Enumeración de coliformes totales

y enterococos en aguas naturales

por la técnica de Número más
Probable (NMP)
Guía de Laboratorio

Laboratorio de Microbiología Ambiental

Duración de la práctica
Día 1: Fase presuntiva
Día 2: Fase confirmatoria
Día 3: Fase final
Objetivo
Evaluar el nivel de calidad microbiológica de muestras de aguas obtenidas de
fuentes naturales
Identificar la importancia del grupo coliforme como microorganismos indicadores
en calidad de aguas.
Identificar la importancia de los enterococos como microorganismos indicadores
en calidad de aguas.

Introducción
Los microorganismos indicadores son un grupo de organismos que comparten
alguna característica morfológica, fisiológica o ecológica, cuya presencia en
grandes cantidades se correlaciona con mala calidad higiénica (1).
Las características ideales de un buen indicador sanitario incluyen: a) estar
limitados al hábitat intestinal; b) ser detectados en la muestra cuando los
patógenos fecales están presentes; c) mostrar mayor resistencia que los
patógenos frente a desinfectantes y condiciones adversas en el ambiente; d) ser
incapaces de multiplicarse en el ambiente; e) de detección fácil, rápida y con
métodos económicos; y f) la densidad del indicador debe correlacionarse con el
grado de contaminación fecal o con el riesgo a la salud (2).
Los coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comúnmente en las
plantas, el suelo y los animales, incluyendo los humanos. La presencia de
bacterias coliformes es un indicio de que el agua puede estar contaminada con
aguas negras u otro tipo de desechos en descomposición. En función de la
tolerancia a temperaturas elevadas que tienen algunos de estos microorganismos,
el grupo puede dividirse en dos: coliformes totales y coliformes fecales (son
termotolerantes) (1,3–5).
El grupo de los enterococos, incluye a especies tales como Enterococcus faecium
y Enterococcus faecalis, que se encuentran en heces humanas y animales.
Debido a su resistencia a los factores medioambientales tienen un mayor tiempo
de supervivencia, por lo tanto, son considerados como indicadores de
contaminación fecal antigua en contraste con la presencia de coliformes fecales
que indican la contaminación fecal reciente (3,4,6).
Principio de la técnica de NMP
Es una estrategia eficiente de estimación de densidades poblacionales
especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es
factible. La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia (pos o
neg) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de
microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto,
un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un
atributo particular de la población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El
estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese
atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabilística.
Para calcular la densidad de coliformes, calcule en términos de Número Más
Probable (MPN). Los valores de MPN, para una variedad de series de siembra y
resultados, se dan en la Tabla 1. En esta tabla se incluyen los límites de confianza
del 95% para cada valor de MPN determinado. Si los volúmenes de muestra
utilizados son los encontrados en las tablas (cinco volúmenes de 10 ml, cinco de
1,0 ml y cinco de 0,1 ml de muestras), reporte el valor correspondiente al número
de resultados positivos y negativos en la serie como el MPN / 100 mL o informe
como presencia o ausencia de coliformes totales o fecales.
Cuando la serie de diluciones decimales sea diferente de la tabla, seleccione el
valor MPN de la Tabla 1 para la combinación de tubos positivos y calcule de
acuerdo con la siguiente fórmula:
Valor NMP (tabla)*10/V=NMP/100ml
Donde:
V= volumen de una porción de la muestra en la dilución más baja (mayor
concentración de bacterias) escogida.
Cuando se utilizan más de tres diluciones en una serie decimal de diluciones,
utilice los resultados de sólo tres de éstas en el cálculo de NMP. Para seleccionar
las tres diluciones que se utilizarán para determinar el índice NMP, elija la dilución
más alta que dé resultados positivos en las cinco porciones ensayadas (ninguna
dilución menor que dé resultados negativos) y las dos siguientes diluciones
superiores. Utilice los resultados en estos tres volúmenes en el cálculo del índice
NMP.
El MPN para combinaciones que no aparecen en la tabla, o para otras
combinaciones de tubos o diluciones, puede estimarse mediante la fórmula simple
de Thomas:

NMP/100ml=(P*100) /√(N*T)

Donde:
P =Número de resultados positivos
N =Volumen de muestra en todas las porciones negativas combinadas
T = Volumen total de muestra en las diluciones seleccionadas.
Materiales
Sr. No. Tipo Material

1 Medios de cultivo Lauril Sulfato Caldo

2 para coliformes BRILA Caldo
3 EC Caldo
4 Agar EMB
5 Agar MacConkey
6 Medios de cultivo Dextrosa Azida Caldo
7 para enterococos Enterococcus selective Pfizer Agar
8 Material de vidrio y Tubos de ensayo de vidrio estériles para
otros diluciones con tapa de algodón o de rosca.
9 Campana de Durham
10 Espátula
11 Placas de Petri estériles de plástico
12 Pipetas de vidrio graduadas estériles
13 Reactivos Agua destilada
14 Reactivo de Kovacs
15 Rojo Metilo
16 VP1 y VP2
17 Equipos Balanza
18 Incubadora
19 Cámara de recuento de colonias

Instrucciones: Estimación de enterococos

Día 1: Fase presuntiva:
1. Preparar una serie de tubos con caldo dextrosa azida con una cantidad
apropiada. Tome 10 ml de muestra o menos e inocúlelo en el caldo
preparado a una concentración de 2X para los inóculos de 10 mL.
2. En aguas con una baja carga microbiana sembrar directamente de la
muestra 10, 1 y 0.1 ml en cada grupo de 5 tubos (ver figura #1).
3. En aguas con una alta carga microbiana realizar diluciones seriadas en
base 10 (ver figura #2)
4. Incubar los tubos inoculados a 35 ± 0,5 ° C. Examinar cada tubo de turbidez
al final de 24 ± 2 h. Si no hay turbidez definida, vuelva a incubar y vuelva a
leer al final de 48 ± 3 h.
Día 2: Fase confirmativa:
1. Seleccionar los tubos de caldo Dextrosa Azida que muestren turbidez
después de 24 o 48 h de incubación e inocular cada tubo positivo en placas
con Agar PSE. Incubar las cajas de Petri inoculadas a 35 ± 0,5 °C durante
 24 ± 2 h. Las colonias de color negro pardo con halos marrones confirman
la presencia de Estreptococos fecales.
2. Las colonias de color negro pardo con halos marrones se pueden transferir
a un tubo con caldo Infusión de Cerebro Corazón con 6,5% de NaCl. El
crecimiento en caldo con NaCl al 6,5% a una temperatura de 45ºC indica
que la colonia pertenece al grupo de enterococos.
Día 3: Cómputo y registro de NMP.
1. Estimar las densidades de estreptococos fecales a partir del número de
tubos en cada serie de dilución que son positivos en agar PSE. De forma
similar, estimar las densidades de enterococos a partir del número de tubos
en cada serie de dilución que contiene estreptococos que pueden crecer en
caldo de NaCl al 6,5%. Calcule la combinación de positivos y registre como
el número más probable (MPN).
Instrucciones: Estimación de coliformes totales y fecales
Día 1: Fase presuntiva:
Colocar los tubos de fermentación en filas de cinco en una gradilla. El número
de filas y los volúmenes de muestra seleccionados dependen de la calidad y el
carácter del agua a examinar:
En aguas con una baja carga microbiana sembrar directamente de la muestra
10, 1 y 0.1 ml en cada grupo de 5 tubos (ver figura #1).
En aguas con una alta carga microbiana realizar diluciones seriadas en base
10.
a. Tomar 10 g/ml de muestra y 90 ml de agua peptonada
b. Hacer una o más diluciones a 10 veces transfiriendo un volumen de la
muestra de agua a 9 volúmenes de diluyente.
Pipetear 1ml de cada dilución en tubos con caldo Lauril Triptosa Sulfato,
utilizando 5 tubos por cada dilución.
Agitar la muestra y las diluciones vigorosamente. Mézclense porciones a
estudiar con el medio mediante agitación suave.
Incubar a 35ºC durante 24-48 h.
Revisar los tubos que contengan turbidez y gas a las 24 horas; si no hay
turbidez y gas, vuelva a incubar y examine al final de 48 ± 3 h
Día 2: Fase confirmativa (coliformes totales):
Seleccionar los tubos de caldo Lauril Triptosa que muestren turbidez,
producción de gas o reacción de acidificación después de 24 o 48 h de
incubación y someterlos a la fase confirmatoria
Agitar vigorosamente los tubos presuntivos que muestren gas o crecimiento
ácido para resuspender los organismos.
 Con un asa en aro estéril transfiera una o más asadas del tubo presuntivo a un
tubo con caldo Brila.
Incubar el tubo inoculado a 35 ± 0,5°C (dentro de las 48 ± 3 horas se considera
positivo para la fase confirmatoria).
Día 2: Fase confirmativa (coliformes fecales):
Tomar los tubos positivos que tengan gas, crecimiento o acidez dentro de las
48 h en la prueba de coliformes totales:
Agitar o girar suavemente los tubos presuntivos de fermentación que muestren
gas, crecimiento o acidez. Utilizando un asa en aro estéril de 3 ó 3,5 mm de
diámetro y transferir el inoculo a cada tubo con caldo EC
Incubar los tubos de caldo EC inoculados en un baño de agua a 44,5 ± 0,2°C
durante 24 ± 2 h.
Colocar todos los tubos de EC en baño María 30 minutos después de la
inoculación.
Día 3: Fase final.
Tomar un inoculo de cada tubo con caldo BRILA positivo con un asa en aro y
sembrar por aislamiento en Agar EMB y Agar MacConkey. Asegurarse que el
inoculo quede distribuido y se puedan observar colonias discretas separadas
por lo menos a 0.5 cm.
Usar un asa en aro estéril de 3 mm de diámetro
Inclinar el tubo de fermentación para evitar recoger cualquier membrana o
espuma
Inserte el extremo del asa o aguja en el líquido en el tubo hasta una
profundidad de aproximadamente 0,5 cm
Tener cuidado cuando realice el aislamiento para no romper el agar.
Quemar el asa entre el segundo y la tercera estría para mejorar el aislamiento
de las colonias
Incubar las placas (invertidas) a 35 ± 0,5°C durante 24 ± 2 h.
Las colonias típicas en agar EMB son purpuras o rosas (totales) y negras con
brillo verde metálico (E. coli) después de 24 h de incubación.
Las colonias típicas en agar MacConkey son rojas y pueden estar rodeadas de
una zona opaca de bilis precipitada.
Escoger uno o más colonias típicas para coliformes; si no hay colonias típicas,
elegir dos o más colonias que considere perteneciente al grupo coliforme.
Transferir las colonias a un tubo de fermentación con Caldo Lauril triptosa y a
los tubos con agar nutritivo inclinados. (Este último es innecesario para las
muestras de agua potable).
Tomar colonias de Agar nutritivo y sembrar en agua Triptona, caldo MR y caldo
VP. Incubar por 24h a 37°C. Revelar usando los reactivos de Kovac, rojo de
metilo, VP1 y VP2, respectivamente.
Tabla 1. Indice de NMP y límites de confianza del 95% para varias combinaciones de resultados positivos
cuando se utilizan cinco tubos por dilución (10 mL, 1.0 mL, 0.1 mL).

Lista de valores de NMP y límites de confianza para varias combinaciones de resultados positivos cuando
cinco tubos son usados por dilución (10 ml, 1.0 ml, 0.1 ml)
Combinación Límites de Combinación Límites de
de tubos NMP/100 ml confianza de tubos NMP/100 ml confianza
positivos Inferior Superior positivos Inferior Superior
0-0-0 <1.8 ----- 6.8 4-0-3 25 9.8 70
0-0-1 1.8 0.090 6.8 4-1-0 17 6.0 40
0-1-0 1.8 0.090 6.9 4-1-1 21 6.8 42
0-1-1 3.6 0.70 10 4-1-2 26 9.8 70
0-2-0 3.7 0.70 10 4-1-3 31 10 70
0-2-1 5.5 1.8 15 4-2-0 22 6.8 50
0-3-0 5.6 1.8 15 4-2-1 26 9.8 70
1-0-0 2.0 0.10 10 4-2-2 32 10 70
1-0-1 4.0 0.70 10 4-2-3 38 14 100
1-0-2 6.0 1.8 15 4-3-0 27 9.9 70
1-1-0 4.0 0.71 12 4-3-1 33 10 70
1-1-1 6.1 1.8 15 4-3-2 39 14 100
1-1-2 8.1 3.4 22 4-4-0 34 14 100
1-2-0 6.1 1.8 15 4-4-1 40 14 100
1-2-1 8.2 3.4 22 4-4-2 47 15 120
1-3-0 8.3 3.4 22 4-5-0 41 14 100
1-3-1 10 3.5 22 4-5-1 48 15 120
1-4-0 10 3.5 22 5-0-0 23 6.8 70
2-0-0 4.5 0.79 15 5-0-1 31 10 70
2-0-1 6.8 1.8 15 5-0-2 43 14 100
2-0-2 9.1 3.4 22 5-0-3 58 22 150
2-1-0 6.8 1.8 17 5-1-0 33 10 100
2-1-1 9.2 3.4 22 5-1-1 46 14 120
2-1-2 12 4.1 26 5-1-2 63 22 150
2-2-0 9.3 3.4 22 5-1-3 84 34 220
2-2-1 12 4.1 26 5-2-0 49 15 150
2-2-2 14 5.9 36 5-2-1 70 22 170
2-3-0 12 4.1 26 5-2-2 94 34 230
2-3-1 14 5.9 36 5-2-3 120 36 250
2-4-0 15 5.9 36 5-2-4 150 58 400
3-0-0 7.8 2.1 22 5-3-0 79 22 220
3-0-1 11 3.5 23 5-3-1 110 34 250
3-0-2 13 5.6 35 5-3-2 140 52 400
3-1-0 11 3.5 26 5-3-3 170 70 400
3-1-1 14 5.6 36 5-3-4 210 70 400
3-1-2 17 6.0 36 5-4-0 130 36 400
3-2-0 14 5.7 36 5-4-1 170 58 400
3-2-1 17 6.8 40 5-4-2 220 70 440
3-2-2 20 6.8 40 5-4-3 280 100 710
3-3-0 17 6.8 40 5-4-4 350 100 710
3-3-1 21 6.8 40 5-4-5 430 150 1100
3-3-2 24 9.8 70 5-5-0 240 70 710
3-4-0 21 6.8 40 5-5-1 350 100 1100
3-4-1 24 9.8 70 5-5-2 540 150 1700
3-5-0 25 9.8 70 5-5-3 920 220 2600
4-0-0 13 4.1 35 5-5-4 1600 400 4600
4-0-1 17 5.9 36 5-5-5 >1600 700 -----
4-0-2 21 6.8 40

Referencias consultadas
1. Urzúa MÁH. Microbiología de los alimentos: fundamentos y aplicaciones en
Ciencias de la Salud. Editorial Médica Panamericana; 2016. 232 p.
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http://www.unicolmayor.edu.co/publicaciones/index.php/nova/article/view/47

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5. Ramos LM, Vidal L, Vilardy S, Saavedra L. Análisis De La Contaminación

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