Prácticas de

bioquímica clínica

- Glucemia -
Entendemos por glucemia el nivel de glucosa en sangre. Para determinar los niveles de
glucosa se recurre a determinar los niveles de glucosa en sangre ya sea en ayunas, tras
la eliminación o bien suspensión.
Valores de referencia:
Adultos 55-100mg/100ml

Niños 55-90mg/100ml

Lactantes 20-80mg/100ml

PATOLOGÍA:

1. Hiperglucemias:

• Diabetes Mellitus: síndrome de hiperglucemia persistente.

✔ DM insulinodependiente (tipo1): la insulina es baja. Patogenia contra la
células β de Langerhans.
✔ DM no insulinodependiente (tipo2): Asociada a la obesidad. Puede cursar
con hiperinsulinemia. Existe pérdida a la sensibilidad por la insulina.

• Alteración de la tolerancia a la glucosa: se diagnostica cuando la glucemia basa

es menor de 126mg/100ml o entre 140 – 200mg/100ml a las 2h tras una
carga oral de 75g de G.
• Otras: embarazo, pancreatitis crónica, síndrome de cushing,etc.
2. Hipoglucemias: insulinomas, exceso de dosis de insulina o hipoglucemiantes
orales.
CRITERIOS DE DIAGNÓSTICO DE DIABETES:
• Síntomas clásicos y glucemia causal ≥ 200 mg/100ml.
• Glucemia basal (tras ayuno nocturno) ≥ 126mg/100ml.
• Alterción de la curva de glucemia, con valores ≥ 200mg/100ml a las 2h post-
ingesta de 75g de glucosa con 300ml de H2O.

MÉTODO DE LA GLUCOSA OXIDASA: método a punto final.

La glucosa oxidasa cataliza la oxidación de la glucosa a ác.glucónico. El peróxido
producido se detecta mediante un agente cromogénico reductor, 4-aminofenazona +
p-clorofenol, en presencia de peroxidasa. La quinonaimina formada es aproximadamente
igual a la cantidad de glucosa.

Glucosa + O2 + H2O -----GOD----> Ác. Glucónico + H2O2

H2O2 + p-clorofenol + 4-aminofenazona ----POD---->Quinonaimina +2 H2O

Interferencias:
• El agua bidestilada debe ser de calidad analítica.
• El frasco utilizado debe estar limpio y sin detergentes.
• Los anticoagulante como EDTA, oxalato, heparina o fluoruro no afectan al
resultado.
• No hay interferencias por Hb (4g/L), bilirrubina (20 mg/L), creatinina (100 mg/L) y
galactosa (1g/L).
• La hemólisis hasta 0,3 g/100ml de Hb no interfiere.

Cálculos: determinar la glucemia del suero e interpretar los resultados:

Glucosa 1 Glucosa 2

Blanco 1 0 Blanco 2 0

Patrón 1 0,439 Patrón 2 0,432

Suero 1 0,302 Suero 2 1,261

Am Cm
=
Ap Cp
--------> Cm=Cp⋅  
Am
Ap
 
Cm 1=
100ml 
100mg 0,320
⋅
0,439=68,8 mg /100ml NORMAL (55-100)

Cm 2=
 ⋅
 
100mg 1,261
100ml 0,432
=291,9 mg /100ml DIABETES (>200 mg)
 -Triacilgliceroles-
Los triacilgliceroles o grasas neutras son trapotadores an la sangre de
lipoproteínas: QM, VLDL (lipoproteínas de muy baja densidad). Los valores normales en
suero son: 36-165mg/100ml. Son valores elevados > 200mg/100ml.

PATOLOGÍA:
1. La hipertriacilglicerolemia aparecen en:
• Hiperlipemias: tipo I, II b, III, IV, V.
• Hipotiroidismo.
• Diabetes mellitus.
• Síndrome nefrótico.

MÉTODO: método a punto final.

Loas triacilgliceroles se hidrolizan a glicerol y ácidos grasos libres por acción de
la lipoproteína lipasa. El glicerol es transformado en glicerol fosfato en presencia de
glicerol quinasa y ATP. El glicerol fosfato es oxidado a dihidrixiacetona fosfato por la
acción de la glicerol fosfato oxidasa. El peroxido formado, se valora mediante un agente
reductor p-clorofenol + 4-aminofenazona, en presencia de peroxidasa. La quinonaimina
roja es proporcional a la concentración de triacilgliceroles.

Triacilgliceroles + H2O ------lipasa------> Glicerol + ác.grasos.

glicerol + ATP -------glicerol quinasa--------> glicerol-3-P + ATP

glicerol-3-P + O2 -------glicerol3Poxidasa------> H2O2 + Dihidroxiacetato-P

H2O2 + p-clorofenol + 4-aminofenazona -------POD-------> quinonaimina + 2 H 2O

CÁLCULOS: calcular la [ ] de triacilgliceroles teniendo en cuenta la disulución. Interpretar

los resultados.

Triacilgliceridos 1 Triacilgliceridos 2

Blanco 1 0 Blanco 2 0

Patrón 1 0,197 Patrón 2 0,154

Suero 1 0,046 Suero 2 0,104

 
Cm 1=
100ml 
200mg 0,046
⋅
0,197=46,7 mg /100ml×3=140,1 mg /100ml El 3 es es factor de

dilución

Cm 2=  100ml 
200mg 0,104
⋅
0,154=135,06 mg /100ml×3=405,2 mg /100ml DIABÉTICO
 - Colesterol y HDL-colesterol -
El colesterol es un compuesto importante para la formación de la membranas celulares y
hormonas esteroideas. Su transporte está asociado a lipoproteínas. Estas lipoproteínas
pueden ser de dos tipos:
• LDL (lipoproteína de baja densidad): transportan esteres de colesterol desde el
hígado a los tejidos periféricos. Contienen un 60-75% de colesterol. Si está en
exceso aumenta el riesgo de ateroesclerosis.
• HDL (lipoproteína de alta densida): transporta colesterol esterificado y libre desde
sangre y tejidos hasta el hígado. Contiene un 15-30% de colesterol total. Su
aumento disminuye el riesgo de arteroesclerosis.

Los valores normales de colesterol total y HDL-colesterol varían con la edad y el sexo:
• Colesterol total: < 200mg/100ml y supone un riesgo grave > 240 mg/100ml.
• HDL-colesterol:

HOMBRE MUJER

Riesgo bajo > 55 mg/100ml > 65 mg/100ml

Riesgo normal 35-55 mg/100ml 45-65 mg/100ml

Riesgo alto < 35 mg/100ml < 45mg/100ml

CÁLCULO DE LDL-colesterol. FÓRMULA DE FRIEDEWALD:

T.A
LDL- colesterol = colesterol total - (VLDL) – HDL- colesterol
5

Valores sospechosos a partir de 130 mg/100ml , elevado 160mg/100ml

COCIENTE DE RIESGO ATEROGÉNICO

Colesterol total
HDL −colesterol
MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN:
Los esteres de colesterol son hidrolizados a colesterol y ác.grasos libres por la
colesterol esterasa. En presencia de O2, la enzima actúa sobre el colesterol libre
formando colesterona y peróxido de hidrógeno, el cual se valora con 4-aminofenazona
y p-clorofenol, en presencia de peroxidasa. La quinonaimina roja es proporcional de la
[ ] de colesterol.
La determinación de HDL-colesterol se basa en la precipitación selectiva de la
lipoproteínas. Mediante un reactivo precipitamos LDL y VLDL, mientras que la HDL queda
en el sobrenadante.

Reactivo de precipitación: ácido fosfotúngstico 14 mmol/L pH=1,3, cloruro de Mg 2mmol/L

INTERFERENCIAS:
• No interfieren:
◦ ácido úrico: 1,5 mmol/L
◦ glucosa: 28 mmol/L
◦ ácido salicílico: 3,6 mmol/L
◦ cafeína: 52 mmol/L
◦ paracetamol: 0,66 mmol/L
◦ ácido nicotínico: 0,16 mmol/L
◦ fenobarbital: 0,4 mmol/L
◦ cortisona: 5 mmol/L
• El ácido ascóbico interfiere negativamente por encima de 300 μ mol/L
• La hemólisis superior a 3g/L de Hb influye positivamente

CÁLCULOS:
1. Calcular la [ ] de colesterol total de la muestra
Colesterol:
✔ blanco: 0
✔ Patrón: 0,182
 ✔ Suero (colesterol total): 0,158
✔ Sobrenadante (HDL): 0,053

Cct =
 200 mg
100 ml  
⋅
0,158
0,182
=173,62 mg /100ml NORMAL < 200 mg/100ml

2. Calcular la [ ] de HDL-colesterol

C HDL =
 200 mg
100 ml  
⋅
0,053
0,182
=58,24 mg / 100ml RIESGO BAJO > 55 mg/100ml

3. Calcular LDL-colesterol:

TA 140,1
LDL-colesterol = Ct - - HDL = 173,62 - - 58,24= 87,36 mg/100ml
5 5
< 130 mg/100 ml NORMAL.

4. Calcular el ciente de riesgo aterogénico:

CT 173,62
Cociente de riesgo = = =2,981 < 4 RIESGO BAJO
HDL 58,24

5. Interpretación de los resultados:

Paciente con valores normales de colesterol y HDL-colesterol, con bajo riego
de padecer ateroesclerosis.
 - Bilirrubina -
Se origina por degradación del grupo hemo de la hemoglobina, resultante de la
lisis de los hematies en el retículo endotelial. Cuando aparece hemoglobina libre, forma
un complejo con la haptoglobina, proteína que se encarga de su transporte, la cual es
retirada de la circulación por las células del retículo endotelial. Aquí las cadenas de
globina son metabolizados en aa y el gurpo hemo en bilirrubina mediante dos
reacciones redox consecutivas. La bilirrubina es transportada por la albumina al hígado
donde es conjugado a ác.glucurónico y excretada a la bilis.
Interesa conocer los niveles de bilirrubina total y diferenciar la libre, que aumneta en
procesos hemolíticos, de la conjugada, que aumneta an disfunción hepática,
concretamente en fallos de eliminación a través de la bilis.

Valores normales en suero:

• Nacimiento: hasta 5mg/10ml; 5 días: hasta 12mg/100ml; 1 mes hasta
1,5mg/100ml,
• Adultos: bilirrubina total: 1,1 mg/100ml.
Bilirrubina directa: 0,25 mg/100ml.

Patología:

• Hiperbilirrubinemia:
Sustrato humoral de toda la ictericia. Tiene lugar siempre que se libere un exceso
de hemoglobina (hiperhemólisis) o se retenga la bilirrubina formada en proporción
normal, por insuficiencia hepática u obstrucción biliar. Se traduce en ictericia con
una concentración superior a 2,5 mg/100ml.
Observamos hiperbilirrubinemia en :
◦ En el recién nacido. Durante la permanencia en grandes alturas.
◦ En ictericia obstructiva o mecánica, tanto por obstucción total o parcial.
Reacción de Van der Bergh.
◦ En ictericia hepatocelular o parenquimatosa, fallo en el transporte.
Bilirrubinemia directa e inmediata.
◦ En ictericia hemolítica. Enfermedades sangíneas que cursan con destrucción
exagerada de hamatíes. Hiperbilirrubinemias discretas.

• Hipobilirrubinemia:
En anemias intensas ferropénicas o aplásicas.
Método: MÉTODO A PUNTO FINAL.
Reacción de Malloy-Evelyn, valira la formación de azobilirrubina (color rojo cereza)
cuando se hace reaccionar con bilirrubina y el ác. Sulfanílico diazotado.
La bilirrubina conjugada (muy polar) reacciona en medio acuoso con el reactivo, por lo
que se llama directa, al ponerlo en contacto dan el color directamente. La libre es
indirecta pues necesita de un tercer reactivo (dimetilsulfóxido).

Cálculos:

Bilirrubina total Bilirrubina directa

Blanco 0 Blanco directo 0

Suero total 0,09 Suero indirecto 0,066

Blanco patrón total 0

Patrón total 0,02

1. Calcular la [ bilirrubina total, directa e indirecta]

Cmt =
  
1 mg
100 ml
⋅
0,091
0,019
=4,789 mg /100ml/2=2,4 mg /100ml

Cmd =
  
1 mg
100 ml
⋅
0,066
0,019
=3,47 mg /100ml/2=1,7 mg /100ml

B.indirecta= BT – BD = 2,4 – 1,7 = 0,7 mg/100ml.

 - Urea -
Es el producto final del catabolismos de la proteínas. Se sintetiza en el hígado a
partir de amonio de los aa. El 90% de la urea se elimina por el riñón mediante filtración
glomerular, el resto (10%) por la piel mediante sudor y por el tracto gastrointestinal. Entre
el 40-70% difunde pasivamente del túbulo al intersticio para volver al plasma, proceso
que depende del flujo urinario. La disminución del flujo produce un aumento de la
reabsorción de urea y una menor eliminación La medida de urea es una de las pruebas
más útiles para determinar el correcto funcionamiento de la función renal.

Valores normales en suero:

• Adultos: 17-43 mg/100 ml.
• Niños: 10-25 mg/100 ml.
• Lactantes: 5-15 mg/100 ml.

Valores normales en orina: 20-40 g/24h.

Patología:
Aumento de los niveles de urea se entiende como azotemia o uremia, puede ser:
• Azotemia prerrenal: perfusión inadecuada del riñón y como consecuencia una
filtración glomerular disminuida en presencia de una función renal normal. Otros
factores son dietas hiperprotéicas, pérdida de masa muscular tras ayuno
prolongado o aumento del catabolismos protéico en fiebre, estrés, quemaduras...

• Azotemia renal: consecuencia de una insuficiencia renal aguda o crónica.

• Azotemia postrenal: Obstrucción del tracto urinario, con la difusión pasiva de la

urea desde el túbulo renal a la circulación.

Los niveles de urea en suero o plasma disminuyen en malnutrición, ingesta elevada de

líquidos, embarazo y enfermedades hepáticas graves.

Métodos: MÉTODO CINÉTICO

La ureasa cataliza la hidrólisis de la urea formando amonio y CO 2. El amonio se
valora mediante la reacción enzimática catalizada por la glutamato deshidrogenasa
(GLDH) que oxida el NADH a NAD+. La disminución de la absorbancia del NADH frente
al tiempo es proporcional a la concentración de urea.
 Urea + H2O + 2H+ ------ureasa------> 2NH4+ + CO2.

2NH4+ + 2 α-cetoglutarato + 2 NADH -----GLDH------> 2L-glutamato + 2NAD+ + H2O.

Cálculos: 1ml ----> 100 μl

Cm =Cp⋅
 Absr m
Absr p ×factor de dilución 1,5 L orina 24 h

Blanco 0

Patrón 1 0,934 Suero 1 1,042 Orina 1 0,981

Patrón 2 0,870 Suero 2 1,008 Orina 2 0,915

Patrón 3 0,812 Suero 3 0,977 Orina 3 0,841

Patrón 4 0,763 Suero 4 0,952 Orina 4 0,762

Patrón 2 - 1 -0,064 Suero 2 - 1 -0,034 Orina 2 - 1 -0,066

Patrón 3 - 2 -0,058 Suero 3 - 2 -0,031 Orina 3 - 2 -0,074

Patrón 4 - 3 -0,049 Suero 4 - 3 -0,025 Orina 4 - 3 -0,079

Media x = -0,057 Media x = -0,03 Media x = - 0,073

• Concentración en suero:

Cm =
 
50 mg
100 ml
⋅
−0,03
−0,057 
=26,31 mg /100ml NORMAL (17-43 mg/100ml)

• Concentración en orina:

Cm =
 
50 mg
100 ml
⋅
−0,073
−0,057 
⋅50=3201,5 mg /100ml

3201,5 ---------- 100ml

X =48026,25 mg /1500 ml =48 g /24h
x ---------- 1500 ml (20-40g/24h)
 - Creatinina -
Procedente de la fosfocreatina muscular, la cual actúa como una pequeña reserva de
energía. El enzima creatina quinasa cataliza la transferencia del grupo fosfato de la
fosfocreatina al ADP dando ATP y cretina. Parte de la creatina sufre una deshidratación y
cliclación dando lugar a la creatinina, producto no reutilizable. La valoración se emplea
como índice de filtración glomerular, prácticamente toda la creatinina filtrada se excreta
por orina. En condiciones normales su concentración es proporcional a la masa
muscular.

Valores normales en suero:

• Adultos:
◦ Hombres: 0,6-1,2 mg/100ml.
◦ Mujeres: 0,5-1 mg/100ml.
• Niños: 0,25-0,85 mg/100ml.

Valores normales en orina: 1-1,5 g/24h (15-30mg/Kg/día).

Aclaramiento renal:
Para expresar la función depuradora del riñón se utiliza el aclaramiento renal, volumen de
plasma depurado de una sustancia por unidad de tiempo. Se calcula:

Aclaramiento  ml / min =
 O  mg /100ml
P  mg /100ml 
×V  ml / min 

O = creatinina en orina.
P = creatinina en plasma (o suero).
V = volumen orinario.

El aclaramiento es proporcional al número de glomerulos que a su vez lo es de la

masa renal, por tanto influye la masa corporal del individuo corrigiéndose el aclaramiento
por un factor de 1,73/A.

AR =
  
O ×V
P
×
1,73
A
A = superficie corporal (m2)
Patología:
Los valores de creatinina en suero se encuentran aumentados en: insuficiencia
renal, gigantismo y acromegalia. Están disminuidos en: atrofia muscular.
En orina están aumentados en gigantismo y acromegalia. Y disminuidos en
insuficiencia renal y atrofia muscular.

Método: MÉTODO A PUNTO FINAL.

• Reacción de Jaffé: La creatinina en medio alcalino reacciona con el picrato sódico

formando un producto rojo-anaranjado que se valora. La adición de ác. Pícrico
precipita las proteínas plasmáticas que pueden interferir.

Picrato + creatinina ----OH-------> compuesto coloreado (520nm).

Cálculos:

1. Concentración de creatinina en la curva patrón

Patrón 1 0,118

Patrón 2 0,252

Patrón 3 0,534

Suero 0,130

Orina 0,533

y = a + bx
y = - 0,023 + 0,139 X

2. Concentración en orina y suero (mg/100ml)

• 0,130 = - 0,023 + 0,139 · X -------> X = 1,101 mg/100ml.

• 0,533 = - 0,023 + 0,139 · X -------> X = 4 mg/100ml · 50 = 200mg/100ml

200mg --------- 100ml

X = 3000 mg/1500ml = 3 g/24h
x --------- 1500ml
 - Ácido úrico -
Es un producto final del metabolismo de las purinas. Los valores normales en
sangre oscilan entre 2-7mg/100ml. El ácido úrico se filtra en el glomerulo y se absorbe
en el túbulo proximal en un 98%. la mitad del urato absorbido se excreta da nuevo hacia
el túbulo proximal y la mayor parte de este se reabsorbe en el túbulo distal. Alrededor
de un 10% del ác.úrico filtrado se excreta en orina.

Valores normales en orina: 250-750mg/24h.

Patología:
• Hiperuricemias:
◦ Transtorno del metabolismo de la purinas: síndrome Lesch-Nyhan déficit de
hipoxantina guanina fosforribosil transferasa.
◦ Nefritis: fallo de la secrección tubular renal.
◦ Destrucción de tejido o leucocitos: leucemias, radioterapia, mieloma,
tratamiento con antimitóticos.
◦ Artritis gotosa: síndrome más importante. Se caracteriza por precipitación de
cristales de urato sódico de las cavidades sinoviales de las articulaciones.
Puede producirse cuando el pH sinovial se acidifica o cuando la [ ] en
sangre > 7 mg/100ml.

• Hipouricemia: Enfermedad de Wilson, afecta a los túbulos renales, disminuyendo la

reabsorción tubular de ác.úrico.

Método enzimático: MÉTODO A PUNTO FINAL.

El ác.úrico es oxidado por la uricasa a alantoína y peróxido de hidrógeno en

presencia de peroxidasa, 4-aminofenazona y el compuesto fenólico 2,4-DCPS forman un
derivado quinónico coloreado.

Ác.úrico + 2H2O + O2 ------uricasa-------> Alantoina + CO2 + H2O2

H2O2 + 2,4-DCPS + 4-aminofenazona ----POD----> Derivado quinónico (520nm) + 2H 2O

Interferencias:

• Anticoagulantes como la heparina, EDTA, oxalato o fluoruro no afectan.

• El patrón de ác.úrico es fácilmente contaminable
• Hemólisis (100mg/100ml Hb) y bilirrubina 20 mg/100ml no afectan.

Cálculos:

Blanco 0,000

Patrón 0,110

Suero 0,054

Orina 0,141

• Suero:

Cm =
  
6 mg
100 ml
⋅
0,054
0,110
=2,94 mg /100ml ------> (2-7mg/100ml)

• Orina:

Cm =
  
6 mg
100 ml
⋅
0,141
0,110
⋅10=76,9 mg /100ml

76,9 mg -------- 100ml

X = 1153,5 mg/1500ml = 1,15g/24h
X -------- 1500 ml
 - Proteínas en suero y orina -
El glomérulo actúa como un ultrafiltro para proteínas plasmáticas. Encondiciones
normales el paso de proteínas depende de se peso molecular y su concentración. La
albúmina (66KDa) filtra con dificultad, pero debido a su elevada concentración se
encuentra en cantidades considerables en el filtrado (66% de total).
Las proteínas de bajo peso son reabsorbidas en el túbulo e hidrolizadas en los
lisosomas de las células del túbulo, por lo que apenas aparecen en orina aunque se
aceptan < 80mg/L
Hay proteinuria cuando >150mg/24h.
Valor normal en suero: 62-82g/ L
Valor normal de orina:
• Proteinuria débil: < 0,5 g/L (< 1g/24h).
• Proteinuria grave: 0,5-2g/L (1-4 g/24h).
• Proteinuria muy grave: > 2g/L ( > 4g/24h).

Patología:
La proteinuria es un signo de enfermedad renal como el síndrome nefrótico,
glomerulonefritis, pielonefritis crónica y esclerosis renal.
También aparece en infecciones sin afección del sistme renal y en enfermedades
generales como signo de afección renal: diabetes, gota, hipertensión...

Método de Biuret:
Las proteínas en medio alcalino dan color violeta azulado en presencia de sales
de cobre. La intensidad está en función de la cantidad de proteína. Es posible aplicar
esta técnica en suero, orina o LCR.
-----> Reactivo Biuret: SO4Cn 5H2O, tartrato Na-K, NaOH, IK.
Cálculos:
1. Calcular la [ ] de proteínas en el suero:

Patrón 0,351

Orina 0,008

Suero 0,240

Cm =70⋅
 
0,240
0,351
=47,86 g / L (62-82 g/L) BAJO
2. Calcular la [ ] de proteínas en orina, teniendo en cuenta el proceso:

Patrón: 70 g/L x 50·10-6 L = 3,5 · 10-3 g (gramos en el patrón)

Cm =3,5 · 10 ⋅
−3

 
0,008
0,351
=7,977⋅10 g proteínas en orina.
−5

7,977·10-5 ------- 2ml

X = 3,98·10-5 g/ml = 0,0398g/l
X -------- 1ml
 - Enzimología sérica -
-----> aminotransferasas.
Las aminotransferasas (transaminasas) catalizan la trasnferencia del grupo α-amino
de un aa al grupo cetónico de un α-cetoácido. Realizan un papel importente en el
metabolismo de síntesis y degradación de a.a.
En el suero solo determinamos: aspartato aminotransferasa (ASAT) y alanina
aminotransferasas (ALAT). La actividad de ambas se encientra elvada en los pacientes
con enfermedades hepáticas, trastornos cardiovasculares, miopatías y otras.
La cantidad se expresa en unidades internacionales (U) por unidad de volumen,
entendiendo como U: cantidad de enzima que transforma un μmol de sustrato en 1 min.

Valores normales en suero: ASAT (GOT): hasta 40 U/L.

ALAT (GPT): hasta 30 U/L.

Patología:
Las aminotransferasas aumentan an el suero cuando se produce destrucción
tisular. La ASAT es abundante en el miocardio, la ALAT en el hígado, aunque ambas se
encuentran en otros tejidos. Las principales causas de elevación en suero son:

• Aumento de ASAT (GOT) :

◦ Infarto de miocardio, necrosis y traumatismo.
◦ Miocarditis reumática grave.
◦ Traumatismo muscular.
◦ Hepatitis.

• Aumento de ALAT (GPT) :

◦ Hepatitis.
◦ Cirrosis hepáticas.
◦ Miocarditis.
◦ Necrosis de hepatocitos.
Método:
• Método cinético de determinación de ASAT (GOT):
Se basa en la reacción catalizada por la ASAT. Esta reacción se acopla con la de
la malato dehidrogenasa, el oxalacetato formado se reduce a malato, con la
oxidación de NADH a NAD+.

Aspartato + α-cetoglutarato -----ASAT-----> oxalacetato + glutamato.

Oxalacetato + NADH + H+ -----MDH----> malato + NAD+ (340nm).

• Método cinético de determinación de ALAT (GPT):

Se basa en la reacción catalizada por la ALAT. Se acopla con la de la lactato
deshidrogenasa, el piruvato formado se reduce a lactato con la oxidaciñon del
NADH a NAD+.

Alanina + α-cetoglutarato ---ALAT----> piruvato + glutamato

piruvato + NADH + H+ ----LDH----> lactato + NAD+ (340nm).

Interferencias:
La hemólisis interfiere en ambos ensayos.

Linealidad:
Si el ∆ A/min a 340 es superior a 0,150, la muestra deberá diluirse 1:10 con suero
fisiológico. Tenerlo en cuenta en los cálculos.

Cálculos: calcular las actividades de las dos enzimas en el suero, en U/L.

GOT GPT

Abs t = 1 min 0,780 Abs t = 1 min 0,778

Abs t = 2 min 0,735 Abs t = 2 min 0,747

Abs t = 3 min 0,689 Abs t = 3 min 0,716

Valor ∆ A/min:
• GOT: Abs 2-1= 0,735 – 0,780 = -0,045
Abs 3-2 = 0,689 – 0,735 = -0,046 x = -0,0455

• GPT: Abs 2-1 = 0,747 – 0,778 = -0,031

x = -0,031
Abs 3-2 = 0,716 – 0,747 = -0,031
       
6
0,0455 1 1025 10
GOT U / L= ⋅ ⋅ =300 U / L (40 U/L)
min 6220 25 mol

      
6
0,031 1 1050 10
GPT U / L = ⋅ ⋅ =104,6 U / L (30 U/L)
min 6220 50 mol

MUY AUMENTADAS LAS DOS!!!

------> fosfatasas alcalinas.
Existen dos grupos de fosfatasas séricas, diferenciados por el pH óptimo de
actuación:
• Fosfatasas ácidas: pH óptimo 4,9-5,2. se encuentran en la próstata, hematíes, riñón
y leucocitos.
• Fosfatasas alcalinas: pH óptimo 8,6-9. están en tejido óseo e hígado.

Los valores normales en suero de las ácidas (FAC) son de 0,2-1,8U/L. Pueden
encontrarse aumentadas en carcinoma prostático, metástasis ósea, y disminuyen en el
tratamiento de estrógenos.
Las alcalinas (FAL) oscilan entre 20-90U/L. En suero aumentan en el raquitismo,
osteomalacia, metástasis ósea e ictericia obstructiva y disminuyen en hipofosfatemia y
atrofia ósea.

Método:
Las FAL hidrolizan enlaces ésteres fosfatos, sus sustratos naturales son fosfatos
orgánicos y su producto, el fosfato inorgánico. Cuando el sustrato es el p-nitrofenol-
fosfato sódico en medio básico, libera p-nitrofenol que da color amarillo. Dietanolamina
aceptor de grupos fosforilo.

p-nitrofenilo-fosfato + dietanolamina ----FAL-----> p-nitrofenol + fosfato de dietanolamina

405 nm

Linealidad:
Si el ∆ A/min es superior a 0,25 se repetirá la determinación diluyendo la
muestra 1:10 con suero salino.

Cálculos:
Fosfatasa alcalina Método cinético

Blanco 0,000 Abs t = 1 min 0,463

Tubo 1 0,179 Abs t = 2 min 0,492

Tubo 2 0,344 Abs t = 3 min 0,522

Tubo 3 0,619 Ao 0,436

Valor ∆ A/min :

• Abs 2-1: 0,492 – 0,463 = 0,029 x = 0,03

• Abs 3-2: 0,522 – 0,492 = 0,03

1. Calcular la Q (μmol) de p-nitrofenol y su [ ] en los 3 tubos. Pm p-nitrofenol: 139

Disolución p-nitrofenol: 0,05mM
• Tubo 1:
n n
C= 0,05= ------> n = 0,015 mM (μmol).
v 0,3

• Tubo 2

n
0,05= -------> n = 0,03 mM (μmol).
0,6

• Tubo 3

n
0,05= --------> n = 0,06 mM (μmol).
1,2

[ ] ??

0,05mM -----> 100ml

n
C=
v
0,015
C1= =0,0125 mM =1,25⋅10 M
−5

1,2

0,03
C2 = =0,025 mM =2,5⋅10 M
−5

1,2

0,06
C3 = =0,05 mM =5⋅10 M
−5

1,2

Calculamos la recta patrón: abs vs μmol

X Y a = 0,0415
0,015 0,179 b = 11629 y = 0,0415 + 11629 · X
r = 0,998
0,030 0,344

0,060 0,619
 2 . Calcular el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol:

ε405
p-nitrofenol = b ----> 11.629 ≈ 18700 M-1· cm-1 ( la diferencia entre ambas marca la
diferencia de las actividades)

ε = b (pendiente).

3. Calcular la actividad (U/L) de las fosfatasas en el suero utilizando la recta patrón

elaborada:

     
0,03 1 1220 10
−6

U / L= ⋅ ⋅ ⋅ =157,36 U / L (10-6 μmol)

min 11629 20 mol

     
0,03 1 1220 10
−6

U /L= ⋅ ⋅ ⋅ =97,86 U / L
min 18700 20 mol
 ------> gama-glutamil-transpeptidasa.

Enzima que participa en el transporte de a.a a través de la membrana celular.

Carboxipeptidasa que cataliza la transferencia de un grupo γ-glutamilo desde el glutation
a los a.a.

No se encuentra en el músculo, pero se encuentra en el riñón, hígado y en el páncreas.

Su actividad varia con el sexo y edad.

Valores normales:

• Hombres: hasta 28 U/L.

• Mujeres: hasta 18 U/L.

Patoligía:

La actividad sérica se atribuye al isoenzima hepático. Está aumentada en

patologías hepatobiliares, hepatitis, obstrucción biliar y enfermedades pancreáticas.

Es interesante en la detección de metástasis hepática. Su determinación en suero es de

gran sensibilidad como indicativo de afección hepática.

Método:

Cataliza la transferencia de un grupo γ-glutamilo desde un dador, la γ-glutamil-p-

nitroanilida, hasta un dipéptido aceptor, la glicil-glicina, liberándose p-nitroanilina.

Γ-glutamil-p-nitroanilida + glicil-glicina ----CGT-----> p-nitroanilina (405nm) + γ-glutamil-

glicil-glicina.

La velocidad de formación es proporcional a la actividad de la enzima.

Linelidad:

Si el ∆ A/min es superior a 0,20 se repetirá diluyendo 1:10.

Cálculos:

Ao 0,499

Abs t=1 min 0,536

Abs t= 2 min 0,574

Abs t= 3 min 0,606

Valor de ∆ A/min:

• Abs 2-1 = 0,574-0,536 = 0,038

x = 0,035
• Abs 3-2 = 0,606 – 0,574 = 0,032

    
0,035 1 1050 10
−6

U / L= ⋅ ⋅ ⋅ =74,24 U / L AUMENTADA (28 U/L o 18 U/L)

min 9900 50 mol
 ------> Lactato deshidrogenasa

Cataliza reversiblemente la reacción que constituye el proceso de fermentación

láctica. Piruvato + NADH + H+ -----> lactato + NAD+.

Su actividad sérica no siempre aporta datos para el diagnóstico, debido a la existencia

de 5 formas isoenzimáticas presentes en todos los tejidos.

La LDH es un enzima tetramérico formado por dos subunidades diferentes: H (corazón) y

M (músculo). Existen dos isoenzimas puros, formados por la misma subunidad y tres
híbridos:

Puros: LDH1 o H4: corazón, riñón y eritrocito.

LDH5 o M4: músculo esquelético e hígado.

Híbridos: LDH2 o H3M: corazón pero menos que LDH1.

LDH3 o H2M2: pulmón, bazo y plaquetas.

LDH4 o M3H: hígado y músculo esquelético pero menos LDH5,

Al ser una enzima intracelular, el aumento de su actividad indica una alteración tisular con
lesión celular.

Patologías:

• Infarto de miocardio: aumenta LDH1 y LDH2

• Infarto pulmonar: aumenta LDH3

• Hepatitis: aumentan LDH4 y LDH5

Valores normales:

Los valores normales en suero 90-350 U/L.

LDH1 (H4) y LDH3 (H3M) siguen siendo activos después de un calentamiento a 60ºC,
LDH3 , LDH4,, y LDH5 se desnaturalizan. Estos dos isoenzimas constituyen la fracción
termoresistente. En individuos normales representa un 30-60% de la actividad LDH total.
En infarto de miocardio aumenta por encima de 60%, en enfermedades hepáticas
disminuyen por debajo de 30%.

Método:

La actividad se determina utilizando un método enzimático. El sustrato es lactato el

cual pasa a piruvato con la reducción de NAD+ a NADH + H+. Esta reacción se acopla
con la diaforasa, que utiliza el NADH para reducir una sal de trifeniltetrazolio a una sal de
formazán, intensa coloración.

Lactato + NAD+ -----LDH------> piruvato + NADH + H+

NADH + H+ + cloruro de trifeniltetrazolio -----diaforasa----> NAD+ + cloruro formazán

(500nm)

Cálculos:

C → 0,335 · 2 = 0,67
X = 0,6925 → PATRÓN
D → 0,715

E → 0,235 · 2 = 0,47
X = 0,39 → SUERO
F → 0,310

G → 0,122 · 2 = 0,244
X = 0,2065 → SUERO A 60ºC
H → 0,169

1. Calcular la actividad de la LDH en el suero y a 60ºC:

0,39
• U /L s = ×150×20=1689,53 U / L
0,6925
MUY AUMNETADOS
0,2065
• U / L 60º= ×150×20=447,3 U / L
0,6925

2. Calcular la facción termoresistente de LDH

100% --------- 1689,53

X = 26,47% < 30 %
X -------- 447,3
Es de origen hepático, ya que las termoresistentes
son de origen cardiaco.
El paciente sufre un patología hepática.