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UT COMISIÓN ACADÉMICA NACIONAL

AREA AGRO-INDUSTRIAL ALIMENTARIA

MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

MANUAL DE ASIGNATURA

NOVIEMBRE DE 2010
 PROLOGO

Dado la globalización de la economía y los tratados que nuestro país tiene con diferentes
homólogos del mundo, es necesario poner más énfasis en la calidad de los productos que se
exportan, así como los que se consumen en el país. Y uno de los productos que se
contemplan más importante son los alimentos. Dentro de ésta rama es importante recalcar
que tenemos avances y deficiencias que nos han permitido saber cual es el rumbo que
debemos tomar, y en el ámbito educativo, los programas que debemos implementar para
estar a la vanguardia en cuanto a calidad e inocuidad alimentaría.
Los alimentos, como tal, forman parte del ser humano y cada día se diversifican productos
que son consumidos por la población y realmente no sabemos cuál es el tratamiento que ha
recibido y que garantice que no afecta la salud de las personas que los consumen.
Siendo los alimentos el principal medio para transporte de enfermedades es necesario
trabajar con esmero para convencer tanto a los que los producen como los que los
consumen, conocer los procesos por los cuales han pasado los alimentos antes de llegar a
sus mesas.
La Universidad Tecnológica de Tabasco, a través de la División de tecnología de alimentos
esta trabajando grandemente por incluir en sus programas de estudio lo más reciente en
cuanto a mejoramientos de procesos y calidad, y dentro de este contexto incluir las buenas
prácticas de manufactura, que a la par se lleva con los controles microbiológicos en
alimentos.

ING. ROGELIO KURI GONZÁLEZ

RECTOR

2
 INDICE

Página
PRESENTACION 1
PROLOGO 2
MANUAL No. 1. CONOCIMIENTO DEL MATERIAL DEL LABORATORIO 4
MANUAL No. 2. USO DEL MICROSCOPIO 13
MANUAL No. 3. COLORACIÓN DE GRAM 27
MANUAL No. 4. PREPARACIÓN DEL MATERIAL PARA 32
ESTERILIZACIÓN.
MANUAL No. 5. RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS 40
MANUAL No. 6. MÉTODO DE CUENTA TOTAL ESTÁNDAR DE
44
MICROORGANISMOS MESÓFILOS AEROBIOS EN ALIMENTOS.
MANUAL No. 7. DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES EN
49
ALIMENTOS(PRUEBA PRESUNTIVA)
MANUAL No. 8. DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES EN
55
ALIMENTOS (PRUEBA CONFIRMATIVA)
MANUAL No. 9. IDENTIFICACIÓN Y RECUENTO DE SALMONELLA 58
MANUAL No. 10. IDENTIFICACIÓN Y RECUENTO DE
66
STAPHILOCOCCUS
MANUAL No. 11. IDENTIFICACIÓN Y RECUENTO DE
71
STREPTOCOCCUS DEL GRUPO LANCEFIELD
MANUAL No. 12. RECUENTO DE ENTEROBACTER 76
MANUAL No. 13. IDENTIFICACIÓN Y RECUENTO DE BACILLUS
80
CEREUS
REFERENCIAS 84
RESPONSABLES 85

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MANUAL No. 1
METODO DE CUENTA TOTAL ESTANDAR DE MICROORGANISMOS MESOFILOS AEROBIOS EN
ALIMENTOS.

OBJETIVO

3
Desarrollar el método microbiológico para determinar el número de microorganismos mesófilos aerobios en
alimentos.

INTRODUCCIÓN
Cada bacteria(al igual que cada levadura o cada moho) tiene una temperatura óptima, que es aquella a la que
mejor crece; una temperatura mínima, la más baja a la que se desarrolla, y una temperatura máxima, la más
alta que permite su crecimiento .Se han encontrado bacterias capaces de crecer a temperaturas de –5 y –2 C
Las bacterias con temperaturas óptimas entre 20 y 45  C se denominan mesófilas.

MARCO TEORICO
Son un grupo de bacterias que se multiplican en aerobiosis a temperaturas de 25 y 40 grados centígrados,
siendo su temperatura optima 31 grados centígrados. En este grupo se incluyen bacterias patógenas y no
patógenas alterantes, saprofitos, etc.. Nos permite conocer la calidad microbiológica del agua. Unas tasas
altas de mesófilos indican que el agua no es apropiada para el consumo humano.
El análisis se puede realizar mediante dos técnicas. Para la determinación de este grupo solo será necesario
realizar uno de los análisis, en función de los medios con que cuenta el laboratorio.

1.- Método de las diluciones decimales.

a) A partir de 100 mL de muestra problema de agua realizar las diluciones decimales seriadas que se
consideren convenientes.
b) A partir de las tres últimas diluciones añadir 1 mL de cada dilución a dos cajas de petri estériles vacías para
la siembra de los microorganismos con detalle.
c) Verter unos 20 mL por placa de PCA fundido y atemperado a 45-50 grados centígrados.
d) Una vez que haya solidificado el agar, incubar las placas a 37 grados centígrados. Anotar los resultados
obtenidos a las 24 y 48 horas de incubación.
e) Realizar el recuento de las colonias. El número de aerobios mesófilos totales presentes en la muestra
inicial se expresa como UFCmL.
Método de las membranas filtrantes. Preparar el equipo de filtración de aire, que consta de las siguientes
partes: recipiente de vidrio de 250 mL con base para embudo esmerilado, frasco de Erlenmeyer de 1000 mL,
pinzas, portafiltros, rejilla metálica, filtro de membranas de 0.2 m de poro y bomba de vacio.
a) Filtrar 100 mL de la muestra de agua problema mediante vació, de manera que los microorganismos
presentes queden retenidos en el filtro de membranas.
b) Retirar el filtro de la membrana con la ayuda de unas pinzas estériles y colocarlo en la superficie de una
placa de PCA.
c) Incubar a 37 grados centígrados durante 24-48 horas. Durante este periodo las sustancias nutritivas del
medio difunden hacia la membrana y permiten que crezcan las bacterias dando lugar al número de
UFC100 mL.
d) NOTA: si se sospecha una alta carga microbiana en la muestra inicial, no es conveniente llevar a cabo esta
técnica de recuento, ya que no se visualizaran las colonias aisladas en la membrana Pelczar, 1998.

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

1 Espátula Medios de cultivo:
1 Probetas de 100 ml Agar cuenta estándar o agar

4
5 Pipetas de 1 ml y 1 de 10 ml con graduación de 0.1 ml bacteriológico
1 Asa bacteriológica, gradilla Agua peptonada
1 Mechero bunsen Agua destilada
2 Matraces erlenmeyer de 250 ml
10 Cajas de petri de vidrio de 100 x 15 mm.
2 Vasos de precipitados de 100 ml
1 Piceta de agua y 1 alcohol
5 tubos de ensaye
1 gradilla, agitador de vidrio
Guantes de asbesto
1 vidrios de reloj.

METODOLOGÍA
Preparación de la muestra.
Pesar 10 gr. del alimento en condiciones asépticas, transferir a un frasco de dilución con 90 ml, de solución de
peptona y agitar vigorosamente para homogeneizar la muestra. (En su caso licuarla por 1 min.) Con las
muestras liquidas tomar 10 ml. y realizar la misma operación.
Esta primera dilución corresponderá a 10 1, y a partir de ella se harán tantas diluciones decimales como sea
necesario (10 -2, 10-3, 10-4, etc.).
De la dilución 10-1 se toma 1 ml. Y se pasa a un tubo con tapón de rosca, el cual contiene 9 ml. de diluyente,
este tubo va ser la dilución 10-2; y así sucesivamente hasta llegar a la dilución 10 -3.
Sembrar en placa de Agar de Cuenta estándar, inoculando 0.1 ml. de cada dilución preparada e incubar a 35 C
por 24 o 48 hrs., según el resultado obtenido.
RESULTADOS
Seleccionar las placas que contengan crecimiento de microorganismos y contar las colonias multiplicando por el
factor de dilución, reportando el número de colonias por gramo o ml.

CUESTIONARIO
1.- Investigar las características que identifican a las bacterias mesófilos aerobios de las demás bacterias.
2.- ¿Cuál es el pH que debe tener el agar para que se desarrollen las bacterias mesófilas aerobias y menciona
alguna familia de las mismas?
3.- ¿Qué función tiene el agar de cuenta estándar en el crecimiento de los microorganismos?
4.- ¿Cuántas técnicas para recuento de mesófilos conoces?
5.- ¿En qué se basa la técnica de diluciones?
REFERENCIAS
Pelczar J. M. y Chan E. C. S. “Elementos de Microbiología”. Editorial Mc. Graw Hill. México, 1998.

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MANUAL No. 2
DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES EN ALIMENTOS
(PRUEBA PRESUNTIVA)
OBJETIVO
5
Determinar bacterias coliformes en alimentos que puedan ocasionar daños a la salud.

MARCO TEORICO

Investigacion y recuento de coliformes fecales E. coli en medio liquido.

Dentro del grupo coliforme se investiga la presencia de Escherichia coli por ser el coliforme mas estrechamente
ligado a contaminación fecal. Una de las características diferenciales de esta bacteria respecto al resto de los
coliformes totales es la capacidad de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas a 44 grados
centígrados.
a) Determinar los coliformes fecales a partir de los tubos positivos del análisis anterior. Para ello,
transferir de cada tubo positivo el volumen correspondiente 10, 1, 0.1 mL a nuevos tubos del
medio caldo de lactosa con púrpura de bromocresol.
b) Incubar 24 horas a 45 grados centígrados.
c) Determinar el NMP de coliformes fecales100 mL de agua a partir de los datos de la tabla
anterior.
Determinación de estreptococos fecales.
Son cocos Gram positivos, aerobios, catalasa negativos, que fermentan la lactosa con producción de ácido y
gas a 37 grados centígrados. Los estreptococos fecales pertenecen al grupo D de Lancefield. Son gérmenes
cuyo hábitat normal es el tubo digestivo del hombre y los animales de sangre caliente. Por lo que se utilizan
como indicadores de contaminación fecal. La determinación se realiza por el método de NMP realizándose una
prueba presuntiva y otra confirmativa.
a) Prueba presuntiva: a partir de la muestra problema añadir con pipetas estériles 10 mL a 3
tubos de medio Rhote X2, 1 mL a 3 tubos de medio Rhote 1X y 0.1 mL a otros tres X1.
Incubar los tubos a 37 grados centígrados durante 48 horas. Se consideran positivos los tubos
que presenten enturbiamiento o sedimento.
A partir de cada tubo de caldo Rhote positivo homogeneizar el medio y sembrar con asa de siembra en tubos de
caldo de Litsky. Incubar a 37 grados centígrados durante 24-48 horas. Si se consideran positivos los tubos que
presentan enturbiamiento yo sedimento de color violeta. Se determina en la tabla anterior en el NMP de
estreptococos fecales100 mL de agua (Pelczar, 1987).

Tabla para la obtención del Numero Mas Probable NMP.

Numero de tubos que dan reacción positiva
3 tubos de 10 mL 3 tubos de 1 mL 3 tubos de 0.1 mL NMP
0 0 1 3
0 1 0 3
1 0 0 4
1 0 1 7
1 1 0 7
1 1 1 11
1 2 0 11
2 0 0 9
2 0 1 14
2 1 0 15

6
 2 1 1 20
2 2 0 21
2 2 1 28
3 0 0 23
3 0 1 39
3 0 2 64
3 1 0 43
3 1 1 75
3 1 2 120
3 2 0 93
3 2 1 150
3 2 2 210
3 3 0 240
3 3 1 460
3 3 2 1100

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.

10 Tubos de ensaye de 16x150 mm. Medios de cultivo:
2 Pipetas Graduadas De 10 Ml. Caldo lactosado O verde brillante
1 Pipeta De 1 ml Purpura de bromocresol
1 vaso de precipitado de 500 ml 1 asa bacteriológica
1 Matraz Erlenmeyer de 250 ml. 1 vidrio de reloj
1 Espátula. 1 perilla
10 Campanas de Durham algodón
1 gradilla gasa
1 mechero MUESTRA POR EQUIPO LIQUIDA (Leche, Jugo, Agua, Etc., una
1 probeta de 100 ml muestra por equipo) Papel estraza y todo el material necesario
Piceta de agua y de alcohol
1 par de guantes de asbesto
1 vaso de precipitado 500 ml

METODOLOGÍA
1. Se prepara caldo lactosado y se distribuye de 12 ml. en tubos de 16X150 mm. Con campanas de Durham
invertidas.
2. Se esterilizan los medios de cultivo a 15 lb/pulg 2. Después de la esterilización no debe existir aire en las
campanas invertidas
3. Colocar 10ml, 1 ml y 0,1ml en 3 tubos correspondiente de la muestra que se obtuvo.
4. Se incuban los tubos a 35° C. durante 48 horas.

RESULTADOS
1. Al final se examinan los tubos con el fin de observar si hay gas en las campanas invertidas o
desprendimiento de burbujas en el medio enturbiado.
2. El número de coliformes por gramo se puede determinar contando el número de colonias de las placas de
agar biliado rojo violeta que han resultado positivas en caldo verde brillante lactosa bilis.

CUESTIONARIO
1.- ¿Cuál es el parámetro que nos indica que la prueba es positiva?
2.- ¿Qué nombre recibe el gas que desprenden los microorganismos en esta prueba?
3.- ¿Cuál es la reacción que lleva a cabo el microorganismo con el medio de cultivo?.
4.- ¿Qué microorganismo es el que principalmente se busca en la prueba confirmativa?

7
REFERENCIAS
Pelczar J. M. y Chan E. C. S. “Elementos de Microbiología”. Editorial Mc. Graw Hill. México, 1998.

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MANUAL No. 3

DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES EN ALIMENTOS

(PRUEBA CONFIRMATIVA)

OBJETIVO
Determinar bacterias coliformes en alimentos que puedan ocasionar daños a la salud.

INTRODUCCION
La interpretación del hallazgo y abundancia de los organismos coliformes no tiene un carácter universal. En
tanto que en el agua, en términos generales, se considera que su presencia revela una exposición reciente a la
contaminación fecal, su significado no es el mismo en el caso de la leche, substrato en el cual son capaces de
desarrollar muy activamente.
8
MARCO TEORICO
Escherichia coli es una habitante normal del tracto intestinal de las personas y otros animales de sangre
caliente. Normalmente no es patógeno. Otro miembro del grupo coliforme es Klebsiella pneumoniae, que esta
amplia mente distribuido por la naturaleza. Se encuentran en el suelo, en el agua, en los cereales y también en
el tracto intestinal de las personas y de otros animales.
Enterobacter aerogenes, es una bacteria coliforme que se encuentra en el tracto intestinal de las personas y
otros animales. Se encuentra también en el suelo, en el agua y en productos lácteos. Los coliformes, como
grupo, se caracterizan por ser bacterias de forma bacilar, aerobias o anaerobias facultativas que no esporulan,
son Gram negativas y fermentan la lactosa con producción de ácido y gas al cabo de 48 horas a 35 grados
centígrados.
Los coliformes poseen varias características en comun con miembros de los géneros Salmonella y Shigella, dos
géneros que tienen especies patógenas entericas. Sin embargo, una importante diferencia bioquímica que los
distingue es que los coliformes fermentan la lactosa con producción de ácido y gas, y Salmonella y Shigella no
fermentan la lactosa. Como luego veremos, la fermentación de la lactosa es la reacción clave en el
procedimiento de laboratorio que se sigue para determinar la potabilidad del agua.

Investigacion y recuento en medio liquido de coliformes totales.

El grupo coliforme pertenece a la familia Enterobacteriaceae e incluye varios géneros Escherichia, Citrobacter,
Enterobacter y Kleibsiella. Se encuentra en el intestino del hombre y los animales pero también en otros
ambientes como suelo, plantas, etc. Por lo que como indicadores de contaminación fecal no presentan buena
especificidad. In embargo, su frecuencia en las heces, su fácil detección y la posibilidad de que junto a ellos
existan microorganismos patógenos hace que se empleen como principales microorganismos indicadores de
contaminación fecal. Se realiza esta determinación por la técnica de Numero Mas Probable NMP. El medio
que se utilizara será un caldo lactosado con púrpura de bromocresol para aprovechar la capacidad de estos
microorganismos de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas.
Todos los tubos se preparan con 10 mL de dicho medio de la siguiente forma: 3 tubos a doble concentración del
medio base y del azúcar X2 y 6 tubos a concentración sencilla X1.
a) Añadir con pipetas estériles:
 10 mL de la muestra inicial a tres tubos X2.
 1 mL de la muestra inicial a tres tubos X1.
 0.1 mL de la muestra inicial a tres tubos X1.
 NOTA: si la muestra problema se sospecha altamente contaminada, se debe realizar esta
técnica procediendo de la misma forma pero a partir de diluciones de la muestra inicial.
b) Incubar los tubos a 37 grados centígrados durante 24 horas. Se consideran positivos los tubos
que traza la incubación producen gas se debe observar al menos un 10 del volumen de la campana
Durham con gas y un viraje en el color del caldo, la producción de ácido se visualiza al virar el medio de
púrpura a amarillo.
c) Determinar el NMP de coliformes totales100 mL de agua a partir de los tubos positivos, como
se muestra en la siguiente tabla Pelczar, 1998.

9
MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.
10 cajas Petri Medios de cultivo:
1 Pipetas graduadas de 10 ml. Agar Eosina Azul de Metileno
1 Pipetas graduadas de 1 ml. Agar verde brillante
1 probeta de 100 ml
2 Matraz Erlenmeyer 250 ml.
1 Espátula, vidrio de reloj
Guantes de asbesto
1 mechero bunsen, Piceta agua/alcohol, asa
bacteriológica, 1 mechero Fisher, 1 tela de
asbesto, Tripie y olla exprés.

METODOLOGÍA
1) Preparar 230 ml. de medio de cultivo y esterilizarlo, después de esterilizarlo se debe mantener en baño de
agua caliente a 44-46ºC, si no se hace así podría estar demasiado frío y solidificarse en el momento de
añadirse sobre las placas, o demasiado caliente y destruir algunas bacterias termolábiles.
2) En el caso de que el alimento sea liquido se pueden tomar 10 ml. de muestra en 90 ml. de diluyente que es
equivalente a 1 ml. de muestra en 9 ml. de diluyente, y así se obtiene la primera dilución 10 -1. a partir de
este punto se debe trabajar utilizando el mechero para evitar contaminar la muestra, el diluyente y el medio
de cultivo.
3) Después de mezclar cuidadosamente la suspensión bacteriana con el medio, se deja que el agar
solidifique. Mas tarde las placas se invierten para evitar la condensación de la humedad en la superficie del
agar durante la incubación.
4) Una vez solidificado el medio de cultivo se incuban a temperaturas de 37ºC durante 24 horas.
RESULTADOS
1. Los recuentos se deben efectuar únicamente en las placas que contengan entre 30 y 300 colonias.
2. El cálculo del número total de microorganismos se obtiene multiplicando el número de bacterias obtenidas
en una dilución determinada y multiplicarla por el inverso de la dilución.
Ejemplo:
No. De colonias: 58 Dilución: 10-3
UFC/Gr. ó ml. = (58)(103)= 58,000 UFC/Gr. ó ml

CUESTIONARIO
1.- Mencione los principales grupos coliformes que hay en alimentos.
2.- ¿Cuál es el principal indicador de contaminación por coliformes fecales en alimentos?
3.- Mencione los factores de desarrollo de los grupos coliformes en alimentos.
4.- Mencione algún sistema para inhibir el crecimiento de coliformes.
5.- Mencione en que se basa el cálculo de microorganismos por l técnica de número más probable.
6.- Enumere dos posibles vías de contaminación por coliformes en un alimento.

10
REFERENCIAS
Pelczar J. M. y Chan E. C. S. “Elementos de Microbiología”. Editorial Mc. Graw Hill. México, 1998.

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MANUAL No. 4
RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS
OBJETIVO

Desarrollar el método microbiológico para determinar el número de hongos y levaduras en alimentos según la
Norma Oficial Mexicana.

INTRODUCCIÓN

Se entiende por recuento total de mohos y levaduras revivificables, el número de colonias que se desarrollan a
partir de 1 gramo o 1 ml. de alimento sobre el medio Sabouraud - Dextrosa - Agar durante 3 a 5 días a la
temperatura de 25 - 28°C.

MARCO TEORICO

En muchos estudios microbiológicos es importante reconocer con exactitud el número de microorganismos

presentes en una muestra. Así, en el campo de la alimentación y la higiene es esencial conocer la carga
microbiana de aguas, alimentos, superficies de trabajo, etc.; para determinar la repercusión sanitaria o la

11
calidad de los productos analizados. También en muestras clínicas como la origina el recuento es de gran
interés con visitas al diagnóstico y tratamiento.

Para estos propósitos existen diversos métodos.

Los hay directos, como el recuento por observación al microscopio en placa, de hemocitometro, e indirectos,
que son los más utilizados, como la medida de la turbidez o el recuento de células viables por diluciones
sucesivas Pelczar, 1998.

MATERIALES , REACTIVOS Y EQUIPOS

MATERIALES Y EQUIPOS REACTIVOS

1 Espátula, probeta de 100 ml Medios de cultivo:
Probetas de 100 ml. Agar de papa y dextrosa
5 Pipetas de 1 ml. Caldo peptonado
1 pipetas de 10 ml con graduación de 0.1 ml
1 Asa bacteriológica Traer por equipo
1 Mechero bunsen Algodón, gasa papel, estraza, masKing tape,
2 Matraces Erlenmeyer de 250 ml. cerillo, franela.
10 Cajas de Petri de vidrio de 100 x 15 mm.
1 Vasos de precipitados de 100 ml. Muestra de alimento: pan, tortilla, cereal o
2 Piceta (agua y alcohol) cacahuates diferente producto por equipo
1 Vidrio de reloj
1 par de guantes de asbesto
1 gradilla

METODOLOGÍA

Preparación de la muestra.

Pesar 10 gr. del alimento en condiciones asépticas, transferir a un frasco de dilución con 90 ml, de solución de
peptonada y agitar vigorosamente para homogeneizar la muestra. (En su caso licuarla por 1 min.).Con las
muestras liquidas tomar 10 ml y realizar la misma operación.
Esta primera dilución corresponderá a 10 1, y a partir de ella se harán tantas diluciones decimales como sea
necesario (10 -2, 10-3, 10-4, etc.).

De la dilución 10-1 se toma 1 ml. Y lo paso a un tubo de con tapón de rosca, el cual contiene 9 ml. De diluyente,
este tubo va ser la dilución 10-2; y así sucesivamente hasta llegar a la dilución 10-4.

Sembrar por estría cruzada una placa de Agar Dextrosa-Sabouraud o una de Agar de Papa y Dextrosa con 0.1
ml. de cada dilución preparada e incubar a 25 - 30 C por 2 – 5 días.

RESULTADOS

Sacar las cajas de incubación y contar las colonias características de mohos y levaduras, reportando él número
de colonias multiplicado por el factor de dilución, nos dará el recuento de mohos y levaduras por gramo de
alimento.

CUESTIONARIO

1.- Mencione las características generales de los mohos y levaduras.

2.- Qué características tiene el medio de cultivo para que se desarrollen los hongos y levaduras.
3.- ¿Cómo influyen los hongos y levaduras en alimentos?
4.- Menciona cinco hongos que tienen utilidad industrial.

REFERENCIAS

Pelczar J. M. y Chan E. C. S. 1998 “Elementos de Microbiología”. Editorial Mc. Graw Hill. México.

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MANUAL No. 5
RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS
OBJETIVO
Determinación de microorganismos enterobacter en alimentos.
INTRODUCCIÓN
Al investigar la presencia de entero bacterias en un alimento se hace, no sólo sobre los gérmenes Gram
negativos fermentadores de la lactosa (coliformes), sino también sobre la lactosa negativa; tan importante como
los Salmonella, Shigella y otros.

La familia Enterobacteriaceae está integrada por bacilos Gram negativos, generalmente móviles por flagelos
perítricos, a veces inmóviles (Shigella), que fermentan la glucosa con producción frecuente de gas, aunque
otras veces no y reducen los nitratos a nitritos.

El recuento total de enterobacterias consiste en la determinación del número de enterobacterias por gramo o
mililitro de alimento.

MARCO TEORICO
13
Los organismos entéricos son un grupo de bacilos Gram negativos que, no esporulados cuyo habitad es el
intestino del hombre y de los animales. Algunos (por ejemplo Escherichia coli) forman parte de la flora normal y
del intestino, otros (por ejemplo las Salmonellas y las Shigellas) son generalmente patógenos para el hombre.
Las bacterias intestinales son aerobias, fermentan una gran variedad de carbohidratos y poseen una estructura
antigénica muy compleja. La mayoría de las bacterias Gram negativas poseen lipo-polisacaridos complejos en
su pared celular. Estas substancias, endotoxinas, tienen una variedad de efectos fisiopatológicos. Las
endotoxinas de las bacterias Gram negativas son lipo-polisacaridos complejos y derivados de la membrana de
la célula bacteriana y muchas veces liberadas por la lisis de la bacteria.

Después de su introducción en el cuerpo de los mamíferos, las endotoxinas son eliminadas principalmente por
las células del sistema retículo endotelial después de la adsorción transitoria inicial en los leucocitos de la
circulación.

Las bacterias coliformes son un grupo grande y heterogéneo de bacilos Gram negativos que en cierta forma son
similares a la Escherichia coli. La complejidad del grupo, las variaciones en los resultados de las pruebas
bioquímicas y las relaciones ecológicas cambiantes han conducido a una profusión confusa de nombres. Junto
a E. coli habitante del intestino, los siguientes grupos se incluyen frecuentemente entre los coliformes:
1. El grupo Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-Serratia: Klebsiella pneumoniae típica: inicialmente
conocida como un microorganismo patógeno del aparato respiratorio, es en el momento actual un
microorganismo patógeno muy común. Se caracteriza por un crecimiento mucoide, grandes cápsulas
de polisacáridos y ausencia de motilidad. Enterobacter aerogenes es a menudo móvil, su crecimiento es
mucho menos mucoide, sus cápsulas son pequeñas y puede encontrarse tanto como un
microorganismo de vida libre, como en el intestino (el Enterobacter antes se denominaba Aerogenes).
Las bacterias pertenecientes a esta familia son bacilos Gram negativos que se caracterizan por ser
citocromos C oxidasa negativos, fermentadores de la glucosa y reducir los nitratos a nitritos. Se aíslan
del intestino del hombre y de los animales, aunque se pueden encontrar en diferentes ambientes. Su
presencia en los alimentos en niveles altos hace pensar en una elaboración inadecuada y o
contaminación posterior. Dentro de la familia Enterobacteriaceae se incluyen bacterias patógenas
Salmonella, Yersinia y Shigella que se identifican por métodos específicos.
2. El grupo Arizona-Edwardsiella-Citrobacter: estos organismos fermentan la lactosa muy lentamente,
cuando llegan a fermentarla. Se parecen a las Salmonellas tanto en sus características bioquímicas
como ocasionalmente en su patogenicidad para el hombre.
3. El grupo de organismos Providence: que antiguamente se incluía con las bacterias del grupo 2,
bioquímicamente se encuentran relacionadas con los Proteus, desaminan los aminoácidos (Jawetz y
col, 1989).
MATERIAL Y REACTIVOS:

5 Pipetas estériles de 1 ml Medio de cultivo:

2 pipetas graduadas de 10ml Agar entérico de hektoen
10 Placas Petri estériles Caldo peptonado
5 tubos de ensaye, gradilla
1 Probeta graduada de 100 ml Suspensión de ampicilina, terramicina, penicilina,
2 matraces Erlenmeyer de 250 ml amikacina, cefalosporinas. Por equipo
1 matraz Erlenmeyer de 500 ml
2 Vidrio de reloj, espátula Muestra de alimento: cualquier platillo preparado
2 asa bacteriológica
Mechero bunsen y tela de asbesto
Guantes de asbesto, Papel filtro

METODOLOGIA

1. Se realiza a partir de las diluciones decimales. La prueba se hace por duplicado.

2. Se mezclan, en placas Petri estériles, 1 ml de cada una de las diluciones decimales con, aproximadamente,
15 ml del medio (AEHK) previamente fundido y enfriado a 50°C. Una vez que ha solidificado el medio, se
recubre Con unos 5 ml del mismo medio, pero no sembrado.
3. Dejar solidificar y llevar a incubar a 37°C durante 16 y 18 horas.

RESULTADO

14
Se cuentan las colonias violeta rodeadas de un precipitado rojo - violeta. Se contarán las placas que contengan
entre 30 a 150 colonias. El número contado se multiplica por el factor de dilución, lo que proporciona el número
de enterobacterias revivificables por gramo.

CUESTIONARIO

1.- Investiga los factores de crecimiento de los microorganismos enterobacter.

2.- Investiga los medios de contaminación de enterobacter en los alimentos.
3.- ¿Cuál es la temperatura optima de desarrollo de estos microorganismos?
4.- Menciona los sitios en donde podemos encontrar las bacterias Enterobacter.
5.- ¿Cómo se diferencia el grupo Enterobacter del Coliformes?
REFERENCIAS
Jawetz E., Melnick L. J., Edward A. A. “Manual de Microbiología medica”. Editorial El Manual Moderno. Quinta edición. México 1989.

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MANUAL No. 6

IDENTIFICACIÓN Y RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

OBJETIVO
Determinar y cuantificar grupos de microorganismos staphylococcus aureus patógenos para el hombre, en
muestras de alimentos con los métodos de cultivo más comunes.
INTRODUCCIÓN
Staphylococcus aureus es una especie microbiana perteneciente a la familia Micrococcanae y al género
Staphylococcus, integrada por gérmenes en forma de cocos, agrupados generalmente en racimos, inmóviles,
gran positivos, aerobios y anaerobios facultativos con temperatura óptima de crecimiento a 37°C. Posee unas
enzimas que le diferencian de otros Staphylococcus: coagulasa, fosfatasa y desosiribonucleasa. Producen
toxinas: hemolisina y enterotoxina.

MARCO TEORICO
Un envenenamiento alimentario comun se produce al ingerir una toxina producida por Staphylococcus aureus
toxigénicas que crecen sobre alimentos contaminados. Los estafilococos son organismos que se encuentran
normalmente en varias partes del cuerpo humano, incluida la nariz, garganta y piel, y por ello pueden llegar
fácilmente a los alimentos. Pueden proceder de los que manejan los alimentos que sean portadores o que
tienen infecciones piógenas. Este es el tipo mas comun de envenenamiento alimentario, afortunadamente la
enfermedad es de corta duración 24-48 horas; la recuperación total tiene lugar en casi todos los casos. En
niños muy pequeños y en personas debilitadas puede producirse un shock y la muerte, aunque raramente, a

15
causa de deshidratación. Usualmente no se reconoce como envenenamiento alimentario estafilococico a menos
que haya muchas personas afectadas al mismo tiempo.

Los síntomas se presentan poco después de la ingestión del alimento contaminado. La cantidad de enterotoxina
consumida determina el tiempo de aparición de los síntomas asi como la gravedad. Generalmente entre 2 y 6
horas después de la ingestión aparecen síntomas como nauseas, dolor de cabeza, vómitos y diarreas.

Solo ciertas cepas de S. aureus producen la enterotoxina. La mayoría de estas cepas son coagulasa-positiva,
es decir que tienen la capacidad de coagular el plasma de la sangre citratada o con oxalato. Existen al menos
cinco tipos de enterotoxina antigénicamente distintos, designados como A, B, C, D y E. Los tipos A y B son los
más comunes.

La enterotoxina es termoestable, no se afecta al hervir durante 30 minutos. Ocho a diez horas de exposición del
alimento contaminado la temperatura ambiente son suficientes para que se produzca una cantidad adecuada de
toxina como para producir una intoxicación alimentaría. Ni siquiera una subsecuente refrigeración de este
alimento durante muchos meses destruirá la toxina. El volver a cocer estos alimentos tampoco destruirá su
contenido de toxina.

No hay antibióticos indicados para el tratamiento de la intoxicación alimentaria estafilocócica. En casos con
severa deshidratación, sin embargo se recomienda la administracion de líquidos intravenosos.

En el laboratorio se puede confirmar el diagnostico examinando al microscopio un frotis del alimento

sospechoso, con el fin de ver la presencia de abundantes cocos Gram-positivos. También puede cultivarse el
alimento para tener estafilococos hemolíticos coagulasa-positivos a partir de los cultivos y luego dar filtrados de
los mismos a varios voluntarios o animales de experimentación. Los métodos recientes para ensayar la
presencia de enterotoxina se basan en reacciones serológicas, tales como las técnicas de difusión en gel y de
anticuerpos fluorescentes.

Las personas son la fuente mas importante de contaminación de estafilococos que producen enterotoxina. En
los brotes de intoxicación alimentaría por estafilococos, suele ser posible mostrar que la cepa de estafilococo
que esta en el alimento contaminado y la que esta en las manos de la persona que la maneja, son la misma.

Los alimentos que permiten un buen crecimiento de estafilococos son los responsables de la enfermedad. Los
mas comúnmente asociados a la enfermedad son los pasteles o dulces rellenos de crema, carnes elaboradas
tales como el jamón York y las ensaladas de patatas. Desgraciadamente los alimentos con suficiente toxina
para causar la enfermedad, usualmente tienen aspecto, olor y sabor normal.

La mejor medida preventiva es la refrigeración por debajo de 6 a 7 grados centígrados de todos los alimentos
perecederos. Los que manipulan alimentos no deberán tener lesiones piógenas en la piel, ni ser portadores de
estafilococos toxigénicos. Los alimentos recalentados no deberían dejarse durante varias horas antes de ser
servidos. La mayoría de las intoxicaciones alimentarías son una consecuencia del mal manejo de los alimentos
en establecimientos y en casa Pelczar, 1998.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS

5 Pipetas estériles de 1 ml Reactivos:
2 Pipetas graduadas de 10 ml Ácido clorhídrico 1 N
2 matraces Erlenmeyer de 250 ml Medios de cultivo:
Asas bacteriológicas estériles Agar Estafilococos
10 Placas Petri Caldo peptonado
5 Tubos de ensayo Muestra: cualquier alimentos guisado 25 gr.
2 vidrios de reloj, espátulas. Agitador de vidrio
Gradilla, 1 mechero bunsen
1 Probeta graduada de 100 ml
Guantes de asbesto

16
Piceta de agua, Piceta de alcohol.
METODOLOGIA
1. Preparar un homogeneizado del alimento y diluciones decimales siguiendo la misma técnica que para el
recuento total estándar.
2. Pipetear 0.1 ml de cada dilución, por duplicado, en placas Petri con medio de Baird Parker solidificado.
Distribuir el inoculo uniformemente con un asa de vidrio.
3. Incubar a 37°C durante 24 – 48 Horas

RESULTADOS
Las colonias de estafilococos aparecen negras, brillantes, con bordes reducidos blancos y rodeados de zonas
claras que contrastan con el medio opaco. Se cuenta el número de colonias que tienen estas características y
se multiplica por el factor de dilución.
A continuación se procede a identificar las colonias sospechosas de Staphylococus aureus, investigando la
presencia de las enzimas.
Prueba de la Dnasa:
A partir de una colonia típica, sembrar sobre una placa de Dnasa Test Agar bien seco, practicando solo tres
estrías separadas. Incubar a 37°C 18 – 24 horas. Cubrir las placas con HCl 1N y observar el aclaramiento del
medio alrededor de las áreas de crecimiento, en cuyo caso es Dnasa positivo.
Prueba de la coagulasa:
A partir de las colonias negras crecidas en agar Baird-Parker, sembrar en medio de infusión cerebro-corazón
(Brain Heart Infusión) e incubar 24 horas a 37°C.
Del crecimiento resultante pasar 2 ó 3 gotas a un tubo de hemolisis que contenga 0.5 ml de plasma de conejo.
Incubar a 37°C y observar periódicamente para comprobar si ha coagulado. Normalmente la coagulación tiene
lugar antes de las 4 horas, en cuyo caso se demuestra la producción de coagulasa por el microorganismo.

CUESTIONARIO

1. Investigar las características de crecimientos de los staphylococcus y estreptococos.

2. ¿Cuál es la finalidad y reacción que se lleva a cabo en el medio de plasma de conejo?.
3. ¿Cuál es la reacción que se lleva a cabo en el medio de Dnasa Test agar y HCl 1 N., con el
microorganismo?
4. ¿Cómo se transmite la enfermedad producida por la toxina de estafilococos?
5. Menciona tres alimentos involucrados en el contagio de enterotoxinas de estafilococos.

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MANUAL No. 7

IDENTIFICACIÓN Y RECUENTO DE BACILLUS CEREUS

OBJETIVO

Identificara los microorganismos Bacillus cereus en alimentos.

INTRODUCCIÓN

Este microorganismo saprófito, considerado como no patógeno por vía oral, produce toxiinfecciones
alimentarias cuando tiene la oportunidad de desarrollarse en los alimentos en número igual o superior a 10 6
colonias por gramo. Sus esporas resisten a la acción del calor por lo que de esta forma pueden sobrevivir en
productos alimenticios que han sido sometidos a calentamiento.

Es un bacilo, móvil por flagelos perítricos, esporulado, con esporas termodúricas, es decir, que resisten a la
pasteurización e incluso a tratamientos más fuertes. Elabora una fuerte lecitinasa.

MARCO TEORICO
Es una causa de enfermedad transmitida por los alimentos que se reconoce con poca frecuencia. Tiene una
morfología celular similar a la del B. anthracis pero a diferencia de éste en general es móvil y no es susceptible
a la penicilina o al gama-fago. (1)

18
La intoxicación alimentaria por B. cereus puede causar dos síndromes clínicos:

1. tiene un periodo de incubación breve de cuatro horas. Se caracteriza por náuseas y vómitos severos y
con frecuencia se confunde con la intoxicación alimentaria estafilocócica.

2. tiene un periodo de incubación más prolongado (17 hrs) y se caracteriza por cólicos abdominales y
diarrea. Habitualmente se confunde con la intoxicación alimentaria por clostridios. (1)

Generalidades

Bacillus cereus causa intoxicaciones alimentarias a través de la ingesta de alimentos contaminados. En general
se admite que, debido a la levedad del cuadro y a que la detección microbiológica de esta bacteria no se realiza
rutinariamente en pacientes diarreicos, la incidencia real puede ser superior a la estimada.

La bacteria elabora dos tipos distintos de toxinas relacionadas con dos síndromes clínicos diferenciados:
síndrome emético y síndrome diarreico.
Diagnóstico microbiológico

En medios no selectivos de uso generalizado como agar sangre esta bacteria origina grandes colonias beta
hemolíticas planas con apariencia de vidrio esmerilado. Sin embargo, en los casos de toxi-infección alimentaria
la presencia de flora potimicrobiana en las muestras (heces, vómitos, alimentos) hace aconsejable el empleo de
medios selectivos diferenciales como manitol-polimixina-yema de huevo, medio de Kim-Goepfert o manitol-
polimixina-piruvato-yema de huevo con azul de bromotimol o púrpura de bromocresol. En estos medios
polimixina B actúa como agente selectivo. El carácter diferencial viene mediado por la actividad lecitinasa de
Bacillus cereus sobre la yema de huevo y su incapacidad para catabolizar el manitol. Los medios se incuban
37ºC durante 48 horas. En ocasiones puede ser conveniente emplear un medio previo de enriquecimiento como
caldo de soja tripticasa con polimixina.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS

5 Pipetas estériles de 1 ml; 1 de 10 ml Medios de cultivo:
1 Asa bacteriológica
10 Cajas Petri estériles Agar sal y manitol
3 matraces Erlenmeyer de 250 ml Indicador Rojo metilo
1 Mechero Caldo peptonado
1 Espátula 1 yema de huevo
1 Gradilla
5 Tubo de ensaye Muestra: cualquier alimento a base de trigo,
1 Vidrio de reloj maíz o arroz
1 probeta graduada 100 ml
Par de guantes de asbesto, Piceta agua y
alcohol

METODOLOGIA

1. Por duplicado y a partir de las diluciones decimales del alimento, se deposita 0.1ml de cada dilución sobre
la superficie bien seca del medio de agar manitol
2. Se extiende el inóculo por toda la superficie con varilla de vidrio estéril y se incuban las placas a 30°C
durante 24-48 horas.
3. Al cabo de este tiempo se hace la lectura.

RESULTADOS

Los B. Cereus dan colonias rosas rodeadas de una zona de opacidad de la yema de huevo debida a la
lecitinasa. Las colonias son planas con tendencia a invadir, de contornos irregulares, con aspecto seco y
rugoso.

El medio de Mossel contiene manitol. Los microorganismos manitol positivos hacen virar el rojo fenol a amarillo.
El B. Cereus es manitol negativo, por lo que no hace virar el indicador. La polimixina ni inhibe el crecimiento del
B. Cereus pero si el de la flora secundaria. La lecitina de la yema de huevo, al crecer el B. Cereus, se precipita
por acción de la lecitinasa de este microorganismo.
19
La confirmación bioquímica se hace sembrando las colonias sospechosas en el medio para la reacción de la
gelatinasa y en el agua de peptona para rojo metilo. Se incuban los cultivos 2-3 días a 30°C.

RECUENTO:
El B. Cereus es: Rojo metilo +
Gelatina +
Lecitinasa ++
El recuento de B. Cereus se hace contando las colonias típicas sobre el medio de Mossel y multiplicando el
número por el factor de dilución para referir el resultado a un gramo de producto.
CUESTIONARIO
1.- ¿Cómo se desarrolla e influye el B. Cereus en los alimentos?
2.- ¿Cuáles son los factores de crecimiento de estos microorganismos?
3.- ¿Cuál es la sustancia que produce este microorganismo?
REFERENCIAS
Harrigan, W.F., Mc Cance, M.E. 1968. Métodos de Laboratorio en Microbiología. Editorial Academia. León.

Tanner, F.W. 1950 Laboratory manual and workbook in microbiology of foods. The Garrad Press. Champaign, Illinois

Sistema API. Identificación de Enterobacteriáceas.

James M. Jay. “Microbiología Moderna de los Alimentos”. Tercera edición. Ed. Acriba S. A. Zaragoza España.

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MANUAL No. 8

IDENTIFICACIÓN Y RECUENTO DE STREPTOCOCCUS DEL GRUPO DE LANCEFIELD

OBJETIVO
Determinar y cuantificar grupos de microorganismos streptococcus en muestras de alimentos con los métodos
de cultivo más comunes.

INTRODUCCIÓN
El grupo serológico D de Lancefield comprende las especies Streptococcus faecalis, Streptococcus faeciun y
Streptococcus durans, que se designan bajo la denominación de estreptococos fecales o enterococos ya que se
encuentran habitualmente en el intestino del hombre y de los animales. Son cocos gran positivos, agrupados en
cadenas aerobios facultativos con temperatura óptima de crecimiento a 37°C.

MARCO TEORICO
Los estreptococos son microorganismos esféricos, con una disposición característica en forma de cadenas y
ampliamente distribuidos en la naturaleza. Algunos son miembros de la flora normal del hombre, en tanto que
otros están asociados a importantes enfermedades humanas atribuibles en parte a la infección por los
estreptococos y en parte a la sensibilización hacia ellos. Producen una gran variedad de substancias y enzimas
extracelulares, su capacidad para efectuar diferentes grados de hemólisis constituye la base de un importante
método para su clasificación.

Los cocos individuales son esféricos u ovoides y se disponen en cadenas, los cocos se dividen en un plano
perpendicular al eje mayor de la cadena. Los miembros de la cadena a menudo presentan una notable
apariencia de diplococos y ocasionalmente se observan individuos cuya longitud los hace semejantes a los
20
bacilos cortos. La longitud de las cadenas varía mucho y está condicionada principalmente por factores
ambientales. Algunos estreptococos elaboran como sustancia capsular un polisacárido parecido al que se
encuentra en los neumococos, por otra parte la mayoría de las cepas de los grupos A y C poseen cápsulas
compuestas de ácido hialuronico. Estas estructuras son más fácilmente apreciables en cultivos muy jóvenes.
Impiden la fagocitosis. La pared celular del estreptococo contiene proteínas (antigenos M, T, R), carbohidratos y
mucopeptidos.

La mayoría de los estreptococos crecen en medios sólidos formando colonias discoidales generalmente de 1 a
2 milímetros de diámetro. Las cepas capsuladas del grupo A frecuentemente dan lugar a colonias mucoides. La
energía es obtenida fundamentalmente de la utilizacion de azucares. El crecimiento de los estreptococos tiende
a ser pobre tanto en medios sólidos como en caldo, a menos que se les enriquezca con sangre o líquidos
tubulares diversos. El requerimiento nutricional varia ampliamente para las distintas especies, en este sentido
las especies patógenas para el hombre son más estrictas, ya que requieren la presencia de diversos factores de
crecimiento. El crecimiento y la hemólisis se incrementan por el suministro de CO 2 al 10%.

Mientras la mayoría de los estreptococos hemolíticos patógenos crecen mejor a 37 C, los enterococos del
grupo D crecen bien a temperaturas comprendidas entre los 15 y 45 C. Los enterococos son capaces de crecer
también en presencia de altas concentraciones 6.5% de cloruro de sodio, asi como en medios que contengan
0.1% de azul de metileno. La mayoría de los estreptococos son anaerobios facultativos.

El agrupamiento de los estreptococos en categorías fundamentales se puede basar en su acción sobre los
eritrocitos, resistencia a los factores físicos y químicos y reacciones bioquímicas. Las características
individuales de cada especie de estreptococo tienen valor muy limitado en tanto que al considerar a todos los
estreptococos como un grupo permite su separación en cuatro grupos:

1. Estreptococo hemolítico: elaboran hemolisinas solubles que dan por resultado hemólisis de tipo beta
en gelosa sangre.
2. Estreptococos viridans: no producen hemolisinas solubles ni hemólisis beta en gelosa sangre.
3. Enterococos (Streptococos faecalis): producen carbohidratos C grupo D-especifico y son capaces de
crecer tanto a 10 C como a 45 C así como en leche con 0.1% de azul de metileno, en gelosa con 40%
de bilis o en presencia de NaCl a una concentración de 6.5%. Son muy resistentes, la penicilina a
menudo inhibe su crecimiento pero no los mata.
4. Estreptococos lácticos: su actividad hemolítica es variable, crecen en gelosa con 40% de bilis pero no
a 45 C o en presencia de 6.5 % de NaCl (Jawetz y col, 1989).

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS

5 Pipetas estériles de 1 ml Medios de cultivo:
2 matraces Erlenmeyer de 250 ml Agar KF para estreptococos
Asas bacteriológicas Caldo peptonado
10 cajas Petri estériles
1 bureta graduada de 10 ml Muestra: cualquier alimento a base de carne
Mechero, gradilla, guantes de asbesto
5 tubos de ensaye
2 pipetas de 10 ml
Vidrio de reloj, espátula
Piceta agua, Piceta alcohol
Agitador magnético y parilla electromagnética

METODOLOGIA
1. A partir de una serie de diluciones decimales y por duplicado, se depositan 0.1 ml de cada una de las
diluciones sobre la superficie de los agares bien seco.
2. Se distribuye con asa de vidrio estéril.
3. Se incuban a 37°C durante 48 horas.

RESULTADOS

21
Se cuentan las colonias típicas que aparecerán en rosa o rojo marrón. El número de colonias se multiplica por el
factor de dilución y se refiere el resultado a un gramo de producto, teniendo en cuenta que se ha partido de 0.1
mililitro.
El medio de Slanetz y Batley es selectivo para los enterococos. Es rico en sustancias nutritivas, lo que garantiza
un buen crecimiento. La flora secundaria queda inhibida por la azida sódica. Las colonias de estreptococos D de
Lancefield reducen el cloruro 2, 3, 5 trifeniltetrazolio y lo transforma en formazona roja.
Para confirmar que las colonias obtenidas son de enterococos, se siembran en los siguientes medios:
Agar o caldo triptosa (incubación a 45°C)
Caldo triptosa bilis 40% (incubación a 37°C)
Caldo triptosa sal (incubación a 37°C)
Caldo con pH 9.6 (incubación a 37°C)
Si aparece crecimiento en todos ellos, se confirma que se trata de enterococos.
Clasificación bioquímica de los Streptococcus (Sherman)
Cultivo a 45°C Cultivo en caldo Cultivo en caldo Cultivo a pH 9.6
hipersalino biliado
Streptococcus Pyogenes - - - -
Streptococcus lácticos + - - -
Enterococos (St. Fecales) + + + +

CUESTIONARIO.

1.- Investiga las características de crecimientos de streptococcus.

2.- ¿Cuál es la concentración de NaCl en la que los streptococcus se desarrollan?.
3.-¿Qué tipo de proteína elabora los microorganismos del tipo streptococcus?.
4.-¿Qué característica presentan las colonias de streptococos?.
5.- Describe la morfología de los estreptococos.

REFERENCIAS
Pelczar J. M. y Chan E. C. S. “Elementos de Microbiología”. Editoral Mc. Graw Hill. México, 1998.
López B. M. “Procedimientos en Microbiología Clínica”. España 1994.

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MANUAL No. 9
IDENTIFICACIÓN Y RECUENTO DE SALMONELLAS
OBJETIVO
Identificara y determinará la cantidad de salmonella contenido en un alimento
INTRODUCCIÓN
En los alimentos, las Salmonellas, como consecuencia de la naturaleza de la contaminación se ven
acompañadas de gran cantidad de enterobacterias muy similares. De aquí la necesidad de su enriquecimiento.
Como a pesar de su enriquecimiento suele ser difícil demostrar su existencia, éste debe hacerse en varios
medios selectivos, ya que parece ser que cada uno de estos medios puede frenar e inhibir el desarrollo de
ciertas cepas de Salmonella.
MARCO TEORICO
Generalidades
Las salmonellas son bacilos Gram negativos, oxidasa negativos, anaerobios facultativos, ampliamente
distribuidos en diferentes ambientes. Producen principalmente cuadros gastrointestinales, fundamentalmente
asociados a intoxicaciones alimentarías con una alta incidencia en los países desarrollados. También gérmenes
pertenecientes a la misma especie son los causantes de las fiebres tifoideas y paratifoideas (Salmonella typhi y
Salmonella paratyphi A, B y C).
En España, durante el período 1990-1992, el 84% de las toxi-infecciones alimentarías fueron debidas a alguno
de los serotipos de Salmonella sp de la subespecie I. La incidencia de la fiebre tifoidea ha disminuido de una
forma considerable en los últimos años, hasta una tasa por 100.000 habitantes de 1,8 en 1993.
La dosis infectante de las salmonellas oscila entre 105 y 109 UFC/ml, aunque se han descrito casos de
infecciones por concentraciones de 10². Las salmonellas son consideradas bacterias invasivas, pero solamente

22
superan las barreras mucosa y linfótica, invadiendo el torrente sanguíneo, las productoras de fiebre tifoidea y
excepcionalmente algún otro serotipo.
Diagnóstico microbiológico
Las salmonellas productoras de gastroenteritis se aíslan de las heces mediante coprocultivo. El análisis
microscópico de las heces en el caso de las salmonelosis no suele ser de utilidad, porque aunque pueden
aparecer heces sanguinolentas y existir leucocitos, estos también se presentan en otras diarreas invasivas.
El coprocultivo debe realizarse a partir de heces recién tomadas o en su defecto mantenidas refrigeradas en
medio de transporte (Cary-Blair).
La utilización de un medio líquido de enriquecimiento (caldo de F-selenito o caldo de tetrationato) es
fundamental cuando se trata de estudiar portadores sintomáticos, ya que en estos casos suele eliminarse sólo
una baja concentración de salmonellas en heces. Sin embargo, también es recomendable utilizar medios de
enriquecimiento en cuadros de gastroenteritis agudas con objeto de inhibir la flora fecal competitiva, aunque el
elevado número de salmonellas presente en las heces en estos casos no los hace indispensables.
El coprocultivo se realiza mediante la preparación de una emulsión de uno o dos gramos de heces en solución
salina fisiológica, a partir de la cual se inocula un tubo de un medio liquido de enriquecimiento y tres medios
sólidos distintos: un medio general (agar sangre o agar de soja y triptona), un medio poco selectivo (agar
MacConkey o agar de eosina azul de metileno) y un medio de selectividad media (agar Hektoen o agar
salmonella-shigella). En los casos poco frecuentes en los que se considere necesario buscar una cepa de
Salmonella sp. fermentadora de inetosa es útil añadir un cuarto medio más selectivo como agar sulfito o agar
MacConkey con verde brillante (estos medios inhiben el crecimiento de coliformes).
En casos de sospecha de fiebre tifoidea lo habitual es aislar el germen de sangre, pero también se puede aislar
a partir de heces si se toma la muestra antes del inicio del tratamiento con antibióticos. Para aislar S. typhi es
conveniente incluir el medio de agar sulfito-bismuto. La reacción de Widal (estudio de anticuerpos séricos frente
a antígenos O-H y Vi de Salmonella typhi) presenta una escasa utilidad.
Todos los medios se incuban en aerobiosis a 37º C. Los medios sólidos deben examinarse a las 24 y 48 horas y
el caldo de enriquecimiento se resiembra a las 24 horas en los tres medios sólidos antes mencionados.
Uno de los principales objetivos en microbiología clínica es la identificación del agente causal por
procedimientos cada vez más ágiles y seguros (mayor rapidez con especificidad y sensibilidad más altas).
La identificación del germen aislado en placa puede acelerarse usando diferentes técnicas: aglutinación
(aglutinación de látex con anticuerpos específicos, coaglutinación etc.), detección de umbeliferona, un producto
fluorescente liberado por la enzima caprilaro esterasa (C8 esterasa) producida por salmonella ("Mucap", Biolife,
Milán, Italia), mediante pruebas enzimáticas rápidas o por sondas específicas de hibridación de ADN.
Se está trabajando en la elaboración de sondas específicas de hibridación con objeto de utilizarlas directamente
para la detección de Salmonella sp. En muestras clínicas. Uno de los inconvenientes de dichas sondas es que
son necesarias elevadas concentraciones de la bacteria que normalmente no se dan en las heces. Para
solucionar este problema se puede recurrir a la aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
aunque tanto las condiciones químicas y físicas de las heces como la presencia de otras bacterias que pueden
interferir en los resultados dificultan la puesta a punto de la técnica. La elaboración de una sonda basada en el
fragmento de inserción IS200 específico de salmonella es prometedora.

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

2 Pipetas estériles de 10 ml Medios de cultivo:
Asa de siembra estériles Caldo de peptona
10 cajas Petri estériles Caldo tetrationato
1 matraz de 500 ml aséptico Caldo selenito
3 matraces de 250 ml Agar Bismuto – sulfito
1 vidrio de reloj Agar Salmonella – Shigella
1 Probeta de 100ml
Espátula, guantes de asbesto, Muestra: __derivados de pollo__
Piceta de agua y de alcohol
1 agitador y parilla eléctrica

METODOLOGIA
1. Toma de muestra: la muestra representativa ha de ser al menos de 100 gramos. Se toman de distintas
zonas, al menos 25 gramos.
2. Trituración y homogeneización: se mezclan 225 ml de agua de peptona tamponada, con los 25 gramos de
alimento. Se trituran durante 2 minutos con la trituradora. El alimento triturado necesita un ajuste de pH 6 –
7, particularmente en alimentos ácidos donde las Salmonellas no pueden desarrollarse.
3. Pre enriquecimiento: El alimento triturado y homogeneizado se pasa asépticamente a un matraz de 500 ml
y se incuba 16 – 20 horas a 37°C.

23
4. Enriquecimiento: del crecimiento en caldo peptona tamponado, se pasan 10 ml a un matraz que contenga
100 ml de caldo tetrationato, y otros 10 ml a un matraz con 100 ml de caldo selenito. El primero se incuba
48 horas a 42°C – 43°C y el segundo a 37°C también 48 horas.
5. Siembra en placa: cuando la incubación de ambos medios alcanza las 24 horas, se siembra a partir de cada
uno de ellos en placa con Agar Bismuto – Sulfito y Agar S – S para obtener colonias aisladas (primer
subcultivo). Incubar las placas a 37°C durante 48 horas.
6. A las 48 horas de incubación de los medios de enriquecimiento, se hace una segunda siembra de forma
idéntica y en los mismos medios en placa (segundo subcultivo).
RESULTADOS
A las 24 horas de incubados estos cultivos se hace la lectura.
Las colonias de Salmonella en Agar Bismuto – Sulfito tienen la siguiente morfología: pardas, grises tirando a
negro, presentan a veces un brillo metálico, rodeadas de un halo oscuro. Algunas cepas dan colonias verdes y
no oscurecen el medio.
En Agar S – S las colonias de salmonella al cabo de 18 horas son de color rosa pálido a incoloras que con el
tiempo se van haciendo opacas más grandes y pueden presentar un punto central gris a negro.
Tomar varias colonias típicas o sospechosas para confirmarlas, ya que reconocer las colonias de salmonellas
requiere mucha experiencia y el aspecto puede varias no sólo de especie sino de lote a lote de medio de cultivo.
CUESTIONARIO
1.- ¿Cuál es la finalidad de realizar el pre enriquecimiento de las muestras utilizadas?
2.- ¿Cuáles son las condiciones para el desarrollo de microorganismos del tipo salmonella-shigella en un
alimento?
3.- ¿Cuál es la principal vía de contaminación de salmonelosis?
4. ¿Qué animal sirve como reservorio de las salmonellas?

REFERENCIAS
Pelczar J. M. y Chan E. C. S. “Elementos de Microbiología”. Editorial Mc. Graw Hill. México, 1998.
López B. M. “Procedimientos en Microbiología Clínica”. España 1994.
D.A.A. Mossel/B. Moreno García. “Microbiología de los Alimentos”. Ed. Acriba S.A. Zaragoza España.
John T. Nickerson / Anthony J. Sinskey. “Microbiología de los alimentos y sus Procesos de Elaboración. Acriba S.A. Zaragoza España.

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MANUAL No. 10

IDENTIFICACIÓN Y RECUENTO DE BACERIAS ANAEROBIOS

OBJETIVO
Identificara y determinará la cantidad de microorganismos anaerobios contenidos en un alimento

INTRODUCCIÓN

Los organismos anaerobios o anaeróbicos son los que no utilizan oxígeno (O2) en su metabolismo, más
exactamente que el aceptor final de electrones es otra sustancia diferente del oxígeno. Si el aceptor de
electrones es una molécula orgánica (piruvato, acetaldehído, etc.) se trata de metabolismo fermentativo; si el
aceptor final es una molécula inorgánica distinta del oxígeno (sulfato, carbonato, etc.) se trata de respiración
anaeróbica. El concepto se opone al de organismo aerobio, en cuyo metabolismo se usa el oxígeno como
aceptor final de electrones.

Aquellos organismos unicelulares que no pueden vivir o desarrollarse con la presencia de oxígeno se
denominan anaerobios estrictos. Algunos microorganismos aeróbicos, que pueden desarrollarse en ausencia
de oxígeno, por medio de la fermentación se denominan anaerobios facultativos.

MARCO TEORICO

La mayoría de los organismos anaerobios utilizan la fermentación para obtener energía química. Existen
diferentes tipos de fermentación en función de la ruta metabólica utilizada. Así, se denomina fermentación
24
alcohólica a aquella en la que se genera etanol, fermentación láctica a la que genera ácido láctico, fermentación
ácido-mixta a la produce ácido láctico, etanol y ácido propiónico y fermentación butírica a la que genera el ácido
butírico.

Algunos microorganismos realizan un proceso metabólico conocido como respiración anaeróbica que, a pesar
de no utilizar oxígeno, es completamente diferente de las fermentaciones. En la respiración anaeróbica existe
una cadena de transporte de electrones análoga a la de la respiración aeróbica, pero el aceptor final de
electrones no es el oxígeno sino otra molécula, generalmente inorgánica, como: SO42-, NO3- o CO2.

MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPOS

5 Pipetas estériles de 1 ml Medios de cultivo:

2 matraces Erlenmeyer de 250 ml Agar anaeróbico
Asas bacteriológicas Caldo peptonado
10 cajas Petri estériles
1 bureta graduada de 10 ml Muestra: Alimento enlatado
Mechero, gradilla, guantes de asbesto
5 tubos de ensaye
2 pipetas de 10 ml
Vidrio de reloj, espátula
Piceta agua, Piceta alcohol
Agitador magnético y parilla electromagnética

METODOLOGIA

1. A partir de una serie de diluciones decimales y por duplicado, se depositan 0.1 ml de cada una de las
diluciones sobre la superficie de los agares bien seco.
2. Se distribuye con asa de vidrio estéril.
3. Se incuban a 37°C durante 48 horas en condiciones anaerobias

RESULTADOS

Sacar las cajas de incubación y contar las colonias características de las bacterias obtenidas, reportando él
número de colonias multiplicado por el factor de dilución, nos dará los resultados por gramo de alimento.

REFERENCIAS
Pelczar J. M. y Chan E. C. S. “Elementos de Microbiología”. Editorial Mc. Graw Hill. México, 1998.
López B. M. “Procedimientos en Microbiología Clínica”. España 1994.
D.A.A. Mossel/B. Moreno García. “Microbiología de los Alimentos”. Ed. Acriba S.A. Zaragoza España.
John T. Nickerson / Anthony J. Sinskey. “Microbiología de los alimentos y sus Procesos de Elaboración. Acriba S.A. Zaragoza España.

25
Norma Oficial Mexicana. Expedida por la SECOFI 1994.

Orozco D. F. “Análisis Químico Cuantitativo”. Editorial Porrua. México, 1987.

Pelczar J. M. y Chan E. C. S. “Elementos de Microbiología”. Editoral Mc. Graw Hill. México,

1998.

López B. M. “Procedimientos en Microbiología Clínica”. España 1994.

Jawetz E., Melnick L. J., Edward A. A. “Manual de Microbiología medica”. Editorial El Manual
Moderno. Quinta edición. México 1989.

S COMISION
UT
ACADEMICA NACIONAL
AGRO-INDUSTRIAL ALIMENTARIA

RESPONSABLES

26
Q.F.B. JUAN MANUEL NAVARRETE
UT DEL VALLE DEL MEZQUITAL
GOMEZ
ING. JUAN JOSE HERNANDEZ UT DE LA COSTA GRANDE DE
RAMOS GUERRERO
DR. FRANCISCO CALDERON
UT DE TECAMACHALCO
CERVANTES
M. C. ELPIDIA GASCON RAMIREZ UT DEL SUROESTE DE GUANAJUATO
M. C. CARLOS MARTINEZ MARTINEZ UT DE IZUCAR DE MATAMOROS
M. C. ANTONIO VALADEZ VILLAREAL UT DE TABASCO
M. C. OSCAR MARTIN LARIOS
UT DE HUEJOTZINGO
CORTES
UT DEL SUR DEL ESTADO DE
ING. MARTIN ARCADIO CRUZ LOPEZ
MEXICO
ING. ARTURO HERNANDEZ TAGLE
UT DE LA HUASTECA HIDALGUENSE
REYES
M. C. MARTHA LORENA GUZMAN
UT DE NAYARIT
ROBLES

Practica 12 aislamiento y determinación de Campylobacter jejuni

Aislamiento e identificación: Para el aislamiento a partir de materias fecales, los

medios de cultivo selectivos más comunes se basan en agar sangre y antibióticos; los
más usados son Skirrow, Butzler y Campy-BAP. Los caldos de enriquecimiento no
suelen ser necesarios ya que los individuos enfermos excretan grandes cantidades de
bacterias (106 - 109) por gramo de materia fecal. El desarrollo de técnicas de filtración,
con filtros que permiten el pasaje de estas pequeñas bacterias pero retienen las de
mayor tamaño como las de la flora entérica, seguidas del cultivo en medios no
selectivos como agar sangre, ha representado un avance significativo sobre el uso de
medios selectivos y es actualmente el método recomendado para el aislamiento
primario de Campylobacter.

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