UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONÓMA DE NICARAGUA, MANAGUA

UNAN-MANAGUA
FACULTAD DE CIENCIAS E INGENIERÍAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
QUÍMICA DE LOS ALIMENTOS
PRÁCTICA DE LABORATORIO #5

DETERMINACIÓN COLORIMÉTRICA DE CARBOHIDRATOS TOTALES EN

BEBIDAS ALCOHÓLICAS Y NO ALCOHÓLICAS.
I. Introducción

En bebidas alcohólicas y no alcohólicas, la principal fuente de calorías son los

carbohidratos en forma de azúcares, los cuales aportan 4 𝑐𝑎𝑙/𝑔. Sin embargo una alta
concentración de carbohidratos totales, alteran el valor nutritivo de los mismos haciendo que
éstos aporten más calorías de las que normalmente deberían aportar, ocasionado así problemas
en la salud como la obesidad y la caries dental en los consumidores permanentes.

Los oligosacáridos y polisacáridos presentes en muestras de alimentos pueden ser

determinados, en forma de azúcares simples (monosacáridos), por espectrofotometría utilizando
el método colorimétrico de fenol-ácido sulfúrico propuesto por Dubois et al (1956), éste
fundamenta que los carbohidratos, en presencia de ácido fuerte y calor, se hidrolizan a
monosacáridos, éstos a su vez se deshidratan para formar derivados de furano, los cuales al
reaccionar con fenol producen un complejo amarillo-naranja que absorbe luz dentro del rango
visible en un intervalo de longitudes de onda comprendido entre 480 – 490 nm.

Para determinar experimentalmente la concentración de carbohidratos en muestras de

alimentos, es necesario crear una curva de calibración o curva patrón utilizando una solución
estándar del carbohidrato de interés a diferentes concentraciones, a partir de la relación lineal de
las absorbancias vs las concentraciones de los estándares de calibración se obtiene la ecuación de
primer orden con la que es posible cuantificar la concentración de carbohidratos totales presente
en las muestras.
II. Objetivos

 Determinar el contenido de carbohidratos totales en bebidas alcohólicas y no alcohólicas

mediante el método de fenol-ácido sulfúrico.

 Realizar los cálculos pertinentes para el reporte del contenido de carbohidratos totales en
bebidas alcohólicas y no alcohólicas.

 Contrastar los valores obtenidos experimentalmente con los valores establecidos en las
respectivas etiquetas de las bebidas.
1
 III. Materiales y Reactivos

N° Cristalería, Materiales y Equipos Reactivos

Cristalería Clase A Fórmula Grado
1 Matraz Volumétrico Pyrex® 1000 mL Clase A H2O ASTM tipo III (5 pisetas 1 L)
6 Matraces Volumétricos Pyrex® 100 mL Clase A H2SO4 ACS, para análisis
1 Matraz Volumétrico Pyrex® 50 mL Clase A C6H6O ACS, para análisis
3 Beakers Pyrex® 600 mL Clase A C6H12O6 ACS, para análisis
20 Beakers Pyrex® 50 mL Clase A
22 Tubos de ensayo Pyrex® 15 mL
12 Matraces Erlenmeyer de 125 mL
6 Embudos de filtración Pyrex®

Materiales de Laboratorio Cada Equipo de Trabajo debe de Traer:

2 Pipeta de asistencia magnética 100-1000 µL 1 Rollo de papel toalla
2 Pipeta de asistencia magnética 500 µL- 5 mL 1 Marcador Sharpie® punta fina
1 Bebida no alcohólica (Coca-Cola®
1 Espátula
regular o Coca-Cola® Zero™)
5 Pinzas de 3 dedos 1 Bebida alcohólica (Cerveza Toña®
regular o Toña® Lite)
5 Soportes universales 1 Caja de papel Kleenex®
4 Gradillas para tubos de ensayo 2 Bolsas con hielo
2 Cronómetros digitales 1 Rollo de tela de gasa
1 Varilla de agitación
1 Cubeta

Equipos de Laboratorio
1 Balanza analítica 0,0001 g
1 Espectrofotómetro UV/VIS
1 Campana de gases
1 Mezclador Vórtex
1 Baño de limpieza por ultrasonidos con
calefacción

IV. Procedimiento experimental

4.1. Preparación de soluciones.

1. Solución de fenol (C6H6O) 5%: Pese 2,5000 g de fenol sólido y trasvase a un matraz
volumétrico de 50 mL diluyendo hasta la marca de aforo con agua destilada.
2. Solución stock de glucosa (C6H12O6) 100 mg/L: Pese con exactitud 0,1000 g de glucosa,
trasvase cuantitativamente a un matraz volumétrico de 1 L y diluya con agua destilada
hasta la marca de aforo.
3. Soluciones estándares de glucosa: A partir de la solución stock de glucosa prepare, por
duplicado, seis estándares de trabajo a diferentes niveles de concentración de glucosa en
el rango de 0 – 50 mg/L según la Tabla 4.1. Para esto adicione en tubos de ensayos
2

previamente rotulados los volúmenes de solución stock y de agua destilada indicados en la

 Tabla 4.1. Utilice dos pipetas de asistencia magnética de 1000 μL (1,0 mL), una para
medir con exactitud los volúmenes de solución stock y otra para medir con exactitud los
volúmenes de agua destilada. Todos los tubos de ensayo deben completar un volumen
total de 2 mL. Se deben preparar dos gradillas de soluciones estándares de glucosa, una
será utilizada para la lectura de la curva de calibración en el espectrofotómetro UV/Vis, la
otra gradilla se utilizará para enjuagar las celdas en el transcurso de la lectura de cada
estándar.

Tabla 4.1. Esquema de preparación de la soluciones estándares de glucosa.

ID del tubo de ensayo STD 1 STD 2 STD 3 STD 4 STD 5 STD 6
Vol. Solución stock (mL) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Vol. H2O destilada (mL) 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0
[C6H12O6] (mg/L) 0 10 20 30 40 50

4. Adicione rápidamente a cada tubo de ensayo 1 mL de la solución de fenol al 5 % y selle

con Parafilm®, luego agite en el agitador Vórtex durante 30 segundos a 2000 RPM.
5. Subsecuentemente, en intervalos de 3 minutos e iniciando por el tubo de ensayo STD 1,
agregue 5 mL de H2SO4 concentrado a cada tubo de ensayo, cubra nuevamente los tubos
con el Parafilm® y sumérjalos en agua con hielo durante 2 minutos, retire los tubos de
ensayos y agite nuevamente en el agitador Vórtex durante 30 segundos a 2000 RPM.

4.2. Preparación de las muestras.

1. Descarbonatación
1.1. En matraces Erlenmeyer de 125 mL, adicione aproximadamente 25 mL de la muestra (si la
muestra es cerveza, evite la formación de espumas). Si en la bebida se observan sólidos
suspendidos, filtre la muestra antes de la descarbonatación con ayuda de tela de gasa.
1.2. Llene hasta la mitad de agua destilada el baño por ultrasonido, seguidamente sumerja en
el baño los matraces Erlenmeyer que contienen las muestras; utilice pinzas de tres dedos
y soporte universal para sostener los matraces Erlenmeyer.
1.3. Encienda el ultrasonido en intervalos de 10 min y retire las muestras hasta que no se
observe la formación de burbujas debido a la liberación de CO2.
2. Dilución de las muestras
En la Tabla 4.2 se detallan el esquema de dilución y volúmenes a ensayar de modo que las
muestras de ensayo contengan entre 0 – 50 mg C6H12O6/L.

2.1. Para diluciones 1:2000: Adicione 5 mL de la muestra descarbonata en un matraz

volumétrico de 100 mL y afore con agua destilada (ésta es una dilución 1:20). Luego
extraiga 1 mL de la dilución 1:20 en un matraz volumétrico de 100 mL y afore con agua
destilada (ésta es una dilución 1:2000).
3
 2.2. Para diluciones 1:1000: Adicione 10 mL de la muestra descarbonatada en un matraz
volumétrico de 100 mL y afore con agua destilada; o bien adicione 5 mL de la muestra
descarbonata en un matraz volumétrico de 50 mL y afore con agua destilada (en ambos
casos, se obtiene una dilución 1:10). Luego extraiga 1 mL de la dilución 1:10 en un matraz
volumétrico de 100 mL y afore con agua destilada (esta es una dilución 1:1000).
Tabla 4.2. Dilución recomendada según el tipo de bebida.
Tipo de Muestra Dilución requerida Volumen a ensayar (mL)
Cola-Cola®
Regular 1:2000 1
Zero™ 1:10 1
Cerveza Toña®
Regular 1:2000 1
Lite 1:1000 1
Nota: Las muestras deben de prepararse por cuadruplicado.
2.3. Después de haber diluido apropiadamente las muestras, con la ayuda de una pipeta de
asistencia magnética de 1000 μL, agregue 1 mL de la muestra en un tubo de ensayo y
adicione 1 mL de agua destilada. Seguidamente continúe como se describió en los incisos
4 y 5 del acápite 4.1.
4.3. Lectura de las soluciones estándares de glucosa: obtención de la curva de calibración.
1. Transcurrido 45 minutos después de la adición del ácido sulfúrico concentrado, lea la
absorbancia de los estándares en intervalos de 3 minutos a la longitud de onda de máxima
absorción (𝝀𝒎á𝒙) la cual debe estar comprendida en el intervalo 480 – 490 nm. Recopile
los datos en la Tabla 5.2.
4.4. Lectura de las muestras.
1. Transcurrido 45 minutos después de la adición del ácido sulfúrico concentrado, lea la
absorbancia de los blancos analíticos y de las muestras en intervalos de 3 minutos a la
misma a longitud de onda de máxima absorción que fue obtenida la curva de calibración.
Recopile los datos en la Tabla 5.2.
2. Calcule la concentración de carbohidratos totales en la alícuota de muestra ensayada así:
𝐴𝑐 − 𝑎
[𝐶𝐻𝑂]𝑑 = (1)
𝑏
Dónde:
o 𝐴𝑐 : absorbancia corregida de la alícuota de muestra ensayada 𝐴𝑐 = 𝐴̅𝑚 − 𝐴̅𝑏 .
o [𝐶𝐻𝑂]𝑑 : concentración de carbohidratos totales (mg/L) en la alícuota de muestra ensayada.
3. Seguidamente estime de la concentración de carbohidratos totales en la muestra original:
𝑉2
[𝐶𝐻𝑂]𝑓 = [𝐶𝐻𝑂]𝑑 × × 𝑓 × 0.000001 (2)
𝑉1
Dónde:
o [𝐶𝐻𝑂 ]𝑓 : concentración de carbohidratos totales en la bebida preenvasada (g/mL).
o 𝑉2 : Volumen de aforo de la alícuota ensayada (2 mL).
o 𝑉1 : Volumen de ensayo extraído de la muestra diluida para el análisis (1 mL)
o 𝑓: factor de dilución para la bebida preenvasada: 2000 mL/1 mL (1:2000) para bebidas regulares y
4

1000 mL/1 mL (1:1000) para bebidas lite.

V. Resultados
Tabla 5.1. Control del tiempo desde la adición del ácido sulfúrico y tiempo de
lectura de los estándares de glucosa y las muestras.
Lectura en el
Adición de H2SO4
Estándares espectrofotómetro UV/Vis

Tiempo Hora Tiempo Hora

1a
1b
2a
2b
3a
3b
4a
4b
5a
5b
6a
6b
Muestras de ensayo
B1
B2
CCR1
CCR2
CCZ1
CCZ2
CTR1
CTR2
CTL1
CTL2
Leyenda:
B: Blanco analítico (agua destilada)
CCR: Cola-Cola® Regular
CCZ: Cola-Cola® Zero™
CTR: Cerveza Toña® Regular
5

CTL: Cerveza Toña® Lite

 Tabla 5.2 Resultados de la curva de calibración.
STD [𝐶𝐻𝑂] (mg/L) 𝐴̅*
1
2
3
4
5
6
* Absorbancia promedio por estándar.

Tabla 5.3. Estadísticos de la curva de calibración.

Coeficiente de regresión o correlación (𝑟) =
Pendiente (𝑏) =
Intercepto al origen u ordenada(𝑎) =
Ecuación de Regresión = 𝐴𝑐 = __________ + __________[𝐶𝐻𝑂]𝑑
𝒕𝒄𝒂𝒍𝒄𝒖𝒍𝒂𝒅𝒐 =
𝒕𝒕𝒂𝒃𝒖𝒍𝒂𝒅𝒐 =
¿Existe correlación significativa?

Tabla 5.4. Datos analíticos para la cuantificación de Carbohidratos totales en las muestras de análisis.
Absorbancia [𝑪𝑯𝑶]𝒅 [𝑪𝑯𝑶]𝒇
ID Muestra Absorbancia (𝑨̅) 𝑽𝟏 (𝒎𝑳) 𝑽𝟐 (𝒎𝑳) 𝒇
corregida (𝑨𝒄 ) (𝒎𝒈/𝑳) (𝒈/𝒎𝑳)
B1
𝐴̅𝑏
B2
CCR1 1 2 2000
𝐴̅𝑚
CCR2 1 2 2000
CCZ1 1 2 10
𝐴̅𝑚
CCZ2 1 2 10
CTR1 1 2 2000
𝐴̅𝑚
CTR2 1 2 2000
CTL1 1 2 1000
𝐴̅𝑚
CTL2 1 2 1000
Leyenda
o 𝐴̅𝑏 : absorbancia promedio de los blancos de análisis.
o 𝐴̅𝑚 : absorbancia promedio de la muestra.
o 𝐴𝑐 : absorbancia corregida de la muestra, 𝐴𝑐 = 𝐴̅𝑚 − 𝐴̅𝑏 .
o [𝐶𝐻𝑂]𝑑 : concentración de carbohidratos totales (mg/L) en la alícuota de muestra ensayada (ecuación 1).
o [𝐶𝐻𝑂 ]𝑓 : concentración de carbohidratos totales en cada mililitro (g/mL) de la bebida preenvasada (ecuación 2).
6
 VI. En su Reporte
 En la Sección de Análisis de los Resultados:
 Compare el valor obtenido con el valor reportado en la etiqueta del producto o con el
valor reportado en la bibliografía (Normas y Tablas de Composición de Alimentos) y
explique los factores que pueden haber influido para la obtención de sus Resultados.
 Como Anexo realice la siguiente investigación bibliográfica:
a) ¿Cuáles son las ventajas, desventajas y fuentes de error de este método para determinar
el contenido de carbohidratos totales?
b) Un técnico de laboratorio realiza el análisis de fenol-H2SO4 en muestras de alimentos para
determinar el contenido de carbohidratos totales, pero los resultados mostraron baja
precisión, y los valores fueron muy altos. El técnico cuenta con nuevos tubos de ensayo
(que nunca habían sido utilizados). ¿Qué fue lo más probable que causo estos resultados?
¿Por qué? Describa que ocurrió.
c) Resuelva: Un analista pretende montar el método de fenol-ácido sulfúrico para la
determinación de carbohidratos totales, realizando dos Curvas de calibración obteniendo
los siguientes datos:
Curva de calibración 1 Curva de calibración 2
STD [CHO] A STD [CHO] A
1 0 -0.021 1 0 -0.004
2 10 0.173 2 10 0.144
3 20 0.374 3 20 0.182
4 30 0.449 4 30 0.231
5 40 0.567 5 40 0.331
6 50 0.952 6 50 0.378

c.1) Represente gráficamente las Curvas de calibraciones 1 y 2, respectivamente.

c.2) Para ambas Curvas, calcule los siguientes estadísticos: el coeficiente de correlación, la
pendiente y el intercepto.
c.3) Construya una Curva de calibración promedio a partir de las dos Curvas de calibración
(no promedio las absorbancias, incluya los 12 puntos) y calcule nuevamente el coeficiente
de correlación, la pendiente y el intercepto de la curva promedio. Compare los valores de
estos estadísticos con los calculados en el inciso c.2).
c.4) En la curva promedio observará que los puntos de la curva no son repetibles, Explique.
¿Porque cree usted que la curva no fue repetible? ¿En qué paso del método de Dubois
debe tener sumo cuidado?

Bibliografía
M, D., KA, G., JK, H., PA, R., & F, S. (1956). Colorimetric method for determination of sugars and
related substances. Anal Chem 28:350-365.
Nielsen, S. (2010). Food Analysis, Fourth Edition. New York: Springer.
Zumbado, F. H. (2004). Análisis Químico De Los Alimentos - Métodos Clásicos. La Habana:
7

Instituto de Farmacia y Alimentos.