PRACTICA N° 6.

MICROORGANISMOS INDICADORES DE LA CONTAMINACION

FECAL (Enterobacterias: Coliformes, Colifecales, y E. coli; y
Streptococcus del grupo “D” de Lancefield).

I. INTRODUCCIÓN.
Los microorganismos indicadores de la contaminación fecal, principalmente son:
Enterobacterias totales, Coliformes, Echerichia Coli, y Streptococcus del grupo de D de
Lancefield; por cuanto normalmente se les encuentra en el tracto digestivo del hombre
y de animales de sangre caliente.

A) ENTEROBACTERIAS TOTALES. La Enterobacterias, son un conjunto de

microorganismos que integran la flora microbiana del intestino del hombre y de los
animales que poseen las siguientes características: Son bacilos gram negativos no
esporulados; Son móviles e inmóviles, provistos de flagelos en peritrico; Se les
diferencia por sus reacciones bioquímicas y que se caracterizan porque todas reducen
los nitratos a nitritos, con excepción de Erwinia sp., tiene reacción oxidasa negativa,
fermentan la glucosa con reducción de ácido(A) o ácido y gas(AG);
Las reacciones bioquímicas de las Enterobacterias, son mayormente utilizadas con la
finalidad de investigar y detectar Salmonella sp, en los alimentos.

B) COLIFORMES. El termino coliforme, comprende los géneros: Escherichia,

Enterobacter, Klebsiella, y Citrobacter, y se caracterizan por utilizar la lactosa como
fuente de carbono. Los coliformes distintos a la E. coli, persisten en el suelo o sobre
las superficies, tales como los granos, frutas y otros productos del campo.

C) COLIFECALES. Son un grupo de microorganismos procedentes de la incubación del

inoculo a la temperatura de 44 a 45.5° C, que contienen por lo general un alto
porcentaje de E. coli tipo I y II, por lo que son muy indicativos de la contaminación
fecal.

D) Escherichia coli. Este microorganismo habita naturalmente en el tracto digestivo del

hombre y de otros animales de sangre caliente.
.

E) Streptococcus del grupo “D” de Lancefield: El grupo “D” de Lancefield incluye además,
de los enterococos, especies menos resistentes, tales como los Streptococcus bovis y
Streptococcus faecalis.

Los enterococos pueden tener un papel muy importante como indicadores de una
limpieza y desinfección deficiente en las plantas y fábricas de los alimentos, a causa
de su gran resistencia a la desecación, a las altas temperaturas, a los detergentes
y a los desinfectantes.

En conclusión, podemos considerar lo siguiente:

- Las Enterobacterias totales, son indicadores de los métodos de limpieza y

desinfección de superficies en las fábricas de alimentos y de calidad higiénica de
los componentes de los alimentos.

- La E. Coli, es un buen indicador de la contaminación fecal para la mayoría de los

alimentos.
 - Los demás coliformes, son buenos indicadores de una limpieza y de infecciones no
adecuadas o de una industrialización o procesamiento no correctos de los alimentos.

- Los Coliformes fecales, tienen una mayor probabilidad de contener gérmenes de

origen fecal, por lo que son organismos indicadores mucho más seguros de la
contaminación fecal que los Coliformes totales.

- Los Enterococos, son indicadores de limpieza y desinfección deficientes en las

plantas y fábricas de alimentos (alimentos congelados y desecados).

MEDIOS DE CULTIVO: Los medios de cultivos en la siguiente práctica son los siguientes:

A) Para Enterobacterias. Método de Recuento en placas.

Agar Mac Conkey, por el método de recuento en placas. Se debe añadir a la fórmula
del Agar Mac Conkey, 10 g. de glucosa. Cuando se trata de determinar la presencia
de Salmonella spp., se produce de otra manera, ya que la presencia en los alimentos
de cualquier serotipo de Salmonella, es potencialmente peligrosa como fuente de
enfermedad para el hombre, bien de modo directo por el consumo de estos alimentos
o indirectamente mediante la contaminación secundaria de utensilios, de equipos
para el tratamiento e industrialización de los alimentos o de otros alimentos.
B) Para Coliformes.- Método de Recuento en placas.

Agar Rojo Violeta con Sales Biliales (VRBA), que tiene la siguiente composición:
- Cristal Violeta 2.0 mg.
- Rojo Neutro 30.0 mg.
- Extracto de levadura en polvo 3.0 gr.
- Sal Bilial N°3 1.5 gr.
- Lactosa 10.0 gr.
- Cloruro de sodio (Na Cl) 5.0 gr.
- Peptona 7.0 gr.
- Agar Agar 15.0 gr
- Agua destilada 1.0 L

Después de la disolución llevar el pH del medio a 7.3. El calentamiento se realiza a

más o menos 100°C para la disolución de los ingredientes, al eliminar las bacterias
vivas que pueden dificultar la numeración de Coliformes, hace que no haya
necesidad de esterilizar el medio , solo se le conserva a 50 – 60°C después de
lograrse la disolución.

Este método permite enumerar no solamente los bastones Gram (-) que fermentan la
lactosa (denominada bacterias coliformes o coli-aerógenes), como la E. coli,
Citrobacter freundii, Enterobacter aerógenes, etc., sino también las bacterias
intestinales lactosa (+), conocidas como Colifecales, patógenas indeterminados,
como la Salmonella, Arizona, Shigella, y las especies denominadas
“Paracolobactrun”. El medio se caracteriza porque lleva consigo un colorante
apropiado y sales biliales que van a inhibir el desarrollo de las bacterias que no sean
Coliformes.

C) Para Coliformes totales, Coliformes fecales y Escherichia coli.- Método de Numero

Más Probable (NMP).

1) Prueba Presuntiva, para determinar Coliformes Totales. Para esta prueba se utiliza
el Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis al 2% (CLVBB) a doble y simple
concentración.
 - Verde Brillante 15.0 mg.
- Peptona 10.0 gr.
- Lactosa 10.0 gr.
- Bilis deshidratada 20.0 gr
- Agua destilada 1.0 L

Esta fórmula es a simple concentración, para obtener doble concentración, se

adiciona el doble de cada componente en un litro de agua destilada. Después de la
disolución llevar el pH a 7.0 – 7.2 y repartir en tubos de ensayo a razón de 9.0 ml.
Provistos de una campana Durham y esterilizar a 121°C x 15 minutos.

2) Prueba Confirmativa o Test de Eijkman, para determinar Colifecales. Se utilizan

Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis al 2%(CLVBB) a simple concentración, y
Caldo Peptonado , cuya composición es la siguiente:

- Peptona o Triptona 10.0 gr.

- Cloruro de sodio 5.0 gr
- Agua destilada 1.0 L.
Después de la disolución llevar el pH a 7.0 y repartir a razón de 5.0 ml. por tubo de
ensayo y esterilizar a 121°C por 20 minutos.
3) Prueba Bioquímica IMViC, para determinar E. coli; se utilizan los medios de cultivo.

-Medio Politrópico Kligler. Después de la disolución llevar el pH a 7.4, repartir en

tubos de ensayo y esterilizar a 121°C x 20 minutos; luego dejar solidificar en
posición inclinada bajo la forma de “pico de flauta”.

-Medio para ver la formación del Indol. Se utiliza el caldo Peptonado o Triptonado.

-Medio para la reacción del Rojo de Metilo.

-Medio para la reacción de Voges ProsKauer. Para las dos reacciones se utiliza el
mismo medio (MR-VP) y es inútil el ajuste del pH, repartir en tubos de ensayo
esterilizar a 121°C x 20 minutos.

-Medio para asimilación del Citrato. Se utiliza como medio el Citrato de Simmons.

Después de la disolución llevar al pH a 6.8, luego repartir en tubos de ensayo y

esterilizar a 121°C x 20 minutos; dejar solidificar bajo la forma de “pico de flauta”.

D) Para Streptococcus del grupo “D” de Lancefield.- Método de Número Más Probable
(NMP).

Caldo glucosado con azida de sodio, para la prueba presuntiva para Streptococcus del
grupo “D” de Lancefield; cuya composición es:

- Triptosa 15.0 gr
- E|xtracto de carne en pasta 4.5 gr
- Glucosa 7.5 gr
- Cloruro de Sodio 7.5 gr
- Azida de Sodio 0.2 gr
- Purpura de Bromocresol 15.0 mg.
- Agua destilada 1.0 L.
 Después de la disolución de los ingredientes, llevar el pH a 7.2 y repartir 9.0 ml., por tubo
de ensayo y esterilizar a 121°C x 15 minutos.
Este medio se caracteriza porque contienen la azida de sodio, que inhibe el crecimiento
de la mayor parte de otras bacterias que no sean Streptococcus. El método a utilizar es
el del NUMERO MAS PROBABLE (NMP), de manera similar que para la determinación
Escherichia coli.

Caldo Violeta de Etilo con azida de sodio (caldo EVA), para la prueba confirmativa para
Streptococcus del grupo “D” de Lancefield; cuya composición es:

- Triptosa 20.0 gr
- Glucosa 5.0 gr
- K2HPO4.3H2O 2.7 gr
- Azida de Sodio (NAN3) 0.4 gr
- Violeta de etilo 0.83 mg
- Purpura de Bromocresol 15.0 mg
- Agua destilada 1.0 L.
Después de la disolución llevar el pH a 7.2 y repartir 9.0 ml. Por tubo de ensayo y esterilizar
a 121°C por 15 minutos. En este medio, la azida de sodio y la violeta de etilo, actúan como
inhibidores estrictos de toda bacteria que no sea Streptococcus del grupo “D” de Lancefield.
II. OBJETIVO.
Enseñar al estudiante las técnicas e interpretación de los microorganismos indicadores
de la contaminación fecal en los alimentos.

III. MATERIALES Y METODOS.

1) Materiales.
Placas Petri, tubos de ensayo, pipetas de 1, 2, 5 y 10 mL., frascos Erlenmeyer,
licuadora, cuchillos, vaso de licuar, mortero y pilón, estufas de incubación, baño maría
eléctrica, Agar Rojo Violeta con Sales Biliales (VRBA), Agar Mac Conkey, Caldo
Lactosado Verde Brillante Bilis al 2%(CLVBB) de doble y simple concentración caldo
Glucosado con azida de sodio de doble y simple concentración, Caldo Violeta de Etilo
con Azida de Sodio, y muestras de alimentos sospechosos.

2) Procedimiento.
Para el recuento de Enterobacterias. La forma de sembrar es como sigue: Mezclar
en placas petri estériles 1.0 mL. De la serie de diluciones con más o menos 15.0 mL.
Del Agar Mac Conkey. Dejar enfriar hasta la solidificación, luego recubrir la mezcla
con más o menos 5.0 mL. del medio de cultivo. Luego de solidificado, incubar a 37°C
por 24 – 48 horas. Pasando el tiempo de incubación, contar las colonias de las placas
que contienen entre 30 y 300 colonias. Tanto en colonias violetas con precipitado rojo
violeta, como aquellas transparentes, amarillentas verdosas y deducir el número de
Enterobacterias por gr. o mL. de muestra.

Para el recuento de coliformes. Mezclar en placas Petri esteriles, 1.0 mL. De la serie
de disoluciones con más o menos 15.0 mL. Del medio de cultivo, y mezclar. Una vez
solidificado recubrir la mezcla con más o menos 5.0 ml del medio estéril. Luego llevar
a incubación a 37°C x 24 – 48 horas: luego de este tiempo contar las colonias de las
placas que contienen entre 30 – 300 colonias, el número de colonias violeta rodeadas
de un precipitado rojo violeta, y deducir el número de coliformes por gramo o mililitro
de muestra.
C). Para Coliformes, Colifecales y E. coli. Método de Número Más Probable (NMP).

1) Para Coliformes Totales.

 - Pipetear tres veces 10 mL. del homogeneizado del alimento, en tres tubos de
ensayo con CLVBB al 2% de doble concentración.
- Pipetear tres veces 1 mL. del homogeneizado en tres tubos de ensayo con
CLVBB al 2% a simple concentración.
- Pipetear tres veces 1 mL. de cada uno de las diluciones siguientes del
homogeneizado en tres tubos de ensayo con CLVBB al 2% a simple
concentración.
- Agitar cada tubo de ensayo e incubar a 36- 37°C x 24 – 48 horas.
- Pasado el tiempo de incubación, anotar los tubos de ensayo que muestren
producción de gas más de 1/3 del volumen de la campana de Durham.
- Elegir la dilución más alta (la más diluida), en la que sean positivos de formación
de gas los tres tubos y las dos diluciones superiores (más diluidas) más
próximas. Si esto no es posible, a que ninguna de las diluciones trabajadas
presentan tres tubos positivos, seleccionar las tres últimas diluciones y anotar
el número de diluciones y anotar el número de tubos positivos de cada una.
Por ejemplo: Si las tres últimas diluciones positivas fueron 1:100, 1:1000, y
1:10000; y el número de tres tubos positivos en cada dilución fuera: 3 – 1 – 0,
el resultado se anotaría del siguiente modo:

Diluciones: 1: 100 =3
1: 1000 =1
1: 10000 =0
Este valor 3 – 1 – 0, se busca en la tabla del NMP, de tres alícuotas; y nos dará
la población de coliformes totales.

La población se calcula de la siguiente manera:

Lectura: 3 – 1 – 0 (1:100, 1:1000, 1; 10000).
Valor de la Tabla del NMP: 43
Dilución intermedia: fd(i) = 1000

NMP
Población/gr. o mL. = --------- X fd (i)
100
43
N° = --------- X 1000 = 430 = 4.3 X 10 2 UFC /g. o mL.
100

Nota: Estos cálculos han sido realizados considerando que se analizaron

1033
Unidades de muestra problema.

2) Para determinar el Número de Colifecales.

Se sigue el Test de Eijkman, compuesto por dos tubos de ensayo conteniendo
CLVBB al 2% a simple concentración, uno y caldo Peptonado (CP) el otro, en los
que siembran por azadas el inoculo de cada tubo positivo de la prueba anterior,
luego se incuban en Baño María a 44°Cx 24 horas. Para el cálculo se anotan los
tubos de CLVBB al 2 % con formación de gas (aquí no interesa ya la condición
de más de 1/3 del volumen de la campana, suficiente con que haya igual o
cercado a 1/3 de gas) y su respectivo CP con formación de Indol (formación de
anillo rojo grosella con tres gotas de reactivo de Kovac´s). Cualquier variación
contraria, se considera prueba negativa. Luego del triple número obtenido, se
logra el valor respectivo de la tabla de NMP y se procede igual que para el
anterior caso visto.
3) Para determinar E. coli.
Para determinar E. coli, se hace uso de la galería Bioquímica de IMViC; a partir
de los tubos positivos con CLVBB al 2% procedentes del Test de Eijkman, se
siembran unas azadas por picadura profunda y estría superficial en el medio
Politrópico de Kligler Irón Agar, y se incuban a 37°Cx24 horas.

Seguir trabajando solo con aquellos tubos con Kligler que hayan virado al
“amarillo” la parte superior a todo el medio (lactosa positivo).Descartar aquellas
que presenten además un precipitado negruzco o la parte superior del tubo o
todo el medio de color rojo. De los Kligler positivos, se siembran por azadas en
4 tubos que contienen: Caldo Peptonado, caldo Rojo de Metileno, Caldo Voger
Proskauer, y Agar Citrato de Simmons; luego se incuban a 37°Cx24 horas.
Se consideran para las lecturas los siguientes resultados:

- Caldo Peptonado (l).

Se investiga la formación de Indol formando después de la incubación,
agregando gotas de reactivo de Kovac´s y agitando en seguida. La reacción es
positiva si la fase alcohólica esta coloreada de rojo claro u oscuro y constante.

- Caldo Rojo de Metilo (M).

Después de haber incubado la siembra a 37°C por 24 horas, agregar 5 gotas de
una solución al 0.04% de rojo de metilo. La reacción se considera positiva, si la
coloración es roja y negativa si es amarilla.
- Caldo Voges ProsKauer (Vi).
Caracteriza gérmenes que producen Acetil Metil Carbinol (AMC) a partir de
glucosa que lleva el medio de cultivo. Al Acetil Metil Carbinol, se reconocen
oxidándolo a diacetil. Al tubo con el medio respectivo inoculado e incubado a
37°C por 24 horas, se le agrega unos mgs. de creatina p.a y 0.5 mL. de una
solución de soda al 40% y agitar fuertemente por 3 minutos. La reacción es
positiva, si la coloración rojo carnil aparece al cabo de 10 minutos. (La lectura
se puede hacer solo con KOH, pero la creatina se utiliza como estabilizador).

- Agar Citrato de Simmons (C).

Una vez sembrada el inoculo por estría superficial en el Agar citrato de Simmons
inclinado, e incubado a 37°C por 24 horas; la reacción es positiva si el medio
presenta una coloración azul.

Luego de los resultados obtenidos (confirmados según IMViC en la tabla N°1), se

logra el valor de la tabla del NMP, para después calcular la poblacion de E. coli, en
la muestra problema, de manera similar que los anteriores.

Tabla N° 1
============================================
I M Vi C
Escherichia coli + + - -
Enterobacter aerógenes - - + +
(O Aerobacter aerógenes).
Citrobacter -+ + - +
Klebsiella -+ - + +
TABLA Nº 2: TABLA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) DE MC CRADY

TUBOS POSITIVOS ÍNDICE DEL NMP Limite Confianza (95 %)

10ml 1.0ml 0.1ml POR 100 ml Inferior Superior
----------------------------------------------------------
0 0 1 3 0.5 9
0 0 2 6
0 0 3 9
0 1 0 3 0.5 13
0 1 1 6
0 1 2 9
0 1 3 12
0 2 0 6
0 2 1 9
0 2 2 12
0 2 3 16
0 3 0 9
0 3 1 13
0 3 2 16
0 3 3 19
1 0 0 4 0.5 20
1 0 1 7 1.0 21
1 0 2 11
1 0 3 15
1 1 0 7 1.0 23
1 1 1 11 3.0 36
1 1 2 15
1 1 3 19
1 2 0 11 3.0 36
1 2 1 15
1 2 2 20
1 2 3 24
1 3 0 16
1 3 1 20
1 3 2 24
1 3 3 29
2 0 0 9 1.0 36
2 0 1 14 3.0 37
2 0 2 20
2 0 3 26
2 1 0 15 3.0 44
2 1 1 20 7.0 89
2 1 2 27
2 1 3 34
2 2 0 21 4.0 47
2 2 1 28 10 150
2 2 2 35
2 2 3 42
2 3 0 29
 2 3 1 36
2 3 2 44
2 3 3 53
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 0 3 95
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 280
3 1 3 160
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 2 3 290
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800
3 3 3 1100 más
---------------------------------------------------------------------------------------------------

IV. CUESTIONARIO.

1. Que finalidad tienen las diluciones? Donde se requieren más diluciones, en una
muestra fresca o en una muestra procesada). Porque?.

2. Defina lo que es un microorganismo indicador de la contaminación fecal, y cuál es la

importancia en los alimentos?.

3. Exponga todo acerca de la influencia de los microorganismos indicadores de la

contaminación fecal en la salud del hombre.

4. Qué le indicaría la presencia en gran número de Streptococcus del grupo “D” de

Lancefield y de coliformes en un alimento procesado, y otro caso donde solo se
observa una gran población de Streptococcus del grupo “D”?.

5) Describa la función que desempeñan cada uno de los medios de cultivo descritos en
la presente práctica.

6) Reporte el fundamento de la tabla del NMP de MC Crady.

7) Analizando 15 g. de una muestra de tomate, en la investigación de la contaminación
fecal se ha encontrado el siguiente resultado:

Medio VRBA
Dilución L - 1 L - 2
S.M. inf. 786
-2 589 286
-3 68 43
-4 13 8
Encontrar el número de Coliformes por gramo de muestra, y fundamente la
elección de sus datos para sus cálculos.