Clonación

y Selección
Los procesos de clonación /enen dos finalidades:

1. Obtener un gran número de moléculas recombinantes, a

par/r de una can/dad limitada de material inicial
2. Purificación de las moléculas recombinantes.


Sin embargo se pueden obtener diferentes mezclas a par/r
de las diferentes reacciones de clonación:

•  Vectores no ligados
•  Fragmentos de DNA no ligados
•  Vectores recircularizados o religados (sin inserto de DNA)
•  Moléculas recombinantes que llevan fragmentos de DNA
no deseado
•  Moléculas recombinantes con el DNA de interés
Es bastante inusual que una célula acepte más de un /po de molécula de DNA.
 Transformación de células bacterianas

La mayoría de las especies bacterianas, solo toman can/dades

limitadas de DNA, bajo circunstancias normales.
Para aumentar la eficiencia de transformación, las bacterias se
someten a tratamientos Qsicos o químicos, obteniendo finalmente
una célula a la que se le conoce como “célula competente”.
En los procesos de transformación se u/lizan células:

Quimiocompetentes Electrocompetentes

Tratamiento con CaCl2 Tratamiento bajo en sales

Llevar a 42ºC Electroporar

Siembra y selección de Siembra y selección de

recombinantes recombinantes
Video
 Selección de células transformadas

Aunque el proceso de transformación puede ser bastante

ineficiente, con 1 ng de plásmido pUC18, pueden obtenerse
entre 1000 y 10.000 transformantes.

La toma y retención de un plásmido, se detecta cuando se
busca la expresión de un gen específico que lleva el plásmido.
 pBR322

Genes que confieren resistencia a an/bió/cos

El gen de resistencia debe ser expresado
 Iden=ficación de células recombinantes

Inac/vación insercional (gen: resistencia a an/bió/co)

La iden/ficación se da, cuando ciertas caracterís/cas ya no se expresan
más en la célula hospedera
Inac/vación insercional (gen: funcional)
mmm
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-
b-D-galactopyranosido
 VECTORES DE CLONACIÓN PARA E.coli

Caracterís/cas de los plásmidos:

-  Tamaño (debe ser menor de 10 kb para evitar que se rompa el
DNA durante la purificación)
-  Poseen marcadores de selección
-  Variedad de si/os de restricción que puedan generar la
inac/vación insercional de un gen al clonar un gen de interés
-  Alto número de copia (pBR322 = 15; pBR327 = 1000; pUC8=
500 ~700)
-  Origen de replicación (dirige la mul/plicación del plásmido en
la célula hospedera)
-  No conjuga/vo (de manera que no se auto-transfiera a otra
bacteria)
 Introducción del DNA de Fagos en células bacterianas

El procedimiento u/lizado es la transfección:

Es equivalente a la transformación, la diferencia es que no hay
plásmido sino fago.
Es le fago el que se mezcla con las células competentes de E. coli y
el DNA se introduce por choque térmico
 Pero, qué es un Fago o Bacteriófago?

Los bactriófagos o fagos (nombre más común), son virus que

específicamente infectan bacterias.
Como todos los virus, /enen una estructura simple: DNA
(ocasionalmente RNA), rodeado por una cubierta protectora o
cápside, formada por moléculas de proteínas.
El DNA del fago, con/ene varios genes y algunos de ellos codifican
para la los procesos de replicación del mismo.
 Pero, qué es un Fago o Bacteriófago?

(a) Fago de /po cabeza–y–cola. (b) Fago Filamentoso.

Ej: fago λ Ej: fago M13
 Ciclo de infección de un Fago o Bacteriófago

El proceso de infección es similar para los fagos y consta de 3 etapas:

1.  La parncula de fago se une al exterior de la bacteria e inyecta su
DNA en el interior de la célula
2.  La molécula de DNA del fago se replica, por medio de enzimas
específicas de fago, presentes en su propio DNA
3.  Otros genes del fago dirigen la síntesis de las proteínas que
componen la cápside y nuevas parnculas de fago se ensamblan y
se liberan de la bacteria

El proceso de infección en algunos fagos, puede llegar a realizarse en
20 minutos. A este /po de infección rápida se le conoce como ciclo
lí=co, puesto que la liberación del fago se asocia con la lisis celular
Patrón de
infección de
un fago a
una bacteria:

CICLO LÍTICO
La infección del /po lisogénica, se caracteriza por la retención del
DNA del fago al interior del DNA de la bacteria; posiblemente por
cientos de divisiones celulares.
El DNA del fago (profago) insertado en el genoma de la bacteria está
quiescente; y una bacteria que lleve el material de un profago, es
indis/nguible de otra que no lo lleve.
Sin embargo, eventualmente el profago se libera del genoma del
hospedero e inicia el ciclo lí/co.
El fago lambda (λ) es /picamente lisogénico.
Patrón de
infección de
un fago a
una bacteria:

CICLO
LISOGÉNICO
Fago M13: no es
lisogénico ni lí/co
 Detección de la transfección

Posterior a la transfección, la lisis celular se visualiza en forma de

placas.
Tanto M13 com λ, forman placas sobre un cul/vo celular.
Aunque las placas generadas por M13 son un poco diferentes a
las de λ; esto se debe a que M13 disminuye la velocidad de
crecimiento de la bacteria y se observan zonas de rela/va
claridad.
Al igual que en los plásmidos, las placas pueden ser generadas
por fagos recombinantes o fagos autoligados
Detección de la
transfección
 Iden=ficación de fagos recombinantes
1.  Inac/vación insercional del gen lacZ’ en el fago
Los vectores de clonación M13 llevan una copia del gen lacz’. La
introducción de DNA en este gen inac/va la síntesis de ß-
galactosidasa. Las células transformadas, se dis/nguen porque
las placas que se forman en agar con X-Gal son azules,
comparadas con las placas de células recombinantes que serán
blancas.
 Introducción de DNA en células diferentes a bacterias

En la mayoría de los organismos, la dificultad para la toma del DNA es

la pared celular. Por tanto, en células animales cul/vadas, es fácil
realizar la transformación, especialmente si el DNA se precipita sobre
la superficie de la célula (CaPO4) o encapsulado en liposomas que se
fusionan con la membrana celular
Por medio del uso de enzimas que degraden paredes celulares de
levaduras, hongos y plantas, puede llegar a obtenerse el protoplasto
intacto, que /enen la posibilidad de tomar fácilmente el DNA. Aunque
la transformación puede es/mularse por medio de la electroporación
(pulso eléctrico corto que genera poros en la membrana celular).
Luego de la transformación los protoplastos se lavan para eliminar las
enzimas degrada/vas y la pared celular se forma espontáneamente.
Métodos Qsicos para la introducción del DNA:
-  Microinyección: se usa una pipeta de punta muy fina para inyectar
DNA directamente en el núcleo de una célula. Se usa tanto en
animales como en plantas
-  Biolís/ca (biobalís/ca): consiste en bombardear las células con
micro-proyec/les a alta velocidad (parnculas de oro o tungsteno
recubiertas de DNA).
-  Electroporación
 Vectores para Levaduras

En la levadura Sacharomyces cerevisiae se ha encontrado uno de los

pocos plásmidos, presentes en células eucariotas y es conocido como
el “plásmido 2µm”.

Caracterís/cas:
-  Tamaño 6kb
-  Número de copia: 70 ~200
-  REP1 y REP2: genes implicados en la
replicación del plásmido
-  FLP gen que codifica para la proteína
que ayuda al proceso de recombinación
intramolecular
Para llegar a u/lizar un marcador de selección, es necesario un
plásmido que codifique para una caracterís/ca especial.

Por ejemplo, un plásmido con el gen LEU2, que codifica para la enzima
ß-isopropil-malato deshidrogenasa, una enzima que interviene en el
proceso de conversión de ácido pirúvico a leucina.
De manera que es necesario u/lizar una levadura mutante auxotrófica
(gen LEU2 no funcional o leu2–).

Ya que la célula no /ene copia del gen LEU2, se requiere que el
medio provea del aminoácido para que la levadura pueda crecer
En un experimento de clonación, las células se siembran en medio
mínimo, que no con/enen aminoácidos adicionados.
Sólo las células transformadas serán capaces de sobrevivir y formar
colonias.
 Vectores basados en el plásmido 2µm

1. Yeast Episomal plasmid YEps: el vector puede ser clonado y

seleccionado tanto en levadura como en E. coli.

YEp13
Yeast episomal plasmid YEps: el vector puede ser clonado y
seleccionado tanto en levadura como en E. coli.
La palabra “episomal” indica que se integra en el cromosoma de la
levadura.
La integración ocurre porque el gen marcador de selección (LEU2, en
este caso), es similar a la versión mutada presente en el cromosoma
de la levadura.
El fenómeno que sucede es una “recombinación homóloga”, que
puede ocurrir entre el gen LEU2 del plásmido y el gen LEU2– de la
levadura, dando como resultado la inserción del plásmido completo en
el genoma de la levadura.
 Vectores basados en el plásmido 2µm

2. Yeast Integra/ve plasmids YIps.

YIp: es un pBR322 más un gen

URA3, que codifica para
oro/dina-5’-fosfato descarboxilasa
(par/cipa en la biosíntesis de
pirimidinas); se usa como marcador
de selección, de la misma manera
que LEU2.
Su supervivencia depende de la
integración en el cromosoma de la
levadura
 Vectores basados en el plásmido 2µm

3. Yeast Replica/ve plasmids YRps.

YRp: es un pBR322 más un gen

TRP1, gen involucrado en la
biosíntesis del triptófano; se usa
como marcador de selección, de la
misma manera que LEU2.
Tienen la capacidad de replicarse a
sí mismos en la levadura. El Origen
de replicación se encuentra
adyacente al gen TRP1.
N-Glicosilaciones
 Vectores para Plantas superiores

Aunque no se conocen plásmidos para plantas, un plásmido

bacteriano, Ti, proveniente de Agobacterium tumefaciens, es de gran
importancia.

Luego de la infección, el A. tumefaciens genera una proliferación cancerosa de tejido en

la región del callo
La formación del callo está mediada por la presencia del plásmido Ti
(tumor inducing plasmid) en A. tuefaciens.

-  Plásmido de gran tamaño ~200

kb.
-  Región de virulencia (genes
involucrados en el proceso de
infección)
-  Luego de la infección, parte del
plásmido se integra en el
cromosoma de la planta,
segmento T-DNA (15-30 kb)
-  T-DNA con/ene ~8 genes,
responsables de las
caracterís/cas cancerosas de
las células transformadas. Y
generan la producción de
opinas, un nutriente para las
bacterias
Pensar en la u/lización del plásmido Ti para realizar la transformación
de células vegetales, se convir/ó en una gran opción para la
manipulación gené/ca, pero se encontraron inconvenientes como el
gran tamaño del plásmido y la imposibilidad de encontrar un único
si/o de restricción en un plásmido de 200 kb.

Estrategias:
1.  Vector binario
2.  Co-integración
Estrategias:
2.  Co-integración
Se basa en un vector de E. coli que lleva una pequeña porción de T-DNA.
La homología entre la nueva molécula y el plásmido Ti, indica que si
ambas están presentes en la misma A. tumefaciens, se puede dar la
recombinación.
El gen al ser clonado estará por tanto inserto en un único si/o de
restricción en el plásmido de E.coli.
La infección de la planta lleva a la inserción del nuevo gen, junto con el
resto del gen T-DNA, en los cromosomas de la planta
 Plantas transformadas

Pero esta situación no es muy ú/l para la biotecnología.

Lo recomendable sería que el nuevo gen estuviera en todas las células
de la planta
Plantas transformadas
 Las plantas se seleccionan en
un medio con kanamicina

Es importante considerar que los genes cancerígenos presentes en la

región T-DNA no hagan daño en la nueva planta. Por tanto ellos no son
necesarios. Y para realizar la recombinación homóloga (proceso de
infección) se requieren de unas regiones repe//vas (~25 pb).
Cualquier DNA que se encuentre entre estas dos regiones se tratará
como T-DNA y se transferirá al genoma de la planta
 Vectores para Animales

Para Drosofila
El proceso se realiza por medio de transposones (pequeños segmentos de
DNA –~10 kb– que se mueven de una posición a otra en un cromosoma)
Las drosofilas /enen un transposón, llamado elemento P (~2.9 kb), que
con/ene 3 genes flanqueados por secuencias inver/das repe/das en
ambos extremos del transposón. Los genes codifican para la enzima
transposasa, que lleva a cabo la transposición y la secuencias inver/das
repe/das, forman una secuencia de reconocimiento que permite que la
enzima iden/fique las dos terminaciones del transposón insertado.
Puesto que los elemento P se mueven de un cromosoma a otro, ellos son
el sistema adecuado para llevar a cabo los procesos de transformación en
la mosca de la fruta.
El sistema a u/lizar es un plásmido que lleve el elemento P.
Aunque es necesario modificar la estrategia para lograr la clonación.
El plásmido debe llevar dos elementos P:
-  Uno que contenga el DNA que se desea clonar. Dicha inserción genera
la irrupción de la transposasa
-  Otro que lleve el gen de la transposasa intacto. Pero este no debe
transferirse al genoma de la drosófila, por tanto no tendrá las regiones
inver/das repe/das y así no se reconoce como un transposón.
Una vez que se tenga la construcción, el plásmido se introduce en
embriones de la mosca por microinyección. Y la transposasa dirige la
inserción del gen de interés dentro del cromosoma de la mosca.
La mosca generada de ese embrión recombinante, llevará copias del gen
clonado en todas sus células.
Clonación en Mamíferos

El proceso se realiza con tres obje/vos:
1.  Gene knockout: técnica ú/l para conocer el funcionamiento de los
genes. Estos experimentos se realizan generalmente en ratones
2.  “Farming” ingeniería gené/ca en animales de granja, con el fin de
obtener proteínas recombinantes en dichos animales (Ej: en la leche)
3.  Terapia génica: células tratadas por ingeniería gené/ca para curar
enfermedades
Virus como vectores de clonación en mamíferos

-  Simian virus (SV40): 5.2 kb
-  Adenovirus: 8 kb
-  Papiloma virus: el más u/lizado es el de bovino
-  Virus adeno asociado: requiere del adenovirus como un virus helper
-  Retrovirus: usado para terapia génica
La Microinyección: otra forma de clonación

-  Es una técnica que requiere de mucha destreza
-  Pueden inyectarse plásmidos bacterianos o copias lineales de DNA
-  Es la técnica usada para la generación de animales transgénicos
(inyección de DNA en células embrionarias, células aún no
diferenciadas y por tanto, to/potentes)
Oveja Dolly