Cap 14 Principios y Aplicaciones Microscópicos

Principios y aplicaciones microscpicos
La microbiologa utiliza el microscopio para detectar e identificar microrganismos a

partir de muestras clnicas.
Mtodos microscpicos
Microscopa de campo brillante
Los microscopios pticos utilizan una fuente de luz para iluminar las muestras,
un condensador para enfocar la luz sobre ellas y dos sistemas de lentes (lentes del
objetivo y lentes oculares) para amplificar sus imgenes. Las muestras se visualizan
al ser atravesadas por la luz que sale del condensador. Las imgenes son amplificadas
primero por las lentes del objetivo y despus por las lentes oculares. Generalmente se
emplean tres lentes del objetivo: de bajo aumento (10), para obtener una visin
general de las muestras, de alto aumento en seco (40), para detectar
microrganismos de gran tamao, y de inmersin en aceite (100), para observar
microrganismos pequeos. Las lentes oculares pueden amplificar las imgenes entre
10 y 15 veces.
El lmite de la microscopa ptica est en la resolucin de la imagen, es decir,
en la capacidad de distinguir que dos objetos estn separados y no son uno solo. El
poder de resolucin de un microscopio est determinado por la longitud de onda de
la luz utilizada y el ngulo con el que esta luz incide en las lentes objetivo (conocido
como apertura numrica). El poder de resolucin aumenta cuando se coloca una
capa de aceite entre la lente objetivo y la muestra, esto porque el aceite reduce la
dispersin ptica. Aunque muchos microrganismos pueden visualizarse mediante
microscopa de campo brillante, tanto ellos como el fondo tienen ndices de
refraccin similares. Por tanto, los microrganismos deben teirse para poder
distinguirlos.
Microscopa de campo oscuro

Los microscopios de campo oscuro utilizan las mismas lentes que los
microscopios de campo brillante, pero tienen un condensador especial que impide que
la luz ilumine directamente las muestras. Solo la luz oblicua y diseminada alcanza las
muestras y penetra los sistemas de lentes, haciendo que las imgenes brillen sobre un
fondo negro. El microscopio de campo oscuro tiene un poder de resolucin mayor al
del microscopio de campo claro, por lo que permite detectar bacterias sumamente
delgadas, como Treponema pallidum. Sin embargo, como la luz pasa alrededor de los
microrganismos y no a travs de ellos, la microscopa de campo oscuro no permite ver
sus estructuras internas.
Microscopa de contraste de fases

En la microscopa de contraste de fases, los haces de luz que atraviesan los
materiales ms densos se retrasan considerablemente con respecto a los dems.
Empleando una serie de anillos en el condensador y en las lentes del objetivo, estas
diferencias de fase pueden amplificarse, haciendo que la luz en fase brille ms que la
luz desfasada. Esto genera una imagen tridimensional de las muestras y permite
analizar mejor las estructuras internas.
Microscopa de fluorescencia
Los fluorocromos son compuestos que pueden absorber la luz ultravioleta y
emitir luz visible. Pocos microrganismos son naturalmente fluorescentes
(autofluorescentes), por lo que la microscopa de fluorescencia debe emplear
fluorocromos para teir las muestras y poder visualizarlas. Los microscopios de
fluorescencia utilizan lmparas halgenas, de vapor de xenn o de mercurio
presurizado para emitir haces luminosos de longitud corta. Una serie de filtros
bloquea el calor de la lmpara, elimina la luz infrarroja y selecciona la longitud de
onda adecuada para excitar los fluorocromos. La luz emitida por estos es despus
amplificada por las lentes del microscopio. Los microrganismos autofluorescentes y
las muestras teidas con fluorocromos brillan sobre un fondo negro, con un color
caracterstico para cada fluorocromo.
Microscopa electrnica
Los microscopios electrnicos utilizan espirales magnticos para dirigir un
haz de electrones desde un filamento de tungsteno a travs de una muestra y hacia
una pantalla. La resolucin de estos microscopios es considerablemente mayor, por lo
que permiten observar incluso partculas vricas individuales. Las muestras suelen
teirse o recubrirse con iones metlicos para generar contraste. En el microscopio
electrnico de transmisin los electrones atraviesan directamente las muestras; en
el microscopio electrnico de barrido, en cambio, rebotan en su superficie para
generar imgenes tridimensionales.
Mtodos de examen
Las muestras clnicas pueden simplemente colocarse en un portaobjetos y
examinarse as bajo el microscopio. Aunque este mtodo permite visualizar
microrganismos de gran tamao, no es el ideal para observar estructuras internas. La
tincin de las muestras, en cambio, permite distinguir adecuadamente mltiples
detalles internos de los microrganismos.
Examen directo
Los mtodos de examen directo son los sistemas de preparacin de muestras
ms sencillos. Las muestras pueden sumergirse en agua o suero fisiolgico, mezclarse
con un lcali o con una combinacin de un lcali y una tincin de contraste. Los
pigmentos tien de manera inespecfica el material celular, incrementando el
contraste y permitiendo realizar un examen detallado de diversas estructuras. El
mtodo de la tinta china emplea tinta para oscurecer el fondo en lugar de los
microrganismos, permitiendo as detectar cpsulas alrededor de los mismos.
Tinciones diferenciales
Las diferentes tinciones que existen se usan para teir microrganismos o
componentes celulares especficos. La tincin de Gram constituye la base de la
clasificacin de las bacterias en bacterias grampositivas y gramnegativas. Adems,
tambin es til para teir levaduras (que son grampositivas). Las tinciones con
hematoxilina frrica y tricrmica son tiles para identificar parsitos protozoos. La
tincin de Wright-Giemsa, por otro lado, permite identificar parsitos sanguneos.
Tinciones acidorresistentes
Las tinciones acidorresistentes permiten distinguir ciertos microrganismos a
partir de su capacidad para retener una tincin primaria incluso al ser expuestos a
agentes decolorantes, como las mezclas de cidos y alcoholes. Los mtodos de tincin
acidorresistente ms comunes son el mtodo de Ziehl-Neelsen, que requiere el
calentamiento de la muestra durante la tincin, el mtodo de Kinyoun, que se
realiza en frio, y el mtodo auramina-rodamina, que emplea un fluorocromo. El
mtodo del fluorocromo es el ms conveniente porque permite examinar rpidamente
grandes reas simplemente buscando regiones fluorescentes sobre un fondo negro.
Tinciones fluorescentes
La tincin con auramina-rodamina es solo una de las diferentes tinciones
fluorescentes. El naranja de acridina, por ejemplo, puede utilizarse para teir
bacterias y hongos. El blanco de calcoflor, a su vez, se emplea para teir la quitina
de las paredes de los hongos.
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