Este documento describe el método de ELISA indirecta para detectar el virus de PRR (Síndrome respiratorio y reproductivo porcino). La técnica involucra fijar antígenos del virus en una placa, luego añadir las muestras, anticuerpos secundarios conjugados a una enzima, y un sustrato que producirá un color si están presentes anticuerpos contra el virus. El objetivo es conocer y poder realizar este método rápido y sencillo para diagnosticar la presencia del virus PRR en muestras.
0 calificaciones0% encontró este documento útil (0 votos)
89 vistas5 páginas
Este documento describe el método de ELISA indirecta para detectar el virus de PRR (Síndrome respiratorio y reproductivo porcino). La técnica involucra fijar antígenos del virus en una placa, luego añadir las muestras, anticuerpos secundarios conjugados a una enzima, y un sustrato que producirá un color si están presentes anticuerpos contra el virus. El objetivo es conocer y poder realizar este método rápido y sencillo para diagnosticar la presencia del virus PRR en muestras.
Este documento describe el método de ELISA indirecta para detectar el virus de PRR (Síndrome respiratorio y reproductivo porcino). La técnica involucra fijar antígenos del virus en una placa, luego añadir las muestras, anticuerpos secundarios conjugados a una enzima, y un sustrato que producirá un color si están presentes anticuerpos contra el virus. El objetivo es conocer y poder realizar este método rápido y sencillo para diagnosticar la presencia del virus PRR en muestras.
Este documento describe el método de ELISA indirecta para detectar el virus de PRR (Síndrome respiratorio y reproductivo porcino). La técnica involucra fijar antígenos del virus en una placa, luego añadir las muestras, anticuerpos secundarios conjugados a una enzima, y un sustrato que producirá un color si están presentes anticuerpos contra el virus. El objetivo es conocer y poder realizar este método rápido y sencillo para diagnosticar la presencia del virus PRR en muestras.
Descargue como DOCX, PDF, TXT o lea en línea desde Scribd
Descargar como docx, pdf o txt
Está en la página 1/ 5
PRACTICA N1 DE TERCERA FASE
PRUEBA DE ELISA INDIRECTA
INTRODUCCION: La tcnica ELISA (acrnimo del ingls Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas) es una tcnica de inmunoensayo en la cual un antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, como cambio de color o algn otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costes del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometra el antgeno en la muestra. Como tcnica inmunoquimica se basa en reaccin especifica antgeno anticuerpo, que en este caso es el tipo primario es decir el reconocimiento especifico y combinacin entre ambas molculas simplemente. En esta prctica trabajaremos para la deteccin del virus de PRR (Sndrome respiratorio y reproductivo porcino)
FUNDAMENTOS: El ELISA se basa y el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro. Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacin: Anticuerpos marcados: ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA sndwich
Antgeno marcado
ELISA competitivo
ELISA Directo: Consta de las siguientes etapas:
1. Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. 2. Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 3. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. 4. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Indirecto: Consta de las siguientes etapas: 1. Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. 2. Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 3. Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 4. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. 5. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Sndwich DAS: (Double Antibody Sandwich).
Consta de las siguientes etapas: 1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. 2. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. 3. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 4. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. 5. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Sndwich HADAS:
Consta de las siguientes etapas: 1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. 2. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. 3. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado. 4. Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. 5. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. 6. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.
ELISA Competitivo: Consta de las siguientes etapas: 1. Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. 2. Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antgenos desconocidos objeto de estudio. Paralelamente, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado. 3. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. 4. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son anlogas, el antgeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antgeno objeto de estudio, est relacionado serolgicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad ptica, es proporcional a la concentracin del antgeno problema en la muestra.
OBJETIVO: Conocer y saber el mtodo de ELISA para el diagnstico de PRRS. Conocer y poder realizar este mtodo rpido y fcil
MATERIALES: kits Diluyente especial Solucin de conjugado Solucin sustrato gromo gnico Solucin de frenado 26 pocillos (6)
Materiales Puntas de pipetas Micropipetas Espectrofotmetro PROCEDIMIENTO: 1. Sacar de la bolsa la placa con las tiras que van a ser utilizadas. Guardar en la bolsa el resto de tiras. Atemperar todos los reactivos, patrones, muestras y tiras que van a ser utilizados en el ensayo en este caso solo utilizamos (6). Dispensar 100 ul de control (-) sin diluir en el pocillo lo mismo hacemos con el (+) Dispersar 100 ul de muestra diluida en los pocillos correspondientes Dejar incubar 18 C por 30 minutos Dejamos a las 9:04 y lo sacamos a las 9:39
2. Luego que hemos encubado a medio ambiente
3. Lavamos 4 veces con 300ul de sol. Lavado 4. Dispensar 100ul de conjugado y emcubar 30 min
5. Lavar 4 veces con 300 ul de sol. De lavado
6. Despesar 100 ul de sustrato de TMB a cada pocillo dejar por 15 minutos 7. Frenar con 100 ul de solucin de frenado a cada pocillo 8. Lectura a 650 nm
