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I. INTRODUCCIN
Mxico posee una enorme riqueza en cuanto a su flora, y dentro de sta hay un
considerable nmero de plantas con propiedades curativas, que en muchos casos
sus usos se transmiten de generacin en generacin. El conocimiento y
conservacin de los recursos biolgicos de Mxico son de inters relevante
porque representan sus principales bienes y servicios. La riqueza vegetal de
Mxico es muy alta; se estima que el nmero probable de especies de plantas
oscila entre 25,000 y 30,000, de las cuales cerca del 60% son endmicas
(Rzedowski, 1991).
El estado de Oaxaca, con una superficie aproximada de 95 000 km2, es el quinto
estado ms grande de Mxico. Su compleja topografa, geologa y climatologa
han determinado un gran nmero de suelos, tipos de vegetacin y, por lo tanto, un
alto porcentaje de especies de plantas y animales. La flora de Oaxaca representa
casi el 40% de la flora de todo el territorio Mexicano. Se estima que 2,800
especies de plantas sean utilizadas en Oaxaca. El 40% de las plantas tienen ms
de un uso, los dos usos ms importantes son medicinales y alimenticios. Con
estos conocimientos se han desarrollado mtodos cientficos para poder
aprovechar las propiedades que brinda los caracteres de la vegetacin.
Realizando tcnicas de anlisis histoqumicos que permitan explicar las
propiedades de la planta.

La Fitoqumica es una ciencia que estudia y evala el aislamiento, anlisis,
purificacin, elucidacin de la estructura y caracterizacin de la actividad biolgica
de diversas sustancias producidas por los vegetales. Un anlisis fitoqumico tiene
como objetivo determinar los metabolitos de la especie vegetal a estudiar,
aplicando para ello una serie de tcnicas que permitirn identificar y caracterizar la
presencia o ausencia de ellos.

La Selaginella lepidophylla es una planta que pertenece a la familia de las
Selaginellaceae. Se caracteriza por no tener flores y reproducirse por esporas.
Necesita suelo bien drenado, poca agua y sol al mximo. Hasta la fecha slo se
han reportado dos casos de plantas de resurreccin, la Selaginella lepidophylla y
Myrothamnus flabellifolia. Experimentos que involucran las plantas de resurreccin
son escasos, slo hay pocos casos de investigaciones de sta planta. Se ha
estudiado las propiedades teraputicas de esta planta Argueta et al. (1994) y
Aguilar et al. (1999), indican que la infusin o la decoccin se utilizan para el
tratamiento de clculos biliares, dolor de rin y diurticos





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Este trabajo, se centr en la especie Lepidophyllia, perteneciente a la familia
Selaginellaceae, especficamente este informe dar referencias de los orgenes,
las caractersticas y las propiedades ms importantes que posee, tiene
propiedades teraputicas como diurtica, antisptica y cicatrizante.
La recoleccin de la planta Selaginella lepidophylla fue en la poblacin Santo
Tomas Mazaltepec, Etla Oaxaca. El procesamiento del ejemplar fue realizado en
las instalaciones del laboratorio de Fitoqumica de la Facultad de Ciencias
Qumicas, perteneciente a la Universidad Autnoma Benito Jurez de Oaxaca.
El inicio del anlisis de Selaginella lepidophylla inicio con la identificacin en
campo, la recoleccin y herborizacin, Tomando en cuenta los lineamientos para
poder procesar la muestra y no daar nuestros ejemplares. Una vez obtenidos
nuestros ejemplares se procedi a realizar la identificacin, etiquetado de los 10
ejemplares recolectados, tomando en cuenta sus caractersticas sensoriales,
macroscpicas y microscpicas.
La primera prueba realizada fue el diafanizado, este examen determina las
caractersticas que permite una mejor visualizacin de tejidos celulares como
pared celular, cristales, Tricomas, estomas y polen. Permitiendo establecer su
identidad y el grado de pureza del material. (Esa, 1995)
Las plantas biosintetiza y almacenan una importante variedad de sustancias
qumicas (metabolitos), para poder analizarlos se realiz una serie de mtodos de
extraccin, la extraccin es un proceso de transferencia de materia, Una vez
obtenido el extracto crudo habr que separar los distintos grupos fitoqumicos
presentes en l, es decir realizar un fraccionamiento. Para ello se recurre a
distintos procedimientos: particin, precipitacin, variacin de pH, cristalizacin,
destilacin, sublimacin, cromatografa, reacciones colorimtricas. (Ocn, 1980).
El anlisis fitoqumico tiene como objetivo determinar los metabolitos secundarios
presentes en la especie vegetal a estudiar, por ejemplo en las plantas medicinales,
aplicando para ello una serie de tcnicas de extraccin, de separacin y
purificacin y de determinacin estructural de los compuestos presentes en las
plantas. (Rzedowski, 1998).
Al observar sus metabolitos secundarios y la manera de extraccin de cada uno,
los mtodos utilizados para obtener cada uno de los metabolitos son explicados
ms adelante, pero en general se realizaron con disolventes como cloroformo y
etanol, los metabolitos obtenidos fueron: saponinas, aminocidos, compuestos




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fenlicos, Taninos, Flavonoides, Quinonas, Cardiotnicos, Alcaloides,
Leucoantocianinas.
Este trabajo fue realizado con la finalidad de identificar las propiedades de
Selaginella lepidophylla, espcimen originaria del territorio nacional Mexicano, y
poder revalorizar las propiedades de una planta para consumo y beneficio de las
personas de la comunidad Sto. Tomas Mazaltepec Etla Oaxaca, brindando
informacin sobre los metabolitos encontrados en esta especie benfica.






















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II. OBJETIVOS


II.I. OBJETIVO GENERAL:

Identificar y Caracterizar por tcnicas histoqumicas la especie Selaginella
lepidophylla (conocida como siempre viva o doradilla), una planta endmica del
estado, con el fin de contribuir a la revalorizacin de la flora autctona oaxaquea
para poder brindar conocimientos bsicos acerca de este espcimen especifico.

II.II. OBJETIVOS ESPECIFICOS:
Realizar las tcnicas bsicas del anlisis histoqumica que permitan
explicar las propiedades de la planta

Desarrollar las tcnicas de colecta y herborizacin.


Desarrollar la tcnica de Dizeo de Strittmater (diafanizado) para permitir la
clarificacin del material vegetal.

Reconocer caractersticas especficas a travs de una marcha que
involucra pruebas microscpicas.


Realizar tcnicas cromatografcas para separar componentes e identificar
una muestra vegetal. (Capa fina, de columna, tcnica de elusin y
recoleccin de fracciones).

Identificar los metabolitos principales de la planta.









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III. MARCO REFERENCIAL
Los tejidos vegetales son un conjunto de clulas que poseen la misma estructura y
que desempean una determinada funcin, un grupo de clulas organizadas
como una unidad estructural y funcional. El componente o componentes qumicos
responsables de su utilidad en diferentes reas: etnofarmacognstico,
farmacolgico, microbiolgico, toxicolgico y fitoqumico. En el rea de
Fitoqumica, se tiene como objetivo el anlisis de metabolitos, presentes en
Selaginella lepidophylla siempre viva. Aplicando en ello una serie de tcnica:
Extraccin, Separacin, determinacin estructural, etc., aplicando en ello una serie
de tcnica: Extraccin, Separacin, determinacin estructural, etc.
Los estudios fitoqumicos tienen como finalidad identificar los diferentes tipos de
compuestos que biosintetiza la planta, estos anlisis se les conoce como.
screening fitoqumico, o estudio fitoqumico sistemtico.
Las plantas tienen su importancia en diferentes campos, por ser uno de los
recursos naturales ms utilizados por el hombre como lo son en plantas
alimenticias, medicinales, energticas, ornamentales, para la construccin entre
otras. (Martnez 1996)
El conocimiento de la propiedades de las plantas se conocen desde tiempos
antiguos, el ser humano ha recurrido a las plantas en busca de curacin para sus
afecciones, teniendo conocimiento de que las especies vegetales poseen las
propiedades medicinales necesarias para la sustentar sus problemas. Se tiene
referencias que los antiguos pobladores tenan un manuscrito donde clasificaban
las propiedades teraputicas de las plantas, en nhuatl denominado Libellus de
Medicinalibus Indorum Herbis, conocido como Codice Badiano por la traduccin
que hiciera de la misma al latn Juan Badiano. (Pava H.2001)
La planta que analizamos Selaginella lepidophylla, se distinguen por su
particular capacidad de permanecer largos periodos de tiempo (hasta 10 aos) en
sequa, sin morir. Recibe varios nombres: Doradilla, Siempre viva, planta de
resurreccin y la planta de la roca.







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Antecedentes
Los antecedentes que se tienen registrados datan desde el siglo XVI, Martn de la
Cruz la describe para la contraccin de la rodilla. (Cdice de la Cruz-Badiano).
Juan de Esteyneffer a principios del siglo XVIII la usa contra "el mareo,
destemplanza del hgado, obstruccin heptica, melancola hipocondriaca (Cdice
Florentino). En el siglo XX Maximino Martnez reporta los usos siguientes: clculos
de la vescula, dispepsia, diurtico, padecimientos hepticos y para el dolor de los
riones.
Los ocultistas de todos los tiempos han tenido conocimientos que esta es una
planta sacra y una de las ms teraputicas de nuestra biodiversidad. La doradilla
absorbe y se alimenta de todo tipo de energas del lugar donde se encuentra,
especialmente de las negativas, transformndolas en positivas.
Las plantas de Selaginella lepidophyla son resistentes al congelamiento y al calor.
Este descubrimiento es de gran importancia para la economa nacional ya que, el
estudio de la resistencia de las especies de Selaginella lepidophyla gracias a la
trehalosa, permitiran la produccin de cultivos ms resistentes que mejoraran la
agricultura y por ende, la economa mexicana.
Trabajos actuales
Dentro de los trabajos que aportan
datos sobre Selaginella lepidophylla,
tenemos los de Adams et al. (1990) y
Martnez (1996), quienes indican que
la planta es conocida como
"doradilla", contiene algunos aceites,
cidos orgnicos, polisacridos como
la sacarosa y trehalosa.

Se le puede encontrar en lugares
cuyo clima sea clido, semiclido,
simiesco y templado. Argueta et al.
(1994) y Aguilar et al. (1999), indican
que la infusin o la decoccin se
utilizan para el tratamiento de
clculos biliares, dolor de rin y
diurticos.



Tabla1. Distribucin de Selaginella
lepidophylla en los estados de la Repblica
mexicana son: (Adams et al. (1990) y
Martnez (1996))
Baja California Norte
Baja California Sur
Chihuahua
Coahuila
Colima
Durango
Guerrero
Jalisco
Mxico
Nayarit
Nuevo Len
Oaxaca
Puebla
Quertaro
San Luis Potos
Sinaloa
Sonora
Tamaulipas
Zacatecas.






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Farmacolgicamente, se ha realizado unestudio para detectar la actividad
antibitica del extracto etanolito de la planta sobre algunos microorganismos, pero
se observ ausencia de actividad (Argueta et al., 1994).
Prez et al. (1994) estudiaron la accin de un tetrahidrofurano aislado de la planta
sobre la inhibicin de la contraccin del tero, en donde se demostr que tiene un
efecto inhibitorio ligero sobre este msculo.

Ms recientemente, Vzquez-Ramrez (2004), partiendo de este estudio
etnobotnica, realiz la evaluacin del efecto diurtico de Selaginella lepidophylla
en rata, los resultados preliminares de estos trabajos indican que el extracto
acuoso y el liofilizado de la planta presentan efecto diurtico y que en las
condiciones experimentales estudiadas esta especie no presenta toxicidad. Mickel
y Smith (2004) describen a Selaginella lepidophylla y mencionan que es una
planta donde los tallos frecuentemente forman roseta, con hojas medias agudas
amucronadas y margen hialino.








FIGURA 1. Selaginella lepidophylla











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Tabla2. Caractersticas Generales Selaginella lepidophylla


Preparacin de un Ejemplar de Herbario
Pasos para que una planta llegue a formar parte de una coleccin de herbario.
a. Colecta
b. Prensado y Secado
c. Montaje
d. Identificacin
e. Etiquetado
f. Encamisado
g. Entrada al Herbario
a.- Colecta. Elegir un lugar a donde se piensa ir a colectar. Aqu necesita
llevar libreta de campo, bolsas de plstico, tijeras de podar y lpiz para hacer
anotaciones. Dependiendo de las caractersticas de las plantas, por ejemplo: si
son leosas o herbceas. Se toma la muestra de la planta con las caractersticas
que se necesitan para una buena muestra de herbario. Todas las muestras se
colocan al interior de una bolsa de plstico, en una zona adecuada para trabajar
las muestras se sacan de las bolsas. Se anotan los datos de la colecta, como la
fecha, condiciones del sitio de colecta, condiciones del tiempo imperante en el
momento de la colecta y si se conocen las plantas que estn al rededor se anotan
los nombres. Color de la flor si la tiene y si se considera la abundancia.
(NAVARRO 2000)
Sinonimia popular

Planta de la Roca, Siempre viva, doradilla,
Planta de resurreccin, Rosa de Jeric.
Selaginela
Sinonimia botnica.
Selaginella martensii, Selaginella kraussiana., Selaginella
lepidophylla
Botnica y ecologa.
Pequeos plantas herbceas de unos 15 cm de altura, segn
especies. Hojas minsculas, en forma de escamas planas, sobre
tallos rastreros, menudos y ramificados.
Etnobotnica y antropologa.
se utiliza para el tratamiento de clculos biliares, dolor de rin y
diurtico





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De cada planta se cortan de tres a cuatro ejemplares, estos forman una colecta y
se le asigna un nmero de colecta y as sucesivamente hasta completar todas
aquellas plantas colectadas. Para tener un mejor control de las colectas, el
nmero de colecta se anota en la libreta de campo y por lo mismo en las hojas de
papel peridico donde se colocaron las plantas para secarse. Si lo anterior no es
posible, se anotan en el papel peridico la fecha y el sitio de colecta adems del
nombre comn que le dan a la planta en la comunidad. (NAVARRO 2000)
b.- Prensado y secado. Se coloca la muestra colectada, con cuidado entre
las hojas de papel peridico. Asegurndose que las hojas de la planta estn
acomodadas en un sentido haz-enves, para poder observar las formas de las
hojas por ambos lados. A continuacin se coloca el papel peridico sobre el
cartn, cubrir con papel peridico la muestra, luego con cartn y as
sucesivamente hasta prensar todas las hojas (fig. 2). Posteriormente colocar los
cartones entre dos rejas de madera resistente y se amarra fuertemente con un
cordn (figuras 3 y 4). De esta manera ya se tiene lista la planta prensada y
se coloca en la secadora, donde se le proporciona calor a la prensa y en el
transcurso de tres a cuatro das se revisa la prensa para determinar cules
muestras de plantas estn secas. (NAVARRO 2000)





Figura 2: Material que se usa para el secado de una planta. El espcimen debe
extenderse y arreglarse correctamente y llevar un rtulo de identificacin. El cartn
corrugado permite el paso del aire por su interior, acelerando la prdida de
humedad.







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Figura 3. La prensa porttil. Las correas sirven para cerrar y dar presin a la
prensa.




Figura 4. Prensa botnica comn, diseada para usarse en el campo.






Figura 5. Dispositivo de laboratorio, til para el secado de varias plantas
prensadas a la vez.




Figura 6. Prensa botnica diseada para usarse en el laboratorio. Permite una
presin ms uniforme que la de la prensa de campo; pero el secado de las plantas
depende bsicamente de una buena fuente de calor.
NOTA: Las que an no se secan, se sujetan nuevamente y se meten a la
secadora par que al siguiente da se revise hasta completar que todas las plantas
estn secas.




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c.- Montaje. Cuando la planta ya se encuentra seca totalmente se coloca
sobre una cartulina blanca y se sujeta con puntadas de hilo blanco. Sin que se
vaya a romper la muestra ya que en este momento es muy quebradiza. Tambin
se puede pegar con Resistol u potro pegamento como el silicn. (NAVARRO
2000)
d.- Identificacin. Las plantas generalmente tienen dos nombres. Un libre o
comn y un nombre cientfico. El nombre comn es el que le otorga la vox populli y
es del dominio pblico, adems una planta puede tener mas de un nombre comn
en diferentes comunidades. El nombre cientfico es el que le asigne un taxnomo,
por lo general un bilogo especialista en el estudio y clasificacin de las plantas es
el que clasifica la planta especificando la Familia, genero y especie. El nombre
cientfico identifica a la planta y con este es conocida en todo el mundo.
(NAVARRO 2000)
e.- Etiquetado. Al identificar la planta se hace necesario elaborar una
etiqueta de herbario, en esta se escriben los datos que se anotaron en la libreta de
campo cuando se realiz la colecta. (NAVARRO 2000)
Familia
Nombre cientfico
Nombre comn
Fecha de colecta
Sitio de colecta
Fenologa de la planta
Abundancia
Caractersticas
Nombre de quin colecto y numero de colecta
Nombre de quin identifico
Usos. Medicinal, alimento, cerca viva, ornamental entre otros
Forma de uso
La etiqueta se coloca y pega en la parte inferior esquina izquierda

f.- Encamisado. Despus del montaje y etiquetado a la planta colectada se
le llama ejemplar de herbario. El cual se protege con papel de china, este debe
cubrir por completo el ejemplar para evitar que se deteriore por el manejo de
consulta y estudio. (NAVARRO 2000)
g.- Entrada al herbario. Previo tratamiento de fumigacin es colocado en la
coleccin del herbario. El principal herbario en Mxico es conocido como Herbario




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Nacional y sus siglas son MEXU y en este se tienen concentradas la mayora de
las plantas que existen en Mxico. (NAVARRO 2000) La planta desecada est
fijada a la cartulina con delgadas tiras de papel engomado.





Figura 7. Ejemplar botnico montado y etiquetado.
.Mtodos histolgicos
La determinacin taxonmica no puede basarse slo en la morfologa floral, ya
que los caracteres son inconstantes y conectan con formas intermedias, por lo que
un estudio anatmico a nivel de raz, tallo y hoja, as como la morfologa del polen
ayudarn a una identificacin ms precisa. (Esau, K. 1976)
III.I. Diafanizado
La primera tcnica desarrollada fue el Diafanizado, mtodo que se basa en el
propuesto por Stittmatter y Dizeo, (1973) y se aplic a la mayora de las especies
latifoliadas herbceas (hierbas).
La tcnica de diafanizado consiste en hacer translucidos los tejidos por medio de
la aplicacin de algn agente aclarante, provocando la eliminacin de pigmentos
y/o algunas otras estructuras. Es til para estudiar la anatoma vascular de los
rganos vegetales, tambin para elucidar la organizacin tridimensional de los
rganos. Los aclarantes son mezclas que degradan diversos compuestos, como
pigmentos, contenidos celulares, etctera, y se tornan ms transparentes los
rganos enteros de una planta o parte de ellos. Con este tratamiento, muchas
estructuras celulares se eliminan y el material deja de ser adecuado para otros
estudios. El tiempo de aplicacin de los aclarantes requieren atencin, porque
estos pueden hidrolizar o macerar parcial o totalmente los tejidos. El mtodo de
diafanizacion nos sirve para la identificacin de una especie de manera




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microscpica. Hay diferentes mtodos de diafanizacin existe el mtodo de
diafanizacin de Sorensen este nos permite observar las caractersticas
histolgicas de la muestra, de tal manera de poder compararla con los patrones ya
existentes, y el mtodo que utilizamos nosotros fue el mtodo de Dizeo de
Strittmater este nos permite la clarificacin del material vegetal. (Stittmatter y
Dizeo, 1973)
El diafanizado permiti desarrollar las tcnicas de identificacin microscpicas y
caractersticas de la planta, para el reconocimiento en drogas no pulverizadas
(enteras o troceadas) es generalmente suficiente el control de caractersticas
organolpticas y botnicas macroscpicas para caracterizar eidentificar la droga,
mientras que en drogas pulverizadas suele ser imprescindible el uso de mtodos
microscpicos. (Ibez, 2002)
Caracteres morfolgicos: Forma, tamao, color y forma de las hojas
Caracteres organolpticos: olor, sabor, color.

III.II. Deteccin de adulteraciones y falsificaciones en drogas en polvo
Anlisis microscpico
Elementos celulares como pelos, vasos, esclereidas, estomas, y acelulares, como
cristales y granos de almidn. Con ellos se puede confirmar la identidad de las
drogas cuando los anlisis macroscpicos han sido insuficientes. Tambin son
necesarios para descartar la presencia de adulteraciones.
Cortes histolgicos. No se puede aplicar siempre, solo en droga entera o
fragmentos, pero no en droga pulverizada. En ellos se pueden observar
contenidos celulares, estructuras. Drogas pulverizadas. Las caractersticas
organolpticas y macroscpicas son insuficientes para su identificacin, por lo que
se hace necesario el estudio microscpico. Se observan los contenidos celulares
(granos de fcula y aleurona, cristales, grasas y esencias), los elementos celulares
(vasos, traqueidas, clulas epidrmicas, estomas, parnquima, colnquima, sber,
esclernquima, clulas ptreas, fibras y pelos o tricomas). (Sgto. Cabral)
Carbonato clcico: se denominan cistolitos, y se encuentran en la base
ensanchada de ciertos pelos caractersticos de algunas especies vegetales
(Camo Indiano). (Fahn, A. 1985)




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Oxalato clcico: Se pueden presentar de diferentes formas segn la droga de que
se trate.
Las formas pueden ser:
Aciculares: Se denominan rafidios y pueden encontrarse:
Aislados Agrupados ,Paquetes, Estrella ,Haz
Prismticos: de formas muy diversas
Cristales agrupados en forma de roseta: drusas
Cristales arenceos.

Granos de almidn (fculas)
Para estudiar el almidn es necesaria la observacin de las siguientes
Caractersticas:
1. Frecuencia: abundantes, poco abundantes o escasos
2. Granos simples o compuestos, aislados o agrupados
3. Forma: Lenticular, elptica, polidrica, ovoide...
4. Tamao de los granos: pequeo, medio, grande, variable.
5. Posicin: Cntrico y Excntrico
6. Forma: Lineal, Puntiforme y Estrellado

Clulas epidrmicas
Las plantas herbceas y en general todos los tejidos jvenes, que no
experimentan un desarrollo secundario, tienen su superficie constituida por clulas
de epidermis y su forma vara segn las distintas especies. (Fahn, A. 1985)
Estomas: En la epidermis es frecuente que se observen aberturas de la epidermis
rodeadas por dos clulas oclusivas, y en muchos casos dos o ms clulas
adyacentes de epidermis (clulas anexas) suelen estar rodeando a las clulas
oclusivas del estoma. (Fahn, A. 1985)
Se pueden clasificar en 4 tipos:
A. Anomocitico: Las clulas epidrmicas que rodean al estoma, no presentan
una disposicin particular.




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B. Anisocitico: Poseen tres clulas epidrmicas alrededor del estoma y una de
ellas es ms pequea que las otras dos.
C. Paracitico: Con una o ms clulas epidrmicas a cada lado del estoma, en
posicin paralela al eje longitudinal del mismo.
D. Diacitico: clulas epidrmicas que envuelven al estoma y su membrana
comn forman ngulos rectos con el eje longitudinal del mismo.

Pelos
Se presentan en clulas epidrmicas y tienen estructuras y formas muy diversas.
Poseen un gran valor de diagnstico en el anlisis de drogas pulverizadas. (Fahn,
A. 1985)

Mtodos analticos
III.III. Cromatografa de columna
Estas tcnicas han sido las ms desarrollada en los ltimos aos, empleada en la
qumica analtica. Su empleo presenta notables ventajas:
1. Es sencilla, rpida y no requiere aparatos complicados.
2. Abarca escalas microanalticas hasta escalas industriales.
3. Es una tcnica poca o nada destructiva que puede aplicarse a sustancias
lbiles.
Constituye una metodologa imprescindible en estudios bioqumicos, toxicolgicos,
estructurales, etc. No solo utilizando como tcnica de separacin e identificacin,
sino como mtodo preparatorio, incluso a escalas industriales. (Smith I, Feinberg
JG 1965)
La palabra cromatografa proviene de kromatos, color y graphos, escrito. Una de
las definiciones de la tcnica ms correcta seria, la dada por Keulemans:
"Mtodo fsico de separacin en el que los componentes a separar se distribuyen
en dos fases, una de las cuales constituye un hecho estacionario de gran
desarrollo superficial y la otra un fluido que pasa a traves o a lo largo del lecho
estacionario (fase mvil)." (Smith I, Feinberg JG 1965)




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En todo proceso cromatografico la fase mvil es la que provoca un movimiento de
las distintas especias para que abandonen el medio soporte, y la fase estacionaria
la que suministra el efecto retardador, selectivo para cada componente, que
condiciona que cada uno de ellos se desplace con distinta velocidad. (Smith I,
Feinberg JG 1965)

Estudios fitoqumicos
El estudio basado en una marcha Fitoqumica consiste en efectuar una extraccin
(del material previamente colectado, secado y molido) que permita obtener la
mayor parte de los constituyentes qumicos (extracto total o crudo o bruto). Por
ello se debe utilizar un solvente universal que solubilice (y cosolubilice) la mayora
de los compuestos, siendo los ms utilizados el metanol y el etanol.
Posteriormente el extracto total se fracciona mediante un cambio de pH y particin
con solvente de menor polaridad (generalmente cloroformo), obtenindose una
serie de fracciones sobre las que se realizan ensayos que permitirn obtener
datos sobre los grupos fitoqumicos presentes. (Dra. Olga Lock de Ugaz)
Requisitos de la marcha
1. Debe ser simple y rpida.
2. Debe ser reproducible.
3. Utilizar equipos sencillos.
4. Ser relativamente sensible y especfica para la/s sustancias a detectar.
5. Podr dar informacin adicional sobre los grupos detectados.
6. Ser cualitativa y semicuantitativa.
Los datos positivos obtenidos en general no ofrecen dudas, salvo en el caso de
falsos positivos. Un resultado negativo puede resultar necesario asegurarlo
considerando que tal vez no se ha realizado un perfecto fraccionamiento, teniendo
en cuenta las posibles variaciones estacionales y ecolgicas de la planta, y la
metodologa de la extraccin que puede no haber alcanzado a extraer todos los
componentes sobre todo si se hallan en muy baja concentracin. (Dra. Olga Lock
de Ugaz)







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Tecnicas generales a aplicar en un analisis fitoqumico
I. De extraccin:
En soxlhets.
Maceracin.
Percolacin.
Arrastre de vapor.
Fluido supercrtico.
II. De separacin y purificacin:
Cromatografa de papel CP
Cromatografa de capa
Delgada, CCD
Cromatografa liquida (de
columna:CC)
Cromatografa en
contracorriente, CCC
Ascendente CPA
Descendente CPD
Circular CPC
Preparativa CPP
Analtica CCD
Preparativa CCDP
Bidimensional CCDB
Adsorcin
Particin
Exclusin
Intercambio inico
Alta Performance, HPLC
A la gota (DCCC)
Alta velocidad (HSCCC)
Cromatografa gas-liquida,CGL

III De determinacin estructural Espectromtricas
Ultravioleta-visible, UV- Vis
Infrarrojo, IR
Resonancia magntica nuclear
De protn y de carbono-13
RMN- H
RMN- C
De masa, EM
Rayos X
Reacciones de coloracin y de
precipitacin




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Metabolitos secundarios frecuentes en las plantas.
Los constituyentes qumicos se agrupan segn su origen biosinttico comn, y
as podemos mencionar a los terpenos y esteroides, flavonoides, crmenos y
benzofuranos, cumarinas, quinonas, alcaloides entre otras. (Dra. Olga Lock de
Ugaz).
Los metabolitos secundarios pueden ser bioactivos, pero no jugar un papel
esencial en los procesos fisiolgicos del organismo. Algunos metabolitos
secundarios son residuos bioqumicos, es decir, productos de actividad
enzimtica de substratos no apropiados o productos de destoxificacin o
desecho de importancia para la supervivencia y la buena condicin de los
organismos.
III.IV. Terpenos y esferoides
El trmino terpeno se refiere a un grupo de sustancias que se biosintetizan
siguiendo la llamada regla del isopreno, esbozada por Wallach en 1866.
Pueden clasificarse como monoterpenos (C 10), sesquiterpenos (C 15),
diterpenos (C 20). triterpenos (C 30) y tetraterpenos (C 40), segn el nmero
de unidades de isopreno (2,3, 8) que los forman. (Dra. Olga Lock de Ugaz)
Monoterpenos.
Constituyen un importante grupo de hidrocarburos, alcoholes y cetonas, que
son los compuestos mayoritarios de los aceites esenciales obtenidos de hojas,
races, corteza y flores de diversas plantas; pueden presentarse como
compuestos acclicos, monocclicos y cclicos. (Dra. Olga Lock de Ugaz)
Dentro de los monoterpenoides debemos considerar a los iridoides y
secoiridoides que tienen como caracterstica presentar un grupo B-glucosiloxi-
en el carbono- 1 y un doble enlace entre los carbones 3 y 4. Presentan tambin
diversos grupos funcionales y pueden encontrarse bajo la forma de agliconas y
glicsidos. (Dra. Olga Lock de Ugaz)
Sesquiterpenlactonas
Las sesquiterpenlactonas, derivadas biogenticamente de los sesquiterpenos,
son una clase de productos naturales distribuidos menos ampliamente que
estos ltimos y de ocurrencia predominante en la familia Asteraceae
(notablemente en gneros Artemisia y ambrosia), de all que su distribucin
permite ser aplicada a problemas taxonmicos especialmente en los gneros
nombrados y en otras taxas.
Son sustancias amargas que se encuentran en todas las partes de las plantas,
en concentraciones que varan entre 0,01 y 8% del peso seco, siendo las
concentraciones mayores generalmente en las hojas; son bastantes solubles
en cloroformo y en ter etlico. Presentan gran importancia por la variada




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accin biolgica que han demostrado: accin citotxica, antitumoral,
analgsica, inhibidoras del crecimiento de bacterias, entre otras.
Estos compuestos lactnicos son primariamente clasificados en base a su
esqueleto carbocclico como germacronlidos, guaianlidos, eudesmanlidos y
pseudo-guaianlidos, entre otros (el sufijo olido se refiere a la funcin lactona ).
Diterpenos
Comprende un grupo de compuestos de 20 tomos de carbono que puede
presentarse en forma de hidrocarburos, alcoholes, cetonas, lactonas y cidos
carboxlicos, siendo estos ltimos conocidos desde tiempo atrs como cidos
resnicos y obtenidos como componentes de las oleorresinas exudadas por
cortes en los troncos de pinos y abetos. (Domnguez XA. 1973)
Se subdividen atendiendo al tipo de esqueleto carbonado, entre otros, como
bicclicos (tipo lbdano y clerodano); trieclicos (tipo primario, abietano,
cassano, totarona y podocarpano); tetracclcos (tipo
Kaurano,beyerano,atisano,giberelano). (Domnguez XA. 1973)
Los diterpenos han sido clasificados tambin en base a sus propiedades; entre
los cidos resnicos ya nombrados, tenemos los cidos abitico, y agtico a los
que se les atribuye funcin protectora en la planta; los diterpenos txicos como
las grayanotoxinas que ocurren en las hojas de rhodadendron y son los
responsables de la naturaleza venenosa de ellas; y las giberelinas, un grupo de
hormonas que estimulan el crecimiento vegetal, de las cuales el ms comn es
el cido giberlico. (DOMNGUEZ XA. 1973)
Algunos diterpenos muestran actividad antitumoral como la taxodiona aislada
de Taxodium distichum, la jatrofona de Jatropha gossypifolia, la gnidicina de
Gnidia lamprantha, el ingenol del Euphorbia escula; siendo quizas el taxol del
Taxu$ brevifolia Nutt, el de mayor importancia a la fecha; otros muestran
actividad irritante, txica o carcinognica como los esteres de forbol aislados de
especies de Croton y Euphorbia, actividad antiinflamatoria como el
cajucarinlido de Croton cajucara; edulcorante como el steviosidio de Stevia
rebaudiana. Otro ejemplo es el forskolin de Coleus forskohlii, que en vista de
sus propiedades ha sido considerado para ser desarrollado como un agente
para el tratamiento de cardiomiopatas congestivas, glaucoma y asma.
(DOMNGUEZ XA. 1973)
III.V. Triterpenoides y Esteroides.
Los triterpenoides son compuestos con un esqueleto carbonado basado en seis
unidades de isopreno que derivan biogenticamente del escualeno,
hidrocarburo acclico de 30 carbonos. Son de estructura relativamente compleja
generalmente tetracclicos o pentacclicos y pueden contener grupos hidroxilo,




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20
cetona o aldehdo y cido carboxlico. Muchos se encuentran como glicsidos
formando las llamadas saponinas triterpenoides. (DOMNGUEZ XA. 1973)
Los esteroides, biogenticamente muy relacionados a los triterpenoides, y con
un esqueleto cclico base al igual que los triterpenoides tetraciclicos, de
ciclopentanoperhidrofenantreno, pueden ser clasificados como esterles (C27
ms), saponinas esteroidales (o sus agliconas sapogeninas), glicosidos
cardiacos, esterocaloides y las llamadas hormonas esteroidales, las que hasta
la dcada del 60 eran consideradas exclusivamente de origen animal, pero que
a partir de 1966 se han aislado de tejidos de plantas aunque en
concentraciones muy pequeas, y en algunos casos como trazas. Por poseer
estos ltimos el grupo de hidroxilo en el carbono 3 son considerados por
algunos autores dentro del grupo de esteroles y ms especficamente como
zooesteroles para diferenciarlos de los fitoesteroles, aquellos que desde sus
inicios son considerados de origen vegetal. (DOMNGUEZ XA. 1973)
Los triterpenoles y esteroles son slidos, incoloros, cristalinos, pticamente
activos, de alto punto de fusin; los esteroles, generalmente tienen punto de
fusin menor que 200C y los triterpenoles mayor que 200C. (DOMNGUEZ
XA. 1973)
Las saponinas son glicosidos de ambos, triterpenos y esteroles, dan soluciones
jabonosas, y algunos extractos crudos de plantas han encontrado uso como
detergentes, y para la produccin de espumas estables. Ellos causan hemolisis
de la sangre an en soluciones muy diluidas, una propiedad que ha sido
utilizada para su deteccin en extractos de plantas. Las saponinas no son
fciles de aislar por ello muchas veces se prefiere hidrolizar el extracto crudo
de la planta y aislar la sapogenina libre de azcares. Con pocas excepciones el
azcar est unida a la aglicona a travs del grupo - OH en C-3. (A. Martnez
1997)
Las saponinas del grupo triterpeno se encuentran extensamente distribuidas, y
constituyen la mayora de las saponinas encontradas en la naturaleza; una
gran variedad de ellas difieren nicamente en el nmero y tipo de unidades de
azcares unidas a las sapogeninas; generalmente pertenecen al grupo de la B-
amirina, otras pocas son derivadas de la &-amirina, del lupeol y del grupo de
triterpenos tetraciclicos. (A. Martnez 1997)
Fuentes ricas de saponinas triterpenoidales y sus genuinas son el ginseng, la
alfalfa, la avena, la quinua y la soya entre otras. Las saponinas esteroidales
son materia inicial para la preparacin de varios productos muy potentes y
ampliamente usados como productos farmacuticos, entre ellos cortisona,
anticonceptivos, estrgenos.testosterona, etc. Fuentes ricas de saponinas
esteroidales son especies de las familias Dioscoreaceae, Liliaceae y
Escrofularaceae. Algunos ejemplos son; digitonina (Digitalis purpurea y D.
lanata), gitogina (D.purpurea) tigonenina (D.lanata), sarsapogenina (Radix




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sarsaparrilla, Yucca schott); dioscina (Dioscorea tokora), etc. (A. MARTNEZ
1997)
Los glicsidos cardiacos o principios activos cardiacos tienen la habilidad de
ejercer una especfica y fuerte accin sobre el msculo cardiaco, son llamados
tambin principios cardiotnicos. Ocurren en pequeas cantidades en las
semillas, hojas, tallos y races de plantas de las familias Escrofularaceae,
Liliaceae, Moraceae.Ranunculaceae, Apocinaceae. Muchas especies crecen
en regiones tropicales y han sido empleadas por los nativos de Africa y Sur-
amrica para preparar flechas venenosas para la caza y la pesca. Las drogas
hechas de las hojas secas han encontrado uso desde la antigedad y quizas
sea la Digitalis purpurea la ms usada. (A. MARTNEZ 1997)
Los estereoalcaloides ocurren frecuentemente como glicsidos en especies del
gnero Solanum y otros. La solanidina y tomatidina son dos ejemplos tpicos de
este grupo de compuestos. (A. Martnez 1997)
III.VI. Flavonoides
Los pigmentos flavonoides, son uno de los grupos ms numerosos y
ampliamente distribuidos de constituyentes naturales. (Dr. Albert Szent-Gyorgi)
Se conoce como diez clases de flavonoides, todos contienen quince atomos de
carbono en su ncleo bsico y estn arreglados bajo un sistema C6- C3- C6,
en el cual dos anillos aromticos llamados A y B estn unidos por una unidad
de tres carbonos que pueden o no formar un tercer anillo, que en caso de
existir es llamado anillo C. .(Dr. Albert Szent-Gyorgi)
Los flavonoides se encuentran generalmente en mezclas como agliconas y/o
glicsidos, an de las diferentes clases siendo este ltimo ms comn, en
muchos casos debido a la complejidad de la mezcla es ms frecuente el
estudio de estos compuestos en forma de agliconas en extractos de plantas
previamente hidrolizados. Se hallan presentes en todas las partes de las
plantas, algunas clases se encuentran ms ampliamente distribuidas que otras,
siendo ms comunes las flavonas y flavonoles, y ms restringidas en su
ocurrencia las isoflavonas, las chalconas y auronas. .( Dr. Albert Szent-Gyorgi)
Los flavonoides se emplean desde hace mucho tiempo como colorantes de
lana, y actualmente se usan en la conservacin de grasas o jugos de frutas
debido a las propiedades antioxidantes de algunas polihidroxiflavonas. Entre
otras aplicaciones mencionaremos la de los glucsidos de dihidrochalconas
como edulcorante, de la rotenona como insecticida, etc. (Dr. Albert Szent-
Gyorgi)
La accin farmacologa es tambin extensa y variada, son bien conocidas sus
actividades como la fragilidad capilar (bioflavonoides del gnero Citrus: rutina y
derivados) dilatadores de las coronarias (proantocianidinas de Crata egus,




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rnica y Gingko), espasmolitica (glicsidos de arpigenina), antihepatotxica
(silimarina de Sylybum), colertica, estrgena y diurtica. Destacaremos as
mismo la actividad antimicrobiana de flavonoides prenilados y otros fenoles y la
accin fungitxica de las isoflavonas. . (Dr. Albert Szent-Gyorgi)
III.VII. Cumarinas
Las cumarinas son compuestos ampliamente distribuidos en las plantas,
principalmente en as familias Umbeliferae y Rutaceae; se encuentran en todas
las partes de la planta desde la raz a flores y frutos siendo ms abundante en
estos ltimos; se presentan a menudo como mezclas, en forma libre o como
glicsidos. (Dr. Albert Szent-Gyorgi)
Los desarrollos en los procesos de aislamiento y anlisis estructural en estos
ltimos aos han conducido a un marcado incremento en el nmero de
cumarinas aisladas de plantas; ello unido al inters despertado por el amplio
rango de actividad biolgica que muchas cumarinas han mostrado, como por
ejemplo la accin anticoagulante y antibacterial del dicumarol, la accin
antibitica de la novobiocina, la aguda hepatotoxidad y carninogenicidad de
ciertas aflatoxinas, la actividad astrognica del cumestrol, la accin
fotosensibilizadora de furanocumarinas como el bergapteno y la xantotoxina, la
accin insecticida de los surangin A y B, entre otros; cabe destacar tambin las
aplicaciones de las cumarinas como saborizantes y en perfumera. (Dr. Albert
Szent-Gyorgi)
Las cumarinas de las cuales solo el 5% aproximadamente carece de oxgeno
en la posicin -7, pueden clasificarse como:
Simples, o sus derivados hidroxilados, alcoxilados y alquilados, y sus
glicsidos.
Furanocumarinas, lineales o angulares.
Piranocumarinas, anlogas a las anteriores con un anillo de pirano,
pueden ser tambin lineales o angulares.
Cumarinas preniladas.
Cumarinas sustituidas en el anillo de pirona.

II.XIII. Cromenos y benzofuranos
Los crmenos y benzofuranos son productos naturales que se han encontrado
en algunas especies de Rutaceae, Liliaceae, Ciperaceae y principalmente en
ciertas tribus de las Asteraceae, entre las cuales parece ser exclusivos de las
Astereae, Eupatorieae, Heliantheae, Inulaeae y Senecioneae. (Dr. Albert Szent-
Gyorgi)




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Estos compuestos se encuentran presentes generalmente en hojas y tallos, y
menos comnmente en races habindose encontrado en los primeros hasta un
5% sobre el peso seco. (Dr. Albert Szent-Gyorgi)
Muchos crmenos y benzofuranos han mostrado ser biolgicamente activos
como el toxol y la dehidrotremetona que son bacteriostticos; la tremetona, la
dehidrotremetona y la hidroxitremetona son txicos a los peces; el toxol y el
angelato de toxilo exhiben una dbil actividad antitumor contra la leucemia
linfocitica P- 388; el encecalin, el 7- hidroxiencalin y la 6- metoxieuparina son
fototxicos a varios hongos y bacterias; el encecalin tambin ha mostrado
accin insecticida; as mismo los precocenos I y II actan como hormonas
antijuveniles en los insectos. (Dr. Albert Szent-Gyorgi)
II. IX. Xantonas
Son pigmentos fenlicos amarillos; qumicamente son diferentes a los
flavonoides, pero son muy similares en sus reacciones de coloracin y en su
movilidad cromatogrfica. Se presentan especialmente en ciertas familias:
Gutiferae, Gentianaceae, Moraceae, y Polignonaceae, al estado libre o como
O- glicosidadas, siendo menos comunes las C- glicosidadas. (Dra. Olga Lock
de Ugaz)
Las Xantonas aisladas a la fecha pueden ser clasificadas en cinco grupos
mayores: xantonas simples oxigenadas, glicosidadas. Preniladas, lignoides y
miscelneos.El inters creciente de estos compuestos es explicado por su
actividad farmacolgica; inhibidor de la monoaminoxidasa, actividad
antipsictica, efecto tuberculosttico, entre otros. (Dra. Olga Lock de Ugaz)
II. X. Quinonas
Las quinonas naturales son un grupo de compuestos cuya coloracin puede
ser desde el amarillo plido hasta casi negro. Se encuentran frecuentemente
en la corteza, en el corazn de la madera o de la raz, y en algunos casos en
las hojas, donde su color est enmascarado por otros pigmentos. En general,
estn ampliamente distribuidas pero contribuyen en muy pequea extensin a
la colaboracin de las plantas superiores, a diferencia por ejemplo de los
carotenoide y antocianinas; en cambio hacen mayor contribucin en las
bacterias, hongos y liqenes. Para su mejor estudio las quinonas se subdividen
en benzoquinonas, naftoquinonas, antraquinonas, quinonas isoprenoide.
Pueden adems contener diversos grupos funcionales, anillos de furanos o
pirano, encontrarse como dmeros, ser parcialmente reducidos como los
antranoles y antronas, etc. (Dra. Olga Lock de Ugaz)
Las quinonas han sido reconocidas desde la Antigedad por sus propiedades
tintreas; algunos presentan adems otras propiedades como la emodina que
es catrtica; shikonina, antimictica, plumbagina, activa para la leshmaniasis,
lapachol, cilosttica, bacteriosttica, etc. (Dra. Olga Lock de Ugaz)




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III.XI. Alcaloides
Los alcaloides constituyen el grupo ms grande de metabolitos secundarios de
plantas.Se encuentran en las semillas, races, cortezas y hojas; al estado libre
o como glicsidos, o formando sales con cidos orgnicos. Al ao 1970 se
reportaba alrededor de 5000 alcaloides aislados de aproximadamente 40
familias de plantas, principalmente de Apocinaceae (ca. 800), Papaveraceae
(ca. 400), Ranunculaceae (ca. 300), Solanaceae (ca. 150), Rutaceae (ca. 250)
y Rubiaceae (ca. 150); al ao 1990 se reporta alrededor de 7,000. (Seplveda,
2004, Wilhelm Meissne)
Aunque no hay una definicin exacta pero el trmino alcaloide, en l se
incluyen aquellas substancias bsicas que contienen uno ms tomos de
nitrgeno como parte de un sistema cclico, que manifiesta significante
actividad farmacolgica y han sido biosintetizados de aminocidos como
precursores; compuestos que llenan estas caractersticas, se dice que son
verdaderos alcaloides, para diferenciarlos de los protoalcaloides aminas
biolgicas, como las alquilaninas, biosintetizadas tambin de aminocidos, y de
pseudoalcaloides, aquellos que tambin poseen nitrgeno en un ciclo, pero no
son originados por aminocidos, por ejemplo : los derivados de purina y los
esteroalcaloides. (Seplveda, 2004, Wilhelm Meissne)
La funcin de los alcaloides en las plantas es an no muy conocida, como
ocurre con la mayoria de los productos naturales, aunque se reporta que
algunos intervienen como reguladores del crecimiento, o como repelente o
atractores de insectos; el hecho que aproximadamente el 80% de las plantas
no contienen alcaloides hace suponer que estos no son vitales para los
organismos vivientes. Sin embargo, por aos, es conocida la accin fisiolgica
de muchos de ellos. (Seplveda, 2004, Wilhelm Meissne)
















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25
IV. MARCO METODOLGICO
Se realiz una visita a Santo Tomas Mazaltepec, Etla Oaxaca, el da 8 de
marzo del ao en curso. Con el objetivo de realizar una colecta y herborizacin
de un espcimen vegetal, como tambin conocer las plantas ms comunes de
la zona, lo cual se realizara una caracterizacin e identificacin para poder
brindar conocimientos bsicos acerca de esta planta endmica, con el fin de
contribuir a la revalorizacin de la flora autctona oaxaquea, para su mejor
aprovechamiento medicinal o alimenticio.
Preparacin de un Ejemplar de Herbario
Una vez estando en la comunidad con sus respectivos materiales para realizar
la colecta, se procedi al campo e iniciamos la recolecta de un espcimen
plantas distribuidos en equipo siguiendo el protocolo respectivo para la colecta
y herborizacin descrito por Navarro en el ao 2000. Al equipo le toco
recolectar una planta que se encontraba adherida a las piedras, con hojas de
color verde obscuro, pequeas y conocida por los habitantes como planta de la
roca.
Se prensaron y secaron 10 especmenes de la misma especie, que
posteriormente fue procesado en el laboratorio de Fitoqumica de la Facultad
de ciencias Qumicas de la UABJO.
Se realiz una investigacin cientfica de acuerdo a sus caractersticas
morfolgicas para encontrar su clasificacin y datos especficos del ejemplar,
que al trmino del proceso son colocadas en un herbario, se encontr que esta
planta pertenece a la familia Selaginellaceae, con nombre cientfico Selaginella
lepidophyla (siempre viva).
Una vez llevado acabo la recolecta, el secado y la identificacin se procedi a
su herborizado y a realizar pruebas Fitoqumicas que nos permita obtener una
buena identificacin de componentes estructurales, as como las
adulteraciones o las falsificaciones que esta pueda presentar.

IV.I. Diafanizado
Como primer estudio que se realiz en el laboratorio de Fitoquimica en la
UABJO fue la tcnica de diafanizado de Dizeo de Strittmater para permitir la
clarificacin del material vegetal de la especie recolectada.





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Procedimiento histolgico
Se coloc en un vaso de precipitados hojas del material seco recolectado
previamente y se le agrego alcohol de 96 y se llev a ebullicin durante 10
minutos, enseguida se llev a partes iguales de hidrxido de sodio al 5% y
alcohol, donde se puso a ebullicin nuevamente por 10 minutos ms, despus
de eso se esper un momento a que el ejemplar se enfriara, inmediatamente
se hicieron varios lavados con agua de la llave hasta que el agua quedo limpia,
los lavados se realizaron con mucho cuidado ya que la hoja se encontraba muy
frgil, a continuacin se pas el material a un cuadro de vidrio y se realiz un
lavado con agua destilada por duplicado, inmediatamente se le aplico al
material una solucin de hipoclorito de sodio al 50%, se dej en reposo
aproximadamente por una hora hasta que la muestra tomo un color
trasparente, despus de haber quedado el material transparente se agreg
agua destilada y se hicieron 5 cambios de esta cada tres minutos,
posteriormente se coloc el material en hidrato cloral durante 10 minutos, para
quitar cualquier opacidad, terminado dicho proceso se le agrego glicerina de
modo que cubriera toda la hoja, esta con la intencin de fijarla al vidrio.

IV.II. Deteccin de adulteraciones y falsificaciones en drogas en polvo
Presencia de Carbonatos de calcio
En un tubo de ensayo se tom una pequea cantidad de la muestra, se le
adiciono unas gotas de cido sulfrico diluido
Determinacin de Almidn
Prueba microscpica: Posteriormente se realiz la identificacin de
caractersticas microscpicas, para esto se coloc la hoja previamente
diafanizada en el estereoscopio
Observacin visual con Lugol: despus de las observaciones microscpicas se
le adiciono a la placa una gota de lugol, se coloc sobre una superficie blanca y
observamos el color de la tincin para identificar la presencia de almidn en la
muestra.
Determinacin de Tricomas y Oxalatos de calcio
En hidrato de cloral se mont una placa (porta objetos), que es un reactivo que
disuelve, protenas, almidn, resinas, aceites esenciales y produce la
expansin de clulas retradas, se calent suavemente y se observ a
microscopio




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27
Determinacin de Estomas
Se tom una pequea muestra de hoja diafanizada a la cual se le agrego
safranina por un minuto, posteriormente se lav con agua y se observ al
microscopio a 10 x para poder contar los estomas y las clulas epidrmicas.
As mismo clasificarlos por su tipo
IV.III. Separacin de pigmentos Vegetales por Cromatografa en columna
Se inici con machacar 15 gr de hoja de manteca en un mortero, se pas la
masa obtenida a un matraz apropiado, se aadi 45ml de ter de petrleo, ms
5 ml de tetra clorur de carbono y 15 ml de alcohol metlico, posteriormente se
sacudi continuamente el matraz por media hora y se decant. Enseguida se
lav el residuo vegetal con 10 ml de la mezcla del solvente; se decant
nuevamente y el lquido obtenido con el anterior se tap y se guard.
Preparacin de columna
Se coloc un pedazo de algodn en la punta de una columna de cromatografa,
cuidando as que el algodn no quede muy comprimido, posteriormente se
agreg a la columna de 15 a 20 gr de silica de gel 60 (0.063-0.200mm),
golpeando as suavemente la columna para que quedara bien empacada, y as
evitar la formacin de grietas o burbujas de aire. Enseguida se agreg 5 gr de
carbonato de calcio finalmente molido tomando as precauciones, ms otros 5
gr de azcar glass, bien molido y colocamos un pedazo de algodn sobre esta
ltima capa por ltimo se coloca sobre un soporte universal.
Elucin de columna
Se abri la llave de la columna y se coloc debajo de un matraz, con una pipeta
se coloc en la parte superior de la columna 5 ml del extracto vegetal, cuando
el nivel del extracto casi coincida con el nivel del absorbente agregamos unos
mililitros de una mezcla de tetra clorur de carbono y metanol. Aparte se
prepar 500 ml de la mezcla de disolvente (CCl
4
, CH
3
OH) cuando el nivel baj
nuevamente se continuo agregando la mezcla anterior, se recolecto las
fracciones en matraces, cambiando as el matraz cada vez que aparezca un
nuevo color, identificando as la fraccin ms verde como clorofila y las otras
fracciones identificndolas con las pruebas de carotenos y xantofilas. Por hacer
ms rpida la separacin se aplic aire al sistema.






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28
Muestra seca y pulverizada (50g)
Fraccin A (AA, CF, TA, FL, TE, QU, CA, AL,
LE)
HCl diluido
Insolubles (Fraccin B) Solubles
Fase CH
3
Cl (Fraccin C)
Ensayar CA, TE
Ensayar AL (en medio
cido)
Fase Acuosa Bsica
Fase

(Fraccin D)
Ensayar FL, LE, CA, TE, AL
Fase Acuosa (Fraccin E)
Ensayar AL, FL, CF, TA
H
2
O
Ensayar FL, LE, CF, AA, TA
IV.IV. Extraccin selectiva de componentes en un material vegetal con
diferentes disolventes
Como punto final se procedi a realizar una extraccin de metabolitos con
distintas clases de solvente que permitan su adecuada obtencin.













Convenciones
AA: Aminocidos
CF: Fompuestos fenlicos
FL: Flavonoides
TE: Triterpenoides
QU: quinonas
CA: Cardiotnicos
AL: Alcaloides
LE: Leucoantocianinas
TA: Taninos
Figura 8. Marcha Fitoqumica. Obtencin de un extracto total del material vegetal, fracciones del extracto para su
posterior anlisis qumico




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Droga o muestra (50g) seca y
pulverizada
Residuo, lavarlo con alcohol
Residuo
Desechar
Filtrado
Filtrado (Fraccin A)
Ensayar AA Llevar a sequedad
Redisolver en 20 ml de agua caliente y filtrar
Residuo
Desechar
Filtrado acuoso
Ensayar FL y LE Filtrar en frio
Residuo Filtrado acuoso
Ensayar CF y TA
Fraccin A residual
Desechar
Obtencin y anlisis de la Fraccin A
















Fraccin A
Sobre esta fraccin se determina:
Flavonoides
Taninos
Lpidos
Hidratos de carbono
Compuestos fenolicos.
Leucoantocianinas



Figura 9. Obtencin y anlisis de la Fraccin A,
NOTA: Para llevar a sequedad utilice calentamiento con temperatura no mayor de 50 c




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30
Fraccin A residual
Llevar a sequedad
Aadir 30 ml de HCl 5%, Calentar a 60C durante 15
minutos, Filtrar en caliente
Residuo insoluble
Lavar con 20 ml de HCl 5% y filtrar
Residuo
Disolver con 30 ml de cloroformo o diclorometano
Deshidratar con
2

4
anhidro y filtrar
Filtrado (fraccin B)
Ensayar TE, CA, QU, FL.
Residuo
Desechar
Filtrado
Filtrado acuoso acido I
Obtencin y anlisis de la fraccin B


















Filtrado Fraccin B:
Sobre esta fraccin se determina:
Terpenos
Cardiotnicos
Quinonas
Flavonoides


Figura 10. Obtencin y anlisis de la fraccin B. marcha Fitoqumica




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31
Filtrado acuoso acido I
Alcallinizar con gotas de
4
concentrado (pH 10-11)
Particin con 2x15 ml de cloroformo (o diclorometano)
FASE orgnica
Lavar con 10 ml de
2

FASE orgnica
Deshidratar con
2

4
anhidro y filtrar
Residuo
Desechar
Filtrado (Fraccin C)
Ensayar CA y TE Llevar a sequedad
Redisolver en 10 ml de HCl 5% con calor y filtrar
Filtrado
Ensayar AL
Residuo
Desechar
FASE ACUOSA
Fase Acuosa Bsica
Obtencin y anlisis de la Fraccin C



















Sobre esta fraccin se determina:
Cardiotnicos
Terpenos
Alcaloides


FIGURA 11. Obtencin y anlisis de la Fraccin C.




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32
Fase acuosa bsica
Hacer particin con 2x15 de
3
o
2

2

FASE orgnica
Lavar con 20 ml de solucin semisaturada de NaCl
FASE orgnica
Deshidratar con
2

4
y filtrar
FILTRADO (FRACION D)
Repartir en tres porciones iguales de 5 ml c/u:
D1, D2 y D3. Llevar a sequedad
Redisolver D1 en 4ml de etanol y ensayar FL, CA, LE
Redisolver D2 en 1ml de
3
y ensayar TE
Redisolver D3 en 5 ml de HCl 1% y ensayar AL.
Residuo
Desechar
FASE ACUOSA
FASE ACUOSA (FRACCIN E)
Neutralizar con HCl y ensayar
TA (pH neutro)
FL y LE, AL (en medio cido).
CF (pH ligeramente cido)
Obtencin y anlisis de la Fraccin D y E

















Sobre esta Fraccin se determina
Alcaloides
Terpenos.
Flavonoides
Cardiotnicos
Leucociantidinas
Compuestos Fenlicos
Taninos


FIGURA 12. Obtencin y anlisis de la Fraccin D y E




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33
IV.V. Determinacin de metabolitos secundarios en la Fraccin A
Reconocimiento de Flavonoides
Reaccin de Shinoda
Se llevaron a seco 0.5 ml de la fraccin A que se retomaron con igual volumen
de agua destilad. Despus se agregaron unas granallas de Zn y 0.2 ml de HCl
concentrado. (Resultado positivo: color purpura variando del rosa muy tenue
hasta el color guinda).
Reconocimiento de compuestos Fenlicos
Reaccin de FeCl
3
Se llevaron a seco 3 ml de la fraccin A calentado a Bao Mara. El residuo se
redisolvi en 1 ml de agua destilada y se agregaron 3 gotas de FeCl
3
al
1%acuoso. (Resultados: 1OH amarillo, 2 OH adyacentes verde grisceo, 3 OH
adyacentes azul negro).

Reconocimiento de Taninos
Reaccin con Gelatina
Se llev a sequedad 3 ml de la fraccin A calentado a Bao Mara. El residuo
seco se re disolvi en 1 ml de agua destilada y se le agreg 10 gotas de
gelatina al 0.5%. (Resultado positivo: aparicin de turbidez hasta un precipitado
abundante).
Reconocimiento de Lpidos
Se coloc una gota de la fraccin A sobre papel filtro, dejndose secar, y se
expuso a Vapores de I
2.
(Resultado positivo: mancha marrn-naranja)

Reconocimiento de Hidratos de carbono

Se agregaron a 2 ml de la fraccin A seca retomada con agua, a la que se
agreg 0.5 ml de una solucin acuosa de fenol al 5% y 2.5 ml de H
2
SO
4

concentrado. (Resultado positivo: color naranja, pardo).






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IV.VI. Determinacin de metabolitos secundarios en la Fraccin B
Reconocimiento de Esteroides y Triterpenos.
Prueba de Liebermann-Buchard.
Se mezclaron 1 ml de anhdrido actico y 1 ml de cloroformo, enfrindose a
bao de Hielo. A continuacin se puso en contacto la fraccin B con la mezcla
de reactivos anterior y el tubo se coloc nuevamente en bao de Hielo,
entonces se agreg por las paredes 1 gota de H
2
SO
4 .
Enfrindose nuevamente
como ltimo paso.( Resultado positivo: coloracin verde indica la presencia de
grupo esteroide, coloracin rojo-naranja evidencia al grupo Triterpeno).

Reconocimiento de Antraquinonas
Reaccin de Borntrger
Se agitaron suavemente 3 ml de la Fraccin B con 5 ml de NaOH al
5%.(Resultado positivo: fase acuosa roja o amarilla, con fluorescencia roja).

IV.VII. Determinacin de metabolitos en la Fraccin C
Determinacin de Alcaloides
Reaccin de Dragendorff.
Se tomaron 0.2 ml de la fraccin C llevndose enseguida a sequedad, se
retomaron con 2 ml de HCl 1%, a continuacin se agregaron 2 gotas de
reactivo Dragendorff. (Resultado positivo: formacin de un precipitado pardo
anaranjado).
Determinacin de Cardenlidos
Reactivo de Kedde
Se ensayaron sobre papel filtro 1 gota de Fraccin C (llevada a seco y
retomada con alcohol) y 0.1 ml de reactivo Kedde. (Resultado positivo:
cloracin prpura o violeta persistente).







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Determinacin de Leucoantocininas
Reaccin de Rosenheim
Se llevaron a seco 2 ml de la fraccin C retomndose con el mismo volumen de
HCl al 1% en agua. Se agreg continuacin 1 ml de HCl concentrado y se
calent en Bao Mara durante 10 minutos. Se enfro y se agreg despus un
pequeo volmen de alcohol amlico. (Resultado positivo: color desde carmes
hasta rosa plido).
IV.VIII. Determinacin de Saponinas, Cumarinas y Aminocidos.
Determinacin de Saponinas
Se calent en Bao Mara 0.5 gr. De droga seca (Selaginella lepidophyla) y
pulverizada con 8 ml de agua destilada, durante 30 minutos. A continuacin se
filtr en caliente. Tomndose 1 ml de la solucin se coloc en un tubo, se tap
con el dedo agitndose fuertemente durante 15 segundos.
Determinacin de Protenas - Aminocidos
Reaccin de Ninhidrina
A1 gr. De droga (Selaginella lepidophyla.) se agreg 50 ml de agua, calentar a
ebullicin durante 2 min. Se filtr en caliente y se concentr a 5ml.Sobre papel
filtro se coloc 1 gota de solucin y se dej secar. A continuacin se agreg
una gota de solucin etanlica de Ninhidrina al 0.2%.( Resultado positivo:
Mancha azul violeta de igual, menor o mayor intensidad que el testigo. Y
deber ser de mayor intensidad que el blanco de reactivo).
Determinacin de Cumarinas
En un vaso de precipitados se coloc 1 gr. De droga (Selaginella lepidophyla.)
macerada y se agreg cantidad suficiente de etanol, cubriendo el material
vegetal. En seguida se cubri la boca del vaso con papel filtro y se coloc a
ebullicin donde se le agregaron unas gotas de NaOH diluido, al papel.
Despus de la emisin de los vapores de ebullicin se, espero a que secara el
papel y se observ bajo la luz ultravioleta a 365 Nm. (Resultado positivo:
aparicin de una coloracin fluorescente que puede ser verde, amarilla, o roja
en el papel filtro).







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V. RESULTADOS Y DISCUSIN

V.I. Diafanizado y pruebas histolgicas
Durante el desarrollo de este trabajo se obtuvieron datos importantes de las
propiedades generales y especficas de planta ejemplar, que ayudan a
determinar muchas de sus caractersticas y usos ms comunes como, la
resistencia al congelamiento y al calor. Este propiedad es de gran importancia
para la economa nacional ya que, el estudio de la resistencia de las especies
de Selaginella lepidophyla gracias a la trehalosa, permitiran la produccin de
cultivos ms resistentes que mejoraran la agricultura y por ende, la economa
mexicana.
A pesar de que el diafanizado es una tcnica fcil y sencilla de aplicar, resulto
un poco complicado aplicarla a este espcimen, dado que tiene hojas
demasiadas pequeas, tuvimos ciertas complicaciones con la hoja, pero se
logr realizar bien la tcnica, nos permiti expandir y ablandar la hoja y
adems se logr obtener completamente la estructura como se requeria, sin
rupturas y sin contaminacin.
Una vez obtenido el material vegetal diafanizado se procedi a raspar
constantemente hasta obtener una estructura delgada, posteriormente la
teimos, finalmente se pudieron observar estomas que amonoctico o
ranunculceo y tricomas unicelulares que resultaron fciles de observar.
Tambin se determinaron presencia de carbonatos de calcio la cual fue
positiva, al momento de agregar el cido sulfrico se observaron unas burbujas
caractersticas de este compuesto; la prueba para almidn fue positiva al
administrar lugol se pudieron observar fcilmente el almidn presente, fue la
prueba ms sencilla.
En cuanto a oxalatos se procedi a realizar la prueba agregando cido
clorhdrico, lo cual nos result negativa, de acuerdo al fundamento de la
determinacin de oxalatos, ya que no hubo formacin de cristales en la
muestra observada al microscopio.








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Los resultados en resumen se ilustran en la tabla no. 3. Presentada a
continuacin.


Determinaciones en la planta Resultado
Tricomas Positivo (+)
Estomas Estomas (+)
Almidon Positivo (+)
Carbonato de calcio Positivo (+)
Oxalatos Negativo (-)
Tabla 2. Resultados de pruebas microscpicas realizadas con material seco, molido y
diafanizado


V.II. Determinacin cromatografica

Las muestras de Solanum verbascifolium L. se analizaron, empleando como
tcnica analtica, la cromatografa de columna, utilizando una columna
constituida por slice gel, azcar glas y CaCO
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resultando as una columna
polar.( Smith I, Feinberg JG (1965) Paper & Thin Layer Chromatography and
Electrophoresis. Shandon Scientific Company Ltd.). La planta mostr un
mximo de absorcin en su es pectro ultravioleta en 410 nm, lo cual est de
acuerdo con lo reportado por Silverstein (1978).
La separacin de la muestra colocada en la columna se llev a cabo de manera
esperada, aunque con un tiempo prolongado. El producto obtenido es una
sustancia aceitosa que mostro dos diferentes tonalidades los colores que se
presentaron fueron de color amarillo y verde principalmente que identifica a las
clorofilas, segn el autor Nikolai Sharapin la clorofila B se representa con un
color amarillo y clorofila A con un color verde. Estos resultados e observaron de
esta manera debido a que son un grupo de pigmentos verdes que se
encuentran en diversas clulas eucariotas que poseen cloroplastos
(plantas, algas) y algunos procariotas.

V.III. Determinacin de metabolitos secundarios en la Fraccin A
Reconocimiento de Flavonoides
La especie Selaginella lepidophylla dio negativo porque de acuerdo con el
fundamento de la reaccin de Shinoda, nos dice que plantas positivas a
flavonoides presentan colores caractersticos visualmente (color purpura que




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vara desde rosa muy tenue hasta el color guinda),sin embargo hay algunas
que la clorofila y otros componentes de las plantas las cubre y se tiene que
comprobar utilizando los el extracto de la fraccin A mediante filtracin y
eliminacin de clorofila, el extracto obtenido no mostro ninguna de las
caractersticas mencionadas anteriormente a pesar de que se utiliz el mismo
mtodo para determinacin.

Reconocimiento de OH Fenlicos
La especie Selaginella lepidophylla (doradilla) dio positiva a compuestos
fenlicos de acuerdo con la reaccin de FeCl3, nos dice que las plantas
positivas a taninos y OH Fenlicos presentan colores caractersticos
visualmente (que vara de acuerdo a las gotas adicionadas desde amarillo a
verde grisceo hasta azul negro).

Reconocimiento de Taninos
La especie Selaginella lepidophylla (doradilla) dio positiva a la reaccin con
gelatina de acuerdo con el fundamento el sustrato hubo turbidez y hasta
precipitado abundante.

V.IV. Determinacin de metabolitos secundarios en la Fraccin B
Reconocimiento de Esteroides y Triterpenos.
La especie Selaginella lepidophylla (doradilla) dio positivo a esteroides con la
reaccin de LiebermannBurchard, de acuerdo a su fundamento de dicha
reaccin, los sustratos de la fraccin B y C obtenidas presentaron una
coloracin verde-azulado indicando presencia de esteroides y ausencia al
grupo triterpnico, debido a que en este caso ninguno de los sustratos
obtenidos presentaron una coloracin rojo-naranja.

Reconocimiento de Antraquinonas
La especie Selaginella lepidophylla (doradilla) dio negativo a la reaccin de
Borntrager indicando la ausencia de quinonas como son antraquinonas y
naftoquinonas de acuerdo al fundamento de dicha reaccin, el sustrato de la
fraccin B obtenido no presento cambios en su coloracin.




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V.V. Determinacin de metabolitos en la Fraccin C

Reconocimiento de Alcaloides
El ejemplar Selaginella lepidophylla (doradilla) dio negativo la reaccin de
Dragendorff por tanto no contiene alcaloides ya que de acuerdo con Wilhelm
Meissne los alcaloides tienen la capacidad de combinarse con el yodo y
metales pesados como bismuto, mercurio, tugsteno formando precipitados, en
la tcnica utilizamos lo que es el reactivo de Dragendorff que se prepara
mezclando 8 g de nitrato de bismuto pentahidratado en 20 ml de cido ntrico al
30% con una solucin de 27.2 g de yoduro de potasio en 50 ml de agua, y
nuestro ejemplar no mostro ninguna clase de precipitacin al hacer contacto
con el reactivo.


Reconocimiento de Cardenlidos
La especie Selaginella lepidophylla (doradilla) dio positivo a la reaccin con el
reactivo de Kedde, de acuerdo con el fundamento de dicha reaccin, nuestro
sustrato de la fraccin C obtenida presento una coloracin purpura, indicando
la presencia de cardenlidos.

Reconocimiento de Leucoantocininas
Los sustratos de la fraccin A, D, y E obtenidas de la especie Selaginella
lepidophylla fueron positivas a la reaccin de Rosenheim, indicando la
presencia de leucoantocininas, todos los sustratos obtenidos de dicha especie
presentaron una coloracin del amlico.

V.VI. Determinacin de Saponinas, Cumarinas y Aminocidos.

Reconocimiento de Saponinas
La especie Selaginella lepidophylla (doradilla) dio negativo a la prueba de
saponinas debido a que no present ninguna reaccin (no produjo espuma) de
acuerdo al fundamento establecido en la prueba de saponinas.





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Reconocimiento de Protenas Aminocidos
La especie Selaginella lepidophylla (doradilla) dio positivo a la reaccin de la
Nihidrina, indicando la presencia de aminocidos en el sustrato de la fraccin A
obtenido en la extraccin de dicha planta.

Reconocimiento de Cumarinas
La prueba de determinacin en la especie Selaginella lepidophylla (doradilla)
no se llev a cabo.

Reconocimiento de Lpidos
La especie Selaginella lepidophylla (doradilla) dio positivo a la prueba de
lpidos, el sustrato reaccion con el yodo dando como producto un cambio en la
coloracin (cambio a color marrn).
Los resultados de todas las pruebas fitoquimicas realizadas en la especie
Selaginella lepidophylla (doradilla), se ilustran en la tabla no. 4

Pruebas Fitoqumicas Resultado
Aminocidos Positivo (+)
Componentes fenlicos Positivo (+)
Taninos Positivo (+)
Flavonoides Negativo (-)
Terpenos Negativo (-)
esteroides Positivo (+)
cumarinas No se realizo
Quinonas Negativo (-)
Cardenlidos Positivo (+)
Alcaloides Negativo (-)
Leucoantocininas Positivo (+)
Lpidos Positivo (+)
saponinas Negativo (-)
Tabla 4. Resultados de las pruebas Fitoqumicas para la identificacin de los metabolitos
secundarios de la especie Selaginella lepidophylla (doradilla).










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I. CONCLUSIONES
De acuerdo a los datos obtenidos en el proyecto con el objetivo de Identificar y
Caracterizar por tcnicas histoqumicas la especie Selaginella lepidophylla
(conocida como siempre viva o doradilla), una planta endmica del estado,
podemos concluir que:
Esta planta tiene caractersticas y propiedades morfolgicas
procedentes de su gran nmero, tipo y disposicin de sus estomas, esta
propiedad le permite a la planta adquirir humedad (agua) con mayor
facilidad para su supervivencia en el medio ambiente.
De acuerdo a los datos obtenidos en las observaciones a microscopio,
la tcnica de diafanizado resulto ser eficaz, ya que debido al buen
trabajo en equipo, logramos identificar las estructuras celulares en la
especie Selaginella lepidophylla (doradilla), permitiendo as clasificarla e
identificar alguna alteracin en la planta .
De manera general podemos concluir que para una buena identificacin
de estructuras en la planta es necesario ser cuidadoso sobre todo
preciso en el raspado, la tincin y tener el conocimiento previo de lo que
se est determinado en la planta como tambin las condiciones en las
que se realiza.
En el proceso de separacin de los pigmentos en la planta por
cromatografa, nos dimos cuenta que intervienen propiedades
fisicoqumicas como la absorcin y disolucin, por consiguiente es
fundamental tener en cuenta la polaridad tanto de las sustancias a
rastrar como las del disolvente si es que, queremos realizar una buena
separacin de componentes vegetales.
De acuerdo al proceso realizado de extraccin de metabolitos
secundarios que nos result muy tedioso debido a que nos llev
demasiado tiempo porque la extraccin no se llevaba a cabo, por que las
condiciones en las que lo hacamos no eran favorables (temperatura y
presin).
Y como punto final, en la caracterizacin de los metabolitos secundarios
podemos decir que los productos de las reacciones acido base son muy
importantes para su identificacin como lo son, polaridad de los
disolventes y de los componentes de la planta a extraer para llevar a
cabo un arrastre de componentes
.





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BIBLIOGRAFIA
Sharapin, N., Fundamentos de Tecnologa de Productos
Fitoterapeticos, Roberto Pinzn ed., Programa Iberoamericano de
Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo, Cyted, Santaf de Bogot D. C.,
2000.

Farmacognosia y Fitoqumica, versin 2.0, Alejandro Martnez,
Universidad de Antioquia, Medelln, 200 5.


Dominguez a Xorge. 1979. Mtodos de Investigacin Fitoqumica.
Editorial Limusa, Mxico.

Evans, W.C Farmacognosia. Trease-Evans. 13a Ed.
Interamericana.McGraw Hill, Madrid-Auckland-Bogot, 1991.


Determinacin de Metabolitos secundarios voltiles y Semivoltiles, y
cidos Aristolquicos en Aristolochia, Ringens Vahl, Nstor Armando
Marn Solano, Sergio ., Andrs Ordez Caldern Universidad
Industrial de Santander. Facultad de ciencias. Escuela de Qumica.
Bucaramanga 2008

Tcnicas de recolecta de plantas y herborizacin, Arturo Snchez-
Gonzlez y Manuel Gonzlez Ledesma
Luisot P (1982). Bioqumica Estructural, 2 Ed. Editorial AC.

Tcnicas aplicadas al estudio de la Anatoma vegetal.Estela Sandoval
Z.Cuadernos 38. Instituto de biologa UNAM.

Capitulo IV Analisis Fitoquimico y Metabolitos Secundarios Dra. Olga
Lock de Ugaz Pontificia Universidad Catlica del Per

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