CROMATOGRA

FIA AFINIDAD
(CAP. 2)
Martha Cecilia Mosqueda López 17311054

UPZMG
OPERACIONES UNITARIAS
RESUMEN
Fuentes y sus contaminantes asociados.
Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos se producen a partir de fuentes nativas y
recombinantes. La elección del material de origen puede afectar la selección de técnicas para
la preparación de muestras. y purificación debido a las diferencias en contaminantes
específicos y la cantidad requerida de la molécula diana. Sin embargo, en muchos casos, la
alta selectividad de una purificación por afinidad medio para una molécula específica
minimiza la contaminación y produce una muestra de alta Pureza en un solo paso.
Extracción de anticuerpos recombinantes y fragmentos de anticuerpos.
La fuente y la ubicación de la molécula recombinante determinarán la extracción
procedimiento. De origen bacteriano o mamífero, sistemas de expresión inter o intracelulares
que dan todos los productos solubles o cuerpos de inclusión tendrán exigencias especiales.
Centrifugación y filtración.
La centrifugación elimina la mayoría de las partículas, como los desechos celulares. Si la
muestra es todavía no está limpio después de la centrifugación, use un filtro de 5 μm como
primer paso y uno de los filtros enumerados. La filtración elimina las partículas. Filtros de
membrana que dan la menor cantidad de inespecíficos. La unión de proteínas se compone de
acetato de celulosa o fluoruro de polivinilideno (PVDF). Preparación de la muestra antes de
la cromatografía, seleccione un tamaño de poro de filtro en relación con el cordón tamaño de
la cromatografía.
Preparación de la muestra antes de la purificación.
Las tareas principales de la etapa de preparación de la muestra antes de la purificación son:
• Eliminación de impurezas específicas, como lipoproteínas o rojo de fenol, del material de
origen.
• Eliminación de impurezas brutas, como proteínas a granel, del material de origen.
• Intercambio de búfer y desalinización para transferir la muestra a las condiciones correctas
del búfer
Eliminación de impurezas específicas antes de la purificación. Lipoproteínas
Las lipoproteínas y otros materiales lipídicos pueden obstruir las columnas de cromatografía.
Es recomendable. Eliminarlos antes de comenzar la purificación. Las ascitis a menudo tienen
un alto contenido de material lipídico.
Fenol rojo
El rojo de fenol se utiliza como un indicador de pH en cultivos celulares a escala de
laboratorio. Aunque no que interfiere directamente con la purificación, el rojo de fenol se
une a ciertos medios de purificación y debe eliminarse lo antes posible. Se sabe que el rojo
fenol se une al intercambio anicónico cromatografía.
Eliminación de impurezas brutas por precipitación.
Contaminantes de bajo peso molecular. Si las muestras contienen un alto nivel de
contaminantes de bajo peso molecular, use una columna de desalinización como se describe
más adelante en Desalinización e intercambio de tampones para preparar la muestra para la
primera Paso de cromatografía.
Precipitaciones fraccionarias
El aumento de la concentración de sal puede mejorar la interacción hidrofóbica entre
proteínas. Las diferencias en la hidrofobicidad resultan en una precipitación selectiva. La
precipitación fraccional es Usado ocasionalmente a escala de laboratorio y en producción
comercial a pequeña escala para eliminar Impurezas brutas de
pequeños volúmenes de muestra.

Precipitación con sulfato de amonio

La precipitación con sulfato de amonio se usa frecuentemente
para la concentración inicial de la muestra y limpiar. Este método
es particularmente efectivo para eliminar la mayor parte de la albúmina, transferían, y otros
contaminantes altamente solubles.
Precipitación del ácido caprílico
El ácido caprílico (octanoico) es tan efectivo como el sulfato de amonio y se puede usar para
precipitar La mayor parte de proteínas de sueros y ascitis. El ácido caprílico es uno de varios
ácidos grasos que han sido evaluados para la precipitación de anticuerpos y el único ácido
graso utilizado para la Precipitación de anticuerpos monoclonales.
Resolubilización de precipitados de anticuerpos.
Muchos anticuerpos se resuelven fácilmente en una pequeña cantidad del tampón que se
utilizará en el Siguiente paso cromatográfico. Sin embargo, un agente desnaturalizante puede
ser requerido para menos solubles anticuerpos.
Desalinización e intercambio de tampones.
Consideraciones Generales
La desalinización a escala de laboratorio es un método comprobado, simple y rápido que
rápidamente eliminar los contaminantes de bajo peso molecular al mismo tiempo que se
transfiere la muestra en el búfer deseado en un solo paso.
Desalado a pequeña escala de muestras.
Para volúmenes de muestra que van desde 0.2 ml a 2.5 ml, es posible ejecutar múltiples
muestras en paralelo a las columnas desalinizadoras PD-10, PD MidiTrap G-25 y PD
MiniTrap G-25 gravity columnas Hay dos protocolos diferentes disponibles para estas
columnas de gravedad: uno para uso manual en el banco de laboratorio; y uno para usar junto
con una centrífuga estándar en combinación con un adaptador de giro.
Desalar volúmenes de muestra más grandes utilizando las columnas HiTrap y
HiPrep Conecte hasta tres columnas HiTrap Desalting en serie para aumentar la capacidad
de volumen de muestra, por ejemplo, dos columnas permiten un volumen de muestra de 3
ml; tres columnas permiten una muestra volumen de 4,5 ml.
Preparación del tampón
Para sustancias que llevan grupos cargados, se recomienda un eluyente que contenga una sal
tampón. Se recomienda una concentración de sal de al menos 150 mM para prevenir posibles
interacciones iónicas. con el medio.
Preparación de la muestra
La concentración de la muestra no influye en la separación siempre que la viscosidad no lo
haga. difieren en más de un factor de 1,5 de la del búfer utilizado. Esto corresponde a un
máximo Concentración de 70 mg / ml para proteínas, cuando son normales, se utilizan
tampones acuosos.
Ampliando la desalinización de HiTrap a HiPrep
Para la separación de volúmenes de muestra superiores a 1,5 ml, o para aumentar la
resolución entre Componentes de alto y bajo peso molecular, hasta tres columnas HiTrap
Desalting pueden Conectarse fácilmente en serie.
Desalinización a pequeña escala e intercambio de tampones con columnas de
desalinización PD
Columnas desalinizadoras PD-10, PD MidiTrap G-25, MiniTrap G-25 PD, SpinTrap G-25
PD y Las columnas PD MultiTrap G-25 y las placas de filtro de 96 pocillos están
preenvasadas con Sephadex G-25 Medio para la separación de grupos de sustancias de alto
peso molecular (Mr> 5 000) (Mr <1 000) por desalinización e intercambio de tampones.

Columnas desalinizadoras desechables PD-10

Las Columnas de desalinización PD-10 están diseñadas para la desalación conveniente y el
intercambio de búfer de 1.0 a 2.5 ml de volumen de muestra proteica. Las columnas están
preempacadas con Sephadex. Medio G-25, un medio SEC que permite la eliminación
efectiva de bajo peso molecular sustancias de proteínas con un peso molecular> 5000. Estas
columnas proporcionan un excelente alternativa a las columnas PD MidiTrap G-25 debido a
la mayor capacidad de volumen de muestra.