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CENTRO NACIONAL DE HOTELERA, TURISMO Y ALIMENTOS

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES, Escherichia coli y MESFILOS AEROBIOS - TCNICA

FILTRACIN POR MEMBRANA

1. OBJETIVO
Este procedimiento tiene por objeto explicar los pasos a seguir para realizar los ensayos: Coliformes
totales y Escherichia coli en las matriz agua; empleando la tcnica filtracin por membrana.

2. ALCANCE
Este procedimiento es aplicable para las matrices relacionadas a continuacin:

Agua potable.
Agua subterrnea.
Aguas recreativas (Piscinas).
Agua de mar.

3. DEFINICIONES
CEPA: Conjunto de clulas vivas que poseen las mismas caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y
genticas.
COLIFORMES: Estn conformados por todas las bacterias aerobias y anaerobias facultativas cuyas
caractersticas se definen a continuacin:

Gram negativas.
No esporuladas.
Forma de bacilos.
Fermentadores de lactosa.
Productores de gas y cido.

Del grupo coliformes forman parte varios gneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter,
etc. Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero tambin en otros ambientes:
agua, suelo, plantas, cscara de huevo, etc.
COLIFORMES TOTALES: Los coliformes totales son bacterias fermentadoras de lactosa, pertenecen
a la familia Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para fermentar la lactosa con
produccin de cido y gas, en un periodo de 48 horas a una temperatura de incubacin comprendida
entre 30-37C. Son bacilos gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados.

DNPSC: Demasiado numeroso para ser contado.

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Escherichia coli: Es una bacteria gram negativa, con forma de bacilo perteneciente a la familia
Enterobacteriaceae. Es habitual en el intestino del ser humano y de otros animales de sangre
caliente. Aunque la mayora de las cepas son inofensivas, algunas pueden causar graves
enfermedades transmitidas por alimentos. La infeccin por E. coli se transmite generalmente por
consumo de agua o alimentos contaminados, como productos crnicos poco cocidos y leche cruda.
Es considerado como un indicador de contaminacin fecal.
FILTRACIN: Proceso fsico que hace que una sustancia sea dividido en partes de acuerdo al
dimetro, tamao o grosor de las partculas que lo conforman. Se entiende tambin como un proceso
mecnico que no necesita ser estimulado artificialmente mediante el uso de qumicos u otras
sustancias.
FILTROS DE MEMBRANA (Estril): Lmina en forma de circunferencia elaborada con celulosa.
Posee un dimetro de poro equivalente a 0,45 y funciona como una pared de separacin selectiva.
A travs de ella se hace pasar el volumen de muestra a evaluar, quedando en el filtro las clulas
bacterianas que se presume estn presentes en la muestra. Dependiendo el analito, es seleccionado
el dimetro del poro en los filtros de membrana.
MESFILOS AEROBIOS: Denominacin asignada a todos los microorganismos capaces de
desarrollarse en presencia de oxgeno libre y a una temperatura entre 20 y 45 C, logrando alcanzar
temperaturas ptimas de crecimiento entre 30 y 40 C.

4. DESARROLLO DE ACTIVIDADES
4.1. FUNDAMENTO
El mtodo consiste en hacer pasar una muestra de agua a travs de un filtro de celulosa con 0,45 m
de dimetro de poro, aplicando vaco parcial; con el fin que queden retenidas las clulas bacterianas.
Posteriormente al proceso, el filtro es colocado en un medio de cultivo especfico para el
microorganismo que se desea evaluar en la muestra (Mesfilos aerobios, coliformes totales o
Escherichia. coli), y luego se incuba a la temperatura adecuada.

4.2. TOMA Y PRESERVACIN DE MUESTRAS

Antes de esterilizar las botellas, para muestras de agua potable, agua subterrnea y aguas
recreativas, agregar 0.1 ml por cada 120 ml de muestra a examinar; de solucin Tiosulfato de Sodio
al 3% con el fin de inhibir la accin del Cloro Residual. Luego de tomar la muestra homogenizar para
favorecer la distribucin uniforme del agregado en las botellas. Mantener las muestras en
refrigeracin entre 2 y 6 C, hasta entregar al laboratorio.
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4.3. INTERFERENCIAS

Contaminacin cruzada en el transporte, recepcin y almacenamiento de las muestras.

Alta concentracin del analito.
Presencia de slidos suspendidos en la muestra.
Inadecuada homogeneizacin.
Condiciones higinicas del equipo de filtracin.
Temperatura de incubacin fuera del rango de especificacin para el analito.
Dilucin de nutrientes y pH inestable en los medios de cultivos.

4.4. EQUIPOS, MATERIALES, MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS.

4.4.1. Equipos.

Equipo de filtracin.
Cabina de flujo laminar.
Incubadoras 35 C.
Incubadora 44.5 C.
Cuenta colonias.
Nevera 2 8 C.

4.4.2. Materiales.

Dispensador de pipetas.
Pipetas graduadas estriles de 1, 5 y 10 mL.
Asa de inoculacin en aro.
Mechero de Bunsen.
Botellas de vidrio con capacidad de 250, 500 mL.
Cajas Petri grandes y pequeas.
Filtros de membrana 0,47 mm x 0,45 .
Micropipetas de 100 y 1000 L.
Tips para micropipetas, azules y amarillas.
Frascos y recipientes para descarte.
Encendedor.
Bandejas de transporte.
Toallas de papel absorbente.

4.4.3. Medios de cultivos y reactivos.

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Peptona universal.
NaCl (Cloruro de Sodio).
Agar Plate Count.
Agar Endo.
Agar Cromocult
Agua destilada estril.

4.4.4. Soluciones.
Solucin Peptona 0,1 %.
Cloruro de Sodio 0,85 %.
Alcohol Etlico 96 %.

4.4. CONSIDERACIONES DE SALUD, SEGURIDAD Y MANEJO AMBIENTAL.

Usar bata blanca, guantes, mascarilla, gorro y lentes de proteccin.

Lavarse las manos antes y despus de manipular.
Desinfectar el rea de trabajo antes y despus de realizar una tarea.
No comer, beber, fumar, aplicarse maquillaje o cremas en el rea de trabajo.
No almacenar alimentos y bebidas en refrigeradores donde se encuentren los medios de cultivos,
reactivos, soluciones y materiales de trabajo.
Tener en cuenta los avisos de advertencia en lo relacionado con las lmparas UV. No ingresar al
rea mientras se encuentre encendida.
Al salir del laboratorio, verificar que las llaves del gas se encuentren cerradas.

4.5. PROCEDIMIENTO
Rotular las cajas de petri con el cdigo de la muestra, fecha y dilucin utilizada cuando este
sea el caso.
Preparar el equipo de filtracin.
Adicionar de 20 a 30 ml de agua destilada estril al inicio y al final de cada serie de filtracin,
para verificar la presencia de contaminacin. Si los controles indican contaminacin, rechazar
todos los datos de las muestras afectadas y solicitar nuevas muestras.
Utilizar una pinza estril para colocar el portafiltro sobre la base de manifold.
Ubicar sobre la parte porosa del receptculo y utilizando la misma pinza, un filtro de
membrana con la parte cuadriculada hacia arriba.
Cuidadosamente, ubicar el embudo de filtracin en el receptculo y fijar con los broches del
manifold.
Agitar la muestra vigorosamente, por lo menos 25 veces.
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Adicionar un volumen de muestra, determinado con base a la naturaleza, apariencia y carga

bacteriana que se asume de la muestra. Tener en cuenta la informacin contenida en la Tabla
N 2, para seleccionar el volumen de muestra adecuado.
Encender la bomba de vaco y dejar filtrar el contenido.
Cerrar la vlvula en el manifold y adicionar de 20 a 30 ml de agua destilada estril.
Encender nuevamente la bomba de vaco y dejar filtrar el contenido.
Filtrar un volumen determinado de la muestra, para cada ensayo a evaluar.
Cerrar la vlvula en el manifold y apagar la bomba de vaco.
Aflojar el broche de los embudos y retirarlos de la base del receptculo.
Retirar con una pinza estril (Flameada en el mechero de Bunsen), el filtro del receptculo y
ubicarlo con un movimiento de rotacin (para evitar que quede aire atrapado entre la superficie
del medio de cultivo y el filtro de membrana) en la caja petri con el medio de cultivo, invertir las
placas e incubar.
Proceder a utilizar los medios de cultivos, los tiempos y temperaturas de incubacin con base
en la informacin de la tabla N 1.
Tabla N 1.
Ensayo
Coliformes totales
Escherichia coli
Mesfilos aerobios

Medio de cultivo
Agar ENDO
Agar Cromocult
Agar Plate Count

Tiempo de
incubacin
22 24 horas
22 24 horas
48 horas

Temperatura de
incubacin
35 0,5C
35 0,5C
35 0,5C

Cuando el volumen de la muestra a filtrar es menor de 10 ml (Diluida o no), aadir al embudo

aproximadamente 10 ml de agua destilada estril; luego agregue el volumen de muestra a
analizar. Agregar posteriormente de 25 a 50 ml de agua destilada estril. Filtrar todo el
contenido. Esta operacin favorece la dispersin uniforme de las bacterias en el filtrado.
Tabla N 2. Volmenes de muestra sugeridos para evaluar coliformes totales.
Naturaleza
Agua de consumo
Agua de piscinas
Agua de manantial
Agua de lagos y depsitos de
agua
Agua de pozo
Agua de playas
Agua de rio

100
X
X
X

50

Volumen a filtrar (ml).

10 1 0.1 0.01 0.001

X
X
X

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X
X
X

X
X
X

0.0001

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Desechos clorinados
Agua residual

X
X

X
X

4.6. CLCULOS
4.6.1. Mesfilos aerobios
4.6.1.1. Recuento de colonias
El rango ptimo es de 20 a 200 colonias por filtro. Si las colonias son pequeas y no hay
hacinamiento, es aceptable un lmite ms alto.
Contar con la ayuda del cuenta colonias; todas las colonias en la membrana cuando hay
menos 2 colonias por cuadrado (1 cm2).
Para 3 a 10 colonias por cuadrado (1 cm2) contar 10 cuadrados y obtener el promedio x cm2.
Para 10 a 20 colonias por cuadrado (1 cm2), contar 5 cuadrados y obtener el promedio x cm2.
Multiplicar el recuento promedio por 100 y dividir entre el volumen de muestra filtrado.
Si hay ms de 20 colonias por cuadrado, registrar el conteo como > 2000 dividido entre el
volumen de muestra filtrado. Reporte el resultado como UFC/100 mL Estimado.
4.6.1.2. Clculos para la densidad
Reportar como <1 UFC/100 mL, cuando no se observe crecimiento en la caja.
Expresar el resultado aplicando la siguiente frmula:
UFC/100 mL = Nmero de colonias en la caja/ Volumen de muestra filtrado X 100
Reportar los resultados de Mesfilos aerobios. Tcnica filtracin por membrana.

4.6.2. Coliformes totales

4.6.2.1. Recuento de colonias
Seleccionar la(s) membrana(s) con un nmero de colonias dentro del rango ideal (Ver tabla N 3) y
no ms de 200 UFC, y realizar el conteo.
Las colonias tpicas de coliformes en el medio ENDO tienen color rosado a rojo oscuro con brillo
metlico en la superficie, que puede variar desde un punto en el centro hasta el total de la superficie
de la colonia; las colonias atpicas pueden ser de color rojo oscuro, mucoide o nucleadas sin brillo.
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Las colonias de color rosa, azul, sin brillo, colonias blancas o incoloras se consideran bacterias nocoliformes. Realizar el recuento de las colonias tpicas y atpicas.
Las muestras de aguas que atraviesan un proceso de desinfeccin pueden contener organismos
estresados que crecen relativamente despacio y producen su mximo brillo de 22 a 24 horas, otros
organismos presentes en cuerpos de agua no desinfectados pueden producir brillo de 16 a 18 horas.
Para el agua potable, verificar como mnimo cinco colonias tpicas y cinco colonias atpicas por
membrana. Transferir las colonias con la ayuda de una asa estril; a tubos con Caldo Lauril, incubar
a 35 +/- 0,5 C durante un mximo de 48 horas. Si hay formacin de gas, transferir a tubos con Caldo
Lactosa Bilis Verde Brillante e incubar durante 48 horas, si la prueba es positiva se confirma la
presencia de coliformes. La inoculacin simultnea en ambos caldos es aceptable para la produccin
de gas.
En aguas de buena calidad, la aparicin de colonias coliformes suele ser nula o mnima. Para
calcular el resultado aplicar la siguiente ecuacin:
Coliformes totales (UFC/100mL) = Colonias de coliformes contadas x 100 / Volumen de muestra
filtrado (mL).
Para muestras de agua potable, si no se observan colonias de coliformes en la caja, reportar como
<1 UFC/100 mL o ausente en 100 mL de muestra.
Tabla N 3: Nmero de colonias en el rango ideal para determinaciones cuantitativas.
Ensayo
Coliformes totales
Coliformes fecales
Streptococcus fecales
Enterococcus
Escherichia coli

Rango- Conteo de colonias (UFC)

Lmite mnimo
Lmite mximo
20
80
20
60
20
100
20
60
20
60

4.6.2.2. Clculos para la densidad

Para calcular los resultados tener en cuenta las siguientes pautas:
Para las muestras de agua no potable, si se examinan porciones de 10, 0.1 y 0.01 mL y todos los
recuentos son 0, calcular el resultado de la siguiente forma:
1/10 X 100 = <10 UFC/100 ml
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Para las colonias de coliformes verificadas, ajustar el recuento inicial basndose en el porcentaje de
verificacin positiva, e informe de la siguiente forma:
Coliformes totales verificados UFC/100 mL = Nmero de colonias positivas / Nmero total de
colonias evaluadas X 100.
Si se produce un crecimiento confluente y las colonias no se pueden distinguir o si el nmero total de
colonias bacterianas supera las 200, reportar el resultado como DNPSC (Demasiado numeroso para
ser contado).
Para muestras de agua potable, la presencia de coliformes se puede confirmar arrastrando el
crecimiento de la superficie del filtro, con un asa o hisopo de algodn estril e inoculando en un tubo
con Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante. Incubar a 35 +/- 0,5 C durante 48 horas; la produccin de
gas indica la presencia de coliformes.
Reportar demasiado numeroso para ser contado (DNPSC); solo, si se ha confirmado por lo menos
una colonia de coliformes (La verificacin solo es requerida en el medio ENDO).
Si es necesario solicite una nueva muestra de la misma procedencia dentro de las prximas 24
horas, y evale volmenes de muestra ms pequeos para reducir las interferencias. Filtrar
porciones de 50 ml a travs de dos membranas separadas o porciones de 25 ml a travs de cuatro
membranas separadas. Observar el crecimiento en todas las membranas para la misma muestra y
reportar la sumatoria de los recuentos como UFC/ 100 mL.
Este procedimiento tambin se puede aplicar para muestras de agua no potable, por ejemplo:
Ejemplo N 1: Al filtrar por duplicado 50 mL de la misma muestra, los conteos obtenidos son 5 y 3
colonias en cada filtro respectivamente. El recuento total de coliformes se reporta como 8 UFC/100
ml:
[(5 + 3) X 100] / (50 + 50) = 8 UFC/100 mL.
Ejemplo N 2: Si son examinados 50, 25 y 10 mL de muestra, y los conteos obtenidos son 15, 6 y <1
colonias respectivamente, calcular el resultado con base al valor ms cercano al lmite inferior
aceptable (15), y reportar el resultado final como 30 UFC/100 ml Estimado:
[(15) X 100] / (50) = 30 UFC/100 mL Estimado.
Ejemplo N 3: Si son examinados 10, 1 y 0,1 mL de muestra, con conteos obtenidos de 40, 9 y <1
colonias respectivamente, seleccionar el conteo para 10 mL de muestra, para realizar el clculo de la
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densidad; debido a que el recuento est dentro del rango aceptable, y reportar el resultado como 400
UFC/100 mL:
[(40) X 100] / (10) = 400 UFC/100 mL.
Ejemplo N 4: Si porciones de 10, 1, y 0,1 mL de muestra, arrojan recuentos de DNPSC, 150, y 92
colonias respectivamente, calcular el resultado con base al valor ms cercano al lmite superior
aceptable e informar el resultado como 92000 UFC/100 mL Estimado:
[(92 x 100] / (0,1) = 92000 UFC/100 mL Estimado.
Ejemplo N 5: Si son examinados 1, 0,3, 0,1, y 0.03 mL de muestra, con conteos obtenidos de
DNPSC, DNPSC, 78 y 21 colonias respectivamente, sumar los recuentos de coliformes obtenidos en
los dos filtros y dividir entre la suma de sus volmenes, para obtener el resultado final de 76000
UFC/100 ml:
[(78 + 21) X 100] / (0.1 + 0.03) = 76000 UFC/100 mL.
Ejemplo N 6: Si son examinados 1, 0,3 y 0,01 mL de muestra, con conteos de DNPSC obtenidos en
todas las porciones, calcular utilizando el valor correspondiente al lmite mximo del rango de
colonias aceptables y el volumen ms pequeo de muestra filtrado. Reportar el resultado como
>800.000 UFC/100 mL:
[80 X 100] / (0.01) = > 800 000 UFC/100 mL.
Reportar el resultado de Coliformes Totales y Escherichia coli. Tcnica filtracin por membrana.

4.6.3. Escherichia coli

4.6.3.1. Recuento de colonias
En condiciones ambientales y de luz normales, contar las colonias de color azul a prpura y reportar
como Escherichia coli. Las colonias incoloras o blancas no pertenecen al grupo de los coliformes. En
este ensayo la presencia de un elevado nmero de bacterias no-coliformes puede interferir con el
desarrollo de las colonias coliformes. (Se pueden contar todas las colonias de color rojo y azul a
prpura y considerar como un resultado para coliformes totales; no es requerida la verificacin de las
colonias coliformes).
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4.6.3.2. Clculos para la densidad

Para calcular el resultado, aplicar la siguiente frmula:
Escherichia coli (UFC/100 mL) = Nmero de colonias color azul-prpura/ Volumen de muestra filtrado
(mL) X 100.
Coliformes totales (UFC/100 mL) = Nmero total de colonias color rojo y azul-purpura/ Volumen de
muestra filtrado (mL) X 100.
Para muestras diferentes a agua potable, verificar el 10% de las muestras positivas. Ajustar el
recuento aplicando la siguiente frmula:
Resultado final (UFC/100 mL) = Nmero de colonias positivas / nmero total de colonias evaluadas X
100.
Reportar el resultado de Coliformes Totales y Escherichia coli. Tcnica filtracin por membrana.

4.7. BIBLIOGRAFA
Standard Methods: For the Examination of Water and Wastewater. Edicin 22nd 2012: Mtodos
9215 D, 9222 B, 9222 H.

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