NORMA TÉCNICA NTC

COLOMBIANA 4491-1

2005-08-24

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS

PARA ANIMALES.
PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA ENSAYO,
SUSPENSIÓN INICIAL Y DILUCIONES DECIMALES
PARA ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. PARTE 1.
REGLAS GENERALES PARA LA PREPARACIÓN DE
LA SUSPENSIÓN INICIAL Y DE DILUCIONES
DECIMALES

E: MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING

STUFFS. PREPARATION OF TEST SAMPLES, INITIAL
SUSPENSION AND DECIMAL DILUTIONS FOR
MICROBIOLOGICAL EXAMINATION. PART 1: GENERAL
RULES FOR THE PREPARATION OF THE INITIAL
SUSPENSION AND DECIMAL DILUTIONS

CORRESPONDENCIA: esta norma es una adopción modificada

(MOD) a la ISO 6887-1:1999.

DESCRIPTORES: microbiología de alimentos –

preparación de muestras; análisis
microbiológico – preparación de muestras

I.C.S.: 07.100.30

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación (ICONTEC)

Apartado 14237 Bogotá, D.C. - Tel. 6078888 - Fax 2221435

Prohibida su reproducción Primera actualización

Editada 2005-09-05
 PRÓLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Técnicas y Certificación, ICONTEC, es el organismo

nacional de normalización, según el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carácter privado, sin ánimo de lucro, cuya Misión es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y protección al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del país, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.

La representación de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalización Técnica

está garantizada por los Comités Técnicos y el período de Consulta Pública, este último
caracterizado por la participación del público en general.

La NTC 4491-1 (Primera actualización) fue ratificada por el Consejo Directivo de 2005-08-24.

Esta norma está sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuación se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a

través de su participación en el Comité Técnico 25 Microbiología.

ACEITES Y GRASAS VEGETALES S.A. FABRICA DE ESPECIAS Y CONDIMENTOS –

ALGARRA S.A. EL REY S.A.–
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S .A. FRIGORÍFICO GUADALUPE S.A.
AQUALAB LTDA. FRIGORÍFICOS COLOMBIANOS S.A.
ASINAL LTDA. GASEOSAS COLOMBIANAS S.A.
ASOCIACIÓN COLOMBIANA DE INDUSTRIAS PIMPOLLO DEL CARIBE S.A.
MICROBIOLOGÍA INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO
BECTON DICKINSON DE COLOMBIA LTDA. –ICA–
BIANÁLISIS INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
BIOCONTROL LTDA. –INVIMA– INSTITUTO NACIONAL DE
BIOMERIUX S.A. VIGILANCIA DE MEDICAMENTOS Y
BIOQUILAB LTDA. ALIMENTOS
BIOTRENDS LABORATORIOS IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.
CARULLA VIVERO S.A. LABCONTROL E.U.
CASA LUKER S.A. –LABFARVE– LABORATORIO DE
COMPAÑÍA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A. FARMACOLOGÍA VEGETAL
CONGELADOS AGRÍCOLAS S.A. – LABORATORIO A.B.B.A.
CONGELAGRO– LABORATORIO CONTROL DE CALIDAD
CONSULTORÍAS MICROBIOLÓGICAS DEL EJÉRCITO
COOPERATIVA DE GANADEROS DE LABORATORIO GRAM
CARTAGENA LTDA. LABORATORIO MICOBIOLÓGICO –
CREPES Y WAFLES S.A. BARRANQUILLA LTDA.–
E.S.E. SAN CRISTOBAL LABORATORIO MICROBIOLÓGICO SIS
EMPRESA DE ACUEDUCTO Y LABORATORIOS PROCALIDAD
ALCANTARILLADO DE BOGOTÁ LESNIAK E.U.
ENZIPAN DE COLOMBIA LTDA. LEVAPÁN S.A.
MERCADEO DE ALIMENTOS DE –RICA RONDO–, INDUSTRIA NACIONAL
COLOMBIA S.A. DE ALIMENTOS S.A.
MERCK SECRETARIA DE SALUD -
MICROBIÓLOGOS ASOCIADOS LTDA. LABORATORIO DE SALUD PÚBLICA
NULAB LTDA. SUIZO S.A.
PASSIFLORA COLOMBIANA S.A. SURTIQUÍMICOS LTDA.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA TRES M COLOMBIA –DIVISIÓN DE
PROCESADORA DE LECHES S.A. MICROBIOLOGÍA–
PRODUCTOS ROCHE S.A. UNIDAD ADMINISTRATIVA DE SALUD
PRODUCTORA DE JUGOS S.A. PÚBLICA
PURIFICACIÓN Y ANÁLISIS DE FLUIDOS UNIVERSIDAD CATÓLICA –INGECAL–
LTDA. UNIVERSIDAD DE CUNDINAMARCA
QUALA S.A. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
QUÍMICOS Y REACTIVOS LTDA. UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
–QUIMIREL–
QUIOS LTDA.
REPRESENTACIONES BIOTECNOLÓGICAS
LTDA.

Además de las anteriores, en Consulta Pública el Proyecto se puso a consideración de las

siguientes empresas:

AVESCO S.A. LLOREDA GRASAS S.A.

BAVARIA S.A. MINISTERIO DE PROTECCIÓN SOCIAL
BLANCA USECHE - INDEPENDIENTE NESTLÉ DE COLOMBIA S.A.
CENICAÑA TECNIMICRO LABORATORIO DE
CERVECERÍA LEONA S.A. ANÁLISIS
INGENIO PICHICHÍ S.A. VIKINGOS
INGENIO RIOPAILA

ICONTEC cuenta con un Centro de Información que pone a disposición de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.

DIRECCIÓN DE NORMALIZACIÓN
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4491-1 (Primera actualización)

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS Y DE ALIMENTOS PARA ANIMALES.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA ENSAYO, SUSPENSION INICIALY
DILUCIONES DECIMALES PARA LOS ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS.
PARTE 1: REGLAS GENERALES PARA LA PREPARACIÓN DE LA
SUSPENSIÓN INICIAL Y DE DILUCIONES DECIMALES

0. INTRODUCCIÓN

La NTC 4491 consta de las siguientes partes, bajo el título general, Microbiología de alimentos
y de alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo. Suspensiones iniciales y
diluciones decimales para los análisis microbiológicos.

Parte 1: reglas generales para la preparación de la suspensión inicial y de diluciones

decimales.

Parte 2: reglas específicas para la preparación de carne y productos cárnicos.

Parte 3: reglas específicas para preparación de muestras de pescado y productos de la pesca.

Parte 4: reglas específicas para la preparación de productos diferentes de leche, productos

lácteos, carne, productos cárnicos, pescados y productos de la pesca.

Esta primera edición de la NTC 4491-1 anula y sustituye a la NTC 4491:1997 Microbiología de
alimentos y de alimentos para animales. Preparación de muestras para ensayo. Suspensiones
iniciales y diluciones decimales para los análisis microbiológicos. Parte 1: reglas generales para
la preparación de la suspensión inicial y de diluciones decimales.

Esta parte de la NTC 4491-1 define las reglas generales para la preparación de la suspensión
inicial y las diluciones decimales para el análisis microbiológico.

Debido a la gran variedad de alimentos y productos alimenticios, este método horizontal

(aplicable a cualquier producto) puede no ser apropiado, en algunos detalles, para ciertos
productos. En estos casos, métodos diferentes que son específicos para estos productos
pueden utilizarse, por razones técnicas justificadas si son absolutamente necesarios. De lo
contrario, debe intentarse aplicar este método horizontal hasta donde sea posible.

Esta norma es una adopción modificada(MOD) por traducción, respecto a su documento de

referencia, la norma ISO 6887-1:1999 Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs-
Preparation of Test Samples, Initial Suspensión and Decimal Dilutions for Microbiological
Examination. Part 1: General Rules for the Preparation of the Initial Suspensión and Decimal
Dilutions, en los siguientes aspectos:

1
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4491-1 (Primera actualización)

En las referencias normativas se incluye la NTC 4491-2:2004 siendo una adopción modificada
de la ISO 6887-2:2003, como documento indispensable para la aplicación de esta norma.

Se introduce el parámetro de presión en el numeral 5.4 para el proceso de esterilización con el

fin de tener un parámetro controlable.

En el numeral 9.3 especifica que los tiempos de duración del procedimiento para el tiempo de
revivificación no debe exceder los 45 min y el tiempo transcurrido entre la preparación de las
diluciones y el vertido en el medio no debe exceder los 30 min, pero la NTC cambia estos
valores entre 10 min a 20 min y 20 min, respectivamente, valores determinados por la práctica
en Colombia.

1. OBJETO

Esta norma define reglas generales para la preparación aerobia de suspensiones iniciales y de
diluciones decimales para los análisis microbiológicos de los productos para consumo humano
o para consumo animal.

Esta norma es aplicable en todos los casos en general, excepto para los productos
mencionados en la NTC 4491-2:2004 (ISO 6887-2: 2003).

2. REFERENCIAS NORMATIVAS

Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicación de

este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada.
Para referencias no fechadas, se aplica la última edición del documento normativo referenciado
(incluida cualquier corrección).

NTC 4092, Microbiología de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales para los
análisis microbiológicos.

NTC 4491-2, Microbiología de alimentos y alimentos para animales. Preparación de muestras

para ensayo. Suspensión inicial y diluciones decimales para análisis microbiológico. Parte 2.
Reglas especificas para la prepación de carne y productos cárnicos.

ISO 6887-2:2003, Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs. Rules for the Preparation of
Test Samples, of Initial Suspension and of Decimal Dilutions for Microbiological
Examination. Part 2: Specific Rules for the Preparation of the Test Samples and of the Initial
Suspension.

3. DEFINICIONES

Para los propósitos de esta norma se aplican las siguientes definiciones:

3.1
suspensión inicial (primera dilución)
la suspensión, solución o emulsión obtenida después de pesar o medir una cantidad de
producto bajo análisis (o de una muestra de ensayo preparada desde el producto) se ha
mezclado con una cantidad de nueve veces de diluyente (véase el numeral 5 y las Notas 1 y 2
del numeral 9.1), permitiendo partículas grandes, si están presentes, para que sedimenten.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4491-1 (Primera actualización)

3.2
diluciones decimales adicionales
las suspensiones o soluciones obtenidas mediante la mezcla de un volumen determinado de la
suspensión inicial (véase el numeral 3.1) con un volumen de diluyente nueve veces mayor
(véanse las Notas 2 y 3 del numeral 9.1), y por repetición de esta operación con diluciones
adicionales, hasta obtener una serie de diluciones decimales, adecuadas para la inoculación
del medio de cultivo.

3.3
norma específica
una norma o documento guía que describe el análisis de un producto específico (o grupo de
productos) para la detección o recuento de un microorganismo específico (o grupo de
microorganismos).

4. PRINCIPIO

La preparación de la suspensión inicial (véase el numeral 3.1) de tal manera que se obtenga una
distribución tan uniforme como sea posible, de los microorganismos contenidos en la porción de
ensayo.

La preparación, si es necesario, de diluciones decimales (véase el numeral 3.2) para reducir el

número de microorganismos por unidad de volumen para permitir, después de la incubación, la
observación o su crecimiento (en el caso de tubos o botellas) o recuento de colonias (en el
caso de cajas), como se establece en la norma específica.

Para restringir eventualmente el rango de recuento para un intervalo dado, o si se prevé un alto
número de microorganismos, es posible inocular únicamente las diluciones decimales
necesarias (al menos dos diluciones sucesivas) para lograr el recuento de acuerdo con el
cálculo descrito en la NTC 4092 (ISO 7218).

5. DILUYENTES

5.1 MATERIALES BÁSICOS

Para mejorar la reproducibilidad de los resultados, se recomienda que para la preparación del
diluyente se usen componentes básicos deshidratados o una preparación completa deshidratada.
Deben seguirse rigurosamente las instrucciones del fabricante.

El agua utilizada debe ser agua destilada, desionizada o agua de calidad equivalente (véase la
NTC 4092 (ISO 7218)).

5.2 DILUYENTES DE USO GENERAL

5.2.1 Agua peptonada al 0,1%

5.2.1.1 Composición

Peptona 1,0 g

Cloruro de sodio 8,5 g

Agua destilada, desionizada 1 000 ml

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4491-1 (Primera actualización)

5.2.1.2 Preparación

Se disuelven los componentes en el agua, por calentamiento si es necesario. Se ajusta el pH,

tal que después de la esterilización sea 7,0 ± 0,2 a 25 ºC.

5.2.2 Agua peptonada tamponada

5.2.2.1 Composición

Peptona 10,0 g

Cloruro de sodio (NaCl) 5,0 g

Hidrogeno Fosfato disódico dodecahidratado (Na2HP4. 12 H2O) 9,0 g

Dihidrogeno fosfato de potasio (KH2PO4) 1,5 g

Agua destilada, desionizada 1 000 ml

5.2.2.2 Preparación

Se disuelven los componentes en el agua, por calentamiento si es necesario.

Si es necesario se ajusta el pH tal que después de la esterilización, este sea de 7,0 ± 0,2 a 25 ºC.

5.3 DILUYENTES PARA PROPÓSITOS ESPECIALES

Véase la norma ISO 6887-2 (NTC 4494-2)

5.4 DISTRIBUCIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL DILUYENTE

Se vierte el diluyente (véase el numeral 5.2 ó 5.3) necesario para preparar la suspensión inicial
en frascos (véase el numeral 6.4) de capacidad apropiada.

Se vierte el diluyente (véase el numeral 5.2 ó 5.3) necesario para la preparación de las
diluciones decimales en los tubos (véase el numeral 6.5) en cantidades tales que, después de
la esterilización, cada tubo contenga 9,0 ml. Después de la esterilización la incertidumbre dela
medida del volumen final, no debe exceder al ± 2 % del volumen inicial. (El volumen a introducir
antes de la esterilización se determina empíricamente para cada autoclave).

Se tapan los tubos o los frascos.

Se esterilizan en autoclave a 121 ºC (245 kPa) por 15 min.

NOTA Si la intención del cultivo es el recuento de varios grupos de microorganismos usando diferentes medios de
cultivo, sería necesario distribuir todos los diluyentes (o algunos de ellos) en cantidades mayores a 9,0 ml, en tubos
o en frascos acorde a la cantidad. Los tubos o frascos deben tener tapa y se deben esterilizar a 121 º C por 14 min.

6. EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO PARA LABORATORIO

Equipo usual de laboratorio microbiológico (véase la NTC 4092 (ISO 7218.) y en particular:

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4491-1 (Primera actualización)

6.1 EQUIPO PARA ESTERILIZACIÓN SECA (HORNO) O ESTERILIZACIÓN HÚMEDA

(AUTOCLAVE)

Véase la NTC 4092 (ISO 7218).

6.2 EQUIPO DE MEZCLADO

Véase la NTC 4092 (ISO 7218).

6.3 MEZCLADOR

Véase la NTC 4092 (ISO 7218).

6.4 Frascos o botellas, de capacidades apropiadas

6.5 Tubos de ensayo, de capacidades apropiadas

6.6 Pipetas graduadas de suministro total, de capacidades nominales de 1 ml y 10 ml,

graduadas respectivamente en divisiones de 0,1 ml y 0,5 ml.

6.7 Medidor de pH, capaz de leer con una aproximación de 0,01 unidades de pH a 25 ºC,
facilitando que las medidas sean hechas con una exactitud de ± 0,1 de unidad de pH.

6.8 BALANZA

Balanza con capacidad de peso cercana a 0,01 g.

7. MUESTREO

Se lleva a cabo el muestreo de acuerdo con la norma específica apropiada para el producto. Si
no está disponible la norma específica, se recomienda que se logre un acuerdo al respecto
entre las partes interesadas.

8. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

Véase la norma específica apropiada del producto. Si no está disponible la norma específica,
se recomienda que se logre un acuerdo al respecto entre las partes interesadas.

9. PROCEDIMIENTO

9.1 PORCIÓN DE ENSAYO Y SUSPENSIÓN INICIAL (PRIMERA DILUCIÓN)

En una cubeta o bolsa plástica, se pesa con una incertidumbre de ± 5 %, una masa m en g o se
mide con una incertidumbre de ± 5 %, o un volumen representativo de la muestra de ensayo,
un volumen de v en ml (mínimo 10 g ó 10 ml, a menos que se establezca de otra manera)
representativas de la muestra de ensayo (véase el numeral 8).

Se adiciona una cantidad igual a 9 x m g o 9 x v ml. Esta cantidad puede medirse por la masa
con una incertidumbre de medición de ± 5 % o por volumen con una incertidumbre de medición
de ± 5 %.

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NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4491-1 (Primera actualización)

NOTA 1 Puede ser necesario, en ciertos casos, particularmente para productos que dando una suspensión
inicial 1 + 9, la cual es demasiado viscosa o demasiado espesa, se le adiciona más diluyente. Esto debe tenerse en
cuenta para operaciones subsecuentes y/o en la expresión de resultados.

NOTA 2 Esta dilución primaria parcialmente condiciona el valor del límite inferior del recuento el cual también
depende de la técnica usada (por ejemplo, técnica de siembra en placa profunda con 1 ml de inóculo en una
suspensión de 1/10 para la cual el límite es de 10 UFC por gramo; o la técnica de siembra en superficie, o la técnica
del NMP). Si es necesario, para algunos recuentos en ciertos productos, se está por debajo de este límite, es posible
1
usar una cantidad más pequeña de volumen de diluyente . Se debe tener en cuenta que la inoculación de esta
suspensión inicial puede dificultarse debido al desbalance en la relación inóculo / medio (inhibición del crecimiento
microbiano por el incremento en la concentración de los componentes del alimento).

Para evitar el daño de los microorganismos por cambios repentinos en la temperatura, la

temperatura del diluyente durante las operaciones mencionadas antes, serán aproximadamente las
mismas que la temperatura ambiente, excepto para los productos particulares (véanse las normas
específicas de producto).

Se homogeniza la mezcla de acuerdo con las recomendaciones de la NTC 4092 (ISO 7218).

Se deja en reposo la muestra en los alimentos que lo requieran, para tomar la muestra de la
fase acuosa. Permitir que las partículas de gran tamaño se sedimenten si es necesario, hasta
por unos 15 min. Puede utilizarse sistemas de filtración para obtener resultados equivalente. En
caso de recuento de esporas, se puede hacer un tratamiento térmico a la suspensión inicial,
por ejemplo 10 min a 80 ºC, inmediatamente después de la preparación de la misma, seguido
de un rápido enfriamiento.

9.2 OTRAS DILUCIONES DECIMALES

Se transfieren por medio de una pipeta, 1 ml de la suspensión inicial, con una incertidumbre de
la medición de ± 5 %2, en un tubo que contenga 9 ml de diluyente estéril a la temperatura
apropiada.

No se debe introducir la pipeta más de una vez en la suspensión inicial.

Se debe evitar cualquier contacto entre la pipeta que contiene el inóculo y el diluyente estéril.

Se mezclan cuidadosamente, usando un mezclador mecánico (véase el numeral 6.3) por 5 s a

10 s hasta obtener la dilución 10-2.

Si es necesario se repiten estas operaciones usando las diluciones 10-2 y las otras diluciones
usando en cada dilución otra pipeta estéril para obtener 10-3, 10-4, etc., diluciones.

9.3 DURACIÓN DEL PROCEDIMIENTO

9.3.1 El tiempo de revivificación debe estar entre 10 min a 20 min a menos que la norma del
producto analizado especifique otros tiempos.

9.3.2 El tiempo transcurrido entre la preparación de las diluciones y el vertido del medio no
deben exceder los 20 min y preferiblemente a los 10 min.

NOTA Si la temperatura del ambiente del laboratorio es muy alta, estos dos tiempo máximos, deben ser reducidos.

1
En este caso, el volumen de diluyente usado debe reportarse en la porción de ensayo.

La aproximación de la medición retenida de ± 5 % toma en cuenta los límites presentes de las pipetas
2

corrientemente usadas.
6
NORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC 4491-1 (Primera actualización)

10. DOCUMENTO DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of Food and

Animal Feeding Suffs. Preparation of Test Samples, Initial Suspension and Decimal Dilutions for
Microbiological Examination. Part 1: General Rules for the Preparation of the Initial Suspension
and Decimal Dilutions. Geneva: ISO, 1999. 9 p. (ISO 6887-1).