensible a altas temperaturas y al ser Chemistry Industry Chemical Engineerig.
encapsulado se mantiene su sabor como 12:11-17.
olor intacto. La versatilidad d l
Nieves et al., (2010). Encapsulación de
encapsulado incluso ha llegado a ser
ápices de aucalipto en perlas de alginato.
aplicada en la alta cocina con el término
Influencia de AIBY el MH-5. Centro
“esterificación” técnica culinaria cuyo
Agrícola, 37(4): 15-19.
propósito es modificar las propiedades
texturales de los alimentos, para así Sabariz et al., (2012). Determinación del
desarrollar nuevas sensaciones en el efecto de la inmovilización sobre la
comensal. (Corell et al., 2007). actividad enzimática de α-amilasas
Conclusiones Verbelen, P. J., De Schutter, D. P.,
Delvaux, F., Verstrepen, K. J., & Delvaux,
Al llevar a cabo la presente práctica fue
F. R. (2006). Immobilized yeast cell
posible inmovilizar enzimas mediante
systems for continuous fermentation
cápsulas de alginato para observar su
applications. Biotechnology Letters,
actividad en forma libre e inmovilizada. Se
28(19), 1515–1525. doi:10.1007/s10529-
encontró que las enzimas de forma libre
006-9132-5 
actúan a una mayor velocidad pero que no
es posible reutilizarlas. En cambio, al
obtener enzimas inmovilizadas es posible
reutilizar dichas enzimas, mantener un
mayor control de su actividad, así como
reducir costos de producción al aprovechar
por mucho más tiempo la vida útil de estos
catalizadores biológicos.

Referencias
Arroyo, M. (1998). Inmovilización de
enzimas. Fundamentos, métodos y
aplicaciones. Ars Pharmaceutica (39:2).
23-39.
Avedaño, G. (2013). Propiedades del
alginato y aplicaciones en alimentos.
Remas selectos de Ingeniería de
Alimentos.
Corell et al., (2007). Efecto del ión calcio
sobre las propiedades texturales de esferas